JPH04218772A - 診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗原−抗体反応を利用す
る新しい診断用試薬を提供するものである。

【０００２】

【従来技術】抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査に
おいて、凝集反応は沈降反応、補体結合反応と共に、あ
るいはこれらに比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として
利用されている。そして、凝集反応は、遊離細胞や細菌
膜表面に局在する抗原を検出する反応と共に、抗原精製
技術の進歩により特異性の高い抗血清が得られることに
よって、特異性の高い抗体を血球粒子、ベントナイト粒
子、カオリン粒子、ラテックス粒子などの粒子担体に固
定させておき、対応する抗原を凝集反応によって検査す
るなど、臨床検査における応用範囲が著しく拡大してい
る。

【０００３】免疫学的凝集反応用としての担体は種々の
ものが公知で、該担体を使用した種々の診断用試薬が知
られている。これらを大別すると免疫活性物質を物理的
に吸着した診断用試薬と免疫活性物質を共有結合で結合
させた診断用試薬になる。これらの試薬にはそれぞれ一
長一短があり現在なお完全に満足出来る診断用試薬は存
在しない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかも近年、抗原の精
製技術の進歩、特異性の高い抗体の開発、更には定量分
析の発展と共に免疫学的凝集反応は鋭敏性と迅速性が増
加し、非特異的凝集反応が起こらない、しかもより保存
安定性に優れた等の性状を有する診断用試薬の開発が要
望されている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は免疫学的凝
集反応の鋭敏性に優れると共に、非特異的凝集反応が低
くかつ保存安定性の優れた診断用試薬について鋭意研究
を重ねて来た結果、エポキシ基を表面に有する重合体粒
子の該エポキシ基を介してヒドロキシル基を有する有機
化合物が結合されており且つ該重合体表面に免疫活性物
質が固定化されてなる試薬が前記要望を満す優れた効果
をもたらすことを見い出した。

【０００６】即ち本発明はエポキシ基を表面に有する重
合体粒子の該エポキシ基を介してヒドロキシル基を有機
化合物が結合されており且つ該重合体粒子表面に免疫活
性物質が固定化されてなる診断用試薬である。

【０００７】本発明で用いられるエポキシ基を表面に有
する重合体粒子は、グリシジル（メタ）アクリレートを
単独で重合することによって、或いは、グリシジル（メ
タ）アクリレートと共重合可能なビニル系単量体とを共
重合させることによって得ることができる。グリシジル
（メタ）アクリレートと共重合させるビニル系単量体の
代表的なものを挙げれば、スチレン、ビニルトルエン、
クロルメチルスチレン、クロルスチレン、塩化ビニル、
臭化ビニル、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メ
タ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、（
メタ）アクリロニトリル、酢酸ビニル等の疏水性ビニル
系単量体、また、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン
酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メ
チルプロパンスルホン酸、アクリルアミド、Ｎ−（２−
ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、２−ヒドロ
キシエチルメタアクリレート、グリセロールモノメタク
リレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート
等の水溶性ビニル系単量体などが例示される。これらの
ビニル系単量体は２種以上を混合して用いることもでき
る。さらにまた、必要に応じて、ジビニルベンゼン、エ
チレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコ
ールジメタクリレート、ビスフェノールＡジグリシジル
エーテル等の架橋性単量体も好適に使用できる。

【０００８】本発明で用いる重合体粒子のグリシジル（
メタ）アクリレートの組成は０．０５乃至１００モル％
が好適に採用される。免疫活性物質を物理的に吸着させ
た診断用試薬に該重合体粒子を用いる場合、グリシジル
（メタ）アクリレートの組成は０．０５〜２０モル％、
さらに０．１〜１５モル％であることが好ましい。 また、免疫活性物質を共有結合で結合させた診断用試薬
に用いる場合には、１０〜１００モル％、さらに３０〜
９９モル％であることが好ましい。このような組成とす
ることによって、表面のエポキシ基の濃度が前者で０．
００１〜０．４モル％、後者で０．２〜２モル％である
重合体粒子を得るとこができる。

【０００９】本発明で用いられるエポキシ基を表面に有
する重合体粒子を得るための製造方法は特に限定されず
、公知の製造方法が好適に採用される。例えば、アニオ
ン性界面活性剤、非イオン系界面活性剤の存在下に水媒
体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて乳化重合する方法
、界面活性剤を使わずに水媒体中で水溶性ラジカル開始
剤を用いて不均一重合する方法、部分鹸化ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン等の保護コロイドの存
在下に懸濁重合する方法、ビニル系単量体は溶解するが
重合体は溶解しない有機溶媒中で沈澱重合する方法等が
採用される。

