JPH0326788B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫学的診断用試薬に関する。更に詳
しくは、鋭敏性、安定性、迅速性のすぐれた免疫
学的診断用試薬を提供するものである。 抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査におい
て、凝集反応は沈降反応、補体結合反応と共に、
あるいはこれらに比して著しく簡便かつ鋭敏な反
応として利用されており、遊離細胞や細菌膜表面
に局在する抗原を検出する反応と共に、抗原精製
技術の進歩により特異性の高い抗血清が得られる
ことによつて、特異性の高い抗体を血球粒子、ベ
ントナイト粒子、カオリン粒子、ラテツクス粒子
などの粒子担体に固定させておき、対応する抗原
を凝集反応によつて検査するなど、臨床検査にお
ける応用範囲が著しく拡大している。また、検出
しようとする抗原を固定化した担体粒子に、抗原
に対する抗血清と抗原を含む被検体を加えると固
定化粒子の凝集が阻止されることにより、抗原を
検出又は定量する方法も広く用いられている。さ
らにまた、特異性の高い抗血清の利用により、抗
原・抗体反応を定量的に高感度で検出する試みが
なされ、免疫学的凝集反応を光学的検出手法によ
り定量分析する方法も数多く報告され実施されて
いる。 免疫学的凝集反応用としての担体は種々のもの
が公知で、該担体を使用した種々の診断用試薬が
知られている。これらを大別すると免疫活性物質
を物理的に吸着した診断用試薬と免疫活性物質を
共有結合で結合させた診断用試薬になる。これら
の試薬にはそれぞれ一長一短があり現在なお完全
に満足出来る診断用試薬は存在しない。例えばポ
リスチレン、ポリビニルトルエン、ポリアクリロ
ニトリル、ブタジエン−スチレン共重合体等の疎
水性のラテツクス粒子は免疫活性物質を強固に吸
着する性質があり、粒子径が均一で品質を一定に
出来ること、血清学的に活性がないこと或いは化
学的に比較的に安定であること等の特徴があるた
め実用に供されている。また免疫活性物質を共有
結合で結合させるタイプの診断用試薬は例えば特
開昭56−30405号、特開昭56−141559号、特開昭
57−135801号等、比較的最近試みられている方法
であるが再現性に乏しく、副反応として重合を伴
う場合が多く免疫活性を著しく低下させること、
免疫学的に非特異凝集反応が生じ易いこと等の欠
陥を有し必らずしも成功していない。 しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の
高い抗体の開発、更には定量分析の発展と共に免
疫学的凝集反応は鋭敏性を迅速性が増加し、非特
異的凝集反応が起こらない、しかもより保存安定
性に優れた等の性状を有する診断用試薬の開発が
要望されている。 本発明者等はかかる要望を満たすべく鋭意研究
を重ねて来た結果、特定の組成の重合体粒子で、
しかも特定組成比のものが免疫活性物質を吸着し
て用いるとき、前記要望を満すだけでなく著しく
すぐれた効果をもたらすことを見出した。更に研
究を重ねた結果、本願発明を完成し、ここに提案
するに至つた。 即ち、本発明は、一般式、

【式】（但し、R₁は水素原子又はアルキ ル基で、R₂は疎水基である）で示される構造単
位(A)と、 一般式、

【式】 （但し、Ｒは水素原子又はアルキル基である）で
示される構造単位(B)とよりなり且つ上記構造単位
(B)が0.05〜3.0モル％範囲を含まれた重合体粒子
の表面に免疫活性物質を吸着した診断用試薬であ
る。 本発明で使用する重合体粒子は、 (イ) 一般式、 （但し、R₁は水素原子又はアルキル基で、R₂
は疎水基である）で示される構造単位と、 (ロ) 一般式、 （但し、Ｒは水素原子又はアルキル基である）
で示されるジヒドロキシル構造単位とよりな
り、且つ該ジヒドロキシル構造単位が0.05〜
3.0モル％の範囲で含まれる、重合体粒子であ
る。 上記一般式(A)で示される構造単位のうちR₁で
示されるアルキル基は特に限定されるものではな
いが、一般に工業的観点から低級アルキル基例え
ば炭素原子数１〜４のメチル基、エチル基、プロ
ピル基、ブチル基等が好適に使用される。また一
般式(A)で示される構造単位のうちR₂は疎水基で
あれば特に限定されず公知のものが使用出来る
が、工業的に好適に使用されるものを例示すれ
ば、アリール基；ハロゲン化アリール基；ニトリ
ル基；アルキルエステル基；アルキルエーテル
基；グリシジルエステル基；塩素、臭素、沃素、
フツ素等のハロゲン原子等である。更にまた前記
一般式(B)で示されるジヒドロキシ構造単位中、Ｒ
