JPH0157688B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は主として免疫血清学的診断に用いて好
適な診断試薬用ラテツクスの製造方法に関する。
従来、ラテツクス粒子を担体とし、抗原又は抗体
を感作させ、血清中の抗体もしくは抗原と特異的
に起る抗原、抗体反応によりラテツクス粒子の凝
集反応、沈降反応、溶解反応、補体結合反応を生
じさせ、その結果により各種疾患の診断を行うこ
とが免疫血清学的診断法として臨床検査の分野に
おいて行なわれており、例えばリウマチ因子、
HBs抗原、HBs抗体、抗ストレプトリジン−Ｏ
（ASO）、Ｃ−反応性蛋白質（CRP）、α−フエト
プロテイン、癌胎児性抗原（CEA）等の検査に
も診断試薬用ラテツクスが用いられている。 かかる診断試薬用ラテツクスとして、0.05〜1μ
ｍの粒径のポリスチレン粒子が分散されたラテツ
クスが一般的であり、通常は乳化重合によつて製
造されている。 しかしながら、かゝるラテツクスにおける乳化
剤の量が多い場合は、ポリスチレン粒子は抗体又
は抗原で感作後も非常に安定であり、陽性血清中
の対応する抗原もしくは抗体との間で鋭敏な凝集
反応等を示さないものとなり、ときには全く凝集
反応を示さないこともある。又逆に乳化剤の量が
少ない場合は、抗体又は抗原で感作したポリスチ
レン粒子が保存中にしばしば凝集反応を起し、対
応する抗原もしくは抗体を含まない陰性血清と混
合した場合でも凝集反応を起すことがあり、この
ような場合は、誤つた診断結果を招くことにな
る。 通常の乳化重合により得られるラテツクスを用
いる場合は乳化剤が多すぎるか少なすぎるかのい
ずれかの状態となつているのが殆んどの場合であ
り、このため陽性血清と接触した際に凝集反応等
を鋭敏に示し、保存中に凝集反応を生ずることが
なく、陰性血清と接触した場合に凝集反応を起す
ことのない診断用ラテツクスは得られていなかつ
た。 本発明はかゝる欠点のない診断用ラテツクスを
得ることを目的としてなされたものであり、その
要旨とするところは、スチレンもしくはジビニル
ベンゼンと、スチレンスルホン酸もしくはその金
属塩とを乳化重合し、遊離の乳化剤を除去し、緩
衝液に分散させることを特徴とする、診断試薬用
ラテツクスの製造方法に存する。 次に本発明診断試薬用ラテツクスの製造方法に
ついて更に詳細に説明する。 スチレンスルホン酸の金属塩としては、そのナ
トリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等が存す
る。 スチレンもしくはジビニルベンゼンと、スチレ
ンスルホン酸もしくはその金属塩との使用割合
は、全単量体100重量部中にスチレンスルホン酸
もしくはその金属塩が10重量部以下含有されるの
が好適であり、最適には0.001重量部乃至５重量
部とされる。この場合においてスチレンスルホン
酸とその金属塩とが共存されていてもよい。 スチレンもしくはジビニルベンゼンと、スチレ
ンスルホン酸もしくはその金属塩とが乳化重合さ
れる。 この場合の乳化剤としては、アニオン系界面活
性剤又は非イオン系界面活性剤が使用に適する。
アニオン系界面活性剤としては、高級アルコール
の硫酸エステルソーダ、ナフタレンスルホン酸ソ
ーダ、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ等が使
用され、又非イオン系界面活性剤としては、ポリ
エチレングリコールアルキルフエニルエーテル、
ポリエチレングリコールアルキルフエニルエーテ
ル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレング
リコールソルビタン脂肪酸エステル等が使用され
る。乳化剤の使用量は、全単量体100重量部当り
0.5重量部以下とされるのが好適であり、最適に
は0.01乃至0.1重量部とされる。 乳化重合を行なわせるために、水溶性のラジカ
ル重合開始剤が使用される。ラジカル重合開始剤
としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウ
ム等の過硫酸塩、２，2′−アゾビス（２−アミジ
ノプロパン）鉱酸塩、アゾビスシアノブアレリン
酸及びそのアルカリ金属塩及びアンモニウム塩等
のアゾ化合物、酒石酸−過酸化水素、ロンガリツ
ト−過酸化物、アスコルビン酸−過酸化物等のレ
ドツクス系開始剤等があげられ、これらのうちで
