JPS60235061A - 診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的診断用試薬に関する。更に詳しくけ、
鋭敏性、安定性、迅速性のすぐれた免疫学的篩［所用試
薬を提供するものである。

抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応、補体結合反応と共に、あるいはこれら
に比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてし
る。そして、遊離細胞や細菌膜表面に局在する抗原を検
出する反応と共に、抗原精製技術の進歩により特異性の
高い抗血清が得られることＫよって、特異性の高い抗体
を血球粒子、ベントナイト粒子、カオリン粒子、ラテッ
クス粒子などの粒子担体に固定させておき、対応する抗
原を凝集反応によって検査するなど、臨床検査における
凝集反応の応用範囲が著しく拡大している。

免疫学的凝集反応用としての担体は種々のものが公知で
、該担体を使用した種々の診断用試薬が知られている。

例えば、特開昭５７−１３５８０１号公報には、スチレ
ン−グリシジルメタクリレート共重合ラテックス粒子に
免疫活性物質を共重合させて診断用試薬を得る方法が提
供されている。しかしながら、この方法により得られた
診断用試薬は、抗原抗体反応性が低−という欠点がある
。また、凝集反応は、一般に電解質を含んだ体液（例え
ば、血清又は尿）と診断用試薬とを混合して行なわれる
。この混合の際の診断用試薬の非特異的凝集を避けるた
め１診断用試薬を得るにあたって、担体への免疫活性物
質の固定は電解質を含んだ緩衝液中で行なわれる。従っ
て、担体は電解質を含んだ緩衝液中で安定でなければな
らない。

しかしながら、上記の共重合ラテックス粒子は、電解質
を含んだ緩衝液中での分散安定性が極めて悪いという欠
点を有している。

しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の高い抗体
の開発、更には定量分析の発展と共に免疫学的凝集反応
は鋭敏性と迅速性が増加し、非特異的凝集反応が起こら
ない、しかもより保存安定性に優れた等の性状を有する
診断用試薬の開発が要望されている。

本発明者等はかかる要望を満たすべく鋭意研究を重ねて
来た結果、特定の組成の重合体粒子で、しかも特定組成
比のものが免疫活性物質を吸着しているとき、前記要望
を満すだけでなく著しくすぐれた効果をもたらすことを
見出した。更に研究を重ねた結果、本願発明を完成し、
ここに提案するに至った。

１ 即ち、本発明は、一般式−−Ｆ：　ＣＨ２−Ｃ÷２ （但し、Ｒ１は水素原子又はアルキル基で、Ｒ２は疎水
基である。）で示される構造単位と、Ｒ゛ Ｒは水素原子又はアルキル基である）で示されるジヒド
ロキジル構造単位とよりなり且つ該ジヒドロキジル構造
単位が６．０モル％を超えて２０モル％以下の範囲で含
まれる重合体粒子の表面忙免疫活性物質を吸着した診断
用試薬である。

本発明で使用する重合体粒子は、 ２ （但し、Ｒ１け水素原子又はアルキル基で、Ｒ２は疎水
基である）で示される構造単位と、（但し、Ｒは水素原
子又はアルキル基である）で示されるジヒドロキジル構
造単位とよりなり、且つ該ジヒドロキジル構造単位力３
．０　モル％を超えて２０モル％以下の範囲で含まれる
、重合体粒子である。

上記一般式（Ａ）で示される構造単位のうちＲ％で示さ
れるアルキル基は特に限定されるものではないが、一般
に工業的観点から低級アルキル基、例えば炭素原子数１
〜４のメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が
好適に使用される。また一般式（Ａ）で示される構造単
位のうちＲ２け疎水基であれば特忙限定されず公知のも
のが使用出来るが、工業的に好適に使用されるものを例
示すれば、アリール基：ハロゲン化了り−ル基；ニトリ
ル基；アルキルエステル基１アルキルエーテル基；グリ
シジルエステル基：塩素、臭素、沃素、フッ素等の・・
ロゲン原子等である。更にまた前記一般式（Ｂ）で示さ
れるジヒドロキジル構造単位中、Ｒのアルキル基は前記
一般式（Ａ）式中のＲ１のアルキル基と同様なものが使
用出来る。

本発明で使用する前記一般式（Ａ）及び（Ｂ）で示され
る構造単位を有する重合体粒子は一般忙これらの構造単
位を与える単量体を共重合させることによって得ること
が出来る。例えば前記一般式（Ａ）で示される構造単位
を与える単量体の代表的なものを挙げれば、スチレン、
ビニルトルエン、α−メチルスチレン。