のアルキル基は前記一般式(A)式中のR₁のアルキ
ル基と同様なものが使用出来る。 本発明で使用する前記一般式(A)及び(B)で示され
る構造単位を有する重合体粒子は一般にこれらの
構造単位を与える単量体を共重合させることによ
つて得ることが出来る。例えば前記一般式(A)で示
される構造単位を与える単量体の代表的なものを
挙げれば、スチレン、ビニルトルエン、α−メチ
ルスチレン、クロルメチルスチレン、塩化ビニ
ル、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メ
タ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレー
ト、グリシジル（メタ）アクリレート、エチルビ
ニルエーテル、（メタ）アクリロニトリル、ある
いは酢酸ビニル等である。これらの単量体は単独
であるいは混合して用いるとよい。これらの中
で、スチレン、ビニルトルエン、クロルメチルス
チレン等のアリール基をもつビニル系単量体の重
合体は最も好適に採用される。 また本発明の前記一般式(B)を与える単量体の代
表的なものを例示すれば、グリシジルアクリレー
ト；グリシジルメタアクリレート；２，３−ジオ
キシアクリレート；２，３−ジオキシメタアクリ
レート等である。そして一般式(B)を付与するため
には一般に前記一般式(A)を与える単量体と一般式
(B)を与える単量体とを共重合し、必要に応じて加
水分解することによつて得るとよい。その代表的
な態様を示せば次の通りである。 (1) グリシジル（メタ）アクリレートと本発明の
疎水基を有するビニル系単量体との共重合体粒
子を弱酸性、弱アルカリ性条件下、あるいは80
℃以上を加熱条件下にエポキシ基を加水分解す
る。 (2) ２，３−ジオキシ（メタ）アクリレートと本
発明の疎水基を有するビニル系単量体との共重
合体粒子を合成する。 従つて、本発明で使用する重合体粒子は、グリ
シジル（メタ）アクリレートと疎水基を有する一
種以上のビニル系単量体の共重合体粒子を弱酸
性、弱アルカリ性、もしくは80℃以上の加熱条件
下にエポキシ基を加水分解して生成するか、ある
いは２，３−ジオキシ（メタ）アクリレートと疎
水基を有する一種以上のビニル系単量体との共重
合体粒子の合成によつて生成する。 また本発明で用いる重合体粒子は前記(B)式で示
される構造単位が0.05乃至3.0モル％の範囲の間
にあることが極めて重要である。該(B)式の構造単
位が0.05モル％より少ない場合には、免疫学的凝
集反応性は高まるが、免疫活性物質を重合体粒子
に吸着させる操作過程での分散安定性が悪くなる
ばかりでなく、診断用試薬の保存安定性が低下す
る欠点がある。逆に、該(B)式の構造単位が3.0モ
ル％より多い場合には、保存安定性は改良される
が、免疫学的凝集反応の鋭敏性と迅速性が極めて
悪くなる。即ち、(B)式の構造単位が3.0モル％よ
り多い場合には、免疫活性物質の該重合体粒子へ
の吸着による固定化が著しく低下する。従つて、
本発明における前記(B)式で示される構造単位が重
合体粒中0.05乃至3.0モル％の範囲の間にあるこ
とが、疎水基を有するビニル構造単位と相補し合
つて、該重合体粒子の表面に免疫活性物質を吸着
して固定化した診断用試薬の免疫学的凝集反応の
迅速性を鋭敏性を向上させるだけでなく、非特異
的凝集反応の抑制と保存安定性を高める効果を同
時に発揮していると推定される。更に好ましく
は、本発明における(B)式で示される構造単位は重
合体粒子中に0.1乃至2.0モル％含まれることが好
適である。 本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径は特
に限定されないが、一般には0.05乃至10ミクロン
の範囲内、好ましくは0.1乃至２ミクロンの範囲
内にあるのが好ましい。該粒子径0.05ミクロン以
下では微弱な免疫学的凝集反応を肉眼で観察する
ことが困難になる場合がある。また粒子径が10ミ
クロン以上になると分散安定性、保存安定性が悪
くなる場合がある。さらにまた、該重合体粒子の
粒子径の単分散性は小さいことが望ましい。 本発明の重合体粒子を得るための製造方法は特
に限定されず、公知の製造方法が好適に採用され
る。例えば、アニオン性界面活性剤、非イオン性
界面活性剤の存在下に乳化重合する方法、界面活
性剤を使わずに水媒体中で水溶性ラジカル開始剤
を用いて不均一重合する方法（ソープフリー重
合）、部分鹸化ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン等の保護コロイド存在下に懸濁重合
