JPS6363864B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫学的に活性な凝集反応用微粒子に
関するものである。医学的ないしは獣医学的な検
査診断の目的で、ヒト又は動物の体液中の成分と
抗原抗体反応により特異的に結合する免疫学的に
活性な微粒子の凝集反応がしばしば利用される。
凝集反応は肉眼または光学顕微鏡により容易に観
察できるので特殊な機器および施設などを必要と
せず非常に簡便に検査を行なえるという特長があ
る。しかし通常行なわれている凝集反応は微粒子
に抗原又は抗体のいずれか一方を固定化してお
き、検体体液中に対応する抗体又は抗原が存在す
れば微粒子が凝集することを利用するものであ
る。変法としては測定の目的である抗原又は抗体
を微粒子に固定化しておき、別に予め準備した対
応する抗体又は抗原により上記抗原又は抗体固定
化微粒子が凝集する反応が、被検液中に存在する
微粒子に固定化されたものと同一の抗原又は抗体
により阻止される現象を利用する方法もある。い
ずれにしてもこれらの方法によつて測定されるの
は抗原又は抗体であつて抗原と抗体との結合によ
つて生成する免疫複合体を測定することはできな
い。しかるに最近血液に溶解して体内を循環しい
る免疫複合体の測定が診断上または治療上有意義
であることが認識されるに到り、いわゆる循環性
免疫複合体の装定に関する研究結果が数多く発表
されている。その中で微粒子の凝集を利用する方
法としては血小板凝集反応テストがある。これは
新鮮血小板が免疫複合体の存在下で容易に凝集す
るという性質を利用したた方法である。しかし血
小板の寿命は非常に短かいので保存することがで
きず、毎回検査日毎に新続血小板を準備しなけれ
ばならないという欠点がある。 また非常に感度の高い免疫複合体検査法として
はC1_q結合テストがある。この原理は試料を放射
性同位元素で標識した補体成分C1_qとともにイン
キユベートし、これをポリエチレングリコールの
溶媒下で遠沈すれば免疫複合体に結合したC1_qの
みが沈降するので、沈澱の放射能を測定て試料中
の免疫複合体を求めるものである。また予めC1_q
でコートされたポリスチレン管の中で血清試料を
インキユベートし、このC1_qと反応した免疫複合
体のみを放射性同位元素または酵素で標識した抗
イムノグロブリンでインキユベートしてその量を
測定する固相C1_q結合テストがある。いずれにし
てもC1_qは新鮮な血清から分離することによつて
調製しなければならないが、血清中のC1_q含量は
僅少である上にC1_qが不安定な物質であるという
事実が、C1_qを用いる免疫複合体測定法の普及を
妨げている。 C1_q結合テストと同程度に感度の高い方法とし
て最近注目されているものに固相コングルチニン
結合テストがある。コングルチニンは牛血清中に
存在する特殊な蛋白質で、補体第三成分C3のう
ちのC3bの分解産物と特異的に結合し得る性質が
あり、C1_qと異なつて非常に安定性がよく長期間
保存しても失活しない。コングルチニンの上記の
性質を利用して、カサリ等はコングルチニンを吸
着させたポリプロピレン試薬管中で血清試料をイ
ンキユベートし、C3b分解産物を介してコングル
チニンに結合した免疫複合体に放射性同位元素又
は酵素で標識した抗イムノグロブリンを結合させ
ることにより、免疫複合体を定量した（クリニカ
ル・エクスペリメンタル・イムノロジイ、第29
巻、342−354頁（1977））、コングルチニンはC1_q
のように免疫複合体に直接結合するのではなく、
免疫複合体に結合したC3b分解産物を介して結合
するので、測定されている対象がC1_q結合テスト
の場合と同一ではないが、両方法ともそれぞれ医
学的意義を有していると考えられる。上記の放射
能または酵素活性で標識する測定法は感度は非常
に高いが、特別の測定器を必要とし、また測定に
要する時間も長い。 本発明者らはコングルチニンを利用して免疫複
合体を凝集反応により測定することを目的に検討
の結果本発明に到達した。 すなわち本発明はコングルチニンを化学結合に
より固定化した平均直径0.01μｍ以上20μｍ以下の
個々に分離した親水性高分子化合物からなる凝集
反応用微粒子を提供するものであり、この微粒子
を用いることにより、血液中の免疫複合体を凝集
反応により容易且つ確実に測定できるのである。 粒子にコングルチニンを固定化した例としては
カサリおよびランバートの報告（ジヤーナル・オ
ブ・クリニカル・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー、第37巻、2956−309頁、（1979））がある。
