JPH0679164A

JPH0679164A - 複合重合体粒子

Info

Publication number: JPH0679164A
Application number: JP5198229A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Une; 浩宇根; Katsuo Mitani; 勝男三谷
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1986-06-03
Filing date: 1993-08-10
Publication date: 1994-03-22
Also published as: JPH073426B2; JPS62286533A

Abstract

(57)【要約】【目的】診断用試薬の担体として好適に使用し得る粒
子を提供すること。【構成】無機化合物粒子が、個々に独立して重合体層
で被覆されてなり、単粒子性が８０％以上であり、且つ
平均粒径が０．５〜１０μｍであることを特徴とする複
合重合体粒子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は水媒体中で分散安定性の
よい親水性の複合重合体粒子に関する。特に、酵素や免
疫活性物質などの生理活性物質を固定化して、診断用試
薬に好適に使用し得る複合重合体粒子を提供するもので
ある。

【０００２】

【従来技術及び発明が解決しようとする問題点】複合重
合体粒子は無機化合物粒子が重合体層で被覆された構造
であり、電子写真，歯科材料，インキ，イオン交換樹
脂，樹脂成型品，診断用試薬担体，カラムクロマトグラ
フィー用担体，あるいは医薬投与用担体のように、多く
の分野において使用されている。特に最近では、生化学
分野への複合重合体粒子の進出がめざましく、生理活性
物質、特に酵素や免疫性物質を担持させた診断用試薬、
特にマイクロタイター法による診断用試薬としての応用
が試みられている。

【０００３】従来の複合重合体粒子については、例えば
高分子論文集第４０巻．６９７−７０２頁（１９８３
年）に、ヒドロキシプロピルセルロースを下限臨界共溶
温度で飽和吸着させたシリカ粒子を核に使用すると、ス
チレンによるシリカ粒子のカプセル化が促進することが
述べられている。また、高分子論文集第４０巻２５９−
２６６頁（１９８３年）には、硫酸バリウム粉末の存在
下にメタクリル酸メチルの重合を行い、生成ポリマーに
より硫酸バリウム粉末をカプセル化したことが述べられ
ている。

【０００４】しかし、これらの方法によると、一粒子の
中に複数個の無機化合物粒子を含んだ複合重合体粒子や
無機化合物粒子を全く含まない重合体のみの粒子が多数
生成することが、本発明者らの実験により確認された。

【０００５】ところで、診断用試薬の担体としては、粒
子分布が狭く、また、単粒子性の高い粒子を用いること
が、分散安定性や鋭敏性の上から好ましい。従って、複
合重合体粒子を診断用試薬の担体として用いる場合に
は、元の無機化合物粒子の粒度分布を狭く、単粒子性を
高く調製する。しかしながら、このように狭い粒度分布
や高い単粒子性を有する無機化合物粒子を用いても、前
記した方法によって重合を行った場合には、重合後に得
られた複合重合体粒子の粒度分布や単粒子性は悪化して
しまう。

【０００６】このような複合重合体粒子に蛋白質，酵
素，抗原，抗体，バクテリア，ウイルス，細胞等の生理
活性物質を吸着させて診断用試薬に応用した場合、分散
安定性が低いために取扱いが困難であり、また、粒度分
布が広く凝集粒子が多いために表面積が小さく吸着効率
が低いという欠点がある。

【０００７】

【問題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
診断用試薬の担体として好適に使用し得る高い単粒子性
を有する複合重合体粒子の開発を続けてきた結果、本発
明を完成するに至ったものである。

【０００８】すなわち、本発明は、無機化合物粒子が、
個々に独立して重合体層で被覆されてなり、単粒子性が
８０％以上であり、且つ平均粒径が０．５〜１０μｍで
あることを特徴とする複合重合体粒子である。

【０００９】本発明の複合重合体粒子は、無機化合物粒
子が夫々独立して重合体層で被覆されている。すなわ
ち、１個の複合重合体粒子は基本的に１個の無機化合物
粒子を含有していることが重要である。２個以上の無機
化合物粒子を含有すると、複合重合体粒子の粒径及び粒
度分布が大きくなるだけでなく、凝集粒子が生じ易くな
るので、診断用試薬の担体として用いる場合には、固定
化効率が低下し好ましくない。

【００１０】本発明で使用される無機化合物粒子は、公
知のものが何ら制限なく採用することができる。例え
ば、シリカ，アルミナ，チタニア，ジルコニア，酸化第
二鉄，四三酸化鉄，酸化コバルト，酸化ニッケル等の周
期律表第III 族，第IV族または第VIII族の金属または半
金属の酸化物；水酸化アルミニウム，水酸化第二鉄，水
酸化クロム等の水酸化物；臭化銀，塩化銀等のハロゲン
化物；硫化カドミウム等の硫化物；炭酸カルシウム，炭
酸マグネシウム等の炭酸塩；硫酸バリウム，硫酸ストロ
ンチウム等の硫酸塩等を何ら制限なく採用することがで
きる。