する方法、等が採用される。 本発明の重合体粒子に物理吸着によつて固定化
する免疫活性物質としては、特に限定的でなく公
知のものが使用出来る。代表的なものを例示すれ
ば、例えば、変性ガンマグロブリン、リウマチ因
子、抗核因子、ヒトアルブミン、抗ヒトアルブミ
ン抗体、イムノグロブリンＧ（IgG）、イムノグロ
ブリンＡ（IgA）、イムノグロブリンＭ（IgM）、ス
トレプトリジンＯ、抗ストレプトリジンＯ抗体、
Ｃ−反応性蛋白、抗Ｃ−反応性蛋白抗体、アルフ
ア−フエトプロテイン（AFP）、抗AFP抗体、癌
胎児性抗原（CEA）、抗CEA抗体、ヒト胎盤ラク
トゲン（HPL）、抗HPL抗体、ヒト絨毛性ゴナド
トロピン（HCG）、抗HCG抗体、抗エストロゲ
ン抗体、抗インシユリン抗体、Ｂ型肝炎表面抗原
（HBS）、抗HBS抗体、梅毒トレボネーマ抗原、
風疹抗原、補体成分C₁q、抗補体成分C₁q抗体、
等の公知の免疫活性物質をあげることができる。
本発明の重合体粒子に吸着で固定化される該免疫
活性物質の量は、各検査項目に適している割合で
重合体粒子に固定化させればよく、一概に限定さ
れない。一般には抗体／ラテツクス表面積が0.05
〜10mg／m²の範囲となるように選べば好適であ
る。 本発明になる重合体粒子は疎水性と親水性のバ
ランスが極めて良く調節されているので、該重合
体粒子表面に免疫活性物質を極めて容易に物理吸
着法で固定化できる特徴がある。例えば、抗原又
は抗体と重合体粒子を緩衝液又は生理食塩水など
の水媒体中で混合し、抗原又は抗体が化学的に変
化しないように、そしてそれらの免疫学的性質を
保持させるように、非常に緩和な条件下に抗原又
は抗体を重合体粒子表面に吸着させることができ
る。重合体粒子表面に吸着された免疫活性物質の
量は、重合体粒子の疎水基の吸着部位を飽和又は
ブロツクされるように選ぶことが好ましいが、残
存する吸着部位を適当な物質、例えば免疫学的に
不活性な半血清アルブミン、ゼラチン等でブロツ
クさせることができる。 本発明の免疫学的診断用試薬は、分散安定性と
保存安定性が著しく優れるだけでなく、免疫学的
凝集反応の鋭敏性と迅速性も良好である特徴と有
する。この理由は必ずしも明確でないが、ヒドロ
キシル基はカルボキシル基、スルホン酸基等のア
ニオン極性基と異なり、水媒体中での重合体粒子
の分散安定性にPH依存性が極めて少ないこと、
また、免疫学的凝集反応の実施において、水の蒸
発による懸濁液組成の変化がおこり、懸濁液のイ
オン強度が変化しても、ジヒドロキシル基を含有
する重合体粒子はその影響を受け難いこと、さら
にまた、ジヒドロキシル基はヒドロキシル基が隣
接する位置にあるので、特定のジヒドロキシル基
の濃度で診断用試薬の分散安定性と保存安定性が
効果が高められると推定される。さらには、ジヒ
ドロキシル基濃度が小さく、特定の濃度範囲内に
あるために、重合体粒子表面の疎水性部分の面積
が大きく、この疎水性部分に充分な量の免疫活性
物質が吸着されて固定化するために、免疫学的凝
集反応の鋭敏性と迅速性が向上すると推定され
る。 本発明で提供する診断用試薬は前記説明から或
いは後述する実施例からそのすぐれた性能が明白
であるが、物理吸着タイプの診断用試薬でかかる
特性を発揮することは驚異的なことである。例え
ば特開昭57−135801号にはスチレン−グリシジル
メタクリレート共重合ラテツクス粒子に免疫活性
物質を共有結合させる方法が提供されている。該
特開昭の明細書例６にはグリシジルメタクリレー
ト１重量％とスチレン99重量％の混合物を水溶性
ラジカル開始剤を用いて水媒体中で乳化剤の不存
在下に65℃で22時間重合して直径0.5μｍの親水性
ラテツクス粒子を得ている。この得られたラテツ
クス粒子のエポキシ基を同例７に示されたように
加水分解し、次いで過ヨウ素酸ナトリウムを加え
て反応させ、アルデヒド基に変換した。次いで該
ラテツクス粒子のアルデヒド基濃度に対して５倍
当量、10倍当量、20倍当量とヒトIgG濃度を変化
させPH＝7.4のリン酸緩衝液中で後述する本願発
明実施例１と同様の操作でヒトIgGを固定化した
ラテツクス粒子と抗ヒトIgGウサギ血清との抗
原・抗体反応を行なうと、鋭敏性は１日後×640、
３ケ月後×320、迅速性は１日後70秒、３ケ月測
定不能、及び分散安定性は１日後８、３ケ月後６
と良くなかつた。 これに対して、上記重合された１重量％グリシ
ジルメタクリレートを含むポリスチレンラテツク
ス粒子についてエポキシ基を加水分解した後にPH
＝7.4のリン酸緩衝液を用いて本願発明の実施例
１と同様の抗原・抗体反応を行なうと、鋭敏性は