過硫酸塩が最適である。ラジカル重合開始剤の使
用量は全単量体100重量部当り0.01乃至１重量部
とされるのが好適である。 乳化重合を行なうには、水が仕込まれた反応器
内に、スチレンもしくはジビニルベンゼン、スチ
レンスルホン酸もしくはその金属塩、乳化剤、ラ
ジカル重合開始剤を加えて撹拌しながら加熱すれ
ばよい。この際の加熱温度は通常50乃至100℃で
あり、好適には60乃至85℃の範囲とされるのがよ
い。又重合に要する時間は単量体の種類、組成、
濃度、ラジカル重合開始剤の濃度等によつて変る
が、通常は５乃至50時間の範囲とされる。 このようにして、スチレンもしくはジビニルベ
ンゼンとスチレンスルホン酸もしくはその金属塩
との共重合体（スチレンもしくはジビニルベンゼ
ンとスチレンスルホン酸とその金属塩との三元共
重合体の場合を含む。以下同じ）であつて、平均
粒径が0.05乃至2μｍで、粒径のばらつきが変動係
数（粒径の標準偏差／平均粒径）で表わして0.05
以下である、粒径が非常によく揃つた単分散ラテ
ツクスを得ることができる。 しかしながら前記のラテツクスは遊離の乳化剤
を含有しているので、透析又はイオン交換により
除去する。透析により遊離の乳化剤を除去するに
は、セロフアン紙等の半透膜の袋体、チユーブ等
を用い内部に前記のラテツクスを導入し蒸溜水等
を外側に配し、蒸溜水を新鮮なものと置換えるこ
とによりラテツクス中の乳化剤を除去することが
できる。またイオン交換により遊離の乳化剤を除
去するには、イオン交換樹脂、例えばアミノエチ
ル基やジエチルアミノエチル基を有するセルロー
ズゲルを充填した筒内に前記のラテツクスを通過
させ、ラテツクス中の乳化剤を除去するものであ
り、アニオン系の界面活性剤を使用した場合に特
に有効である。ラテツクス中の遊離の乳化剤が除
去された後のものは、前記共重合体粒子のスルホ
ン基に由来する電荷及び前記共重合体粒子に吸着
されている乳化剤によつて単分散状態が安定に保
持される。このようにして得られた、遊離の乳化
剤が除去されたラテツクスは適宜洗滌された後、
緩衝液に分散される。ラテツクスを緩衝液に分散
させるのは、前記共重合体粒子を再分散させると
共に、前記共重合体粒子に血清学的活性物質を感
作させるに適したPH値を付与し、更にラテツクス
を診断試薬用として適した濃度に調整するためで
ある。 緩衝液としてはクエン酸−Na₂HPO₄緩衝液、
クエン酸ソーダ−苛性ソーダ緩衝液、KH₂PO₄−
Na₂HPO₄緩衝液、ベロナールソーダ−塩酸緩衝
液、ホウ酸−ホウ砂緩衝液、グリシン−苛性ソー
ダ緩衝液、Briflon−Robinson緩衝液、Johnson
−Lindsay緩衝液、Teorell−Stenhagen緩衝液等
が使用に適する。緩衝液としてはPH値が6.5乃至
8.5の範囲とされるのが好適である。また緩衝液
に分散されたラテツクスの固形分濃度は、分散液
の全量100重量部当り５重量部以下とされるのが
好適であり、最適には0.5乃至３重量部の範囲と
される。 緩衝液に分散されている前記共重合体粒子に血
清学的活性物質が感作される。ここでいう血清学
的活性物質とは、臨床検査において血清学的診断
の対象となる抗体又は抗原に対応する抗原又は抗
体をいう。 血清学的活性物質により前記共重合体粒子を感
作させるには、例えば緩衝液に前記共重合体粒子
が分散されたラテツクスと、緩衝液で希釈された
血清学的活性物質を混合し、20乃至37℃で撹拌す
ればよい。更に血清学的活性物質が吸着されない
前記共重合体粒子を飽和させるために血清学的に
不活性な生化学物質、例えばウシ血清アルブミン
等を吸着させておくことができる。 本発明により得られる診断試薬用ラテツクスに
おいては遊離の乳化剤が除去されているが、前記
共重合体粒子のスルホン基に由来する電荷及び前
記共重合体粒子に吸着されている乳化剤によつて
前記共重合体粒子の単分散状態が安定に保持され
たものとなり、保存中に凝集反応を生じたりしな
いものとなる。そしてかゝるラテツクスは、これ
に抗原又は抗体を感作されて診断試薬とされるの
であるが、臨床検査における免疫血清学的診断に
供された際に非特異的な凝集反応を起すおそれが
ないばかりでなく、診断の対象となる抗原又は抗
体に対して鋭敏な凝集反応を示し、感度がすぐれ
たものとなる。 以下に本発明の実施例を記す。実施例中単に部
とあるのは重量部を示す。 実施例 １ (1‐1) 診断試薬用ラテツクスの製造 スチレン単量体99部、スチレンスルホン酸ソ