【００１１】本発明において、特に好適に用いられる無
機化合物粒子としては、シリカ，アルミナ，チタニア夫
々を主な構成成分とする無機酸化物か、あるいはシリカ
と結合可能な周期律表第Ｉ族，第II族，第III 族及び第
IV族からなる群より選ばれた少なくとも１群の金属酸化
物及びシリカを主な構成成分とする無機酸化物を挙げる
ことができる。

【００１２】上記の各金属酸化物とシリカを主な構成成
分とする無機酸化物はシリカのシリコン原子と第Ｉ族，
第II族，第III 族または第IV族の金属酸化物、例えば酸
化リチウム，酸化ナトリウム，酸化カリウム，酸化マグ
ネシウム，酸化カルシウム，酸化ストロンチウム，酸化
バリウム，酸化アルミニウム，酸化チタニウム，酸化ジ
ルコニウム，酸化ハフニウム，酸化錫，酸化鉛等が酸素
を仲介に結合してたものである。そして上記第Ｉ族，第
II族，第III 族及び第IV族の金属酸化物（以下単に一般
的Ｍ¹ ₂Ｏ，Ｍ²Ｏ，Ｍ³ ₂Ｏ₃，Ｍ⁴Ｏ₂（ただし、
Ｍ¹は第Ｉ族の金属，Ｍ²は第II族の金属，Ｍ³は第II
I 族の金属，Ｍ⁴は第IV族の金属）で表示する場合もあ
る）の構成比率は得られる無機酸化物の形状に大きな影
響を与える。勿論、Ｍ¹ ₂Ｏ，Ｍ²Ｏ，Ｍ³ ₂Ｏ₃，及
びＭ⁴Ｏ₂の種類，製造方法，製造条件等によってその
構成比率が形状に与える影響は変ってくるが、一般に上
記した粒子径の範囲でかつ球形状の無機酸化物を得よう
とする場合は、Ｍ¹ ₂Ｏ，Ｍ²Ｏ，Ｍ³ ₂Ｏ₃，及びＭ
⁴Ｏ₂の合計の構成比率を１〜２０モル％の範囲とする
ことが好ましく、特に５〜１５モル％の範囲のＭ
¹ ₂Ｏ，Ｍ²Ｏ，Ｍ³ ₂Ｏ₃及びＭ⁴Ｏ₂の合計の構成
比率を選択するときは粒子径が揃った真球に近いものと
なる。

【００１３】本発明で使用される無機化合物粒子は、生
理食塩水または緩衝液に対して難溶性を示すものである
ことが好ましい。

【００１４】本発明に使用される無機化合物粒子及び複
合重合体粒子の平均粒径は、０．５〜１０μｍである。
本発明で得られる平均粒径が０．５〜１０μｍの複合重
合体粒子は、診断用試薬に好適に応用しうる。

【００１５】本発明の複合重合体粒子に生理活性物質を
担持させる場合は、生理活性物質の高い固定化効率を得
るために無機化合物粒子の粒度分布は狭いほどよい。粒
度分布を粒子径の分散値（平均粒径の標準偏差を平均粒
径で除して１００をかけた値、％表示）で示せば、一般
に３０％以下、さらに２０％以下である無機化合物粒子
が好ましい。同様に、本発明の複合重合体粒子の粒径の
分散値は３０％以下、さらに２０％以下であることが好
ましい。

【００１６】さらに、無機化合物粒子の形状は、使用さ
れる無機化合物の結晶構造，製法によって異なり、多面
体，柱体，両錐体，球体等が存在し、これらすべて使用
可能であるが、好ましくは球体、特に好ましくは真球体
がよい。

【００１７】本発明の複合重合体粒子の単粒子性は８０
％以上、好ましくは９０％以上である。単粒子性とは非
凝集粒子、すなわち、全粒子中に占める単一粒子の個数
の割合である。無機化合物の粒子は、合成時あるいは保
存中に２個あるいはそれ以上凝集し、凝集粒子をつく
る。この凝集粒子が増加すると単粒子性が悪化する。単
粒子性は粒子径もしくは粒子体積と粒子個数を同時に測
定する装置を利用して測定される。例えばコールターカ
ウンター社製モデルＺＤ−１等により測定される。

【００１８】前記した無機化合物粒子を被覆する重合体
層は、下記式（１）

【００１９】

【化１】

【００２０】（ただし、Ｒ₁は水素原子，アルキル基ま
たはカルボキシル基若しくはその塩型基であり、Ｒ₂は
水素原子，アルキル基またはハロゲン原子であり、Ｒ₃
はカルボキシル基，スルホン酸基，スルホアリール基，
スルホアルキル基若しくはこれらの塩型基，カルバモイ
ル基，Ｎ−ヒドロキシアルキルカルバモイル基，ヒドロ
キシアルコキシカルボニル基，ヒドロキシアルキル基ま
たはポリエチレングリコールエステル基である。）で示
される親水性単量体単位を含んでいることが好ましい。