１日後×1280、３ケ月後×1280、迅速性は１日後
50秒、３ケ月後40秒、及び分散安定性は１日後及
び３ケ月後共に保存中に全く非特異凝集は認めら
れない。 以上の結果からも本発明の診断用試薬は前記一
般式(B)で示されるジヒドロキシル構造単位の２つ
のヒドロキシル基が特定組成中に特定量含有され
るとき初めて免疫活性物質を物理吸着させたとき
相乗的な効果を発揮するものと推定される。 本発明を更に具体的に説明するため以下実施例
及び比較例をあげて説明するが本発明はこれらの
実施例に限定されるものではない。 実施例１〜４と比較例１〜４ (1) 重合体粒子の調製 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した
後に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後
に、窒素雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウムを
5.0ミリモル／濃度になるように添加した。
次いで70℃に加温したグリシジルメタクリレー
トとスチレンの混合物を第１表に示す割合で添
加して、70℃で30時間撹拌下に重合した。その
後室温まで冷却してから、得られた重合体粒子
を濾紙（NO2）で濾別して大きな凝集体を除
いた。更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に
除いた後、水蒸気蒸留を６時間行なうことによ
つて重合体粒子上のエポキシ基をジヒドロキシ
ル基に変換した。この加熱条件で全てのエポキ
シ基が加水分解してジヒドロキシル基が生成す
ることが赤外吸収スペクトル及び塩酸付加法に
よるエポキシ基の分析で確認された。次いで遠
心分離、蒸留水への再分散の操作を繰返した後
に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、
更に遠心分離と洗浄を行なつて重合体粒子を精
製した。得られた重合体粒子の粒子径と粒子径
の単分散性を第１表に示す。 (2) ヒトIgGを固定化した重合体粒子の調製 (1)重合体粒子の調製で得られた本発明の重合
体粒子を固型分濃度１％でグリシン緩衝液に分
散した。本発明に於いてグリシン緩衝液とはグ
リシン0.05モル及び食塩0.05モルと水１に溶
解し、次いで２規定水酸化ナトリウム水溶液で
PHを8.2に調製し、さらにアジ化ナトリウム１
ｇを添加したものである。 本発明に於いてヒトIgGは、ヒト血清を飽和
硫安で塩析し、さらに透析を行ない精製したも
のを用いた。 ヒトIgGをグリシン緩衝液により希釈し１
mg／mlに調製する。次いで倍数希釈法によりヒ
トIgGをグリシン緩衝液により希釈してヒト
IgG希釈液を調製する。１％濃度の重合体粒子
分散液１容にヒトIgG希釈液１容を加え撹拌
し、室温下２時間放置する。次いでウシ血清ア
ルブミンを１％の濃度になるように添加し、
4.0℃に保ち１夜放置してヒトIgGを固定化した
重合体粒子を得た。次いで遠心分離、グリシン
緩衝液への再分散の操作を繰り返えすことによ
りヒトIgGを固定化した重合体粒子を洗浄し
た。 さらに遠心分離した後、ヒトIgGを固定化し
た重合体粒子をウシ血清アルブミンを0.1％の
濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散し固型
分濃度を0.5％に調整し、４℃に保ちて保存し
た。 (3) 抗原・抗体反応 ヒトIgGをウサギに免疫して得た抗ヒトIgG
ウサギ全血清を60℃、30分非動化処理を行なつ
た。この血清を以下抗ヒトIgGウサギ血清と呼
ぶ。 抗ヒトIgGウサギ血清をグリシン緩衝液で20
倍に希釈したものを原液とし、倍数希釈法によ
り抗ヒトIgGウサギ血清をグリシン緩衝液で希
釈して抗ヒトIgGウサギ血清希釈液を調製す
る。抗原・抗体反応を行なうためにガラス製10
穴のホールグラスを用意し、グリシン緩衝液で
希釈した抗ヒトIgGウサギ血清を各ホールに
0.04ml加える。次いでヒトIgGを固定化した重
合体粒子のグリシン緩衝液分散液を各ホールに
0.04ml加える。この後直ちい平沢製作所製テー
ハー式撹拌機によりホールグラスを１分間に
120回転の速度で水平回転し撹拌を行なう。抗
原・抗体反応により重合体粒子の凝集が認めら
れるまでに要する時間、すなわち凝集像出現時
間及び所定時間撹拌後の重合体粒子の凝集の有
無から、ヒトIgGを固定化した重合体粒子の特
性である迅速性及び鋭敏性を評価した。ホール
グラスを用いた重合体粒子の凝集試験の結果を