【００１０】本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径
は特に限定されないが、一般には０．０５乃至１０ミク
ロンの範囲内にあるのが好ましい。該粒子径が０．０５
ミクロン以下では微弱な免疫学的凝集反応と計測するこ
とが困難になる場合がある。また粒子径が１０ミクロン
以上になると鋭敏性が低下するだけでなく、分散安定性
、保存安定性が悪くなる場合がある。さらにまた、該重
合体粒子の粒子径の標準偏差は小さいことが望ましい。

【００１１】本発明において重合体粒子にエポキシ基を
介してヒドロキシル基を有する有機化合物を結合させる
方法は特に制限されず公知の方法が採用出来る。一般に
は、エポキシ基と反応する官能基とヒドロキシル基とを
有する有機化合物を反応させることによって結合させれ
ばよい。また該有機化合物は、上記の官能基を有する公
知の有機化合物が何ら制限なく採用される。エポキシ基
と反応する官能基としては、カルボキシル基、アミノ基
、メルカプト基、アミド基等が挙げられる。就中、エポ
キシ基と容易に付加反応するアミノ基又はメルカプト基
が好ましい。また、エポキシ基と反応する官能基とヒド
ロキシル基との間の炭素原子数は２〜３０好ましくは、
３〜１０であることが得られる重合体粒子の分散安定性
が向上するために好ましい。さらに、またヒドロキシル
基を複数個有する有機化合物は、上記と同様に得られる
重合体粒子の分散安定性が向上するために好ましい。ま
た、これらの有機化合物の中で、水溶性の有機化合物が
重合体粒子の安定化作用に特に有効であり、好ましく採
用される。

【００１２】本発明に於いて好適に使用される前記有機
化合物の代表的なものを例示すると次のとおりである。 例えば、グロン酸等のヒドロキシカルボン酸類；セリン
、トレオニン等のヒドロキシアミノ酸類；Ｎ−（２−ヒ
ドロキシエチル）ラクタミド、ラクタミド、Ｄ−パンセ
ノール等のヒドロキシアミド類；２−メルカプトエタノ
ール、２−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプ
ロパノール、４−メルカプトブタノール、３−メルカプ
ト−１，２−プロパンジオール、メルカプトペンタエリ
スリトール、パントテニル・ミステイン等のヒドロキシ
メルカプタン類；エタノールアミン、プロパノールアミ
ン、ジエタノールアミン、２−アミノ−２−エチル−１
，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１
，３−プロパンジオール、３−アミノ−１，２−プロパ
ンジオール、ジグリコールアミン、トリス（ヒドロキシ
エチル）アハノメタン、ジイソプロパノールアミン、グ
ルコサミン、ガラクトサミン、ＤＬ−イソセリン、Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパ
ンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
グリシン等のヒドロキシアミン類等の有機化合物をあげ
ることができる。更に好ましくは、エポキシ基と容易に
付加反応するヒドロキシメルカプタン類又はヒドロキシ
アミン類の有機化合物が重合体粒子との反応で苛酷反応
条件を必要としないので好適に採用される。

【００１３】本発明において、エポキシ基を表面に有す
る重合体粒子（以下単に重合体粒子という）と分子中に
エポキシ基と反応する官能基とヒドロキシル基とを有す
る有機化合物（以下単に有機化合物という）の反応は、
重合体粒子表面の特定量のエポキシ基は反応させるに必
要な量の有機化合物及び重合体粒子を水媒体中、エポキ
シ基に不活性な緩衝液中、あるいは、エポキシ基と反応
性の極めて乏しくかつ重合体粒子を溶解させない有機溶
媒中で混合すればよい。有機溶媒としてはメタノール、
エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸メチル
、酢酸エチルあるいはこれらの混合溶媒等の水と親和性
の大きい有機溶媒が好ましい。反応温度は重合体粒子の
分子構造やエポキシ基濃度、有機化合物のエポキシ基と
反応する官能基の種類、及び反応媒体によって異なるが
、一般的には、４℃乃至１００℃、好ましくは４℃乃至
６０℃が好適に採用される。反応媒体に有機溶媒を用い
る場合には重合体粒子を溶解させない処理温度を選ぶこ
とが重要である。

