JPS6049263A - 診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的診断用試薬に関する。更に詳しくは、
鋭敏性、安定性、迅速性のすぐれた免疫学的診断用試薬
を提供するものである。

抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応、補体結合反応と共に、あるいはこれら
に比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてお
り、遊離細胞や細菌膜表面に局在する抗原を検出する反
応と共に、抗原精製技術の進歩により特異性の高い抗血
清が得られることによって、特異性の高い抗体を血球粒
子、ベントナイト粒子、カオリン粒子、ラテックス粒子
などの粒子担体に固定させておき、対応する抗原を凝集
反応によって検査するなど、臨床検査における応用範囲
が著しく拡大している。また、検出しようとする抗原を
固定化した担体粒子に、抗原に対する抗血清と抗原を含
む被検体を加えると固定化粒子の凝集が阻止されること
により、抗原を検出又は定量する方法も広く用いられて
いる。さらにまた、特異性の高い抗血清の利用により、
抗原・抗体反応を定量的に高感度で検出する試みがなさ
れ、免疫学的凝集反応を光学的検出手法により定量分析
する方法も数多く報告され実施されている。

免疫学的凝集反応用としての担体は種々のものが公知で
、該担体を使用した種々の診断用試薬が知られている。

これらを大別すると免疫活性物質を物理的に吸着した診
断用試薬と免疫活性物質を共有結合で結合させた診断用
試薬になる。これらの試薬にはそれぞれ一長一短があり
現在なお完全に満足出来る診断用試薬は存在しない。例
えばポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリアクリロ
ニトリル、ブタジエン−スチレン共重合体等の疎水性の
ラテックス粒子は免疫活性物質を強固に吸着する性質が
あり、粒子径が均一で品質を一定に出来ること、血清学
的に活性がないこと或いは化学的に比較的に安定である
こと等の特徴があるため実用に供されている。また免疫
活性物質を共有結合で結合させるタイプの診断用試薬は
例えば特開昭５６−３０４０５号、特開昭５６−１４１
５５９号、特開昭５７−１３５８０１号等、比較的最近
試みられている方法であるが再現性に乏しく、副反応と
して重合を伴う場合が多く免疫活性を著しく低下させる
こと、免疫学的に非特異凝集反応が生じ易いこと等の欠
陥を有し必らずしも成功していない。

しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の高い抗体
の開発、更には定量分析の発展と共に免疫学的凝集反応
は鋭敏性と迅速性が増加し、非特異的凝集反応が起こら
ない、１〜かもより保存安定性に優れた等の性状を有す
る診断用試薬の開発が要望されている。

本発明者等はかかる要望を満たすべく鋭意研究を重ねて
来た結果、特定の組成の重合体粒子で、しかも特定組成
比のものが免疫活性物質を吸着して用いるとき、前記要
望を満すだけでなく著しくすぐれた効果をもたらすこと
を見出した。更に研究を重ねた結果、本願発明を完成し
、ここに提案するに至った。

即ち、本発明は、一般式、 （但し、Ｒ１は水素原子又はアルキル基で、Ｒ２は疎水
基である。）で示される構造単位と、一般式、（但し、 Ｒは水素原子又はアルキル基である）で示されるジヒド
ロキシ構造単位とよりなり且つ該ジヒドロキシ構造単位
が０．０５〜３．０モル％の範囲で含まれる重合体粒子
の表面に免疫活性物質を吸着した診断用試薬である。

本発明で使用する重合体粒子は、 （イ）一般式、 （但し、Ｒ１は水素原子又はアルキル基で、Ｒ２は疎水
基である）で示される構造単位と、（ロ）一般式、 （但し、Ｒは水素原子又はアルギル基である）で示され
るジヒドロキシ構造単位とよりなり、且つ該ジヒドロキ
シ構造単位が０．０５〜３．０モル％の範囲で含まれる
、重合体粒子である。