クロルメチルスチレン、アクリロニトリル。

塩化ビニル、メチル（メタ）アクリレート。

エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリ
レート、グリシジル（メタ）アクリレート、アルイハエ
チルビニルエーテル等である。これらの単量体は単独で
あるいは混合して用いるとよい。これらの中で、アリー
ル基、ハロゲン化了り−ル基、アルキルエステル基又は
・・ロゲン原子を有するビニル系単量体が好適に使用さ
れ、特にスチレン、ビニルトルエン、クロルメチルスチ
レン等の了り−ル基又は・・ロゲン化アリール基をもつ
ビニル系単量体の重合体は最も好適に採用される。

また本発明の前記一般式（Ｂ）を与える単量体の代表的
なものを例示すれば、グリシジルアクリｌ／−ト：グリ
シジルメタクリレート；２．３−ジオキシアクリレート
：２，５−ジオキシメタクリレート等である。上記のグ
リシジルアクリレート又はグリシジルメタクリレート等
のエポキシ基を有する単量体を使用する場合には、一般
に前記一般式（Ａ）を与える単量体と共重合した後、加
水分解する方法が採用される。加水分解の方法としては
、例えば弱酸性１弱アルカリ性条件下、あるいは８０℃
以上の加熱条件下にエポキシ基を加水分解する方法が好
適に採用される。

また本発明で用いる重合体粒子は前記（Ｂ）式で示され
る構造単位が３．０モル％を超えて２０モル％以下の範
囲の間にあることが極めて重要である。該（Ｂ）式の構
造単位が極めて少ない場合には、特に０．０５モル％よ
り少ない場合には、免疫学的凝集反応性は高まるが、免
疫活性物質を重合体粒子に吸着させる操作過程での分散
安定性が悪（なるばかりでなく、診断用試薬の保存安定
性が低下する欠点がある。逆に、該（Ｂ）式の構造単位
が２０モル％より多い場合には、免疫活性物質の該重合
体粒子への吸着による固定化が著しく低下する。

従って、保存安定性は改良されるが、免疫学的凝集反応
の鋭敏性と迅速性が極めて悪くなる。本発明における前
記（Ｂ）式で示される構造単位が重合体粒子中３，０モ
ル％を超えて２０モル％以下の範囲にあることが、疎水
基を有するビニル構造単位と相補し合って、該重合体粒
子の表面に免疫活性物質を吸着して固定化した診断用試
薬の免疫学的凝集反応の迅速性と鋭敏性を向上させるだ
けでなく、非特異的凝集反応の抑制と保存安定性を高め
る効果を同時に発揮１−でいると推定される。更に好ま
しくけ、本発明における（Ｂ）式で示される構造単位は
重合体粒子中に６．０モル％を超えて１５モル％以下の
範囲で含まれることが好適である。

本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径は特に限定さ
れな込が、一般には０．０５乃至１０ミクロンの範囲内
、好ましくは０．１乃至２ミクロンの範囲内にあるのが
好ましい。該粒子径が０．１ミクロン以下では微弱な免
疫学的凝集反応を肉眼で観察＋ろことが困難になる場合
がある。１だ粒子径が１０ミクロン以上になると分散安
定性、保存安定性が悪くなる場合がある。さらにまた、
該重合体粒子の粒子径の単分散性は小さいことが望まし
い。

本発明の重合体粒子を得るための製造方法は特に限定さ
れず公知の方法が採用される。

例えば、好適な方法を例示すれば次の（１）及び（２）
に示すと卦りである。

（１）　グリシジル（メタ）アクリレート（以後、Ｂ単
量体と呼ぶ）と疎水基を有するビニル系単量体（以後、
Ａ単量体と呼ぶ）との混合物を界面活性剤の存在下もし
くけ不存在下に水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用い
て所定時間重合を行なった（第１段目重合）後に、続す
てＡ単量体を添加して重合を継続することにより重合体
粒子を合成する（第２段目重合）。次いで該重合体粒子
のエポキシ基を加水分解する方法。

第１段目に用いるＢ単量体の添加量は、全草量休に対し
て５．０モル％を超え２０モル％以下である。また第１
段目重合に用いるＢ単量体とＡ単量体の組成比は、Ｂ単
量体の組成によって異なるが、５／９５乃至９５１５モ
ル比、より好ましくけ１０／９０乃至７０／３［］　モ
ル比を採用するとよい。

第１段目重合に添加するＡ単量体とＢ単量体の混合物の
水に対する濃度は限定的ではないが、通常水に対して０
．０５乃至３０容量％、好寸（２くは０．１乃至１０容
量％ｈ″−望ましい。

第１段目重合に用する水溶性ラジカル開始剤の種類とし
ては、過硫酸ナトＩＪウム。

過硫酸カリウム及び過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、
又は過硫酸塩とチオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム
、チオ硫酸水素ナトリウム等のチオ硫酸化合物及び銅イ
オン、鉄イオン等の分解促進剤を組み合わせたレドック
ス系触媒が好適に使用される。