【００１４】前記の反応における重合体粒子の濃度は、
反応中に重合体粒子が非特異的に凝集しないように選択
すればよく、一般的には０．０１乃至２０％の範囲にあ
ることが好ましく、更に０．０５乃至１０％の範囲にあ
ることがより好ましい。また、有機化合物の濃度は、重
合体粒子の表面のエポキシ基濃度、反応すべきエポキシ
基濃度、及び反応条件によって異なるが、一般的には重
合体粒子の表面のエポキシ基濃度に対して、モル比で０
．５〜２００の範囲で選択される。免疫活性物質を物理
的に吸着させた診断用試薬に上記重合体粒子を用いる場
合は、有機化合物の濃度は重合体粒子の表面のエポキシ
基濃度に対してモル比で１〜２００の範囲とすることが
好ましい。また、免疫活性物質を共有結合によって結合
させた診断用試薬に用いる場合は、モル比で０．５〜２
５の範囲とすることが好ましい。

【００１５】前記の反応における反応時間は、重合体粒
子のエポキシ基濃度、有機化合物の濃度及びエポキシ基
との反応性、反応温度によって異なるので特に限定的で
ないが、一般に１０分乃至１００時間が好ましく、更に
は３０分乃至５０時間がより好ましく採用される。

【００１６】前記の反応における重合体粒子と有機化合
物の混合方法は、特に限定的でない。一般的には、重合
体粒子の懸濁媒体中へ有機化合物の水又は有機溶媒の希
釈溶液を一括に添加する方法もしくは滴々添加する方法
、あるいは有機化合物の反応媒体中へ重合体粒子の水又
は有機溶媒の希釈懸濁液を一括に添加する方法もしくは
滴々添加する方法が好ましくは採用される。

【００１７】前記方法により得られた重合体粒子は親水
性重合体粒子（重合体粒子にエポキシ基を介してヒドロ
キシル基を有する有機化合物が結合されている重合体粒
子を以下単に親水性重合体粒子とも呼ぶ）である。体内
での各種細胞、組織による貧食作用の観察用粒子、及び
酵素、蛋白質あるいは免疫活性物質の固定化用粒子等に
応用でき、特に免疫活性物質を吸着法もしくは共有結合
法で固定化した診断用試薬は免疫学的凝集反応性が大き
いだけでなく、分散安定性と保存安定性に優れる特徴が
ある。上記の方法で得られた親水性重合体粒子は免疫活
性物質を吸着法もしくは共有結合法によって固定化する
ことにより診断用試薬となる。

【００１８】該免疫活性物質としては、特に限定的でな
く公知のものが使用出来る。代表的なものを例示すれば
、例えば、変性ガンマグロブリン、抗核因子、ヒトアル
ブミン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリンＧ（
ＩｇＧ）抗ヒトＩｇＧ抗体、イムノグロブリンＡ（Ｉｇ
Ｇ）、抗ヒトＩｇＡ抗体、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ
）、抗ヒトＩｇＭ抗体、ストレブトリジンＯ、ストレブ
トキナーゼ、ヒアルロンダーゼ、抗ストレプトリジンＯ
抗体、Ｃ−反応性蛋白、抗Ｃ−反応性蛋白抗体、アルフ
ァーフェトプロティン（ＡＦＰ）、抗ＡＦＰ抗体、癌胎
児性抗原（ＣＥＡ）、抗ＣＥＡ抗体、ヒト繊毛性ゴナド
トロピン（ＨＣＧ）、抗ＨＣＧ抗体、抗エストロゲン抗
体、抗インシュリン抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）
、抗ＨＢｓ抗体、梅毒トレポネマ抗原、風疹抗原、イン
フルエンザ抗原、補体成分Ｃ１　ｑ、抗Ｃ１　ｑ抗体、
抗Ｃ３　ｑ抗体、等の公知の免疫活性物質をあげること
ができる。

【００１９】本発明で固定化される該免疫活性物質の量
は、各検査項目に適している割合で親水性重合体粒子に
固定化させればよく、一概に限定されない。一般には、
該免疫活性物質の量が多い程、診断用試薬の鋭敏性が上
がるため、鋭敏性を要求する場合には、前記の親水性重
合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質を吸着させること
が好ましい。

【００２０】前記方法により得られた親水性重合体粒子
は免疫活性物質の固定化能力と親水性のバランスが極め
て良く調節されているので、抗原又は抗体と親水性重合
体粒子を緩衝液又は生理食塩水などの水媒体中で混合し
、抗原又は抗体が化学的に変化しないように、そしてそ
れらの免疫学的性質を保持させるように、非常に温和な
条件下に抗原又は抗体を親水性重合体粒子表面に固定化
させることができるだけでなく、該媒体中で極めて安定
性が高い特徴がある。親水性重合体粒子表面に固定化さ
れた免疫活性物質の量は、重合体粒子の蛋白結合部位を
飽和又はブロックされるように選ぶことが好ましいが、
残存する蛋白結合部位を免疫学的に不活性な適当な物質
でブロック又は不活性化させることができる。