【００２１】前記一般式（１）中、Ｒ₁及びＲ₂で示さ
れるアルキル基は、その炭素数に特に制限されないが、
無機化合物粒子の被覆を良好に行うためには、炭素数が
１〜４であることが好ましい。また、前記一般式（１）
中、Ｒ₃で示されるスルホアルキル基，Ｎ−ヒドロキシ
アルキルカルバモイル基，ヒドロキシアルコキシカルボ
ニル基，ヒドロキシアルキル基の各基の中に含まれるア
ルキル基またはアルキレン基はその炭素数に特に制限さ
れないが、上記と同様の理由によって炭素数は１〜４で
あることが好ましい。本発明で好適なスルホアルキル基
としては、スルホメチル基，スルホエチル基等が挙げら
れ、Ｎ−ヒドロキシアルキルカルバモイル基としては、
Ｎ−ヒドロキシメチルカルバモイル基，Ｎ−ヒドロキシ
エチルカルバモイル基等が挙げられ、ヒドロキシアルコ
キシカルボニル基としては、ヒドロキシメトキシカルボ
ニル基，ヒドロキシエトキシカルボニル基，ジヒドロキ
シプロポキシカルボニル基等が挙げられ、ヒドロキシア
ルキル基としては、ヒドロキシメチル基，ヒドロキシエ
チル基等が挙げられる。

【００２２】さらに、前記一般式（１）中、Ｒ₃で示さ
れるスルホアリール基としては、スルホフェニル基，ス
ルホナフチル基，スルホアントラシル基等が挙げられ
る。また、ポリエチレングリコールエステル基は、

【００２３】

【化２】

【００２４】（ただし、ｎは５〜５０）で示される基で
ある。

【００２５】さらに、前記一般式（１）中、Ｒ₁及びＲ
₃で示されるカルボキシル基，スルホン酸基及びスルホ
アリール基の塩型基としては、これらの各基とナトリウ
ムやカリウム等のアルカリ金属とで構成された塩型基が
好適である。

【００２６】さらにまた、本発明の複合重合体粒子に免
疫活性物質を担持させた免疫診断用試薬として用いる場
合には、複合重合体粒子の表面への免疫活性物質の吸着
が行いやすいように、複合重合体粒子の表面を疎水性と
しておくことが好ましい。このためには、複合重合体粒
子の重合体層が、下記式（２）

【００２７】

【化３】

【００２８】（ただし、Ｒ₄は水素原子またはアルキル
基であり、Ｒ₅はハロゲン原子，置換若しくは非置換の
フェニル基，アルコキシカルボニル基である。）で示さ
れる疎水性単量体単位を含んでいることが好ましい。

【００２９】前記一般式（２）中、Ｒ₄で示されるアル
キル基は、その炭素数に特に制限されないが、単量体の
入手の容易さから、通常は１〜４であることが好まし
い。また、フェニル基の置換基としては、単量体単位の
疎水性を保持するものであれば特に制限されないが、一
般にはハロゲン原子，ハロアルキル基，アルキル基等を
挙げることができる。

【００３０】上記の疎水性単量体単位を含む場合には、
前記した親水性単量体単位との比率は、特に制限される
ものではないが、複合重合体粒子の表面を疎水性に保持
するためには、

【００３１】

【数１】

【００３２】さらに０．５〜１０の範囲であることが好
ましい。

【００３３】本発明の複合重合体粒子の重合体層は、極
めて薄いこと、一般には５〜５００オングストロームさ
らに１０〜１００オングストロームの範囲であることが
好ましい。このような薄い重合体層とすることにより、
無機化合物粒子の粒径とほとんど変わらない粒径の複合
重合体粒子とすることができる。

【００３４】また、本発明の複合重合体粒子の重合体層
は、無機化合物粒子を完全に被うことが好ましい。無機
化合物粒子の表面が一部露出していてもよいが、本発明
の複合重合体粒子を水中で使用した場合に無機化合物の
溶出が低い方がよい。例えば、本発明の複合重合体粒子
を蒸留水中に一定濃度分散させ、２４時間放置後の蒸留
水中に溶出した無機化合物の濃度が１０００ｐｐｍ以
下、特に１００ｐｐｍ以下であることが好ましい。

【００３５】前記した複合重合体粒子の製造方法として
は、特に制限されるものではないが、次の方法が好適に
採用される。すなわち、平均粒径が０．５〜１０μｍで
ある無機化合物粒子を分散させた水媒体中で、水溶性ラ
ジカル開始剤の存在下に水１００重量部に対する溶解度
が１０重量部以上の親水性単量体の重合を行う方法であ
る。

【００３６】本発明で用いられる親水性単量体としては
水１００重量部に対する溶解度が１０重量部以上であれ
ば特に制限されず、公知の単量体が用いられる。特に、
水１００重量部に対する溶解度が１５重量部以上である
親水性単量体を用いることが好ましい。