上記一般式（Ａ）で示される構造単位のうちＲ１で示さ
れるアルキル基は特に限定されるものではないが、一般
に工業的観２点から低級アルキル基例えば炭素原子数１
〜４のメチル基、エステル基、プロピル基、ブチル基等
が好適に使用される。また一般式（Ａ）で示される構造
単位のうちＲ２は疎水基であれば特に限定されず公知の
ものが使用出来るが、工業的に好適に使用されるものを
例示すれば、アリール基；ハロゲン化アリール基；ニト
リル基；アルキルエステル基；アルキルエーテル基；グ
リシジルエステル基；塩素、臭素、沃素、フッ素等のハ
ロゲン原子等である。更にまた前記一般式（Ｂ）で示さ
れるジヒドロキシ構造単位中、Ｒのアルキル基は前記一
般式（Ａ）式中のＲ１のアルキル基と同様なものが使用
出来る。

本発明で使用する前記一般式（Ａ）及び（Ｂ）で示され
る構造単位を有する重合体粒子は一般にこれらの構造単
位を与える単量体を共重合させることによって得ること
が出来る。例えば前記一般式（Ａ）で示される構造単位
を与える単量体の代表的なものを挙げれば、スチレン、
ビニルトルエン、α−メチルスチレン。

クロルメチルスチレン、塩化ビニル、メチル（メタ）ア
クリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（
メタ）了クリレート、グリシジル（メタ）アクリレート
、エチルビニルエーテル、（メタ）アクリロニトリル、
あるいけ酢酸ビニル等である。これらの単量体は単独で
あるいは混合して用いるとよい。

これらの中で、スチレン、ビニルトルエン、クロルメチ
ルスチレン等のアリール基をもつビニル系単量体の重合
体は最も好適に採用される。

また本発明の前記一般式（Ｂ）を与える単量体の代表的
なものを例示すれば、グリシジルアクリレート；グリシ
ジルメタアクリレート；２，３−ジオキシアクリレート
；２．３−ジオキシメタアクリレート等である。そして
一般式（Ｂ）を付与するためには一般に前記一般式（Ａ
）を与える単量体と一般式（Ｂ）を与え、る単量体とを
共重合し、必要に応じて加水分解することによって得る
とよい。その代表的な態様を示せば次の通りである。

（１）グリシジル（メタ）アクリレートと本発明の疎水
基を有するビニル系単量体との共重合体粒子を弱酸性、
弱アルカリ性条件下、あるいは８０℃以上の加熱条件下
にエポキシ基を加水分解する。

（２）２，３−ジオキシ（メタ）アクリレートと本発明
の疎水基を有するビニル系単量体との共重合体粒子を合
成する。

従って、本発明で使用する重合体粒子は、グリシジル（
メタ）アクリレートと疎水基を有する一種以上のビニル
系単量体の共重合体粒子を弱酸性、弱アルカリ性、もし
くは８０℃以上の加熱条件下にエポキシ基を加水分解し
て生成するか、あるいは２，３−ジオキシ（メタ）アク
リレートと疎水基を有する一種以上のビニル系単量体と
の共重合体粒子の合成によって生成する。

また本発明で用いる重合体粒子は前記（Ｂ）式で示され
る構造単位が０．０５乃至３．０モル％の範囲の間にあ
ることが極めて重要である。

該（Ｂ）式の構造単位が０．０５モル％より少ない場合
には、免疫学的凝集反応性は高まるが、免疫活性物質を
重合体粒子に吸着させる操作過程での分散安定性が悪く
なるばかりでなく、診断用試薬の保存安定性が低下する
欠点がある。逆に、該（Ｂ）式の構造単位が３．０モル
％より多い場合には、保存安定性は改良されるが、免疫
学的凝集反応の鋭敏性と迅速性が極めて悪くなる。即ち
、（Ｂ）式の構造単位が３．０モル％より多い場合には
、免疫活性物質の該重合体粒子への吸着による固定化が
著しく低下する。従って、本発明における前記（Ｂ）式
で示される構造単位が重合体粒子中０．５乃至３．０モ
ル％の範囲の間にあることが、疎水基を有するビニル構
造単位と相補し合って、該重合体粒子の表面に免疫活性
物質を吸着して固定化した診断用試薬の免疫学的凝集反
応の迅速性と鋭敏性を向上させるだけでなく、非特異的
凝集反応の抑制と保存安定性を高める効果を同時に発揮
していると推定される。