図１に示す。図１は10分間の撹拌後の凝集状態
を示す。凝集が全く認められない場合（−）、
凝集の有無が判定しがたい場合（±）、明らか
に凝集が認められる場合、凝集の強い順に＋＋
＋、＋＋、＋と判定した。図中Ｃは抗原もしくは
抗体を全く含まないことを示す。凝集試験の結
果、明らかに凝集の認められたホールに於ける
抗ヒトIgGウサギ血清希釈液の最高希釈倍数を
もつて、重合体粒子の鋭敏性を評価した。一
方、抗ヒトIgGウサギ血清希釈液の希釈倍数が
×640の希釈液を加えたホールにつき凝集像が
認められるまでの時間をもつて迅速性を評価し
た。 重合体粒子の特性として、さらに重合体粒子
の分散安定性を評価した。すなわち、重合体粒
子にヒトIgG希釈液を加え室温で２時間放置し
た後の重合体粒子の分散状態をもつて重合体粒
子のヒトIgG固定化時の分散安定性を評価し
た。又ヒトIgG固定化後３ケ月経過した後の重
合体粒子の分散状態をもつてヒトIgGを固定化
した重合体粒子の保存中の分散安定性を評価し
た。 尚、比較例として、(A)式で示される構造単位が
本発明の範囲外となる如く、第１表に示す割合で
グリシジルメタクリレートとスチレンの混合物を
用いた以外、全て上記実施例と同様の操作で調節
した重合体粒子及びその診断用試薬の特性を第１
表に示す。また、本発明の(A)式で示される構造単
位を含まない重合体粒子として、ダウ・ケミカル
社製ポリスチレンラテツクス粒子径＝0.497ミク
ロン、分散値＝1.2％（比較例４）を用いた。但
し、このダウ・ケミカル社製のボリスチレンラテ
ツクスは水蒸気蒸留を行なうと、著しく凝集粒子
を発生するために、水蒸気蒸留を行なわずに水洗
いで精製したものを用いた。その結果を第１表に
示す。

【表】 実施例 ５ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて75℃に保つた後に、窒
素雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモ
ル／、チオ硫酸ナトリウム５ミリモル／、硫
酸銅0.25ミリモル／、及び２−メルカプトエタ
ノール1.0c.c.を添加した。次いで75℃に加温した
グリシジルアクリレート10ミリモル及びメチルメ
タクリレート2.86モルの混合物を添加して、75℃
で１時間撹拌下に重合した。その後の操作は実施
例１と同様な操作を行なつた。得られた重合体粒
子の粒子径は0.215ミクロンであつた。この重合
体粒子をを実施例１と同様の操作でヒトIgGを吸
着し固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗原・
抗体反応を行なつた。その結果、鋭敏性は１日後
×1280、３ケ月後×1280、迅速性は１日後50秒、
３ケ月後30秒、また分散安定性は１日後及び３ケ
月後共に保存中に全く非特異的凝集が認められな
かつた。 実施例 ６ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後に、窒
素雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモ
ル／と２−メルカプトエタノール0.5c.c.を添加
した。次いで70℃に加温したグリシジルメタクリ
レート10ミリモル、スチレン2.0モル、及びクロ
ルメチルスチレン0.85モルの混合物を添加して48
時間撹拌下に重合した。その後の操作は実施例１
と同様な操作を行なつた。得られた重合体粒子の
粒子径は0.495ミクロンであつた。この重合体粒
子を実施例１と同様の操作でヒトIgGを吸着して
固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗原・抗体
反応を行なつた。その結果、鋭敏性は１日後×
2560、３ケ月後×2560、迅速性は１日後45秒、３
ケ月後25秒、また分散安定性は１日後及び３ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集が認められなか
つた。 実施例 ７ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.、ドデシルベンゼンスルホン酸
ナトリウム1.0ｇ、過硫酸カリウム５ミリモル／
、２，３−ジオキシメタクレート15ミリモル、
及びスチレン2.8モルを添加して充分に乳化した
後に、70℃に昇温して48時間撹拌下に重合した。
その後室温まで放冷してから、得られた重合体粒
子を濾紙（NO2）で濾別して凝集体を除いた。