ーダ１部、過硫酸カリウム0.05部、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸ソーダ0.1部、イオン交換水
500部を反応容器に仕込み、窒素気流中で反応
温度70℃で24時間をかけて重合させた。このよ
うにして得られたスチレン−スチレンスルホン
酸ソーダ共重合体粒子の平均粒径は0.35μｍで
あり、変動係数は0.04であつた。 上記により得られたラテツクスを透析装置に
かけセルローズチユーブ内にラテツクスを入れ
て室温で24時間をかけて透析し、ドデシルベン
ゼンスルホン酸ソーダを除去した。 次いで0.5モルのNaH₂PO₄50mlに0.5モルの
Na₂HPO₄を41.1mlを加え、更に蒸溜水を加え
て200mlに希釈して得られたPH7.4のリン酸緩衝
液に、前記のラテツクスを固形分濃度が２重量
％になる様に分散させた。 (1‐2) 診断試薬の調整 HBs抗原を、フロイント完全アジユバンド
の中に分散させたものを３週間おきに３回モル
モツトの皮下に注射し、３回目の注射終了後、
３週間後に心臓より採血した。 次にセフアロース4BにHBs抗原を固定した
カラムを用いたアフイニテイークロマトグラフ
イーにより精製した。この際上記の全血から血
清を採取し、血清をPH8.0のトリス−塩酸緩衝
液（0.2モルのトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン25mlに0.1モルの塩酸28.1mlを加え、蒸
溜水で100mlになるように希釈したもの）に溶
かしたものを２回流通させた。その後4.5モル
の塩化マグネシウム又はチオシアン酸アンモニ
ウムで溶離し、溶離液を抗体量が40μｇ／mlに
なるように前記のリン酸緩衝液に溶解させた。 （１−１）により得られたラテツクスをリン
酸緩衝液に分散させたものと、上記により得ら
れた抗体をリン酸緩衝液に溶解させたものを等
量混合し、37℃で３時間をかけて前記共重合体
粒子に抗体を感作させた。 次いで15000回転／分で15分間遠心分離し、
前記共重合体粒子に感作されなかつた抗体を除
去した。尚抗体は99.5％以上が前記共重合体粒
子に感作された。遠心分離により沈降した前記
共重合体粒子をリン酸緩衝液で十分洗滌後、正
常なモルモツトの血清を0.2重量％含有するリ
ン酸緩衝液を加えて、抗体が感作されている共
重合体粒子を再分散させ37℃で10分間撹拌し
た。このリン酸緩衝液中にHBs抗体が30μｇ／
ml含まれていた。 更に、12000回転／分で遠心分離し、上清を
捨て沈降した処理後の抗体が感作されている前
記共重合体粒子をPH７のリン酸緩衝液に再分散
して診断試薬を調整した。 (1‐3) 評価 保存安定性 上記の診断試薬を20℃で保存し、製造直後、
10日後、20日後、30日後、50日後の凝集状態を
観察した。その結果を表１の実施例１の欄に示
す。 感 度 種々の濃度のHBs抗原を含むヒト血清と、
上記の診断試薬をプレート上で混合し、凝集の
強さを判定した。その結果を表２−１の実施例
１の欄に示す。 非特異的凝集反応 血清中のHBs抗原が0.4nｇ／mlである事が判
明している1000人の正常人血清について偽陽性
の件数をみた。その結果を表３−１の実施例１
の欄に示す。 上記の評価結果より本発明により得られる診
断試薬用ラテツクスは保存安定性にすぐれ、又
このラテツクスを用いた診断試薬は感度がすぐ
れ、非特異的凝集反応を生じないものであるこ
とが判明した。 実施例 ２ (2‐1) 診断試薬用ラテツクスの製造 スチレン単量体70部、ジビニルベンゼン単量
体28部、スチレンスルホン酸ソーダ２部、ポリ
エチレングリコールノニルフエニルエーテル
0.2部、過硫酸カリウム0.05部、イオン交換水
500部を反応容器に仕込み、窒素気流中で反応
温度70℃で24時間をかけて重合させた。このよ
うにして得られたスチレン−ジビニルベンゼン
−スチレンスルホン酸ソーダ共重合体粒子は平
均粒径が0.40μｍであり変動係数は0.03であつ
た。 上記により得られたラテツクスを透析装置に
かけ、セルローズチユーブ内にラテツクスを入
れて室温で24時間をかけて透析し、ポリエチレ
ングリコールノニルフエニルエーテルを除去し
た。次いでPH8.5のグリシン−苛性ソーダ緩衝
液に前記のラテツクスを固形分濃度が２重量％
になるように分散させた。 (2‐2) 診断試薬の調整 上記により得られたラテツクスと、グリシン