更に好ましくは、本発明における（Ａ）式で示される構
造単位は重合体粒子中に０．１乃至２．０モル％含まれ
ることが好適である。

本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径は特に限定さ
れないが、一般には０．０５乃至１０ミクロンの範囲内
、好ましくは０．１乃至２ミクロンの範囲内にあるのが
好ましい。該粒子径が０．１ミクロン以下では微弱な免
疫学的凝集反応を肉眼で観察することが困難になる場合
がある。また粒子径が１０ミクロン以上になると分散安
定性、保存安定性が悪くなる場合がある。さらにまた、
該重合体粒子の粒子径の単分散性は小さｂことが望まし
い。

本発明の重合体粒子を得るための製造方法は特に限定さ
れず、公知の製造方法が好適に採用される。例えば、ア
ニオン性界面活性剤。

非イオン性界面活性剤の存在下に乳化重合する方法、界
面活性剤を使わずに水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を
用いて不均一重合する方法（ソープフリー重合）、部分
鹸化ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の
採掘コロイド存在下に懸濁重合する方法、等が採用され
る。

本発明の重合体粒子に物理吸着によって固定化する免疫
活性物質としては、特に限定的でなく公知のものが使用
出来る。代表的なものを例示すれば、例えば、変性ガン
マグロブリン、リウマチ因子、抗核因子、ヒトアルブミ
ン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリ
ンＭ（ＩｇＭ）、ストレプトリジン０．抗ストレプトリ
ジン０抗体、Ｃ−反応性蛋白、抗Ｃ−反応性蛋白抗体、
アルファーフェトプロテイン（ＡＦＰ）、抗ＡＦＰ抗体
、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗ＣＥＡ抗体、ヒト胎盤ラ
クトゲン（ＨＰＬ）、抗ＨＰＬ抗体、ヒト絨毛性ゴナド
トロピン（ＨＣＧ）、抗ＨＣＧ抗体、抗エストロゲン抗
体、抗インシュリン抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳ）
、抗ＨＢＳ抗体、梅毒トレポネーマ抗原、風疹抗原、補
体成分Ｃ１ｑ、抗補体成分Ｃ１ｑ抗体、等の公知の免疫
活性物質をあげることができる。本発明の重合体粒子に
吸着で固定化される該免疫活性物質の量は、各検査項目
に適している割合で重合体粒子に固定化させればよく、
一概に限定されない。一般には抗体／ラテックス表面積
が０．０５〜１０ｍｇ／ｍ２の範囲となるように選べば
好適である。

本発明になる重合体粒子は疎水性と親水性のバランスが
極めて良く調節されているので、該重合体粒子表面に免
疫活性物質を極めて容易に物理吸着法で固定化できる特
徴がある。

例えば、抗原又は抗体と重合体粒子を緩衝液又は生理食
塩水などの水媒体中で混合し、抗原又は抗体が化学的に
変化しないように、そしてそれらの免疫学的性質を保持
させるように、非常に緩和な条件下に抗原又は抗体を重
合体粒子表面に吸着させることができる。重合体粒子表
面に吸着された免疫活性物質の量は、重合体粒子の疎水
基の吸着部位を飽和又はブロックされるように選ぶこと
が好ましいが、残存する吸着部位を適当な物質、例えば
免疫学的凝集反応な半血清アルブミン、ゼラチン等でブ
ロックさせることができる。

本発明の免疫学的診断用試薬は、分散安定性と保存安定
性が著しく優れるだけでなく、免疫学的凝集反応の鋭敏
性と迅速性も良好である特徴を有する。この理由は必ず
しも明確ではないが、ヒドロキシル基はカルボキシル基
、スルホン酸基等のアニオン極性基と異なり、水媒体中
での重合体粒子の分散安定性にＰＨ依存性が極めて少な
いこと、また、免疫学的凝集反応の実施において、水の
蒸発による懸濁液組成の変化がおこり、懸濁液のイオン
強度が変化しても、ジヒドロキシル基を含有する重合体
粒子はその影響を受け難いこと、さらにまた、ジヒドロ
キジル基はヒドロキシル基が隣接する位置にあるので、
特定のジヒドロキジル基の濃度で診断用試薬の分散安定
性と保存安定性が効果が高められると推定される。さら
には、ジヒドロキジル基儂度が小さく、特定の濃度範囲
内にあるだめに、重合体粒子表面の疎水性部分の面積が
大きく、この疎水性部分に充分な量の免疫活性物質が吸
着されて固定化するために、免疫学的凝集反応の鋭敏性
と迅速性が向上すると推定される。