水溶性ラジカル開始剤の濃度は重合温度。

単量体濃度に依存するだめに限定的でなりが、０．０５
乃至２０ミリモル／ｌの範囲が好適に採用される。−！
た、水溶性ラジカル開始剤は第１段目に全量添加しても
良く、第１段目及び第２段目に分けて添加しても良い。

第１段目重合にＢ単量体に対して０〜２０モル％の水溶
性ビニル系単量体、例えば、メタクリル酸、アクリル酸
、スチレンスルフォン酸、α−ヒドロキシエチル（メタ
）アクリレート、ビニルピロリドン、ポリエチレングリ
コール（メタ）アクリル酸エステル等を混合して使用す
ることも可能である。

界面活性剤を添加する態様と、添加しない態様が採用さ
れるが、界面活性剤を添加した場合、Ａ単量体が重合し
てできた重合体とグリシジル（メタ）アクリレートの重
合体との相溶性が大きい場合には、本発明の効果が発揮
されない場合がある。従って、重合体粒子に免疫活性物
質を吸着固定化した試薬の抗原・抗体反応性、及び分散
安定性を高めるには界面活性剤を添加しな込ことが望ま
しい。

第１段目の重合温度は４０℃乃至８５℃、より好オしく
け５０℃乃至８０℃がよい。

重合時間はＡ単量体とＢ単量体の組成と添加量によって
異なるが、一般には１０分乃至５時間、より好ましくけ
２０分乃至６時間と比較的短かい方が好適に採用される
。

第２段目重合に添加するＡ単量体の添加割合は、第１段
目重合に添加するＢ単量体の添加量及びＢ単量体とＡ単
量体の組成比によって異なるが、一般的には第１段目重
合と第２段目重合に添加する全単量体忙占める割合で６
０モル％から９６モル％、より好ましくけ７０モル％か
ら９５モル％の範囲であることが好適である。

第２段目重合にけＡ単量体成分単独で添加することが望
ましいが、Ａ単量体に対して０〜２モル％のＢ単量体も
しくは前記した水溶性ビニル系１１３体を混合して使用
することもできろ。

第２段目重合に添加するＡ単量体の添加は一定速度で逐
次添加することが好適に採用される。

第２段目重合の温度は４０℃乃至８５℃、好ましくは５
０℃乃至８０℃が好適に採用される。

第１段目重合の後に第２段月重合を継続して行なうこと
が望ましい。

エポキシ基を加水分解する方法は、前述したように、重
合体粒子を弱酸性または弱アルカリ性溶液中に浸漬する
方法、又は８０℃以上に加熱する方法が好適忙採用され
る。

（２）２．３−ジオキシ（メタ）アクリレートとＡ単量
体との混合物を界面活性剤の存在下もしくけ不存在下に
水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて所定時間、重
合を行なった（第１段目重合）後に、続いてＡ単量体を
添加して重合を継続すること九より重合体粒子を合成す
る（第２段目重合）方法。

この製造方法に於ける詳細は、前記（１）の製造方法と
同様である。

本発明の重合体粒子に物理吸着によって固定化する免疫
活性物質としては、特に限定的でな（公知のものが使用
出来る。代表的なものを例示すれば、例えば、変性ガン
マグロブリン、リウマチ因子、抗咳因子、ヒトアルブミ
ン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリンＣ）　（
Ｉ４Ｇ）　、イムノグロブリンＡ（ＩｆＡ−）。

イムノグロブリンＭ（■ｆＭ）、ストレプトリジンＯ２
抗ストレプトリジン０抗体、Ｃ−反応性蛋白、抗Ｃ−反
応性蛋白抗体、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）
、抗ＡＦＰ抗体。

癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗ＣＥＡ抗体、ヒト胎盤ラク
トゲン（ＨＰＬ）、抗］−ＴＰＬ抗体。

ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨｃＧ）、抗ＨＣＧ抗体、
抗エストロゲン抗体、抗インシュリン抗体、Ｂ型肝炎表
面抗原（ＨＢＳ）、抗ＨＢＳ抗体、梅毒トレポネーマ抗
原、風疹抗原、補体成分（・１ｑ・抗補体成分Ｃ１ｑ抗
体１等の公知の免疫活性物質をあげることができる。

本発明の重合体粒子に吸着で固定化される該免疫活性物
質の量は、各検査項目に適している割合で重合体粒子に
固定化させればよく、−概に限定されないう一般には、
該免疫活性物質の量が多い程、診断用試薬の鋭敏性及び
迅速性が上がるため、鋭敏性及び迅速性を要求する場合
には、前記の重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質を
吸着させることが好ましい。前記した重合体粒子の製造
方法（１）及び（２）により製造した重合体粒子は、免
疫活性物質の飽和吸着量が多く、例えば、ヒｈｘｙａの
飽和吸着量は、重合体粒子の単位表面積当り１．５■／
ｍ”以上の値を示す。