すなわちカサリらは炭酸塩緩衝液（PH9.6）中で
直径0.2−0.3mmのポリメタクリル酸メチルに、コ
ングルチニンを37℃で３時間インキユベートする
ことにより物理的に吸着させた。そしてそれに血
清中の可溶性免疫複合体を結合させることにより
免疫複合体を分離精製している。しかしながらカ
サリらの用いた粒子は直径0.2−0.3mmという大き
なもので到底凝集反応に応用できるものではな
い。本発明においては平均直径0.01μｍ以上20μｍ
以下の分離に親水性高分子化合物からなる微粒子
を担体として使用しコングルチニンの微粒子への
固定化は化学結合によつて行なう。コングルチニ
ンを固定化した微粒子は補体成分C1、C4、C2お
よびC3の共存下に免疫複合体が存在すれば凝集
する。免疫複合体は検体血清または血漿中に最初
から存在する場合はもとより、検体液に抗原又は
抗体を添加することによつて新たに生成した免疫
複合体もコングルチニン固定化微粒子を凝集させ
る。この事実を応用すれば検体血液中の抗原性物
質および抗体をコングルチニン固定化微粒子の凝
集反応により測定することができる。すなわち検
体中に抗原性物質または何らかの抗原に対する抗
体が含有されていれば、対応する抗体又は抗原を
添加してインキユベートすることにより免疫複合
体が生成する。検体血清又は血漿中に補体が存在
すれば補体成分がC1、C4、C2、C3の順で免疫複
合体に結合し、結合したC3はC3bを経由してコン
グルチニンと結合性のある物質に転化する。その
機構の詳細は未だ明らかではないが補体成分の存
在は必須であり、検体血清又は血漿中の補体で不
十分な場合には、別に準備した動物の新鮮血清を
補体源として反応に添加することにより目的を達
することができる。このような抗原又は抗体の測
定方法は赤血球の免疫粘着反応による検査法とよ
く似ている。しかし免疫粘着反応で必要な霊長類
の新鮮なＯ型赤血球は一定品質のものを大量に調
達することも長期間保存することも実際上不可能
である。この制約のために免疫粘着反応はすぐれ
た検査法であるにも拘わらずあまり普及していな
い。コングルチニン固定化微粒子は一定品質のも
のを大量に供給することも可能であり、長期保存
にも耐える安定なものである。 コングルチニンを牛血清から分離するのに最も
便利なのは酵母菌体による吸着である。コングル
チニンはカルシウムイオンの存在下に酵母菌体に
結合し、エチレンジミン四酢酸（以下EDTAと
略記）の添加によつて酵母菌体から遊離する。こ
の方法によつて牛血清から分離したコングルチニ
ンはそれ以上精製しなくても担体微粒子に固定化
することによつて十分な活性を示す。しかしさら
に純度を上げる必要がある場合には超遠心分離又
はクロマトグラフによつて精製することができ
る。 担体となる微粒子の平均直径は0.01μｍ以上20μ
ｍ以下であることが必要である。微粒子の形状は
必ずしも球形であることを要せず、不規則な形で
も差し支えない。不規則な形の微粒子の直径は最
大径と最小径の和の1/2と定義する。また平均直
径は(1)式によつて定義されるを意味するものと
する。ただしdiはｉ番目の微粒子の直径、Ｎは微
粒子の総数である。 ＝_N 〓ⁱ⁼¹ di／Ｎ (1) 平均直径が2μｍを超えると安定に分散させる
ことが難かしく、一方0.01μｍ未満では凝集の判
定が困難になる。 担体として使用する微粒子は親水性高分子化合
物からなる微粒子であるが、これらはコングルチ
ニンを化学的に結合させるための官能基を有する
ものである。化学結合としてはイオン結合および
共有結合いずれも適用可能である。コングルチニ
ンの等電点は正確には求められていないが酸性側
にあるので、カチオン性の担体微粒子にイオン的
に結合させることができる。担体微粒子に正電荷
を持たせるためには微粒子を構成する有機高分子
化合物に１級、２級または３級アミノ基、または
４級アンモニウムを導入すればよい。コングルチ
ニンを共有結合によつて微粒子に結結合させるた
めの官能基として適当なものは、例えばヒドロキ
シル基、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ
基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシア
ナト基、アジドカルボニル基および酸無水物など
である。エポキシ基、ホルミル基、イソチオシア
ナト基、アジドカルボニル基および酸無水物はコ
ングルチニンと直接結合することができる。ヒド