本発明で提供する診断用試薬は前記説明から或いは後述
する実施例からそのすぐれた性能が明白であるが、物理
吸着タイプの診断用試薬でかかる特性を発揮することは
驚異的なことである。例えば特開昭５７−１３５８０１
号にはスチレン−グリシジルメタクリレート共重合ラテ
ックス粒子に免疫活性物質を共有結合させる方法が提供
されている。該特開昭の明細書例６にはグリシジルメタ
クリレート１重量％とメチレン９９重量％の混合物を水
溶性ラジカル開始剤を用いて水媒体中で乳化剤の不存在
下に６５℃で２２時間重合して直径０．５μｍの親水性
ラテックス粒子を得ている。この得られたラテックス粒
子のエポキシ基を同例７に示されたように加水分解し、
次いで過ヨウ素酸ナトリウムを加えて反応させ、アルデ
ヒド基に変換した。次いで該ラテックス粒子のアルデヒ
ド基濃度に対して５倍当量、１０倍当量、２０倍当量と
ヒトＩｇＧ濃度を変化させｐＨ＝７．４のリン酸緩衝液
中で後述する本願発明実施例１と同様の操作でヒトＩｇ
Ｇを固定化したラテックス粒子と抗ヒトＩｇＧウサギ血
清との抗原・抗体反応を行なうと、鋭敏性は１日後×６
４０、３ケ月後×３２０、迅速性は１日目７０秒、３ケ
月測定不能、及び分散安定性は１日後８、３ケ月後６と
良くなかった。

これに対して、上記重合された１重量％グリシジルメタ
クリレートを含むポリスチレンラテックス粒子について
エポキシ基を加水分解した後にｐＨ＝７．４のリン酸緩
衝液を用いて本願発明の実施例１と同様の抗原・抗体反
応を行なうと、鋭敏性は１日後１２８０、３ケ月後×１
２８０、迅速性は１白後５０秒、３ケ月後４０秒、及び
分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特
異凝集は認められない。

以上の結果からも本発明の診断用試薬は前記一般式（Ｂ
）で示されるジヒドロキシ構造単位の２つのヒドロキシ
基が特定組成中に特定量含有されるとき初めて免疫活性
物質を物理吸着させたとき相乗的な効果を発揮するもの
と推定される。

本発明を更に具体的に説明するため以下実施例及び比較
例をあげて説明するが本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。

実施例１〜４と比較例１〜４ （１）重合体粒子の調製 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウムを５．０ミリモル／ｌ濃
度になるように添加した。次いで７０℃に加温したグリ
シジルメタクリレートとスチレンの混合物を第１表に示
す割合で添加して、７０℃で３０時間撹拌下に重合した
。その後室温まで冷却してから、得られた重合体粒子を
濾紙（ＮＯ２）で濾別して大きな凝集体を除いた。更に
粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後、水蒸気蒸
留を６時間行なうことによって重合体粒子上のエポキシ
基をジヒドロキジル基に変換した。この加熱条件で全て
のエポキシ基が加水分解してジヒドロキジル基が生成す
ることが赤外吸収スペクトル及び塩酸付加法によるエポ
キシ基の分析で確認された。次いで遠心分離、蒸留水へ
の再分散の操作を繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イ
オン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なって重合
体粒子を精製した。得られた重合体粒子の粒子径と粒子
径の単分散性を第１表に示す。

（２）ヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子の調製（１）
重合体粒子の調製で得られた本発明の重合体粒子を固型
分濃度１％でグリシン緩衝液に分散した。本発明に於い
てグリシン緩衝液とはグリシン０．０５モル及び食塩０
．０５モルを水１ｌに溶解し、次いで２規定水酸化ナト
リウム水溶液でｐＨを８．２に調製し、さらにアジ化ナ
トリウム１ｇを添加したものである。

本発明に於いてヒトＩｇＧは、ヒト血清を飽和硫安で塩
析し、さらに透析を行ない精製したものを用いた。

ヒトＩｇＧをグリシン緩衝液により希釈し１ｍｇ／ｍｌ
に調整する。次いで倍数希釈法によりヒトＩｇＧをグリ
シン緩衝液により希釈してヒトＩｇＧ希釈液を調製する
。１％濃度の重合体粒子分散液１容にヒトＩｇＧ希釈液
１容を加え撹拌し。室温下２時間放置する。次りでウシ
血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し、４０
℃に保ち１夜放置してヒ）Ｉ４Ｇを固定化した重合体粒
子を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散
の操作を繰り返えすことによりヒトＩｇＧを固定化した
重合体粒子を洗浄した。