本発明になる重合体粒子は疎水性と親水性のバランスが
極めて良く調節されているので、該重合体粒子表面に比
較的多量の免疫活性物質を極めて容易に物理吸着法で固
定化できる特徴がある。例えば、抗原又は抗体と重合体
粒子を緩衝液又は生理食塩水などの水媒体中で混合（−
１抗原又は抗体が化学的に変化しなりように、そ１−で
それらの免疫学的性質を保持させるように、非常に温和
な灸件下に抗原又は抗体を重合体粒子表面に吸着させる
ことができる。重合体粒子表面に吸着された免疫活性物
質の量は、重合体粒子の疎水基の吸着部位を飽和又はブ
ロックされるように選ぶことが好すしいが、残存する吸
着部位を適当な物質、例えば免疫学的に不活性な牛血清
アルブミン、ゼラチン等でブロックさせることができる
。

本発明の免疫学的診断用試薬は、分散安定性と保存安定
性が著しく優れて因る。特に、診断用試薬を構成する重
合体粒子は、電解質を多量に含む緩衝液中で十分安定で
あるため、免疫活性物質の固定は電解質を含む緩衝液中
で行なえる。従って、本発明の診断用試薬は体液と混合
時に非特異的凝集を防止できるという特徴をもイ１して
いる。免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅速性も良好である
特徴を有する。

この理由は必ずしも明確でないが、ヒドロキシル基はカ
ルボキシル基、スルホン酸基等のアニオン極性基と嚢な
り、水媒体中での重合体粒子の分散安定性にｐＨ依存性
が極めて少ないこと、廿だ、免疫学的凝集反応の実施に
おいて、水の蒸発による懸濁液組広の変性がおこり、懸
濁液のイオン強度が変化しても、ジヒドロキジル基を含
有する重合体粒子はその影響を受け難いこと、さらに壕
だ、ジヒドロキジル基はヒドロキシル基が隣接する位置
にあるので、特定のジヒドロキジル基の濃度で診断用試
薬の分散安定性と保存安定性の効果が高められると推定
される。さらには、特定濃度範囲のジヒドロキジル基が
重合体粒子表面に局在化していると考乏−られ、比較的
多量のジヒドロキジル基を導入しても、重合体粒子表面
の疎水性部分の面積が大きくなり、この疎水性部分に充
分な量の免疫活性物質が吸着されて固定化できるため、
免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅速性が向上すると推定さ
れる。しかも、比較的多量のジヒドロキジル基が導入さ
れているため、診断用試薬の分散安定性と保存安定性は
優れている。

本発明で提供する診断用試薬は前記説明から或いは後述
する実施例からそのすぐれた性能が明白であるが、物理
吸着タイプの診断用試薬でかかる特性を発揮することは
驚異的なことである。例えば、前記した特開昭５７−１
３５８０１号公報の例２ではグリシジルメタクリレート
１５重量％と不予レフ８５重量％の混合物を水溶性ラジ
カル開始剤を用いて水媒体中で乳化剤の不存在下に６５
℃で６時間重合して直径０．５μｍの親水性ラテックス
粒子を得ている。この得られたラテックス粒子のエポキ
シ基を同側７に示されたように加水分解し、次いで過ヨ
ウ素酸ナトＩＪウムを加えて反応させ、アルデヒド基に
変換した。次いで該ラテックス粒子のアルデヒド基濃度
に対して５倍当量、１０倍当景、２０倍当量とヒ）１０
０濃度を変化させ、　Ｈ＝　７．４のリン酸緩衝液中で
後述する本願発明実施例１Ｅ同様の操作でヒトＴｆＧを
固定化したラテックス粒子と抗ヒトエｆＧウサギ血清と
の抗原・抗体反応を行なうと、みかけの鋭敏性は１８後
Ｘ１２８０であったが、ヒトＴｔＧを固定化していない
ラテックス粒子と抗ヒトエタＧウサギ血清の希釈液を混
合すると非特異的凝集反応がおこるために正確な鋭敏性
を評価できなかった。また、分散安定性も１日後４゜３
ケ月後２と極めて悪かった。さらに該ラテックス粒子に
ヒトＴｔＧをｐＨ＝７．４のリン酸塩緩衝液（リン酸０
．０１モに／　ｔ　、　Ｎ＆Ｃ１００１５モル／１）中
で固定化すると１日後、全て非特異的凝集が発生したの
で、全く抗原・抗体反応の凝集反応を行なえなかった。

従って、特開昭５７−１！１５８０１号公報忙記載のス
チレン−グリシジルメタクリレート共重合ラテックス粒
子に免疫活性物質を共有結合させる方法は、抗原・抗体
反応性が低いだけでなく、分散安定性が極めて悪込。特
にＮａＣＬなどの電解質を含む緩衝液中の安定性は非常
に悪い。このことは電解質を含んでいる体液成分（尿、
血清）の使用ができないということを示している。