【００３７】本発明において、特に好適に用いられる親
水性単量体は、下記一般式（３）で示される単量体であ
る。

【００３８】

【化４】

【００３９】（ただし、Ｒ₁は水素原子，アルキル基ま
たはカルボキシル基若しくはその塩型基であり、Ｒ₂は
水素原子，アルキル基またはハロゲン原子であり、Ｒ₃
はカルボキシル基，スルホン酸基，スルホアリール基，
スルホアルキル基若しくはこれらの塩型基，カルバモイ
ル基，Ｎ−ヒドロキシアルキルカルバモイル基，ヒドロ
キシアルコキシカルボニル基，ヒドロキシアルキル基ま
たはポリエチレングリコールエステル基である。）具体
的には、次のような親水性単量体を例示することができ
る。

【００４０】アクリル酸，１−クロルアクリル酸，２−
メチルアクリル酸，メタクリル酸，マレイン酸，スチレ
ンスルホン酸，２−アクリルアミド−２−メチルプロパ
ンスルホン酸，アクリルアミド，Ｎ−（２−ヒドロキシ
プロピル）メタクリルアミド，２−ヒドロキシエチルメ
タアクリレート，グリセロールモノメタクリレート，ア
リルアルコール，ポリエチレングリコールモノメタクリ
レート等である。

【００４１】本発明において、無機化合物粒子の水媒体
中における濃度は特に限定的でなく、一般に０．１〜５
０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％が好適に採用
される。

【００４２】本発明に用いる水溶性ラジカル開始剤は特
に限定的でなく、公知のものが使用される。例えば、過
硫酸ナトリウム，過硫酸カリウム，過硫酸アンモニウム
等の過硫酸塩，または過硫酸塩とチオ硫酸ナトリウム，
チオ硫酸カリウム，チオ硫酸水素ナトリウム等のチオ硫
酸化合物及び銅イオン，鉄イオン等の分解促進剤を組み
合わせたレドックス系触媒が好適に使用される。水溶性
ラジカル開始剤の濃度は重合温度，単量体濃度に依存す
るために限定的でないが、０．０５乃至５０ミリモル／
ｌの範囲が好適に採用される。

【００４３】また水溶性ラジカル開始剤は、親水性単量
体重合時に全量添加することが望ましい。

【００４４】乳化剤もしくは安定剤の存在は、無機化合
物粒子の分散安定性を低下させ、凝集粒子をつくりやす
く、さらに乳化重合が無機化合物粒子表面外の水媒体中
でおこり、被覆度が低下する場合があるため、本発明に
おいては乳化剤や安定化剤を使用しない方が好ましい。

【００４５】本発明において、重合温度は４０℃〜８０
℃、より好ましくは５０℃〜７０℃がよい。

【００４６】本発明において、親水性単量体濃度は、少
なくとも無機化合物粒子の表面を重合体層が一層以上被
うことが可能であるような濃度であることが好ましい。
その濃度は、無機化合物粒子の濃度に依存するため一概
に限定できないが、一般的には無機化合物粒子に対して
０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜５重量％が
好適に採用される。

【００４７】本発明において、重合時間は０．５〜１０
０時間、好ましくは１〜５０時間が好適に採用される。

【００４８】さらに、本発明の複合重合体粒子に免疫活
性物質を担持させて免疫診断用試薬として用いる場合
は、上記の親水性単量体の重合に引き続いて、水１００
重量部に対する溶解度が１重量部以下の疎水性単量体の
重合を行うことが好ましい。疎水性単量体としては、水
１００重量部に対する溶解度が１重量部以下であれば公
知の単量体が特に制限されず用い得る。本発明におい
て、好適に用いられる疎水性単量体は、下記式（４）で
示されるものである。

【００４９】

【化５】

【００５０】（ただし、Ｒ₄は水素原子またはアルキル
基であり、Ｒ₄はハロゲン原子，置換若しくは非置換の
フェニル基またはアルコキシカルボニル基である。）こ
のような疎水性単量体としては、例えばスチレン，ビニ
ルトルエン，クロロメチルスチレン，クロルスチレン，
塩化ビニル，臭化ビニル，メチルメタアクリレート，エ
チルメタアクリレート，プロピルメタアクリレート，エ
チルビニルエーテル，プロピルビニルエーテル等が好適
に用いられ、特に、スチレン，ビニルトルエン，塩化ビ
ニル，メチルメタアクリレートが好ましく採用される。

【００５１】上記した疎水性単量体の重合は、親水性単
量体の重合が５０％以上進行した後に行うことが好まし
い。また、疎水性単量体の濃度は特に制限されないが、
一般には無機化合物粒子に対して０．０１〜１０重量
％、好ましくは０．０５〜５重量％の範囲から採用され
る。