さらに遠心分離した後、ヒトＩｇＧを固定化した重合体
粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加した
グリシン緩衝液に再分散し固型分濃度を０．５％に調整
し、４℃に保ち保存した。

（３）抗原・抗体反応 ヒトＩｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒトＩｇＧウサギ
全血清を６Ｏ℃、３０分非動化処理を行なった。この血
清を以下抗ヒトＩｇＧウサギ血清と呼ぶ。

抗ヒトＩｇＧウサギ血清をグリシン緩衝液で２０倍に希
釈したものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒトＩｇＧ
ウサギ血清をグリシン緩衝液で希釈して抗ヒトＩｇＧウ
ザギ血清希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なうた
めにガラス製１０穴のホールグラスを用意し、グリシン
緩衝液で希釈した抗ヒトＩｇＧウサギ血清を各ホールに
０．０４ｍｌ加える。次いでヒトＩｇＧを固定化した重
合体粒子のグリシン緩衝液分散液を各ホールに０．０４
ｍｌ加える。この後直ちに平沢製作所製テーハー式撹拌
機によりホールグラスを１分間に１２０回転の速度で水
平回転し撹拌を行なう。抗原・抗体反応により重合体粒
子の凝集が認められるまでに要する時間、すなわち凝集
像出現時間及び所定時間撹拌後の重合体粒子の凝集の有
無から、ヒトＩｇＧを固定化した重合体粒子の特性であ
る迅速性及び鋭敏性を評価した。ホールグラスを用いた
重合体粒子の凝集試験の結果を図１に示す。図１は１０
分間の撹拌後の凝集状態を示す。凝集が全く認められな
い場合（−）、凝集の有無が判定しがたい場合（±）、
明らかに凝集が認められる場合、凝集の強い順に＋＋＋
、＋＋、＋と判定した。図中Ｃは抗原もしくは抗体を全
く含まないことを示す。凝集試験の結果、明らかに凝集
の認められたホールに於ける抗ヒトＩｇＧウサギ血清希
釈液の最高希釈倍数をもって、重合体粒子の鋭敏性を評
価した。一方、抗ヒトＩｇＧウサギ血清希釈液の希釈倍
数が×６４０の希釈液を加えたホールにつき凝集像が認
められるまでの時間をもって迅速性を評価した。

重合体粒子の特性として、さらに重合体粒子の分散安定
性を評価した。すなわち、重合体粒子にヒトＩｇＧ希釈
液を加え室温で２時間放置した後の重合体粒子の分散状
態をもって重合体粒子のヒトＩｇＧ固定化時の分散安定
性を評価した。又ヒトＩｇＧ固定化後３ケ月経過した後
の重合体粒子の分散状態をもってヒトＩｇＧを固定化し
た重合体粒子の保存中の分散安定性を評価した。

尚、比較例として、（Ａ）式で示される構造単位が本発
明の範囲外となる如く、第１表に示す割合でグリシジル
メタクリレートとスチレンの混合物を用いた以外、全て
上記実施例と同様の操作で調節した重合体粒子及びその
診断用試薬の特性を第１表に示す。また、本発明の（Ａ
）式で示される構造単位を含まない重合体粒子として、
ダウ・ケミカル社製ポリスチレンラテックス粒子径＝０
．４９７ミクロン、分散値＝１．２％（比較例４）を用
いた。

但し、このダウ・ケミカル社製のポリスチレンラテック
スは水蒸気蒸留を行なうと、著しく凝集粒子を発生する
ために、水蒸気蒸留を行なわずに水洗いで精製したもの
を用いた。

その結果を第１表に示す。

実施例５ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７５℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／ｌ、チオ硫
酸ナトリウム５ミリモル／ｌ、硫酸銅０．２５ミリモル
／ｌ、及び２−メルカプトエタノール１．０ｃｃを添加
した。次いで７５℃に加温したグリシジルアクリレート
１０ミリモル及びメチルメタクリレート２．８６モルの
混合物を添加して、７５℃で１時間撹拌下に重合した。