これに対して、本発明（実施例４）の１５重量％グリシ
ジルメタクリレートを含むポリスチレンラテックス粒子
についてエポキシ基を加水分解して得た重合体粒子をｐ
Ｈ＝７．４のリン酸緩衝液を用いて本発明実施例１と同
様の抗原・抗体反応を行なうと、鋭敏性は１８後Ｘ６４
０．３ケ月後Ｘ１２８０．迅速性は１８後１００秒、３
ケ月後８０秒、及び分散安定性は１日後及び６ケ月後共
に保存中に全く非特異的凝集は認められなかった。また
該重合体粒子にヒトＩ２ＧをＴ））Ｔ＝７．４のリン酸
塩緩衝液（リン酸０．０１モル／　Ｌ　、　ＮａＣｔＯ
１１５モル／１）中で固定化させても全（非特異的凝集
反応が発生しなかった。従って、本発明で使用する重合
体粒子は電解質を多量に含む緩衝液中に於いて安定であ
るから、本発明の診断用試薬は、体液と混合時の非特異
的凝集を防止することができる。しかも、本発明の診断
用試薬は、抗原・抗体の反応性が大きいという特徴を有
する。

以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

実施例１〜４と比較例１〜６ （１）重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウムを５．０ミリモル／１＠
度になるように添加した。次いで７０℃に加温したグリ
シジルメタクリレートとスチレンの混合物を第１表に示
す割合で添加；−で、７０℃で第１表に示す如く第１段
目の重合を行なった。その後第２段目重合のスチレンを
第１表に示す割合で定量ポンプで逐次添加して所定時間
７０℃で攪拌下に重合した。重合後、室温まで冷却して
から、得られた重合体粒子を濾紙（Ｎ。

２）で濾別して大きな凝集体を除いた。更に粗す重合体
粒子を遠心分離で充分に除いた後、水蒸気蒸留を６時間
行なうことによって重合体粒子上のエポキシ基をジヒド
ロキジル基に変換した。この加熱条件で全てのエポキシ
基が加水分解してジヒドロキジル基が生成していること
が赤外吸収スペクトル及び塩酸付加法によるエポキシ基
の分析で確認された。次いで遠心分離、蒸留水への再分
散の操作を繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イオン操
作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって重合体粒子
を精製した。得られた重合体粒子の粒子径を第１表に示
す。

（２）　ヒ）ＩｐＧを固定化した重合体粒子の調製（１
）重合体粒子の調製で得られた本発明の重合体粒子を固
型分濃度１％でグリシン緩衝液に分散した。本発明に於
いてグリシン緩衝液とはグリシン０．０５モル及び食塩
０．０５モルを水１Ｌに溶解し、次いで２規定水酸化ナ
トリウム水溶液で、Ｈを８．２に調製し、さらにアジ化
ナトリウムを１２添加したものである。

本発明に於いてヒトＩｔＧは、ヒト血清を飽和硫安で塩
析し、さらに透析を行ない精製したものを用いた。

ヒトＩＩＧをグリシン緩衝液により希釈し１■／　ｍｌ
に調整する。次いで倍数希釈法によりヒトＩりＧをグリ
シン緩衝液により希釈してヒトＩｆＧ希釈液を調製する
。１％濃度の重合体粒子分散液１容にヒ）　ＩｔＧ希釈
液１容を加え攪拌し、室温下２時間放置する。次すでウ
シ血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し、４
０℃に保ち１夜放置してヒトＩｆＧを固定化した重合体
粒子を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分
散の操作を繰り返えすことによりヒトＩｙＧを固定化し
た重合体粒子を洗浄した。

さら忙遠心分離した後、ヒト１１Ｇを固定化した重合体
粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加した
グリシン緩衝液に再分散し固型分濃度を０．５％に調整
し、４℃に保ち保存した。

ヒトＩ２Ｇをウサギに免疫して得た抗ヒト１ｆＧウサギ
血清を６０℃、６０分非動化処理を行なった。この血清
を以下抗ヒトＩ　ｆ（’ｈウサギ血清と呼ぶ。

抗ヒトＩｐ（）ウサギ血清をグリシン緩衝液で２０倍に
希釈したものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒト１ｆ
Ｇウサギ血清をグリシン緩衝液で希釈して抗ヒト丁ｙａ
ウサギ血清希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なう
ためにガラス製１０穴のホールグラスを用意し、グリシ
ン緩衝液で希釈１−た抗ヒト１ｆＧウサギ血清を各ホー
ルに０．０４−加える。次いでヒ）Ｉ４＋）を固定化し
た重合体粒子のグリシン緩衝液分散液を各ホールに０．
０４−加える。この後直ちに平沢製作所製チー・・一式
攪拌機によりホールグラスを１分間に１２０回転の速度
で水平回転し攪拌を行なう。抗原・抗体反応により重合
体粒子の凝集が認められるまでに要する時間、すなわち
凝集像出現時間及び所定時間攪拌後の重合体粒子の凝集
の有無から、ヒト１１Ｇを固定化した重合体粒子の特性
である迅速性及び鋭敏性を評価した。ホールグラスを用
いた重合体粒子の凝集試験の結果を図１に示す。図１は
１０分間の攪拌後の凝集状態を示す。凝集が全く認めら
れない場合（−）、凝集の有無が判定しがたい場合（±
）、明らかに凝集が認められる場合、凝集の強い順に＋
＋＋　、　＋＋　、十と判定した。