ロキシル基は臭化シアンで活性化してコングルチ
ニンと結合させることができる。アミノ基および
カルバモイル基はグルタルアルデヒドで活性化し
てコングルチニンと結合することができる。また
カルボキシル基はカルボジイミドを縮合剤として
用いることによりコングルチニンと結合すること
ができる。化学結合による固定化は理吸着による
固定化よりも強固で安定であり、化学結合のなか
でも共有結合による固定化はイオン結合による固
定化よりも強固で安定である。 親水性高分子化合物は血清または血漿蛋白質の
非特異的吸着が少なく微粒子が非特異的に凝集を
起こす恐れが少ない点で他の担体よりも顕著にす
ぐれている。好ましい親水性高分子化合物の例を
あげれば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル
アミド、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニル
アルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレー
ト）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、
ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、
ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレー
ト）、ポリ（ポリエチレングリコールメタクリレ
ート）などである。親水性高分子化合物の多くは
水溶性であるから微粒子の形態を保つためには架
橋させることが必要である。また上記のよう単独
重合体に限らず、相互の成分を含む共重合体も同
様に有用である。また高分子化合物の主成分がコ
ングルチニン固定化に適した官能基を有していな
い場合には、官能基を有する成分を共重合すれば
よい。官能基導入のために適した成分は例えば、
アクリル酸、メタクリル酸、無水マレイン酸、ア
クリル酸グリシジル、メタクリル酸グリシジル、
ジメチルアミノエチルメタクリレート、ビニルピ
リジン、アリルグリシジルエーテルなどである。
重合と同時に直接上記の条件を満たす高分子化合
物、すなわち親水性でかつ官能基を有する高分子
化合物を製造しなくても、疎水性高分子化合物ま
たは官能基を有しない高分子化合物を一旦製造し
た後、高分子反応によつて親水性高分子化合物に
変換することも、また官能基を導入することも可
能である。例えばビニルエステル重合体は加水分
解によつてポリビニルアルコールに、アルキルア
クリレート重合体は加水分解によつてアクリル酸
重合体に、アクリロニトリル重合体は加水分解に
よつてアクリルアミド重合体またはアクリル酸重
合体に、ビニルピリジン重合体は４級化によつて
ビニルピリジニウム重合体に変換される。 コングルチニンが活性を保つて担体微粒子に固
定化されたことは酵母菌体に対する付着、免疫複
合体あるいはそのモデル物質である熱集合免疫グ
ロブリンと補体の存在による凝集によつて確認す
ることができる。 実施例 １ （コングルチニンの調製） リン酸水素二ナトリウム0.01モルと塩化ナトリ
ウム0.14モルとを蒸留水１に溶解した溶液とリ
ン酸水素−カリウム0.01モルと塩化ナトリウム
0.14モルとを蒸留水に溶解した溶液とをPHが7.0
になる割合で混合した。以下この混合液をPBS
と称する。製パン用の乾燥酵母（菌種サツカロミ
セスセロビジエ）13.6ｇをPBS60mlに分散し、30
分間オートクレーブで121℃に加熱した。オート
クレーブ処理後の酵母を遠沈し、2000rpm、10分
間の遠心条件で上澄が透明になるまで遠沈を繰り
返してPBSで洗浄した。洗浄後酵母を45mlの
PBSに分散し、メルカプトエタノール0.3mlを加
えて37℃で２時間撹拌した。次いで酵母を遠沈
し、遠沈した酵母を蒸留水72mlに塩化ナトリウム
0.77ｇ、0.2モル／リン酸塩緩衝溶液（PH7.2）
158mlおよびヨードアセトアミド0.33ｇを溶解し
た溶液に分散し、23℃で２時間撹拌した。反応後
酵母を遠沈し、PBSで３回遠沈を繰り返して洗
浄し、再びPBS200mlに分散してオートクレープ
で121℃に30分間加熱処理した。酵母を遠沈して
2000rpm、340分の条件で上澄が透明になるまで
PBSで遠沈を繰り返して洗浄した。別に蒸留水
700mlにベロナールナトリウム塩0.824ｇおよび塩
化ナトリウム8.5ｇを溶解し、少量の1/10規定塩
酸を加えてPHを7.2に調節した。それとは別に蒸