その後の操作は実施例１と同様な操作を行なった。得ら
れた重合体粒子の粒子径は０．２１５ミクロンであった
。この重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧ
を吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原
・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１白後×１
２８０、３ケ月後×１２８０、迅速性は１日後５０秒、
３ケ月後３０秒、また分散安定性は１日後及び３ケ月後
共に保存中に全く非特異的凝集が認められなかった。

実施例６ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／ｌと２−メ
ルカプトエタノール０．５ｃｃを添加した。次いで７０
℃に加温したグリシジルメタクリレート１０ミリモル、
スチレン２．０モル、及びクロルメチルスチレン０．８
５モルの混合物を添加して４８時間撹拌下に重合した。

その後の操作は実施例１と同様な操作を行なった。得ら
れた重合体粒子の粒子径は０．４９５ミクロンであった
。

この重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧを
吸着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原・
抗体反応を行なった。

その結果、鋭敏性は１日後×２５６Ｏ、３ケ月後×２５
６０、迅速性は１日後４５秒、３ケ月後２５秒、１だ分
散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異
的凝集が認められなかった。

実施例７ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃ、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム１．Ｏｇ、過硫酸カリウム５ミリモル／ｌ、２，３−
ジオキシメタクリレート１５ミリモル、及びスチレン２
．８モルを添加して充分に乳化した後に、７０℃に昇温
して４８時間撹拌下に重合した。その後室温まで放冷し
てから、得られた重合体粒子を濾紙（ＮＯ２）で濾別し
て凝集体を除いた。

更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後に、１
力月間セロファン膜で乳化剤を除いた。次いでイオン交
換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を
行なって重合体粒子を精製した。得られた重合体粒子の
粒子径は０．３７２ミクロンであった。この重合体粒子
を実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧを吸着して固定化
し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体反応を行な
った。その結果、鋭敏性は１日後×１２８０、３ケ月後
×２５６０、迅速性は１日後４０秒、３ケ月後２０秒、
また分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く
非特異的凝集反応が認められなかった。

実施例８ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７０Ｏｃｃを加えて６０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、撹拌下に過硫酸カリウム６ミリモル／ｌを添加し
た。次いで６０℃に加温したグリシジルメタクリレート
１２ミリモル及びクロルメチスチレン２．８５モルの混
合物を添加して６０℃で４８時間撹拌下に重合した。そ
の後の操作は実施例１と同様な操作を行なった。得られ
た重合体粒子を実施例１と同様の操作でヒトＩｇＧを吸
着して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原・抗
体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１日後×１２８
０、３ケ月後×２５６０、迅速性は１日後４５秒、３ケ
月後２５秒、また分散安定性は１日後及び３ケ月後共に
保存中に全く非特異的凝集が認められなかった。

実施例９ 撹拌機付きガラス製オートクレーブを窒素置換した後に
、蒸留水２７００ｃｃを加えて６５℃に保った後に窒素
雰囲気下に過硫酸カリウム６ミリモル／ｌ及び塩化カリ
ウム２５ミリモル／ｌ濃度になるように添加した。次い
で６５℃に加温したグリシジルメタクリレート２５ミリ
モル及び塩化ビニルモノマー５．０モルの混合物を窒素
圧でオートクレーブに圧入して６５℃で撹拌下に１．５
時間重合した。この時点で塩化ビニルモノマーの部分圧
は約１／３に低下していた。次いで残存する未反応の塩
化ビニルモノマーをパージしてから、得られた重合体粒
子を濾紙（ＮＯ，２）で濾別して大きな凝集体を除いた
。更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後に、
ｐＨ＝３の酸性水溶液中で重合体粒子上のエポキシ基を
加水分解してジヒドロキジル基に変換した。

次いでセロファン膜で１カ月間透析を行なった後に、イ
オン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と
洗浄を行なって重合体粒子を精製した。かくして得られ
た重合体粒子（粒子径＝０．４９７ミクロン）を実施例
１と同様の操作でヒトＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒ
トＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体反応を行なった。そ
の結果、鋭敏性は１日後×１２８０、３ケ月後×１２８
０、迅速性は１日後５０秒、３ケ月後２５秒、また分散
安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的
凝集が認められなかった。