更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後
に、１カ月間セロフアン膜で乳化剤で除いた。次
いでイオン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更
に遠心分離と洗浄を行なつて重合体粒子を精製し
た。得られた重合体粒子の粒子径は0.372ミクロ
ンであつた。この重合体粒子を実施例１と同様の
操作でヒトIgGの吸着して固定化し、抗ヒトIgG
ウサギ血清との抗原・抗体反応を行なつた。その
結果、鋭敏性は１日後×1280、３ケ月後×2560、
迅速性は１日後40秒、３ケ月後20秒、また分散安
定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特
異的凝集反応が認められなかつた。 実施例 ８ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて60℃に保つた後に、窒
素雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウム６ミリモ
ル／を添加した。次いで60℃に加温したグリシ
ジルメタクリレート12ミリモル及びクロルメチル
スチレン2.85モルの混合物を添加して60℃で48時
間撹拌下に重合した。その後の操作は実施例１と
同様な操作を行なつた。得られた重合体粒子を実
施例１と同様の操作でヒトIgGを吸着して固定化
し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗原・抗体反応を
行なつた。その結果、鋭敏性は１日後×1280、３
ケ月後×2560、迅速性は１日後45秒、３ケ月後25
秒、また分散安定性は１日後及び３ケ月後共に保
存中に全く非特異的凝集が認められなかつた。 実施例 ９ 撹拌機付きガラス製オートクレーブを窒素置換
した後に、蒸留水2700c.c.を加えて65℃に保つた後
に窒素雰囲気下に過硫酸カリウム６ミリモル／
及び塩化カリウム25ミリモル／濃度になるよう
に添加した。次いで65℃に加温したグリシジルメ
タクリレート25ミリモル及び塩化ビニルモノマー
5.0モルの混合物を窒素圧でオートクレーブに圧
入して65℃で撹拌下に1.5時間重合した。この時
点で塩化ビニルモノマーの部分圧は約1/3に低下
していた。次いで残存する未反応の塩化ビニルモ
ノマーをパージしてから、得られた重合体粒子を
濾紙（NO.2）で濾別して大きな凝集体を除いた。
更に粗い重合体粒子を遠心分離で充分に除いた後
に、PH＝３の酸性水溶液中で重合体粒子上のエポ
キシ基を加水分解してジヒドロキシル基に変換し
た。次いでセロフアン膜で１カ月間透析を行なつ
た後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行な
い、更に遠心分離と洗浄を行なつて重合体粒子を
精製した。かくして得られた重合体粒子（粒子径
＝0.497ミクロン）を実施例１と同様の操作でヒ
トIgGを吸着して固定化し、抗ヒトIgGウサギ血
清との抗原・抗体反応を行なつた。その結果、鋭
敏性は１日後×1280、３ケ月後×1280、迅速性は
１日後50秒、３ケ月後25秒、また分散安定性は１
日後及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集
が認められなかつた。 実施例10と比較例５〜６ 熱変性ヒトIgGの固定化 PH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例２で
用いた重合体粒子を0.5％になるよう分散させた。
次いで60℃で10分間加熱処理したヒトIgGをグリ
シン緩衝液により希釈し１mg／mlに調整した。
0.5％濃度の重合体粒子分散液１容に熱変性した
ヒトIgG希釈液１容を加え、撹拌し、室温下２時
間放置した。その後ウシ血清アルブミンを１％の
濃度になるように添加し、４℃に保ち１夜放置し
て熱変性ヒトIgGを固定化した重合体を得た。次
いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散の操作
を繰返して洗浄した後、熱変性ヒトIgGを固定化
した重合体粒子をウシ血清アルブミンを0.1％の
濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散し、固型
分濃度を0.5％に調整した。 リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール
血清をグリシン緩衝液で20倍に希釈したものを原