図中Ｃけ抗原もしくけ抗体を全く含まないことを示す。

凝集試験の結果、明らかに凝集の認められたホールに於
ける抗ヒト１ｆＧウサギ血清希釈液の最高希釈倍数をも
って、重合体粒子の鋭敏性を評価した。一方、抗ヒトＩ
ｆＧウサギ血清希釈液の希釈倍数が×６４０の希釈液を
加えたホールにつき凝集像が認められるまでの時間をも
って迅速性を評価（−た。

重合体粒子の特性と１−で、さらに重合体粒子の分散安
定性を評価した。すなわち、重合体粒子にヒトＩｆＧ希
釈液を加え室温で２時間放置した後の重合体粒子の分散
状態をもって重合体粒子のヒ）ＩｙＣ）固定化時の分散
安定性を評価した。又ヒトＩｆｃ＋固定化後６ケ月経過
した後の重合体粒子の分散状態をもってヒトｌ５ＩＧを
固定化した重合体粒子の保存中の分散安定性を評価した
。

さらにまた、重合体粒子の特性として、電解質を含んだ
緩衝液中での重合体粒子の分散安定性を評価した。即ち
、重合体粒子をイオン交換水に１％濃度になるように調
製した後、ＮａＣＬ濃度が０．１０モル／を及び０．１
５モル／ｌのグリシン緩衝液１が６に４０μを添加１−
で充分に混合してから室温で３日間静置して分散安定性
を調べた。その結果を第１表に示す。

尚、比較例として、（Ａ）式で示される構造単位が本発
明の範囲外となる如く、第１表に示す割合でグリシジル
メタクリレートとスチレンの混合物を用いた以外、全て
上記実施例と同様の操作で調節した重合体粒子及びその
診断用試薬の特性を第１表に示す。また、本発明の（Ａ
）式で示される構造単位を含まない重合体粒子として、
ダウ・ケミカル社製ポリスチレンラテックス粒子径＝０
．４９７ミクロン、分散値−１，２％（比較例６）を用
いた。

但し、このダウ・ケミカル社製のポリスチレンラテック
スは水蒸気蒸留を行なうと、著しく凝集粒子を発生する
ために、水蒸気蒸留を行なわずに水洗いで精製したもの
を用いた。

その結果を第１表に示す。

実施例　５ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７５℃に保った後に、窒素雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／１．チオ硫
酸ナトリウム５ミリモル／１．硫酸銅０．２５ミリモル
／ｌ、及びα−メルカプトエタノールｉ、ｏ　ｃｃヲ添
加シタ。次いで７５℃に加温したグリシジルアクリレー
ト１００ミリモル及びメチルメタクリレート２００ミリ
モルの混合物を添加して７５℃で３０分間攪拌下に重合
した。その後、メチルメタクリレート２，５モルを定量
ポンプで逐次添加して、更忙７５℃で２時間攪拌下に重
合した。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なっ
た。得られた重合体粒子の粒子径は０．１９７　ミクロ
ンであった。この重合体粒子を実施例１と同様の操作で
ヒトｘｙａを吸着して固定化し、抗ヒトエｔＧウサギ血
清との抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は
１８後Ｘ６４０．５ケ月後Ｘ６４０．迅速性は１８後９
０秒、３ケ月後７０秒、また分散安定性は１日後及び３
ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集が認められなかっ
た。さらに実施例１と同様のＮａＣｔ！１度が０．１０
モル／を及び０．１５モル／ｌのグリシン緩衝液中での
分散安定性は、いずれも０であり、非特異的凝集は認め
られなかった。

実施例　６ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素を換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウムを２０ミリモル／を濃度
になるように添加した。次いで７０℃に加温したグリシ
ジルメタクリレート３００ミリモルとクロルメチルスチ
レン２００ミリモルの混合物を添加して７０℃で１．５
時間攪拌下に重合した。

その後クロルメチルスチレン２．５モルを定量ポンプで
逐次添加して、更に７ｏ℃で５０時間攪拌下に重合した
。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得
られた重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒトエ２Ｇ
を吸着して固定化し、抗ヒトＩ９Ｇウサギ血清との抗原
・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１８後Ｘ３
２０，３ケ月後Ｘ６４０゜迅速性は３ケ月後６０秒、ま
た分散安定性は１日後及び６ケ月後共に保存中に全く非
特異的凝集反応が認められなかった。さらに、実施例１
と同様のＮａＣＬ濃度が０，１０モル／を及び０．１５
モル／ｌのグリシン緩衝液中での分散安定性は、いずれ
も０であり、非特異的凝集は認められなかった。

