JPS5896616A - 抗原、抗体またはハプテンの検出試薬およびそれに使用するラテックス並びにそれらの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はラテックスの製法、および遊離ア建ノ基ｔｖす
る低分子量を九は高分子量の生物学的に活性な物質１に
ラテックス粒子表面上においてアルデヒド官能基から導
かれた反応性の基に共有カップリングさせることＫよる
生物学的に活性なラテックス粒子の製法に関する。これ
ら生物学的に活性なラテックスコンジュゲートは匍清学
的筐九ヰ免疫学的欄定操作に特に適する。

適当な免疫学的試薬を負荷された指示ｍｔ＊は担体小粒
子を便用することによシかかる測定法の感ＦｔＬを高め
ることは知らｎている。赤血球または細胞培養物の細胞
のような生吻学的担体物質と並んでｔ直径α０５〜５μ
ｍ’ｉ有するラテックス粒子が主として使用されている
。その広い用、途にも拘らず、従来ラテックス試験操作
は負荷されたラテックス粒子が非特異的に相互に反応す
るか、免疫学的試薬がラテックス粒子の表面と接触する
ことＫよりそれらの生物学的活性が失われるか、または
それらが粒子から脱着される可能性があるという特別な
欠点を有していた・ 担体への免疫学的試薬の化学結合はこれまで使用されて
きた物理的な表面吸着よシ優れていることが示され九・ 従来、担体および免疫学的に活性な物質を結合させるた
めＫは蛋白質の反応性基を担体粒子のそれと結合させる
二官能性カップリング剤が必要とされていた。？−の方
法の欠点は、使用された免疫学的に活性な物質の望まし
からぬ交叉結合が剛反応として起りうろこと、そしてそ
れＫよりこれらが不活性化されるか′ｔたは担体とのカ
ップリングにもはや便用しえないということである・ さらに、結合が重付中に導入されうる表面エポキシド基
またはジアゾ化しうる芳香族ア建ノ化合物によって遂行
される方法も知られている。

一般にこの方法はラテックスのとｎら反応性の基が免疫
学的に活性な物質の多数の官能基と反応しうるという欠
点を有する−それによ）、免疫学的に活性な物質の反応
性を立体的作用によシ′を光は配座変更により破壊する
望ましからぬ結合が生成されうる。さらにもう一つＯ欠
点は、エポキシドは例えば加水分解によシ分解されるの
でとｎら結合のできる基は不安定であって。

従ってかかる活性なラテックス粒子は比較的長時間貯蔵
さｒｔ得ない−。

すなわち、簡単Ｋｔｌ１ｍできそして感度の高い免疫学
的に活性な物質とさえも穏和な条件下に結合して診断上
使用しうる試薬を形成しりる担体が要求されていた。結
合された物質の反応性は長時間保坤されねばならない、
試薬は特異的かつ感度良く反応しなければならない。

今や驚くべきことに、水性媒体中で予め調製され九うテ
ックス核を、酸アミド基を介して結合さｎたアセタール
官能分を含有するビニル単量体を用いて膨潤させ、そし
て当然充分に水不溶性である筈のこのビニル単量体を本
性上親水性またはイオン性であルうる他の単量体と共重
合させるならば前記目的に遍した担体が得られることが
見出さｎた。油溶性および水溶性ラジカル生成性物質の
いずれもラジカル鎖重合の開始剤として便用さｎうる−
特に有用な親水性コモノマーはメタクリルＭまたはアク
リル酸あるいはメタクリルアンドまたはアクリルアオド
鰐導体である・ 親水性単量体を使用しうろことは結合された免疫学的活
性物質の安定性にとって特別Ｋｌ！！である。何故なら
感じ易い蛋白質は例′見ば疎水性表面によシその配座が
変化されそして不活性化されうるからである。それゆえ
親水性表面を有する粒子も好ましい、その理由はそれら
は非特異的な交代作用を相互にあ°ｔ＃）行わないから
であるーこれらは誤った試験結果を生ずる重大な原因で
ある。