液として、実施例１と同様にしてガラス製10穴の
ホールグラスにグリシン緩衝液で希釈した慢性関
節リウマチ患者血清を各ホールに0.04mlを加え、
次いで熱変性ヒトIgGを固定化した重合体粒子を
グリシン緩衝液で希釈した分散液を各ホールに
0.04ml加えて実施例１と同様の操作で鋭敏性、迅
速性及び分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性
は１日後×1280、３ケ月後×1280、迅速性は１日
後75秒、３ケ月後45秒、及び分散安定性１日後及
び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応が
認められなかつた。 尚、比較例５として比較例１で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作でテストする
と、鋭敏性は１日後×640、３ケ月後は×160、迅
速性は１日後90秒、３ケ月後は非特異凝集のため
評価できなかつた。また、分散安定性は１日後６
本、３ケ月後は３本であつた。 さらにまた、比較例６として比較例２で用いた
重合体粒子を用いて上記実施例と同様の操作でテ
ストすると、鋭敏性は１日後×20、３ケ月後は×
20であり、迅速性は評価できなかつた。また分散
安定性は１日後、３ケ月後共に保存中に全く非特
異的凝集反応が認められなかつた。 実施例11と比較例７〜８ アルフア−フエトプロテインの抗体の固定化 PH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例１で
用意した重合体粒子を1.0％になるように分散さ
せた。次いで家兎の産出したアルフア−フエトプ
ロテイン（以下α−FPを略す）の抗体をアフイ
ニテイ−クロマトグラフイーにより精製して得た
精製α−FP抗体を、グリシン緩衝液で10μｇ／ml
の濃度に希釈した。重合体粒子分散液１容と精製
α−FP抗体の希釈液１容とを加え、撹拌し、室
温下２時間放置した。その後ウシ血清アルブミン
を１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち１
夜放置してα−FP抗体を固定化した重合体粒子
を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再
分散の操作を繰り返して洗浄した後、α−FP抗
体を固定化した重合体粒子をウシ血清アルブミン
を0.1％の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分
散し、固型分濃度を0.5％に調整した。 アルフア−フエトプロテインの測定 検体としてヒト血清中のα−FPの濃度が1000μ
ｇ／mlであるものを原液とし、グリシン緩衝液で
10倍ごとの希釈系列を調製した。実施例１と同様
にして、ガラス製10穴のホールグラスにグリシン
緩衝液で希釈したα−FPを各ホールに0.04ml加
え、次いでα−FP抗体を固定化した重合体粒子
の分散液を各ホールに0.04ml加えて、実施例１と
同様の操作で鋭敏性、分散安定性を調べた。その
結果、鋭敏性は１日後10μｇ／ml、３ケ月後1μ
ｇ／mlであつた。分散安定性は１日後及び３ケ月
後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認められ
なかつた。 尚、比較例７として比較例１で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作で試験する
と、鋭敏性は１日後10μｇ／ml、３ケ月後は非特
異的凝集反応の結果、評価できなかつた。 さらにまた、比較例８として比較例２で用いた
重合体粒子を用いて上記実施例と同様の操作で試
験すると、鋭敏性は１日後及び３ケ月後共に
100μｇ／mlであり、分散安定性は１日後及び３
ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認め
られなかつた。 実施例12と比較例９〜10 ヒト絨毛性ゴナドトロピンの抗体の固定化 PH8.2の0.01Mリン酸緩衝液に、実施例４で用
意した重合体粒子を1.0％になるように分散させ
た。次いで家兎の産生したヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（以下HCGと略す）の抗体をアフイニテイ
−クロマトグラフイ−により精製して得た精製
HCG抗体をPH8.2の0.01Mリン酸緩衝液で20μｇ／
mlの濃度に希釈した。重合体粒子分散液１容と、
精製HCG抗体の希釈液１容とを加え、撹拌し、