実施例１０と比較例５〜６ 熱変性ヒトＩｇＧの固定化 ｐＨ８，２に調製したグリシン緩衝液に実施例２で用い
た重合体粒子を０．５％になるよう分散させた。次いで
６０℃で１０分間加熱処理したヒトＩｇＧをグリシン緩
衝液により希釈し１ｍｇ／ｍｌに調整した。０．５％濃
度の重合体粒子分散液１容に熱変性したヒトＩｇＧ希釈
液１容を加え、撹拌し、室温下２時間放置した。その後
ウシ血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し、
４℃に保ち１夜放置して熱変性ヒトＩｇＧを固定化した
重合体を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再
分散の操作を繰返して洗浄した後、熱変性ヒトＩｇＧを
固定化した重合体粒子をウシ血清アルブミンを０．１％
の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃
度を０．５％に調整した。

リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール血清をグ
リシン緩衝液で２０倍に希釈したものを原液として、実
施例１と同様にしてガラス製１０穴のホールグラスにグ
リシン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清を各
ホールに０．０４ｍｌを加え、次いで熱変性ヒトＩｇＧ
を固定化した重合体粒子をグリシン緩衝液で希釈した分
散液を各ホールに０．０４加えて実施例１と同様の操作
で鋭敏性、迅速性及び分散安定性を調べた。その結果、
鋭敏性は１日目×１２８０、３ケ月後×１２８０、迅速
性は１日後７５秒、３ケ月後４５秒、及び分散安定性１
日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応が
認められなかった。

尚、比較例５として比較例１で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作でテストすると、鋭敏性は１
日後×６４０、３ケ月後は×１６０、迅速性は１日後９
０秒、３ケ月後は非特異凝集のため評価できなかった。

また、分散安定性は１日後６本、３ケ月後は３本であっ
た。

さらにまた、比較例６として比較例２で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作でテストすると、鋭
敏性は１白抜×２０、３ケ月後は×２０であり、迅速性
は評価できなかった。また分散安定性は１日後、３ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認められなかっ
た。

実施例１１と比較例７〜８ アルファ−フェトプロテインの抗体の固定化ｐＨ８．２
に調製したグリシン緩衝液に実施例１で用意した重合体
粒子を１．Ｏ％になるように分散させた。次いで家兎の
産生したアルファ−フェトプロテイン（以下α−ＦＰと
略す）の抗体をアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製して得た精製α−ＦＰ抗体を、グリシン緩衝液で
１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。重合体粒子分散液１
容と精製α−ＦＰ抗体の希釈液１容とを加え、撹拌し、
室温下２時間放置した。その後ウシ血清アルブミンを１
％の濃度になるように添加し、４℃に保ち１夜放置して
α−ＦＰ抗体を固定化した重合体粒子を得た。次いで遠
心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作を繰り返して
洗浄した後、α−ＦＰ抗体を固定化した重合体粒子をウ
シ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加したグリシン
緩衝液に再分散し、固型分濃度を０．５％に調整した。

アルファ−フェトプロテインの測定 検体としてヒト血清中のα−ＦＰの濃度が１０００μｇ
／ｍｌであるものを原液とし、グリシン緩衝液で１０倍
ごとの希釈系列を調製した。実施例１と同様にして、ガ
ラス製１０穴のホールグラスにグリシン緩衝液で希釈し
たα−ＦＰを各ホールに０．０４ｍｌ加え、次いでα−
ＦＰ抗体を固定化した重合体粒子の分散液を各ホールに
０．０４ｍｌ加えて、実施例１と同様の操作で鋭敏性、
分散安定性を調べた。

その結果、鋭敏性は１日後の１０μｇ／ｍｌ、３ケ月後
１μｇ／ｍｌであった。分散安定性は１日後及び６ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認められなかっ
た。

尚、比較例７として比較例１で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作で試験すると、鋭敏性は１日
後１０μｇ／ｍｌ、３ケ月後は非特異的凝集反応の結果
、評価できなかった。

さらにまた、比較例８として比較例２で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作で試験すると、鋭敏
性は１日後及び３ケ月後共に１００μｇ／ｍｌであり、
分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特
異的凝集反応が認められなかった。