さらに本発明は結合されるべき物質のアずノ基をラテッ
クス粒子表面上のアルデヒド基と還元的アミノ化の原理
によ多結合させることからなる、生−学的に活性なラテ
ックスコンシュビートの製法にも関する。これらのアル
デヒド基はアセタール基から簡単に酸性化することによ
シ得らｎうる。これはアルデヒド基を担持するラテック
ス粒子が安定なアセタールの形態で負荷されずに貯蔵で
きそしてカップリング剤なしで結合的に活性な形態に変
換されうるという長所を有する。さらに、還元的アミノ
化は生物学的に活性な物質が非常に穏和な条件下に結合
するのを可能にする。というのは例えば蛋白質中におい
て多数に得られそしてこの結合法においてその本来の負
荷形態が保持されるアミノ基のみが選択的に結合される
からである。他の方法と比較すると、この方法はまた特
別に穏やかである。何故なら化学結合が速かＫそして生
理学的ｐＨ−値において遂行されるからである。

それゆえ本発明は式Ｉ （式中ｎは１〜６であり、Ｒ１は■であシ、Ｒ１はＩ［
またはＯＨＩであ夛そして′ＲｓおよびＲ４１４０２〜
０６−アルキルであるかアリールであるかまたはその他
の式！の化合物が充分な水不溶性を有することを確実な
らしめる基である）の末端アセタールを有する基を含有
する共重合物の表面層で被覆された新規なラテックスに
関する。

かかるラテックスは例えばドイツ特許出願公開第２９０
７７９４号明細書に記載されるように、既知方法によシ
単量体のホモポリマーまたは共重合体として得られうる
ようなラテックス粒子上にグラフト共重合させることに
よシ隣製さｎうる・ ラテックス粒子上に表面層を調製する喪めのグラフト共
重合にとって好ましい単量体は核の調製に利用される１
種類またはそれ以上の単量体および末端アセタール基を
有する共重合しうるエチレン状不飽和化合物からなる混
合物である・これらは式Ｉのメタクリル酸の誘導体であ
りうるが、しかし他のアセタール基を含有する単量体も
それらが充分に水不溶性である限り適当である。もし充
分に水不溶性でないとポリスチレンラテックス上へのグ
ラフト生成の代Ｆ）Ｋ水相中における重合が起る。

もう一つの添加剤として親水性単量体が使用されうる（
例えばヒドロキシエチルアクリルアミドおよびその他の
ヒドロキシル基含有単量体）。

特に好ましいのは少量のイオン性コモノマー例えば陰イ
オン性単量体としてのアクリル酸、メタクリル酸または
アクリルアミドプロ／（ンスルホン酸％または陽イオン
性単量体としての４−ビニルピリジンあるいはメタクリ
ルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライドの
使用である。これらはラテックスの安定化に多大の買献
をする。

グラフトされる予定の単量体の混合比を単に変えること
Ｋよジグラフト層はかかる場曾Ｋｇｌ用される免疫学的
に活性な物質の至適納会および安定性を得るための条件
に明確に適合せしめうる。

グラフト層の形成および担体−試薬結合の持続性のため
には重合するビニル基が分子の各官能性末趨と酸アミド
結合により結合することが極めて重要である。すなわち
前記されたタイプのグラフト化は、酸アンド結合の代夛
にエステル結合を有する単量体を例えば（メタ）アクリ
ル酸エチルエステルシー　ｎ　＃　ヘンチルアセタール
またはヒドロキシエチル（メタ）アクリレートを用いて
も実施されうる。しかしながらエステル基はラテックス
の活性化、カップリングまたは貯蔵に際して起）うるよ
うなｐＨ７よシ小さいかまたは大きいすべてのｐＨ値に
おいて、相当するアクリルアミドまたはメタクリルアミ
ド誘導体よりかな）容易に加水分解的忙分解されうる・ 本発明によシ費性され九ポリスチレンラテックスを調製
するには一般に任意の粒子直径をした予め生成されたポ
リスチレンラテックスにその表面の最大被覆忙必要であ
る乳化剤量の約４０〜７０％を加え、続いてグラフト単
量体の混合愉を加え−ラテックスを膨潤させそして重合
せしめる。