室温下２時間放置した。その後ウシ血清アルブミ
ンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち
１夜放置してHCG抗体を固定化した重合体粒子
を用いた。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への
再分散の操作を繰り返して洗浄した後、HCG抗
智を固定化した重合体粒子をウシ血清アルブミン
を0.1％の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分
散し、固型分濃度を0.5％に調整した。 ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定 検体としてヒト尿中のHCGの濃度が64IU／ml
であるものを原液とし、グリシン緩衝液で倍数希
釈系列を調製した。実施例１と同様にして、ガラ
ス製10穴のホースグラスにグリシン緩衝液で希釈
したHCGを各ホールに0.04ml加え、次いでHCG
抗体を固定化した重合体粒子の分散液を各ホール
に0.04ml加えて、実施例１と同様の操作で鋭敏
性、分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は１
日後及び３ケ月後共に1.0IU／mlであつた。分散
安定性は１日後及び３ケ月後共に保存中に全く非
特異的凝集反応が認められなかつた。 尚、比較例９として比較例１で用いた重合体粒
子を用いて上記実施例と同様の操作で試験する
と、鋭敏性は１日後2IU／mlであつたが、３ケ月
後は非特異的凝集反応の結果、評価できなかつ
た。 さらにまた、比較例10として比較例２で用いた
重合体粒子を用いて、上記実施例と同様の操作で
試験すると、鋭敏性は１日後及び３ケ月後共に
32IU／mlであり、分散安定性は１日後及び３ケ
月後共に保存中に全く非特異的凝集反応が認めら
れなかつた。 実施例13と比較例11 撹拌機きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後に、窒
素雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウムを5.0ミリ
モル／の濃度になるように添加した。次いで70
℃に加温したグリシジルメタクリレート5.8ミリ
モルとスチレン2.9×10³ミリモルの混合物を添加
して、70℃で30時間撹拌下に重合した。得られた
ラテツクス粒子の粒子径は0.5511ミクロン、分散
値＝2.2％であつた。 また、比較例として界面活性剤の一種である脂
肪酸モノグリセリンエステルに分類されるグリセ
リンモノラウレート5.8ミリモルを上記実施例の
グリシジルメタクリレート5.8ミリモルに代えて
用いた以外は上記実施例と同様に重合した。得ら
れたラテツクス粒子の粒子径は0.452ミクロン、
分散値＝5.3％であつた。 上記実施例と比較例で得た重合体粒子を濾紙
（No.２）で濾別した後、水蒸気蒸留を６時間行つ
た。比較例で得た重合体粒子は、水蒸気蒸留を行
うと、著しく凝集粒子を発生するために、水蒸気
蒸留を行わずに水洗いで精製したものを用いた。
これに対して上記実施例で得た重合体粒子は水蒸
気蒸留を行つた後も安定に分散しており、実施例
１と同様に精製した。 この重合体粒子に実施例１と同様な操作でヒト
IgGを吸着して固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清
との抗原・抗体反応を行つた。その結果、前記実
施例で得た重合体粒子では、鋭敏性が１日後×
2560、３ケ月後×2560、また分散安定性は１日後
及び３ケ月後共に保存中に全く非特異的凝集反応
が認められらかつた。これに対し、前記比較例で
得た重合体粒子では、鋭敏性が１日後×2560であ
つたが、保存中に非特異凝集を起こし、３ケ月後
は鋭敏性を評価できなかつた。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の診断用試薬の凝集試験結果を
示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式、【式】（但し、R₁は水素原 子又はアルキル基で、R₂は疎水基である）で示
   される構造単位(A)と、 一般式、【式】 （但し、Ｒは水素原子又はアルキル基である）で
   示される構造単位(B)とよりなり且つ上記構造単位
   (B)が0.05〜3.0モル％の範囲で含まれた重合体粒
   子の表面に免疫活性物質を吸着した診断用試薬。