【００２１】

【発明の効果】本発明の診断用試薬は、分散安定性と保
存安定性が著しく優れている。特に、電解質を多量に含
む緩衝液中で十分安定であるため、免疫活性物質の固定
は電解質を含む緩衝液中で行なえる。従って、上記の診
断用試薬は被検体液と混合時に非特異的凝集を防止でき
るという特徴をも有している。しかも免疫学的凝集反応
の鋭敏性も良好である特徴を有する。

【００２２】本発明により得られた診断用試薬がこのよ
うな優れた性質を有する理由は明らかでないが、本発明
者等は次のように推測している。エポキシ基を有する重
合体粒子とヒドロキシル基を有する有機化合物とを反応
させることにより、ヒドロキシル基を親水性重合体粒子
の表面から遠ざけることが可能になるので免疫学的活性
物質を固定化した親水性重合体粒子のコロイド学的安定
性が高まると推定される。また、抗体を共有結合法で重
合体粒子に固定化した場合、抗体のＦａｂ部分の先端に
存在する抗原認識部位は重合体粒子表面と反対の方向を
向くことが望ましい。本発明の試薬では、親水性重合体
粒子表面から離れた位置にあるヒドロキシル基あるいは
またヒドロキシル基を有する有機化合物が立体障害とな
るために、共有結合で固定化した抗体のＦａｂの抗原認
識部位が親水性重合体粒子の表面に向くことが阻害され
易くなる。そのため、抗体を共有結合で固定化した免疫
学的診断用試薬の性能が長期間保持されると推定される
。さらに、有機化合物として複数個のヒドロキシル基を
有するものを用いた場合には、上記の有機化合物と親水
性重合体粒子の持つエポキシ基とが反応してヒドロキシ
ル基が生成するだけでなく、有機化合物の持つヒドロキ
シル基によって親水性が付与され、親水性重合体粒子の
分散安定性と保存安定性が増加すると推定される。ヒド
ロキシル基濃度が増加すると重合体粒子の分散安定性と
保存安定性が増加すると考えられる。重合体粒子のヒド
ロキシル基濃度を増加させるために重合体粒子の重合の
段階でヒドロキシル基を有するモノマーを多量に使用す
ることが考えられるが、この方法は、免疫活性物質を共
有結合活性点が減少したり、また免疫活性物質を吸着固
定化するに有効な疏水性表面が減少するために、免疫学
的凝集反応の鋭敏性が低下する欠点が生じる。しかしな
がら、本発明の試薬はこれらの免疫活性物質の共有結合
活性点濃度もしくは吸着固定化する疏水性表面積を減少
させることなく、親水性のヒドロキシル基濃度を増加さ
せることが可能になるので、免疫学的診断用試薬の鋭敏
性を損うことなく、分散安定性と保存安定性が高まると
考えられる。

【００２３】

【実施例】以下に本発明をさらに具体的に説明するため
に、実施例及び比較例を掲げるが、本発明はこれらの実
施例に限定されるものではない。 実施例１〜９及び比較例１〜２ （１）重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃ加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、撹拌下に過硫酸カリウムを５．０ミリモル／ｌ濃度
によるように添加した。次いでジ−２−エチルヘキシル
スルホコハク酸１．５ｇを乳化剤として添加した後、７
０℃に加温したグリシジルメタクリレート３０ミリモル
とスチレン１００ミリモルの混合物を添加して１時間重
合を行なった。その後スチレン２．６モルを定量ポンプ
で滴々添加してから７０℃で２９時間撹拌下に重合した
。重合後、室温まで冷却してから、得られた重合体粒子
を濾紙（Ｎｏ．２）で濾別して大きな凝集体を除いた。 次いで透析を行なった後に、遠心分離、蒸留水への再分
散の操作を繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イオン操
作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって重合体粒子
を精製した。得られた重合体粒子の粒子径は０．２３７
μｍであった。

【００２４】（２）親水性重合体粒子の調製得られた重
合体粒子を２％濃度で蒸留水に分散した懸濁液１００ｍ
ｌと、有機化合物の水溶液もしくはメタノール溶液を表
１に示す添加割合で混合し、表１に示す温度で所定時間
反応した。反応後、親水性重合体粒子を濾紙（Ｎｏ．２
）で濾別した後に、遠心分離、蒸留水への再分散の操作
を３回繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を
行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって親水性重合体粒
子を得た。かくして得られた親水性重合体粒子を微量窒
素分析計及び微量硫黄分析計を利用して反応した有機化
合物の反応量を分析した。その結果を表１に示す。