【００５２】疎水性単量体の重合は、前記した親水性単
量体の重合と同様に行うことができる。

【００５３】本発明で複合重合体粒子に固定化できる生
理活性物質は、特に限定的でなく、公知のものが使用で
きる。例えば、酵素として西洋ワサビパーオキシダー
ゼ，グルコース酸化酵素，スーパーオキサイドデイスム
ダーゼ，チトクロームａ，ｂ，ｂ₁，ｃ，ｐ４５０等；
ホルモンとして下垂ホルモン（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙｈ
ｏｒｒｎｏｎｅｓ），インシュリン，クルカゴン，サイ
ロイドホルモン等；ハプテンとしてオヒアムカロイド
（モルフイネ），アンチピリン，バルビツール酸；免疫
活性物質として変性ガンマグロブリン，抗核因子，ヒト
アルブミン，抗ヒトアルブミン抗体，イムノグロブリン
Ｇ（ＩｇＧ），抗ヒトＩｇＧ抗体，イムノグロブリンＡ
（ＩｇＡ），抗ヒトＩｇＡ抗体，イムノグロブリンＭ
（ＩｇＭ），抗ヒトＩｇＭ抗体，抗ヒトＩｇＥ抗体等が
あげられる。

【００５４】本発明における複合重合体粒子の生理活性
物質の固定化は、単に粒子分散緩衝液中に生理活性物質
を添加し吸着により固定化する方法や、種々のカップリ
ング剤を用い表面親水性官能基と共有結合により固定化
する方法が採用される。

【００５５】

【発明の効果】本発明の複合重合体粒子は、無機化合物
粒子が夫々独立して重合体層で被覆されておりしかも、
凝集粒子が少なく単粒子性の高いものである。このた
め、無機化合物粒子の粒径，粒度分布及び単粒子性等の
物理的特性が、そのまま複合重合体粒子に継承される。
従って無機化合物粒子の粒径，粒度分布及び単粒子性を
調製することにより、所望の粒径，粒度分布及び単粒子
性を有する複合重合体粒子を得ることができる。さら
に、特定の粒径を有し、粒度分布が狭く、かつ単粒子性
が高い複合重合体粒子は、生理活性物質の固定化能が高
く、かつ保存性が良好である。従って、本発明の複合重
合体粒子は、生理活性物質の担体、特に診断用試薬の担
体、カラムクロマトグラフィー用担体、あるいは医薬投
与用担体として広範囲な応用が可能である。

【００５６】

【実施例】以下に、実施例及び比較例を挙げて、本発明
をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。

【００５７】なお、以下の実施例における無機化合物粒
子及び複合重合体粒子の性状は、以下の方法により測定
した。

【００５８】（１）平均粒径平均粒径は１００個以上の粒子を透過型電子顕微鏡で観
察して求めた。また、粒度分布は平均粒径の標準偏差を
平均粒径で除して１００をかけた値である分数値（％）
で表示した。

【００５９】（２）単粒子性コールターカウンター社製モデルＺＤ−１を用いて測定
した。

【００６０】なお、単粒子性を示すグラフ（図１及び図
２）中、縦軸は、メインピークを９９９として表示した
粒子の相対的な存在割合を示す。

【００６１】（３）重合体層の厚み光電子分光測定によって求めた。具体的には、実施例
１，２，６，７，９，１０，１４，１５，１９，２０，
２２，２３については２８３〜２９１ｅＶの炭素の吸収
と１５５ｅＶのケイ素の吸収の比、実施例５，１８につ
いては炭素と１２４ｅＶのアルミニウムの吸収の比、実
施例３，１６については炭素と５７０ｅＶのチタンの吸
収の比、実施例４については炭素と４３１ｅＶのジルコ
ニウムの吸収の比よりオングストローム単位で求めた。

【００６２】（４）溶出量各々の複合重合体粒子を蒸留水中に１０重量％となるよ
うに分散し、この分散液１ｍｌを取り、２４時間放置
後、上澄液中の溶出した無機化合物に基づくイオンを原
子吸光法より定量した。

【００６３】（５）重合体層の組成光電子分光測定による２８３ｅＶ〜２９１ｅＶの炭素の
吸収に基づいて求めた。実施例１４，２３についてはフ
ェニル基に由来する吸収とエステル基に由来する吸収の
比、実施例１５についてはスルホン酸基に由来する吸収
とエステル基の吸収の比、実施例１６，２０については
アミド基とフェニル基の吸収の比、実施例１７について
はカルボン酸基と塩素の吸収比、実施例１８はカルボン
酸基とフェニル基の吸収の比、実施例１９についてはス
ルホン酸基とエーテル基の吸収の比、実施例２１につい
てはアルキル基とフェニル基の吸収の比、実施例２３に
ついてはスルホン酸基とフェニル基の吸収の比からそれ
ぞれ求めた。

【００６４】実施例１（１）シリカ粒子の合成撹拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール２８００ｃ
ｃ，アンモニア水（２５重量％）６１６ｃｃ，水酸化ナ
トリウム水溶液（５モル／ｌ）２１ｃｃを加え１０℃に
保った後に、テトラエチルシリケートのメタノール溶液
（２２％）１４２８ｃｃを撹拌しながら２５．５ｃｃ／
ｈｒの滴下速度で添加して反応した。その後シリカ粒子
を大量のメタノール中でデカンテーションを繰り返して
精製した。得られたシリカ粒子の平均粒径，分散値及び
単粒子性は第１表に示したとおりである。