留水200mlに塩化マグネシウム６水和物0.36ｇお
よび塩化カルシウム２水和物0.037ｇを溶解した
溶液を作製し、上記ベロナール溶液と混合してナ
トリウムアジド0.2ｇおよびゼラチン1.0ｇを添加
し、さらに蒸留水を加えて全体を１とした。以
下この緩衝溶液をCFDと略記する。前記のよう
にヨードアセトアミド処理後オートクレープ加熱
した酵母はCFD150mlに分散散し、４℃で保存し
た。 成牛血清200mlを56℃で30分間非働化した後上
記酵母CFD分散液60mlと混合し、40％塩化カル
シウム水溶液0.2mlを添加し、４℃で１時間撹拌
した。次に遠沈して酵母をPBSで３回洗浄した
後、EDTA含有PBS220mlに分散し23℃で10分間
撹拌した。ただしEDTA含有PBSとは１中に
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩7.63ｇ、
ナトリウムアジド0.2ｇおよびゼラチン1.0ｇを添
加されているものを意味する。次に酵母を遠沈し
て上澄を採り、酵母にはさらに40mlのEDTA含
有PBSを加えて遠沈し、その上澄を先の上澄と
合わせた。上澄のPHを希リン酸水溶液で5.4に合
わせ、PH5.4のリン酸塩緩衝溶液（塩濃度1/100モ
ル／）中で１晩透析した。透析により生じ粗コ
ングルチニンの沈澱を遠沈により分離し、４℃で
保存した。 （担体微粒子の調製） グリシジルメタクリレート、２−オキシエチル
メタクリレートおよびエチレングリコールジメタ
クリレートの３者を85.7：9.5：4.8のモル比で混
合し、その単量体混合物10.0ｇをプロピオン酸エ
チル30ｇに溶解し、２，2′−アゾビス（２，４−
ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）0.03ｇ
を添加して、アルゴン雰囲気下に40℃で３時間静
置重合させた。白濁した重合混合物をアセトン
100mlに注ぎ、3000rpmで10分間遠沈し、沈降し
た重合体微粒子をメタノール80mlで再分散して洗
浄後石油油エーテル100mlで傾斜により２回洗浄
し紙で自然過後減圧下に40℃で乾燥した。重
合体微粒子の収量は4.0ｇであつた。この重合体
微粒子1.0ｇを９％アンモニア水溶液150mlに分散
し30℃で２時間撹拌してアミノ化を行つた。アミ
ノ化された微粒子を蒸留水で洗浄後水50ｇ、アセ
トン50ｇおよび濃硫酸0.2ｇの混合液に分散し、
30℃で10日間撹拌して加水分解を行ない、重合体
のエポキシ基をα，βジオールに変換した。加水
分解終了後重合体微粒子を蒸留水で十分に洗浄し
た。この状態で重合体微粒子を光学顕微鏡によつ
て観察したところ、形状は球形であり、直径は
2.5μｍ以上6μｍ以下の範囲であり、平均直径は
4.3μｍであつた。 （固定化） アミノ化加水分解処理重合体微粒子を、PH6.4
の5.8％グルタルアルデヒド水溶液に、重合体含
量が0.5％になるように分散し、37℃で18時間撹
拌した後、蒸留水中で遠沈を３回繰返して洗浄し
た。CFDから塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ムム、およびゼラチンを除いた組成の緩衝溶液
（以下VBSと略記）に、粗コングルチニンを0.12
mg／ml、さらに牛血清アルブミン（以下BSAと
略記）を10mg／mlの濃度で溶解し、その中にグル
タルアルデヒドで活性化された重合体微粒子を重
合体含量が0.8％になるように分散した。この分
散液を30℃で４時間撹拌して固定化反応を行なつ
た。反応終了後コングルチニン固定化重合体微粒
子を遠沈し、BSAを１％添加したVBSに微粒子
の含量が１％になるように分散した。この微粒子
分散液と酵母菌体分散液とを混合すると強く凝集
し、コングルチニンが活性を保持して固定化され
ていることが確かめられた。 （熱集合ヒトγ−グロブリンによるコングルチ
ニン固定化微粒子の凝集） 免疫抗原のモデル物質として免疫複合体定量の
ための検量線作成にしばしば用いられる熱集合ヒ
トγ−グロブリン（aggregated human γ−
globulin、以下ATGと略記）によるコングルチ
ニン固定化微粒子の凝集試験を下記のようにして
行なつた。ヒトγ−グロブリン13mgをPBS2mlに
溶かし、63℃に30分間加熱し、11000×Ｇで30分
遠沈して上澄を採つた。高速液体クロマトグラフ
による分析結果ではγ−グロブリンの単量体と２
量体以上との比率は１：１（重量）であつたが、
精製せずに以下の実験に使用した。このAHGを