実施例１２と比較例９〜１０ ヒト絨毛性ゴナドトロピンの抗体の固定化ｐＨ８．２の
０．０１Ｍリン酸緩衝液に、実施例４で用意した重合体
粒子を１．０％になるように分散させた。次いで家兎の
産生したヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下ＨＣＧと略す
）の抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精
製して得た精製ＨＣＧ抗体をｐＨ８．２の０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液で２０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。重合体
粒子分散液１容と、精製ＨＣＧ抗体の希釈液１容とを加
え、撹拌し、室温下２時間放置した。その後ウシ血清ア
ルブミンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち
１夜放置してＨＣＧ抗体を固定化した重合体粒子を得た
。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作を
繰り返して洗浄した後、ＨＣＧ抗体を固定化した重合体
粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加した
グリシン緩衝液に再分散し、固型分濃度を０．５％に調
整した。

ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定 検体としてヒト尿中のＨＣＧの濃度が６４ＩＵ／ｍｌで
あるものを原液とし、グリシン緩衝液で倍数希釈系列を
調製した。実施例１と同様にして、ガラス製１０穴のホ
ールグラスにグリシン緩衝液で希釈したＨＣＧを各ホー
ルに０．０４ｍｌ加え、次いでＨＣＧ抗体を固定化した
重合体粒子の分散液を各ホールに０．０４ｍｌ加えて、
実施例１と同様の操作で鋭敏性、分散安定性を調べた。

その結果、鋭敏性は１日後及び３ケ月後共に１．０ＩＵ
／ｍｌであった。

分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特
異的凝集反応が認められなかった。

尚、比較例９として比較例１で用いた重合体粒子を用い
て上記実施例と同様の操作で試験すると、鋭敏性は１日
後２ＩＵ／ｍｌであったが、３ケ月後は非特異的凝集反
応の結果、評価できなかった。

さらにまた、比較例１０として比較例２で用いた重合体
粒子を用いて、上記実施例と同様の操作で試験すると、
鋭敏性は１日後及び３ケ月後共に３２ＩＵ／ｍｌであり
、分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非
特異的凝集反応が認められなかった。

特許出願人 徳山曹達株式会社 云ｒ−３”’＋ｒ７山＋１；、ｊ’？’（）ｊＩｉＫ；
）昭和５８３１１２月１２１１ ′ｌ！ｉｉ＋’！’１４’Ｌ＊’＋’１′ネ゛「杉和大
賢１、’ｌ；（’ｌの表示 １、ｉｆ蛤ｆｉ；＋、″！５０１５（ｉ’、１ニー３２
叶２究明の名称 診断用品、（枯 ；３．イ＋ｉｉｔｌ−をする老 １）イ！ｌ；’Ｑ）関係特、ｌ’ｌ出１＆ｆｉ人１（１
（イ＋ｌ！、Ｙ讐シｊ７７〕５ １１ノ９ｒ山１−ＩＬ’＋１１．’Ｍ山＋ｉＪｉ；Ｉｔ
’影町］Ｋｉ１を弓／ｌ、肴１ｉｉｌ命令の［１（・１
昭和５＋３イ１１１月１目（同究理１」昭和５８年１１
月２！ｌ１１Ｆ５祖１１１．のλ１象１ソ１面の１；；
１中ん、１９−９１（ハ４閉］；、抽１１．の内容 （＋’）明ンｊｌｌ占第３７１’ｊＩ（ｌｔｒｌ−１次
のし１面の筒中な説明な油１−゛Ｊる。

１７１、図面のｉ′ｉｉｉ’ｆ”〆δ゛説明図１は、本
発明の許断用試Ｖ・の６．ｆ更試験結果なボす。Ｉ Ｌ；ｉｌ−

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（但し、Ｒ１は 水素原子又はアルキル基で、Ｒ２は疎水基である。）で
   示される構造単位と、 一般式 （但し、Ｒは水素原子又はアルキル基である）で示され
   るジヒドロキシ構造単位とよりなり且つ該ジヒドロキシ
   構造単位が０．０５〜３．０モル％の範囲で含まれる重
   合体粒子の表面に免疫活性物質を吸着した診断用試薬。
2. （２）疎水基がアリール基、ハロゲン化アリール基、ア
   ルキルエステル基又はハロゲン原子である特許請求の範
   囲（１）記載の診断用試薬。
3. （３）重合体粒子がジヒドロキシ構造単位を０．１〜２
   ，０モル％含む特許請求の範囲（１）記載の診断用試薬
   。