【００６５】得られたシリカ粒子の単粒子性を示すグラ
フ、すなわち、１個の粒子の体積（横軸）と粒子数の割
合（縦軸）との関係を示すグラフを図１（ａ）に、ま
た、電子顕微鏡写真を図３に示した。

【００６６】得られたシリカ粒子を沈降させ、上澄をの
ぞき、蒸留水を加え、分散させ、さらに沈降させる操作
を２回繰り返し、粒子を洗浄した後、分散濃度１０ｗｔ
％になるように蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。

【００６７】（２）親水性単量体の重合撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、
（１）で得られたシリカ分散液１００ｍｌを加えて４０
℃に保ち、窒素雰囲気下、撹拌下に６７ミリモルのグリ
セロールメタクリレートと過硫酸カリウムを２．９ミリ
モル／ｌとなるように添加した。次いで４０℃に保温し
撹拌下第１表に示す条件で重合を行った。重合後、遠心
分離で上澄を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に
再分散させた。この操作を６回繰り返し、沈澱を洗浄
し、精製した複合重合体粒子を得た。得られた粒子の性
状を第１表に示した。また、単粒子性を示すグラフを図
１（ｂ）に、電子顕微鏡写真を図４に示した。

【００６８】実施例２〜１０実施例１と同様にして、第１表に示した種々の無機化合
物粒子を分散させた水媒体中で第１表に示した水溶性ラ
ジカル開始剤と親水性単量体を用いて重合を行い、その
後、得られた複合重合体粒子を洗浄、精製した。

【００６９】得られた複合重合体粒子の性状を第１表に
示した。

【００７０】

【表１】

【００７１】

【表２】

【００７２】実施例１１実施例２，６，７，８，９，１０で得られた複合重合体
粒子を１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１重量
％濃度となるように分散した。また、市販の西洋ワサビ
パーオキシダーゼ（和光純薬製）（以下、単にＨＲＰと
もいう）を１／１５Ｍリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌと
なるように溶解した。次いで、複合重合体粒子の分散液
５ｍｌと、ＨＲＰ溶液５ｍｌを混合し、室温で２時間、
５分毎に撹拌しながら固定化した。固定化後、遠心分離
して上澄を除き、沈澱を上記リン酸緩衝液５ｍｌに再分
散させ、再度遠心分離し、リン酸緩衝液２ｍｌに再分散
し、ＨＲＰを固定化した複合重合体粒子からなる診断用
試薬を得た。得られた診断用試薬の粒径の分散値及び単
粒子性を第２表に示した。

【００７３】各診断用試薬の分散液０．５ｍｌを取って
遠心分離し、沈澱を乾燥させた後、微量窒素分析機を用
いて担体表面上の窒素量を求め、それをＨＲＰの量に換
算して固定化量を求め、第２表に併記した。

【００７４】次いで、診断用試薬の分散液１ｍｌにグラ
イアコール液及びＨ₂Ｏ₂液を加え、４３６ｎｍの吸光
度より活性を求め、上記のＨＲＰの固定化量から比活性
を求めた。次いで、固定化前のＨＲＰの比活性を同様に
求め、固定化前のＨＲＰ比活性を１００％とした時の固
定化後の比活性を第２表に示した。

【００７５】実施例１２実施例３，４で得られた複合重合体粒子を０．１Ｍホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．０）に１％濃度となるように分散し
た。この分散液１０ｍｌに１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド２０ｍｇを
加え、さらに２ｍｇ／ｍｌに溶解した熱変性ヒトＩｇＧ
を加え、４℃で振とうしながら１８時間固定化した。固
定化後遠心分離し、上澄を除き、沈澱を上記ホウ酸緩衝
液に再分散した。この操作を３回繰り返し、最後に０．
０１％牛血清アルブミン（以下、単にＢＳＡともいう）
及び０．１％界面活性剤を含む１／１５Ｍリン酸緩衝液
に再分散し、熱変性ＩｇＧを固定化した複合重合体粒子
からなる診断用試薬を得た。診断用試薬の単粒子性，分
散値及び熱変性ヒトＩｇＧの固定化量を第２表に示し
た。次いで、マイクロタイタープレート上にリウマチ患
者のプール血清を２０倍希釈から倍数希釈し、熱変性Ｉ
ｇＧを固定化した診断用試薬の分散液を添加し、撹拌後
その凝集像を判定した。それぞれの診断用試薬の鋭敏性
及び判定時間を第２表に示した。