VBSに溶解し、原料として用いたヒトγ−グロ
ブリン換算で（すなわち遠沈による沈澱の損失は
無視し、γ−グロブリン単量体は濃度に含めて）、
０、50、100、500および1000μｇ／mlの５水準の
濃度のAHG溶液を調製した。補体源として新鮮
正常ヒト血清をVBSで100倍に希釈した溶液をつ
くり、各濃度のAHG溶液と同容量づつ混合して
37℃で15分インキユベートした。インキユベート
された溶液をＶ字型管底を有するマイクロプレー
ト中でVBSにより各々４、８、16および32倍に
希釈した。ただし各管中の液量は50μとした。
各管の希釈溶液に0.025ミリモル／の塩化カル
シウム溶液で０倍に希釈したVBSを25μおよび
コングルチニン固定化微粒子分散液25μを加
え、室温で２時間静置した。沈降像により凝集程
度を判定した結果を表１に示した。表１から
AHG（未精製基準）はコングルチニン微粒子の凝
集によつて50μｇ／ml以下の濃度まで検出できる
ことがわかる。

【表】 実施例 ５ 実施例１で詳述した方法により調製した粗コン
グルチニンをジエチルアミノエチル化セフアデツ
クスA50のカラムを通してクロマトグラフイによ
り精製した。精製コングルチニンを実施例１で使
用したのと同じ担体微粒子に同様にして固定化
し、BSAを１％添加したVBSに微粒子の含量が
１％になるように分散した。赤血球凝集阻止法
（以下HI法と略記）におけるHA価が４単位の風
疹ウイルス抗原液（１％BSA含有）と、同容量
の風疹抗体陽性ヒト血清希釈液とを混合し、37％
で15分間インキユベートした。ただし風疹抗体陽
性ヒト血清はHI抗体価１：64のものをVBSで希
釈し、希釈倍率８倍および64倍の２通りについて
試験した。インキユベートにより風疹ウイルス抗
原−抗体複合体を生成させた上記混合液のVBS
による10倍および100倍の希釈液を調製し、原液
および各希釈液に対して、補体源として同容量の
新鮮正常ヒト血清を加え、37℃で15分間再びイン
キユベートした。このようにして補体を結合させ
た免疫複合体を含む溶液をVBSで64、128および
256倍に希釈し、50μをＵ字型マイクロプレー
トのホールに入れ、各々VBS30μおよび精製コ
ングルチニン固定化微粒子分散液20μを加えて
混合後１時間静置して沈降像を判定した。結果は
表２の通りであつた。抗原の濃度が高くなる程、
また抗体の濃度が高くなる程凝集が強くなつてい
ることが認められる。

【表】 ＊ 抗原無添加
実施例 ３ （担体微粒子の調製） メタクリロニトリルとジビニルベンゼンとを
95：５のモル比で混合し、その単量体混合物10.0
ｇをプロピオン酸エチル30ｇに溶解し、２，2′−
アゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシバレ
ロニトリル）0.1部を添加してアルゴン雰囲気下
に40℃に24時間静置した。白濁した重合液を遠心
して重合体微粒子を分離し、酢酸エチルで洗浄後
減圧で乾燥した。重合体微粒子の収量は1.0ｇで
あつた。大部分の重合体微粒子の直径は２〜3μ
ｍの範囲にあつた。次に乾燥重合体微粒子1.0ｇ
を三フツ化ホウ素二酢酸塩20ｇと水3.3ｇとの混
合物に加え、110℃で２時間撹拌下に反応させた
後水を加え、6N水酸化ナトリウム溶液でアルカ
リ性にした。加水分解された重合体微粒子を遠沈
後水洗した。乾燥して赤外線吸収スペクトルを測
定したところポリメタクリルアミドに近い吸収ス
ペクトルを示した。 （固定化） 加水分解重合体微粒子を蒸留水中に５％（乾燥
重合体重量基準）の濃度で分散させた液21ｇに25
％グルタルアルデヒド水溶液３ｇを加えて、30℃
で２時間撹拌した。グルタルアルデヒドにより活
性化された重合体微粒子を遠沈・水洗後、VBS
に重合体含量が1.6℃になるように分散した。こ
の分散液と粗コングルチニンを0.24mg／ml、BSA
を20mg／mlの濃度で含むVBS溶液とを等容量比
で混合し、30℃で４時間撹拌して固定化反応を行
なつた。反応終了後コングルチニン固定化重合体
微粒子を遠沈し、BSAを１％添加したVBSに微
粒子含量が１％になるように分散した。この微粒
子分散液と酵母菌体分散液とを混合すると強く凝
集し、コングルチニンが活性を保持して固定化さ
れていることが確かめられた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コングルチニンを化学結合により固定化した
   平均直径0.01μｍ以上20μｍ以下の個々に分離した
   親水性高分子化合物からなる凝集反応用微粒子。