【００２５】（３）ヒトＩｇＧを固定化した試薬の調製
（２）で得られた本発明の親水性重合体粒子を固型分濃
度１％でグリシン緩衝液に分散した。本発明に於いてグ
リシン緩衝液とはグリシン０．０５モル及び食塩０．０
５モルを水１リットルに溶解し、次いで２規定水酸化ナ
トリウム水溶液でｐＨを８．２に調製し、さらにアジ化
ナトリウムを１ｇ添加したものである。実施例に於いて
ヒトＩｇＧは、ヒト血清を飽和硫安で塩析し、さらに透
析を行ない精製したものを用いた。ヒトＩｇＧをグリシ
ン緩衝液により希釈し１ｍｇ／ｍｌに調整する。次いで
倍数希釈法によりヒトＩｇＧをグリシン緩衝液により希
釈してヒトＩｇＧ希釈液を調製する。１％濃度の親水性
重合体粒子分散液１容にヒトＩｇＧ希釈液１容を加え撹
拌し、室温下２時間放置する。次いでウシ血清アルブミ
ンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち１夜放
置してヒトＩｇＧを固定化した試薬を得た。次いで遠心
分離、グリシン緩衝液への再分散の操作を繰り返すこと
によりヒトＩｇＧを固定化した試薬を洗浄した。さらに
遠心分離した後、ヒトＩｇＧを固定化した試薬をウシ血
清アルブミンを０．１％の濃度で添加したグリシン緩衝
液に再分散し固型分濃度を０．５％に調整し、４℃に保
ち保存した。

【００２６】（４）抗原・抗体反応 ヒトＩｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒトＩｇＧウサギ
全血清を６０℃，３０分非動化処理を行なった。この血
清を以下抗ヒトＩｇＧウサギ血清と呼ぶ。抗ヒトＩｇＧ
ウサギ血清をグリシン緩衝液で２０倍に希釈したものを
原液とし、倍数希釈法により抗ヒトＩｇＧウサギ血清を
グリシン緩衝液で希釈して抗ヒトＩｇＧウサギ血清希釈
液を調製する。抗原・抗体反応を行なうためにガラス製
１０穴のホールグラスを用意し、グリシン緩衝液で希釈
した抗ヒトＩｇＧウサギ血清を各ホールに０．０４ｍｌ
加える。次いでヒトＩｇＧを固定化した試薬のグリシン
緩衝液分散液を各ホールに０．０４ｍｌ加える。この後
直ちに平沢製作所製テーハー式撹拌機によりホールグラ
スを１分間に１２０回転の速度で水平回転し撹拌を行な
う。抗原・抗体反応により試薬の凝集が認められるまで
に要する時間、すなわち凝集像出現時間及び所定時間撹
拌後の試薬の凝集の有無から、ヒトＩｇＧを固定化した
試薬の特性である鋭敏性を評価した。ホールグラスを用
いた実施例１の試薬の凝集試験の結果を図１に示す。図
１は１０分間の撹拌後の凝集状態を示す。凝集が全く認
められない場合（−）、凝集の有無が判定しがたい場合
（±）、明らかに凝集が認められる場合、凝集の強い順
に　＋＋＋、＋＋、＋と判定した。図中Ｃは抗原もしく
は抗体を全く含まないことを示す。凝集試験の結果、明
らかに凝集の認められたホールに於ける抗ヒトＩｇＧウ
サギ血清希釈剤の最高希釈倍数をもって、重合体粒子の
鋭敏性を評価した。

【００２７】親水性重合体粒子の特性として、さらに親
水性重合体粒子の分散安定性を評価した。すなわち、親
水性重合体粒子にヒトＩｇＧ希釈液を加え室温で２時間
放置した後の親水性重合体粒子の分散状態をもって親水
性重合体粒子のヒトＩｇＧ固定化時の分散安定性を評価
した。又ヒトＩｇＧ固定化後３ケ月経過した後の試薬の
分散状態をもってヒトＩｇＧを固定化した試薬の保存中
の分散安定性を評価した。

【００２８】さらにまた、親水性重合体粒子の特性とし
て、電解質を含んだ緩衝液中での親水性重合体粒子の分
散安定性を評価した。即ち、親水性重合体粒子をイオン
交換水に１％濃度になるように調製した後、ＮａＣｌ濃
度が０．１０モル／ｌ及び０．１５モル／ｌのグリシン
緩衝液１ｍｌに４０μｌ添加して充分に混合してから室
温で３日間静置して分散安定性を調べた。その結果を表
１に示す。