【００７６】実施例１３実施例１で得られた複合重合体粒子５ｇを５０ｍｌの蒸
留水に分散させた。次いで２００ｍｇの過ヨウ素酸ナト
リウムを含む酢酸溶液を加え、室温で２４時間反応後、
上澄のｐＨが中性になるまで遠心分離により洗浄し、表
面にホルミル基を導入した粒子を得た。この表面にホル
ミル基を導入した粒子５ｇを５０ｍｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）に分散し、１００ｍｇ／ｍｌ濃度のヒト
絨毛ゴナドトロピン（以下単にＨＣＧともいう）１０ｍ
ｌを加え、４℃で振とうしながら１８時間固定化した。
固定化後の粒子を遠心分離で洗浄し、ヒト絨毛ゴナドト
ロピンを固定化した診断用試薬を得た。この診断用試薬
の粒径の分散値，単粒子性及びヒト絨毛ゴナドトロピン
の固定化量を第２表に示した。

【００７７】この診断用試薬をカラムにつめ、ウサギに
ＨＣＧを免疫して得られた抗ＨＣＧ血清の５０％飽和硫
安画分を１／１５Ｍリン酸緩衝液で溶解し、流したとこ
ろ、極めて高純度の抗ＨＣＧ抗体が得られた。

【００７８】

【表３】

【００７９】

【表４】

【００８０】実施例１４実施例１の（１）で得られたシリカ分散液１００ｍｌを
撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に添加し
て４０℃に保ち、窒素雰囲気下に撹拌しながら６７ミリ
モルのグリセロールメタクリレートと過硫酸カリウムを
２．９ミリモル／ｌとなるように添加した。次いで、４
０℃に保温し、撹拌しながら第３表に示す条件で第１段
目重合を行った。その後、７０℃に昇温を行い、７０℃
に加温したスチレン９０ミリモルを滴々添加した後、所
定時間撹拌下に第２段目重合を行った。重合後、遠心分
離で上澄を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再
分散した。この操作を６回繰り返し沈澱を洗浄し、精製
した複合重合体粒子を得た。得られた粒子の性状を第３
表に示す。また、単粒子性を示すグラフを図２（ａ）に
示した。さらに、得られた複合重合体粒子の光電子分光
測定結果を図６（Ａ）及び（Ｂ）に示した。図６（Ｂ）
は、図６（Ａ）の炭素のピークの部分を拡大したもので
ある。

【００８１】実施例１５〜２３実施例１４と同様にして第３表に示した種々の無機化合
物粒子，親水性単量体及び疎水性単量体を用いて第１段
目重合及び第２段目重合を行った。得られた複合重合体
粒子の性状を第３表に示した。

【００８２】

【表５】

【００８３】

【表６】

【００８４】実施例２４〜３３（１）熱変性ヒトＩｇＧを固定化した複合重合体粒子の
調製ヒトコーンＦII画分（シグマ社製）を１／１５０Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１０ｍｇ／ｍｌになるよう溶
解し、５６℃で２時間加熱することにより熱変性ヒトＩ
ｇＧを得た。得られた熱変性ヒトＩｇＧをリン酸緩衝液
で４０倍に希釈したものを原液とし、倍数希釈法により
希釈した。この熱変性ヒトＩｇＧの希釈液１ｍｌと、実
施例１４〜２３で得られたそれぞれの複合重合体粒子を
リン酸緩衝液で１重量％に希釈した分散液１ｍｌとを撹
拌しながら室温で１時間混合した。次いで、遠心分離し
て固型分を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．５％牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液２ｍｌに再分
散した。かくして得られた熱変性ヒトＩｇＧを固定化し
た複合重合体粒子の単粒子性と粒径の分散値を第４表に
示す。

【００８５】（２）抗原・抗体反応リウマチ患者血清のプール血清をリン酸緩衝液で２０倍
に希釈したものを原液とし、倍数希釈法によりリウマチ
患者血清をリン酸緩衝液で希釈して、リウマチ患者血清
希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行うためにマイク
ロタイタープレートを用意し、リウマチ患者血清希釈液
を各ホールに２５μｌ加える。次いで熱変性ヒトＩｇＧ
固定化した複合重合体粒子の分散液を各ホールに２５μ
ｌ加えた後、５分間撹拌し静置した。次いで抗原・抗体
反応による凝集状態を観察し、熱変性ヒトＩｇＧを固定
化した複合重合体粒子の性能を評価した。反応開始後の
凝集状態を図７に示す。粒子がスポット状に集まり外周
縁が均等でなめらかな円形を示す場合（−）、粒子が小
さなリングを形成し、外周縁が均等でなめらかなもの
（±）、粒子リングが明らかに大きく、リング内に凝集
粒子が膜状に広がっているもの（＋）、凝集が均一に起
こり、凝集粒子が底全体に膜状に広がっているもの（＋
＋）と判定した。図中Ｃは抗原もしくは抗体を全く含ま
ないことを示す。図７の明らかに（＋）像が認められた
ホールにおけるリウマチ患者血清希釈液の最高希釈倍数
をもって、鋭敏性を評価した。迅速性は明らかな陰性
（−）像が現われ、変化しなくなる時間を尺度とした。
また非特異凝集反応は、Ｃ部分に（±），（＋），（＋
＋）のいずれかの凝集状態が認められたホールの個数を
示した。それぞれの熱変性ヒトＩｇＧを固定化した診断
用試薬の鋭敏性，迅速性，及び９６個中の非特異凝集の
個数を第４表に示した。