緩衝液中に0.1重量％含有されるように希釈し
たヒトγ−グロブリン溶液を等量混合し、30℃
で15分間保持した後、26000Gで遠心分離し、
前記共重合体粒子に感作されなかつたヒトγ−
グロブリンを除去し、沈降した共重合体粒子を
グリシン緩衝液で洗浄した。次いでこの共重合
体粒子をグリシン緩衝液に再分散して診断試薬
とした。 (2‐3) 評価 保存安定性 実施例１と同様にして行つた。その結果を表
１の実施例２の欄に示す。 感 度 グリシン緩衝液で種々の倍率に希釈したリウ
マチ因子を含む血清１滴と前記診断試薬１滴と
をガラスプレート上で混合して凝集状態を観察
した。その結果を表２−２の実施例２の欄に示
す。 非特異的凝集反応 リウマチ因子を含まない血清をグリシン緩衝
液で20倍に希釈したものを用いて、診断試薬と
の凝集状態を観察した。その結果を表３−２の
実施例２の欄に示す。 比較例 １ 実施例１において、スチレンスルホン酸ソーダ
１部を使用しないものとし、ドデシルベンゼンス
ルホン酸ソーダの使用量を1.0部とし、又透析を
行なわないこととした以外は実施例１と同様にし
て平均粒径0.35μｍ、変動係数0.07のポリスチレ
ン粒子が分散された診断試薬用のラテツクスを製
造した。次いで実施例１と同様にして診断試薬の
調整を行つた。更に実施例１と同様にして保存安
定性、感度、非特異的凝集反応の評価を行なつ
た。 表１、２−１、３−１に比較例１の欄の結果よ
り、実施例１に比して保存安定性が悪く、又感度
がやゝ劣り、非特異的凝集反応を起し易いことが
判明した。 比較例 ２ 実施例１において、スチレンスルホン酸ソーダ
１部を使用しないものとし、ドデシルベンゼンス
ルホン酸ソーダの使用量を2.0部とし、又透析を
行なわないこととした以外は実施例１と同様にし
て平均粒径0.30μｍ、変動係数0.05のポリスチレ
ン粒子が分散された診断試薬用ラテツクスを製造
した。次いで実施例１と同様にして診断試薬の調
整を行なつた。更に実施例１と同様にして保存安
定性、感度、非特異的凝集反応の評価を行なつ
た。 表１、２−１、３−１比較例２の欄の結果よ
り、実施例１に比して感度が非常に悪く、又非特
異的凝集反応を生じやすいものであることが判明
した。 比較例 ３ 実施例２において、スチレンスルホン酸ソーダ
２部を使用しないものとし、ジビニルベンゼン単
量体の使用量を30部、ポリエチレングリコールノ
ニルフエニルエーテルの使用量を0.5部とし、又
透析を行なわないこととした以外は実施例２と同
様にして平均粒径0.35μｍ、変動係数0.05のスチ
レン−ジビニルベンゼン共重合体粒子が分散され
た診断試薬用ラテツクスを製造した。次いで実施
例２と同様にして診断試薬の調整を行なつた。更
に実施例２と同様にして保存安定性、感度、非特
異的凝集反応の評価を行なつた。表１、２−２、
３−２の比較例３の欄の結果より、実施例２に比
して保存安定性が悪く、感度がやや劣り、非特異
的凝集反応を起し易いことが判明した。 比較例 ４ 実施例２においてスチレンスルホン酸ソーダ２
部を使用しないものとし、ジビニルベンゼン単量
体の使用量を30部、ポリエチレングリコールノニ
ルフエニルエーテルの使用量を2.0部とし、又透
析を行なわないこととした以外は実施例２と同様
にして平均粒径0.30μｍ、変動係数0.06のスチレ
ン−ジビニルベンゼン共重合体粒子が分散された
診断試薬用ラテツクスの製造を行ない、又診断試
薬の調整を行なつた。 更に実施例２と同様にして保存安定性、感度、
非特異的凝集反応の評価を行なつた。表１、２−
２、３−２の比較例４の欄の結果より実施例２に
比して感度が悪く、非特異的凝集反応を起し易い
ことが判明した。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スチレンもしくはジビニルベンゼンと、スチ
   レンスルホン酸もしくはその金属塩とを乳化重合
   し、遊離の乳化剤を除去し、緩衝液に分散させる
   ことを特徴とする、診断試薬用ラテツクスの製造
   方法。 ２ 遊離の乳化剤を透析により除去することを特
   徴とする、特許請求の範囲第１項記載の診断試薬
   用ラテツクスの製造方法。 ３ 遊離の乳化剤をイオン交換により除去するこ
   とを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の診
   断試薬用ラテツクスの製造方法。