【００２９】なお、比較例１として、（１）で得られた
精製重合体粒子を濃硫酸でｐＨ２．０に調節した酸性水
媒体に１％濃度で分散させ、室温で１週間処理し、重合
体粒子のエポキシ基を加水分解してジヒドロキシル基に
変換した。次いで濾紙（Ｎｏ．２）で濾別した後透析を
行なった。その後遠心分離、蒸留水への再分散の操作を
繰り返した後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行な
い、更に遠心分離と洗浄を行なって重合体粒子を精製し
た。得られた重合体粒子を実施例１と同様の操作で性能
を調べた。その結果を表１に示す。また、ポリスチレン
ラテックスとしてダウ社０．４９７μｍのラテックスを
実施例１と同様の操作で性能を調べた結果を、比較例２
として表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】実施例１０と比較例３ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃ加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／ｌ濃度になる
ように添加した。次いで７０℃に加温したグリシジルメ
タアクリレート２１０ミリモル及びスチレン１００ミリ
モルの混合物を添加して７０℃で１時間撹拌下に重合し
た。その後スチレン２．５モルを定量ポンプで滴々添加
してから、７０℃で２９時間撹拌下に重合した。その後
の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得られた重
合体粒子の粒子径は０．３４５μｍであった。この重合
体粒子を蒸留水１００ｍｌに１％濃度になるように調製
し、グルコサミン０．８ｍｍｏｌｅを加えた。その後ｐ
Ｈを８．０に調製し、室温で４８時間反応した。反応後
は実施例１と同様の操作を行なって親水性重合体粒子を
得た。得られた親水性重合体粒子を実施例１と同様の操
作でヒトＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサ
ギ血清との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏
性は１日後×１２８０、３ケ月後×２５６０、また分散
安定性は１日後２本、３ケ月後３本の非特異的凝集反応
が認められた。さらに実施例１と同様のＮａＣｌ濃度が
０．１０モル／ｌ及び０．１５モル／ｌのグリシン緩衝
液中での分散安定性は、いずれも１の評価であった。

【００３２】尚比較例３として、上記で得られた重合体
粒子を水蒸気蒸留を３時間行なって重合体粒子上のエポ
キシ基を加水分解してジヒドロキシルに変換した。次い
で重合体粒子を濾紙（Ｎｏ．２）で濾別した後に、遠心
分離、蒸留水への再分散操作を３回繰返した後に、イオ
ン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗
浄を行なってジヒドロキシル基を含有する重合体粒子を
得た。かくして得られた粒子を実施例１と同様の操作で
ヒトＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血
清との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は
１日後×１２８０、３ケ月後×１２８０、また分散安定
性は１日後３本、３ケ月後４本の非特異的凝集反応が認
められた。さらに実施例１と同様のＮａＣｌ濃度が０．
１０モル／ｌ及び０．１５モル／ｌのグリシン緩衝液中
での分散安定性は各１及び２の評価であった。

【００３３】実施例１１ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７５℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／ｌ、チオ硫
酸ナトリウム５ミリモル／ｌ、硫酸銅０．２５ミリモル
／ｌを添加した。次いで７５℃に加温したグリシジルア
クリレート１５ミリモル及びメチルメタクリレート２５
０ミリモルの混合物を添加して７５℃で３０分間撹拌下
に重合した。その後、メチルメタクリレート２，６モル
を定量ポンプで滴々添加して、更に７５℃で２時間撹拌
下に重合した。その後の操作は実施例１と同様の操作を
行なった。得られた重合体粒子の粒子径は０．２０８μ
ｍであった。この重合体粒子を蒸留水１００ｍｌに１％
濃度になるように調製１、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン１００μｍｏｌｅを加えた。その後、ｐＨ
９．０に調製し、室温で４８時間反応した。反応後は実
施例１と同様の操作を行なって親水性重合体粒子を得た
。得られた親水性重合体粒子を実施例１と同様の操作で
ヒトＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血
清との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は
１日後×１２８０、３ケ月後×１２８０、また分散安定
性は１日後１本、３ケ月後３本の非特異的凝集反応が認
められた。さらに実施例１と同様のＮａＣｌ濃度が０．
１０モル／ｌ及び０．１５モル／ｌのグリシン緩衝液中
での分散安定性は、いずれも１の評価であった。