本発明によるラテックスコンジュゲートを調製するｋは
、前記グラフト重合されたラテックス粒子の懸濁液を酸
の添加によシＰＨ２以下に調整し、培養し１そして中和
後に適当な遺元剤の存在下に、結合される予定の免疫学
的忙活性な物質と培養する。還元には中性緩衝液中の水
素化硼素シアノナトリウム溶液を使用するのが好オしい
。

結合反応後に、好ましく紘緩衝液中において遊離アばノ
基を有する化合物を添加することｋよシ過剰のアルデヒ
ド基を「封鎖（シール）する」のが好都合であシうる。

多くの用途にとって場合によシ結合しなかった免疫学的
に活性な物質ま危はその他の不純物を遠心分離によるか
または適当な膜上で洗浄することによシ反応混合物から
分離するのが適切である。

ラテックスコンジュゲートは種々の診断操作、例えばガ
ラス担体上における例えばラテックス凝集試験による物
質の定性的および半定量的測定において、または直接的
あるいは競争的凝集試験における痕跡量蛋白質の比濁測
定的また拡混濁測定的測定のために、あるいはラテック
ス−ハプテン抑制試験において使用されうる・例　　１ メタクリルアミド−アセトアルデヒドジ−ｎ−ペンチル
アセタール（１］の調製 アミノア七トアルデヒドジーｎ−＜７チルアセタールを
、Ｔｕｒｅｔおよび０ｈｉｎ両氏の「Ｊ、ムｍ、−０３
ｏａ、Ｊ第８３巻＠１５６０頁（１９６１年）記載の一
般的操作に従いアミノアセトアルデヒドジメチルアセタ
ールをはンタノールを用いてアセタール交換することに
よシ調製する。

単量体（１）はメタクリル酸クロライドを無水溶液中に
おいてアミノア１トアルデヒドＱ　−ｎ−インチルアセ
タールと反応させることＫよｐＩＩＩＩｌ製される・ この目的のためＫはアオノアセトアルデヒドジーｎ−ｄ
ンチルアセタール７．２　ｆ　（五３Ｘ１０−２モル）
およびｘ２ｏｏ３９．１　ｆ　Ｃ４６Ｘ　１０”２篭ル
）を窒素気流下に無水クロロホルム２〇−中に加えそし
て０℃に冷却するーこれにクロロホルム２〇−中に溶解
し九メタクリル酸クロ２イド＆４ｆ（Ａ３ｘ１０−２モ
ル）を攪拌下に５．０分関以円で滴下する・合針９０分
後忙ゆっ〈プと室温まで温度上昇せしめる。

この反応混合物に水を加え、クロロホルム相を分醜し、
乾燥しそして室温で真空下に生成物（１）から溶媒を除
去する・帯黄色の粘稠な油状物＆Ｏｔ（収率６４％）が
得られ、このものは高められ九温度で速かに重合するの
で蒸留できない。

例　　２ ａ）水不溶性の２ジカル生成剤を用いるポリスチレンラ
テックス上への（１）のグラフト共重合平均粒子直径１
９４ｎｍを有する洗浄剤不含のポリスチレンラテックス
４７−（固体物質４２に相当）′ｆＩ：、ドデシル硫酸
ナト硫酸ナトリウム０タ４８６１ ジーｎ−パンチルアセタール０．　６　６　ｆ　ｓメタ
クリル酸α３３Ｆおよびアゾビスイソプテロ二トリル１
０１Ｆと共に反応容器に加える．この混合物を注意深〈
数回真空排気しそして窒素で換気する・この混合物を攪
拌下に室温で１時間乳化させセして次に７０℃で５時間
重合させる。

冷却したラテックスを限外濾過によシ精製する。カルボ
キシル基含量（電位差滴定による）は重合体１ｆ当ｊ５
　０００Ｈα２３ンり当量であシそしてアルデヒド基含
量（アセクールの酸分解およびヒト薗キシルアミンを用
いる滴定後）は重合体１　ｆ轟１）アルデヒド０．１３
ｔり当量である。

ｂ）水溶性のラジカル生成剤を用いるポリスチレンラテ
ックス上への（１１のグラフト共重合平均粒子直径１９
６ｎｍを有する洗浄剤不含のポリスチレンラテックス４
　７ｍ（固体物質４ｆＫ相当）をドデシル硫酸ナトリウ
ムα０４Ｂ４１。