【００８６】

【表７】

【００８７】実施例３４〜４３（１）アルフアーフエトプロテイン抗体（ＡＦＰ抗体と
略す）を固定化した複合重合体粒子の調製ヤギの産生したアルフアーフエトプロテイン（以下、Ａ
ＦＰともいう）の抗体をアフイニテイクロマトにより精
製して得た精製ＡＦＰ抗体を１ｍｇ／ｍｌ濃度に含有す
るリン酸緩衝液を調製した後、倍数希釈法により希釈し
てＡＦＰ抗体希釈液を調製した。このＡＦＰ抗体希釈液
１ｍｌと、実施例１４〜２３で得られたそれぞれの複合
重合体粒子をリン酸緩衝液で１重量％に希釈した分散液
１ｍｌとを撹拌しながら室温で１時間混合した。次いで
遠心分離し、固型分を０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０及び
０．２５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液２ｍｌに再分散し
た。かくして得られたＡＦＰ抗体を固定化した複合重合
体粒子の単粒子性と粒径の分散値を第５表に示す。次い
で、かくして得られたＡＦＰ抗体を固定化した複合重合
体粒子と患者血清のプール血清との抗原抗体反応を実施
例２４の（２）と同様の方法で調べた。それぞれのＡＦ
Ｐ抗体を固定化した複合重合体粒子の鋭敏性，迅速性及
び９６個中の非特異凝集の個数を第５表に示した。

【００８８】

【表８】

【００８９】比較例１撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、実施
例１（１）で得られたシリカ分散液１００ｍｌを加えて
５０℃に保ち、窒素雰囲気下、撹拌しながらメチルメタ
クリレートを６７ミリモルと過硫酸カリウムを２．９ミ
リモル／ｌとなるように添加して４時間重合した。得ら
れた粒子を実施例１（２）と同様に精製した。得られた
粒子の粒子径は１．３２μｍ，粒子径の分散値は５３．
９％，単粒子性は５０．１％であった。また、単粒子性
を示すグラフを図２（ｂ）に、また電子顕微鏡写真を図
５に示した。このように、単量体として水１００重量部
に対する溶解度が１０重量部未満のメチルメタクリレー
トを用いた場合には、元の無機化合物粒子の単粒子性が
良好であっても重合によって凝集粒子が増加するために
単粒子性の良好な複合重合体粒子は得られない。

【００９０】この複合重合体粒子に、実施例２４及び３
４と同様に熱変性ヒトＩｇＧ及びアルフアーフエトプロ
テイン抗体を固定化した。得られた診断用試薬の鋭敏
性，迅速性及び９６個中の非特異凝集の数を第４表及び
第５表に併記した。

【００９１】比較例２実施例１（１）で得られたシリカ粒子にヒドロキシプロ
ピルセルロース（以下、ＨＰＣともいう）を１０重量％
濃度になるように添加し撹拌しながら４５℃に保温し、
４時間吸着した。吸着後遠心分離を６回繰り返し、未吸
着のＨＰＣを除去し、１０重量％濃度になるように蒸留
水に分散した。この分散液１００ｍｌを撹拌機付きガラ
ス製フラスコに取り、７０℃に加温し、窒素置換後、ス
チレン９６ミリモルと過硫酸カリウム２．９ミリモル／
ｌを加え１６時間重合した。重合後、実施例１（２）と
同様に精製し、複合重合体粒子を得た。得られた複合重
合体粒子の分散値は５６％，粒子径は２．６５μｍ，単
粒子性は４２．３％であった。

【００９２】この複合重合体粒子に実施例２４と同様に
熱変性ヒトＩｇＧを固定化し、抗原抗体反応による凝集
像を判定したところ９６穴すべてが非特異凝集となっ
た。また、実施例３４と同様にＡＦＰ抗体を固定化した
ところ、９６穴すべてが非特異凝集であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】無機化合物粒子及び複合重合体粒子の単粒子
性を示す。

【図２】複合重合体粒子の単粒子性を示す。

【図３】実施例１で得られた無機化合物粒子の電子顕
微鏡写真である。

【図４】実施例１で得られた複合重合体粒子の電子顕
微鏡写真である。

【図５】比較例１で得られた複合重合体粒子の電子顕
微鏡写真である。

【図６】（Ａ）及び（Ｂ）は実施例１４で得られた複
合重合体粒子の光電子分光装置による測定結果を示す。

【図７】実施例２４で得られた診断用試薬の凝集像を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ 6807−4ＢＧ０１Ｎ 33/545 Ｚ 9015−2Ｊ 33/551 9015−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】無機化合物粒子が、個々に独立して重合
体層で被覆されてなり、単粒子性が８０％以上であり、
且つ平均粒径が０．５〜１０μｍであることを特徴とす
る複合重合体粒子。