【００３４】実施例１２と比較例４ 熱変性ヒトＩｇＧの固定化 ｐＨ８．２に調製したグリシン緩衝液に実施例３で用い
た親水性重合体粒子を０．５％になるように分散させた
。次いで６０℃で１０分間加熱処理したヒトＩｇＧをグ
リシン緩衝液により希釈し１ｍｇ／ｍｌに調整した。 ０．５％濃度の親水性重合体粒子分散液１容に熱変性し
たヒトＩｇＧ希釈液１容を加え、撹拌し、室温下２時間
放置した。その後ウシ血清アルブミンを１％の濃度にな
るように添加し、４℃に保ち１夜放置して熱変性ヒトＩ
ｇＧを固定化した試薬を得た。次いで遠心分離、グリシ
ン緩衝液への再分散の操作を繰返して洗浄した後、熱変
性ヒトＩｇＧを固定化した試薬をウシ血清アルブミンを
０．１％の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散し、
固型分濃度を０．５％に調整した。

【００３５】リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール血清をグ
リシン緩衝液で２０倍に希釈したものを原液として、実
施例１と同様にしてガラス製１０穴のホールグラスにグ
リシン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清を各
ホールに０．０４ｍｌを加え、次いで熱変性ヒトＩｇＧ
を固定化した親水性重合体粒子をグリシン緩衝液で希釈
した分散液を各ホールに０．０４ｍｌ加えて実施例１と
同様の操作で鋭敏性及び分散安定性を調べた。その結果
、鋭敏性は１日後×１２８０、３ケ月後×１２８０、で
あり、分散安定性は１日後及び３ケ月後に共に非特異凝
集反応は認められなかった。尚、比較例４として比較例
１で用いた重合体粒子を用いて上記と同様の操作でテス
トすると、鋭敏性は１日後×１２８０、３ケ月後は非特
異凝集のため評価できなかった。

【００３６】実施例１３ アルファ−フェトプロティンの抗体の固定化ｐＨ８．２
に調製したグリシン緩衝液に実施例１で用意した親水性
重合体粒子を１．０％になるように分散させた。次いで
家兎の産生したアルファ−フェトプロティン（以下α−
ＦＰと略す）の抗体をアフィニティ−クロマトグラフィ
ーにより精製して得た精製α−ＦＰ抗体を、グリシン緩
衝液で５００μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。 親水性重合体粒子分散液１容と精製α−ＦＰ抗体の希釈
液１容とを加え、撹拌し、室温下２時間放置した。その
後ウシ血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し
、４℃に保ち１夜放置してα−ＦＰ抗体を固定化した試
薬を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散
の操作を繰り返して洗浄した後、α−ＦＰ抗体を固定化
した試薬をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加
したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃度を０．５％
に調整した。

【００３７】アルファ−フェトプロティンの測定検体と
してヒト血清中のα−ＦＰの濃度が１０００μｇ／ｍｌ
であるものを原液とし、グリシン緩衝液で１０倍ごとの
希釈系列を調製した。実施例１と同様にして、ガラス製
１０穴のホールグラスにグリシン緩衝液で希釈したα−
ＦＰを各ホールに０．０４ｍｌ加え、次いでα−ＦＰ抗
体を固定化した試薬の分散液を各ホールに０．０４ｍｌ
加えて、実施例１と同様の操作で鋭敏性、分散安定性を
調べた。その結果、鋭敏性は１日後１０μｇ／ｍｌ、３
ケ月後１０μｇ／ｍｌであった。分散安定性は１日後及
び３ケ月後共に非特異凝集反応は全く認められなかった
。

【００３８】実施例１４と比較例５ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウム４ミリモル／ｌチオ硫酸
ナトリウム２ミリモル／ｌ、及び硫酸銅、０．２ミリモ
ル／ｌを添加した。次いで７０℃に加温したグリシジル
メタクリレート１．５モル及びスチレン０．５モルの混
合物を添加して７０℃で６時間重合した。その後の操作
は実施例１と同様の操作を行なった。得られた重合体粒
子の粒子径は０．３０４μｍであった。