水５２ｍ１％メタクリルア電ドアセトアルデヒドジ−　
ｎ−　パンチルアセタールα４ｆｓスチレンα４ｔおよ
びメタクリル酸α２ｆと共に反応容器に加える．仁の混
合物を数回注意深′〈真空排気しそして窒素で換気する
。この混合物を室温で１時間乳化させ１次に７０℃に加
温し、さらに１５分間攪拌後に水１−中に溶解されたイ
ルオキソジ硫酸カリウムα０１６ｆの注入により共重合
を開始させる。重合は７０℃で５時間進行する・冷却し
たラテックスを限外−過によシ精製するーカルボキシル
基含量鉱α１電り当量／ｆであシ、アルデヒド基含量は
同じく（Ｌ１ミリ当量／ｆであシ、新しい平均粒子直径
線２０７ｎｍである・ 例　　５ １ｊＢＰ１−糖蛋白質証明の九めの競争的レーザー比濁
試験 ａ）β８Ｐ１−ラテックスコンジエゲートの調製ラテッ
クスを活性化させるために例２ｂで得られた５％ラテッ
クス懸濁液３−を１ｎ　ＨＯＡ　５ｏＯｓｌおよび２，
０％ツィーｙ　（Ｔｗｅｅｎ）　２　０溶液５０〇−と
室温で１時間培養する６次Ｋ　１ｎ　ＮａＯＨ　２５０
μｔおよび飽和燐酸水素ジナトリウム溶液の添加によ＃
）ＰＨ　ｔ　６．５１１Ｃｌｉｌｉ整する．これと共に
生理食塩水溶液（ｐｉｓ）中の１叩／−一８Ｐ１−糖蛋
白および１１１／−ヒト血清アルプ建ンを含有する溶液
１５ｓｄならびに燐酸塩緩衝された食塩溶液中のａ５％
水素化硼素シアノナトリウム溶液１５ｓ＋１を＋４℃で
一夜培養する・過剰のアルデヒド基を封鎖（シール）す
るためにα５モル濃度のエタノ−ルア電ン塩酸塩溶液Ｃ
ＰＨ＆５）１．２ａｄおよび２．５％水素化硼素ナトリ
ウム溶液α３−を加えそしてこの混合物を＋４℃で１時
間培養する０次に如Ｐ１ーラテックス；ンジュゲートを
遠心分離して沈殿させそしてこの沈殿をツイーン２０を
１２％含膚するアＢ８　５−中にとる。

ｂ）試験操作 血清試料を１．７％のライ−７２０を含有するＰＢｅ中
に１：５で予め希釈する・標準物として、１．７％のツ
イ−７２０を含有するＰＨ６中に１：５で希釈されたβ
５Ｐ１−糖蛋白質（ベーリング・ウエルケ社製品）なら
びに男性供与者からの２０％ヒト血清が便用される。測
定には希釈された試料′を九は標準物１００μＬ１ヒト
−８７１−１１蛋白質に対する家兎の抗血清（１％のＭ
ｈＯＬを含有するｐＨ＆２のα１モル濃度ダリシン緩衝
液中に１：３２００で希釈）１００ｆｉｔおよび１．７
％のツイ−７２０を含有するＰＨ６中に１：１００で希
釈さｎたラテックス試薬２００μｔをキュベツト中で混
合する・この混合物を基塩で５時間培養しセして次にレ
ーザー比濁計（ベーりング・ウエルケ社製品）中で測定
する。未知試料について測定ｉ５ｆ’した散乱光シグナ
ルを標準希釈物を用いて用意された参考曲線に基いて評
価する。測定範囲は如ｐ１−糖蛋白質１１ｄ当シ約２．
５μｆ〜５０　ｎｇまでに達する。

例　　４ 破傷風トキソイドに特異的な抗体の直接的比濁測定 破傷風トキソイド−ラテックスコンシュメートの調製は
例５と同様にして５％ラテックス急濁液３−および約５
０００Ｌｆ／−を有する破傷風トキソイド溶液Ｌ５ｍか
ら出発して実施される。