実施例　７ 攪拌機付きガラス製オートクレーブを窒素置換した後に
、蒸留水２７００ＣＣを加えて６５℃に保った後に窒素
雰囲気下に過硫酸カリウム１０ミリモル／を濃度になる
ように添加した。次いで６５℃に加温したグリシジルメ
タクリレート９０ミリモルと塩化ビニルモノマー　３０
０　ミ＋Ｊモルの混合物を窒素圧でオートクレーブに圧
入して６５℃に攪拌下に３０分間重合した。その後塩化
ビニルモノマー２．６モルを逐次添加して６５℃で４時
間攪拌下に重合した。次いで残存する未反応の塩化ビニ
ルモノマーをパージして２から、得られた重合体粒子を
濾紙（ＮＯ２）で濾別して大きな凝集体を除いた。更に
粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後に、ｐＨ＝
５の酸性水溶液中で重合体粒子上のエポキシ基を加水分
解してジヒドロキジル基に変換した。次いでセロファン
膜で１力月間透析を行なった後に、イオン交換樹脂で脱
イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって重
合体粒子を精製した。かくして得られた重合体粒子を実
施例１と同様の操作でヒトエｔＧを吸着して固定化し、
抗ヒトｘｙａウサギ血清との抗原・抗体反応を行なった
。その結果、鋭敏性は１８後Ｘ１２Ｂ０．３ケ月後Ｘ２
５．！ＳＯ、迅速性は１６後４０秒、３ケ月後２０秒、
また分散安定性Ｆｉ１日後日本１本び６ケ月後２本の非
特異的凝集反応が認められた。さらに実施例１と同様の
ＮａＣＬ濃度が０．１０モル／を及び０．１５モル／ｌ
のグリシン緩衝液中での分散安定性は、いずれも０であ
り、非特異的凝集は認められなかった。

実施例　８ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７０℃に保った後に窒素雰囲気
下に過硫酸カリウム１０ミリモル／を濃度になるように
添加した。次いで７０℃１（加温した２、３−ジオキシ
メタクリレート８０ミリモルとスチレン４２０ミリモル
の混合物を添加して７０℃で１時間１１拌下に重合した
。次いでスチレン２．０モルヲ定量ポンプで逐次添加し
て７０℃で２４時間攪拌下に重合した。その後室温まで
放冷してから、得られた重合体粒子をｆ！１紙（ＮＯ２
）で濾別して凝集体を除いた。更に粗い重合体粒子を遠
心分離で除いた後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を
行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって重合体粒子を精
製した。この重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒト
１１Ｇを吸着して固定化し、抗ヒトエ１Ｇウサギ血清と
の抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１０
後Ｘ１２８０．５ケ月後Ｘ２５＜Ｓｏ。

迅速性は１８後６０秒、３ケ月後４０秒、また分散安定
性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集
反応が認められなかった。さらに実施ｆ１１１と同様の
ＮａＣ１濃度が０．１０モル／を及び０．１５モル／ｌ
のグリシン緩衝液中での分散安定性は、いずれも０であ
り、非特異的凝集は認められなかった。

実施例　９ ヒトＩｐＧ飽和吸着量の測定 実施例１〜８及び比較例１〜６で得られた重合体粒子を
精秤してグリシン緩衝液に１％濃度になるように調製し
た重合体粒子懸濁液１５０　Ｆと塩析ヒ）ＩｐＧを２り
／■になるようにｔ＋製したグリシン緩衝液Ｌ５ｍｌを
よ〈混合した後、４℃で一夜放置した。次いで１５００
０ｒｐｍで２０分間遠心分離を行ない、上澄液を採取し
た。沈澱した重合体粒子を更忙グリシン緩衝液３ｃｃを
加えて再分散させた。

同様な操作を２回繰返した後、採取した全ての上澄液を
集め、更に１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行な
い、上澄液中のヒトｒ’ｐ。

量を波長２８０　ｎｍの吸光度を測定することによって
めた請求められたヒトエ？Ｇ量の残りを重合体粒子に吸
着されたヒト：ｔｙＧ飽和吸着量とした。また沈澱した
重合体粒子を充分に乾燥した後に一精秤することにより
、重合体粒子に吸着されたヒトＩ　ｙ　ａｔ＠和吸着量
の精度をチェックした請求められたヒトエｔＧ飽和吸着
量を重合体粒子の粒子径から計算した重合体粒子表面積
（ｒｒｔ’単位）で表示した。