【００３９】得られた重合体粒子を蒸留水１００ｍｌに
１％濃度になるように調製し、ジエタノールアミン１０
μｍｏｌｅを加えてからｐＨ９．５に調製後、室温で４
時間反応した。反応後は実施例１と同様の操作を行なっ
て親水性重合体粒子を得た。かくして得られた親水性重
合体粒子をｐＨ７．５に調製し、水蒸気蒸留を行なって
、残存するエポキシ基をジヒドロキシル基に変換した。 次いで蒸留水１００ｍｌに０．８％濃度になるように再
分散してからＨ２　ＳＯ４　でｐＨ＝３．０に調製した
。その後ＮａＩＯ４　９ｍｍｏｌｅを加えて４０℃で１
８時間反応して、ジヒドロキシル基をアルデヒド基に変
換した。得られたアルデヒド基含有親水性重合体粒子を
濾紙（Ｎｏ．２）で濾別した後に、遠心分離、蒸留水へ
の再分散の操作を６回繰返した。その後イオン交換樹脂
で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なっ
て精製した。かくして得られたアルデヒド基含有親水性
重合体粒子を緩衝液をグリシン緩衝液から０．１０モル
のホウ酸−ホウ砂とＮａＣｌ　　０．０５モルを蒸留水
１リットルに溶解したｐＨ＝８．２に調製したホウ酸緩
衝液に変えたことと、ウシ血清アルブミンを全工程で添
加しなかったこと以外は全て実施例１と同様の操作でヒ
トＩｇＧを固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原
・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏製は１日後×２
５６０、３ケ月後×２５６０、また分散安定性は１日後
２本、３ケ月後４本の非特異的凝集反応が認められた。

【００４０】尚、比較例５として、本発明のジエタノー
ルアミンと重合体粒子のエポキシ基の反応を行なわずに
上記と同様の操作を行なった。その結果、ヒトＩｇＧを
固定化していないものまで非特異的凝集反応がみられた
ために正確な鋭敏性が判定できなかった。また、分散安
定性は１日後７本、３ケ月後１０本の非特異的凝集反応
が認められた。

【００４１】実施例１５と比較例６ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウム５．０ミリモル／ｌ、チ
オ硫酸ナトリウム５ミリモル／ｌ、及び硫酸銅０．２５
ミリモル／ｌを添加した。次いで７０℃に加温したグリ
シジルメタクリレート２．０モル及びエチレングリコー
ルジメタクリレート３０ミリモルの混合物を添加して７
０℃で２時間重合した。その後の操作は実施例１と同様
の操作を行なった。得られた重合体粒子の粒子径は０．
２６１μｍであった。

【００４２】得られた重合体粒子を蒸留水１００ｍｌに
２％濃度になるように調製し、Ｎ−トリス（ヒドロキシ
メチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸８μｍ
ｏｌｅを加えてからｐＨ９．０に調製した後、３７℃で
６時間反応した。反応後は実施例１と同様の操作を行な
って親水性重合体粒子を得た。かくして得られた親水性
重合体粒子をｐＨ７．５に調製し、水蒸気蒸留を行なっ
て残存するエポキシ基をジヒドロキシル基に変換した。 次いで蒸留水１００ｍｌに１．６％濃度になるように調
製し、予めＣＨ３　ＣＯＯＨ２０ミリモルとＮａＩＯ４
　２０ミリモルを溶解した水溶液１００ｍｌを加えて４
０℃で２０時間反応して、ジヒドロキシル基をアルデヒ
ド基に変換した。得られたアルデヒド基含有親水性重合
体粒子を濾紙（Ｎｏ．２）で濾別した後に、遠心分離、
蒸留水への再分散の操作を６回繰返した。その後、イオ
ン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗
浄を行なって精製した。かくして得られたアルデヒド基
含有親水性重合体粒子を緩衝液をグリシン緩衝液から０
．１０モルのホウ酸−ホウ砂とＮａＣｌ　　０．０５モ
ルを蒸留水１リットルに溶解したｐＨ＝８．２に調製し
たホウ酸緩衝液に変えたことと、ウシ血清アルブミンを
全工程で添加しなかった以外は全て実施例１と同様の操
作でヒトＩｇＧを固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清と
の抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１日
後×２５６０、３ケ月後×２５６０、また分散安定性１
日後１本、３ケ月後３本の非特異的凝集反応が認められ
た。

【００４３】尚、比較例６として、本発明のＮ−トリス
（ヒドロキシエチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸と重合体粒子のエポキシ基の反応を行なわずに上
記実施例と同様の操作を行なった。その結果、ヒトＩｇ
Ｇを固定化していないものまで非特異的凝集反応がみら
れたために正確な鋭敏性が判定できなかった。また、分
散安定性は１日後３本、３ケ月後に７本の非特異的凝集
反応が認められた。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた親水性重合体粒子を用いた
診断容試薬の凝集状態を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　エポキシ基を表面に有する重合体粒子
   の該エポキシ基を介してヒドロキシル基を有する有機化
   合物が結合されており且つ該重合体粒子表面に免疫活性
   物質が固定化されてなる診断用試薬。