この方法で破傷風トキソイドーラテックスコンジエゲー
）３ｍが得らｎる。標準物として約２゜ｘｘ７−の破傷
風トキソイドＩ＃異的抗体活性を有するヒトのガンマグ
四プリンｉ’−ル（１６０■７ｍ　）　（Ｂ＠ｒｉｇｌ
ｏｂｉｒＰ％ベーりング・ウェルヶ社製品）ｔ１％の食
塩を含有するｐｌｉ　＆　２００．１モル濃度グリシン
緩衝液中ｔｃ１：８０〜１：５１２０で希釈して使用し
九〇 測定に先立ち患者の血清を１％のＩａＯＡを含有する一
ｐＨａ　２０Ｑ、１モル濃度グリシン緩衝液中に１：１
００または１：２０で希釈する。試験混合物に対して希
釈された試料または標準物１００μｔｔ−α２％のツイ
ーン２０を含有するＰＨ６中に１：２５で希釈され喪う
テックスコンジエゲート懸濁液２００−中にキュベツト
中で混合する・２時間後、散乱光シグナルをレーザー測
光計にてＩＩＩ定しそして標準希釈物について調製され
た参考曲線に基いて評価がなされる。

例　　５ ラテックス凝集抑制によるハプテンの証明ニブシロン−
ジェトロフェニル−Ｌ−９９ノー？テツクスコンジエゲ
ートの＊ｓａａ、ｓ％ラテックス懸濁液３−およびエプ
シロンージニトｏｙｘ＝ルー’ｒａ−リジン（ＤＩＰ−
Ｌｙｓｓ）（８１ＲＶＡ社製品）のα６６％溶液１．５
−から出発して例５と同様にして実施される。過剰のア
ルデヒド基を封鎖した後ハゾテンーラテックスコンジ３
−　ｙ＋−）　（ＤＮＰ−ラテックス）を遠心分離して
沈殿させ、α２％のツイーン２０を含有するＰＨ８１０
−中ＫＭＭＩ濁させそして新たに遠心分離したのちα２
％のライ−７２０を含有するＰＨ８５−中にとる。

ＤＩＰ　−７テツクス懸濁液をジニトロフェニル基に対
してヤギで得られる抗血清（Ｐａ＠ｓａ１社製品）とベ
ーりングウエルケ社製のラテックス試験プレートの反応
区分上で混合しそして適轟な希釈度において凝集物を生
成させる。その反応強度は慣用の標準によシ可視的に＋
４として判定されうる。第１！！に示されるように、凝
集反応はハプテン（ＤＮＰ）の添加により抑制されうる
。

これは試料液体中のハプテンの検出ＫｆＥ用されうる。

第　　１　　表 凝集反応強度　４＋　　２〜！ｉ＋　１〜２＋ＱＱ特許
出願人　　−一すングヴエルヶ・アクチェンｌゼルシャ
フト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ラテックスの核、および１種ｗＡまたはそれ以上の
   エチレン状不飽和単量体および式ｌ（式中ｎは１〜６で
   あシ、Ｒ１は■であシ、Ｒ１はａｌたはＯＨ３でありそ
   してＲ５およびＲ４扛０２−０６−アルキルであるかア
   リールであるかまたはその他の式ｌの化合物が充分な水
   不溶性を有することを確実ならしめる基である）を有す
   る単量体からなる共重合体の殻からなるラテックス。 ２）ラテックスを式Ｉの単量体および１１１Ｉ類または
   そｎ以上のエチレン状不飽和単量体および洗浄剤と混合
   しそして重合をラジカル生成性物質の添加により開始す
   ることからなる一前記特許請求の範囲第１項記載のラテ
   ックスの製法。 ３）核がポリスチレンからなりそして殻がメタクリルア
   ミドアセトアルデヒドジーｎ−にンチルアセタール、メ
   タクリル酸および所望ならばさらにエチレン状不飽和率
   量体からなる共重合体からなる、前記特許請求の範囲第
   １項記載のラテックス。 ４）生物学的に活性な物質が前記特許請求の範囲ＩＥ１
   項または第３項に記載のラテックスに共有結合している
   ことからなるラテックス；ンジエゲート。 ５）抗原、抗体ま九はハプテンの診断上の証明Ｏための
   前記特許請求の範囲１１ｉＩ４項記載のうテックスコン
   ジュゲートの使用。