実施例１０と比較例７〜８ 熱変性ヒトＩｐＧの固定化 、）Ｈ８，２に調製したグリシン緩衝液に実施例２で用
いた重合体粒子を０．５％忙なるよう分散させた。次い
で６０℃で１０分間加熱処処理先ヒトＩｙＧをグリシン
緩衝液により希釈し１ｗｑ／−に調整した。０．５％濃
度の重合体粒子分散液１容に熱変性したヒトエｔＧ希釈
液１容を加え、攪拌し、室温下２時間放置した。その後
ウシ血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し、
４℃に保ち１夜放置して熱変性ヒ）Ｉ９Ｇを固定化した
重合体を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再
分散の操作を繰返して洗浄した後、熱変性ヒトＩｔＧを
固定化した重合体粒子をウシ血清アルブミンを０．１％
の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃
度を０．５％忙調整した。

リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール血清をグ
リシン緩衝液で２０倍に希釈したものを原液として、実
施例１と同様にしてガラス製１０大のホールグラスにグ
リシン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清を各
ホールに０．０４−を加え、次いで熱変性ヒ）ＩｔＧを
固定化した重合体粒子をグリシン緩衝液で希釈した分散
液を各ホールに０．０４−加えて実施例１と同様の操作
で鋭敏性、迅速性及び分散安定性を調べた。その結果、
鋭敏性は１８後Ｘ１２８０．３ケ月後Ｘ１２８０゜迅速
性は１日後６５秒、５ケ月後５０秒、及び分散安定性は
１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応
が認められなかった。

尚、比較例７として比較例１で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作でテストすると、鋭敏性は１
８後Ｘ６４０．３ケ月後けＸ１ｉＳＯ，迅速性は１日後
９０秒、！１ケ月後は非特異凝集のため評価できなかっ
た。

また、分散安定性は１日後６本、３ケ月後は３本であっ
た。

さらにまた、比較例８として比較例３で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作でテストすると、鋭
敏性は１日後×２０以下、３ケ月後けＸ２０以下であり
、迅速性は評価できなかった。寸た分散安定性は１日後
、３ケ月後共に保存中忙全く非特異的凝集反応が認めら
れなかった。

実施例１１と比較例９ アルファーフェトプロティンの抗体の固定化、Ｈ８，２
に調製したグリシン緩衝液に実施例２で用意した重合体
粒子を１．０％になるように分散させた。次いで家兎の
産生じたアルファーフェトプロティン（以下α−ＦＰと
略ス）の抗体をアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製して得た精製α−ＦＰ抗体を、グリシン緩衝液で
１０　ｚｔｆ　／ｍｆ、の濃度に希釈した。重合体粒子
分散液１容と精製α−ＦＰ抗体の希釈液１容とを加え、
攪拌し、室温下２時間放置した。その後ウシ血清アルブ
ミンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち１夜
放置してα−ＦＰ抗体を固定化した重合体粒子を得た。

次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作を繰
り返して洗浄した後、α−ＦＰ抗体を固定化した重合体
粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加した
グリシン緩衝液に再分散し、固型分濃度を０．５％に調
整した。

アルファーフェトプロティンの測定 検体としてヒト血清中のα−ＦＰの濃度が１０００μｆ
　／ｍｅであるものを原液とし、グリシン緩衝液で１０
倍ごとの希釈系列を調製した。実施例１と同様にして、
ガラス製１０穴のホールグラスにグリシン緩衝液で希釈
したα−ＦＰを各ホールに０．０４−加え、次いでα−
ＦＰ抗体を固定化した重合体粒子の分散液を各ホールに
０．０４−加えて、実施例１と同様の操作で鋭敏性１分
散安定性を調べた。

その結果、鋭敏性は１８後１０μり／コ、３ケ月後１０
μ？　／ｍｔであった。分散安定性は１日後及び６ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認められなかっ
た。

尚、比較例９として比較例１で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作で試験すると、鋭敏性は１０
後１０μｆ／、８．３ケ月後は非特異的凝集反応の結果
、評価できなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた本発明の診断用試薬の凝
集状態を示す。 特許出願人 徳山曹達株式会社 曇」Ｌ９０心訃鉢４呵暗雪苛都

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （１）　一般式、−＋−ＣＨ２−ＣＨ−（但し、Ｒ１け
   ２ 水素原子又はアルキル基で、Ｒ２は疎水基である。）で
   示される構造単位と、 直 Ｃ−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２ １ （但し、Ｒは水素原子又はアルキル基である）で示され
   るジヒドロキジル構造単位とよりなり、且つ該ジヒドロ
   キジル構造単位が６．０モル％を超えて２０モル％以下
   の範囲で含まれる重合体粒子の表面に免疫活性物質を吸
   着した診断用試薬。 （２）疎水基がアリール基、・・ロゲン化アリール基、
   アルキルエステル基又はノ・ロゲン原子である特許請求
   の範囲（１）記載の診断用試薬。