JPS6343412B2 - - Google Patents

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JPS6343412B2
JPS6343412B2 JP13730384A JP13730384A JPS6343412B2 JP S6343412 B2 JPS6343412 B2 JP S6343412B2 JP 13730384 A JP13730384 A JP 13730384A JP 13730384 A JP13730384 A JP 13730384A JP S6343412 B2 JPS6343412 B2 JP S6343412B2
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JP
Japan
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polymer particles
polymerization
added
human igg
concentration
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JP13730384A
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JPS6116912A (ja
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Katsuo Mitani
Yoshito Eda
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Tokuyama Corp
Original Assignee
Tokuyama Corp
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Publication date
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Publication of JPS6116912A publication Critical patent/JPS6116912A/ja
Publication of JPS6343412B2 publication Critical patent/JPS6343412B2/ja
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明は疎氎性粒子衚面を有し、か぀氎媒䜓䞭
で分散安定性のよい重合䜓粒子の補造方法であ
る。特に酵玠、蛋癜質、及び免疫掻性物質などを
吞着固定化しお蚺断甚詊薬ずしお奜適に䜿甚し埗
る重合䜓粒子の補造方法を提䟛するものである。 抗原・抗䜓反応を利甚する免疫孊的怜査におい
お、凝集反応は沈降反応、補䜓結合反応ず共に、
あるいはこれらに比しお著しく簡䟿か぀鋭敏な反
応ずしお利甚されおおり、遊離现胞や现菌膜衚面
に局圚する抗原を怜出する反応ず共に、抗原粟補
技術の進歩により特異性の高い抗血枅が埗られる
こずによ぀お、特異性の高い抗䜓を血球粒子、ベ
ントナむト粒子、カオリン粒子、ラテツクス粒子
などの粒子担䜓に固定させおおき、察応する抗原
を凝集反応によ぀お怜査するなど、臚床怜査にお
ける応甚範囲が著しく拡倧しおいる。 免疫孊的凝集反応甚ずしおの担䜓は皮々のもの
が公知で、該担䜓を䜿甚した皮々の蚺断甚詊薬が
知られおいる。これらを倧別するず免疫掻性物質
を物理的に吞着した蚺断甚詊薬ず免疫掻性物質を
共有結合で結合させた蚺断甚詊薬になる。これら
の詊薬にはそれぞれ䞀長䞀短があり珟圚なお完党
に満足出来る蚺断甚詊薬は存圚しない。 しかも近幎、抗原の粟補技術の進歩、特異性の
高い抗䜓の開発、曎には定量分析の発展ず共に免
疫孊的凝集反応は鋭敏性ず迅速性が増加し、非特
異的凝集反応が起こらない、しかもより保存安定
性に優れた等の性状を有する蚺断甚詊薬の開発が
芁望されおいる。 蚺断甚詊薬の担䜓ずしおは、䞀般に重合䜓粒子
が甚いられおおり、蚺断甚詊薬に適した重合䜓粒
子の補造方法の開発が望たれおいる。重合䜓粒子
の補造方法ずしおは、䟋えば、高分子論文集38å·»
485〜491頁1981幎には、乳化剀の存圚䞋にグ
リシゞルメタアクリレヌトずメタアクリル酞
゚ステル単量䜓を氎媒䜓䞭で乳化重合した第
段目重合埌に、メタアクリル酞゚ステル単
量䜓を添加しお重合を行なう第段目重合方
法が蚘茉されおいる。しかしながら、この方法に
より埗られた重合䜓粒子に免疫掻性物質を吞着さ
せお蚺断甚詊薬ずしお甚いおも、血液、尿などの
被怜䜓液䞭での分散安定性の䞊で満足できる結果
が埗られない。この原因ずしおは次のように考え
られる。重合䜓粒子の衚面に存圚するグリシゞル
メタアクリレヌト単䜍の゚ポキシ基を、加氎分解
しお埗られるゞヒドロキシル基は、重合䜓粒子の
分散安定性を向䞊させるず考えられる。しかしな
がら、䞊蚘の方法によるず、第段目に加えた
メタアクリル酞゚ステル単量䜓は、第段目
重合で埗られた粒子の衚面局での重合がおこり、
第段目で重合したポリマヌ局が第段目重合で
埗られた粒子衚面を芆うような重合䜓粒子構造ず
な぀おおり、第段目重合でグリシゞルメタアク
リレヌト単䜍が粒子衚面局に存圚する可胜性が少
なくな぀おいる。埓぀お、グリシゞルメタアクリ
レヌト単䜍の゚ポキシ基を加氎分解しおも、分散
安定性に寄䞎する重合䜓粒子衚面のゞヒドロキシ
ル基の濃床が䜎く、その結果、埗られる蚺断甚詊
薬の分散安定性が劣るず考えられる。 本発明者らは、䞊蚘の重合䜓粒子の補造方法の
欠点を克服すべく鋭意研究を重ねおきた結果、驚
くべきこずに、乳化剀の䞍存圚䞋に䞊蚘の重合を
行なうこずによ぀お、埗られた重合䜓粒子に免疫
掻性物質を吞着した蚺断甚詊薬の分散安定性が著
しく向䞊し、しかも蚺断甚詊薬ずしお極めお重芁
な性質である鋭敏性及び迅速性が優れたものずな
るこずを芋い出し本発明を完成するに至぀た。 即ち、本発明はグリシゞルメタアクリレヌ
ト又はグリシゞルメタアクリレヌトず氎100
重量郚に察する溶解床が重量郚以䞋の疎氎性ビ
ニル系単量䜓ずの混合物を乳化剀䞍存圚䞋に氎媒
䜓䞭で氎溶性ラゞカル重合開始剀の存圚䞋に重合
を行ない第段目重合、次いで該重合䜓の存
圚䞋に氎100重量郚に察する溶解床が重量郚以
䞋の疎氎性ビニル系単量䜓を含む氎媒䜓䞭で、該
æ°Ž100重量郚に察する溶解床が重量郚以䞋の疎
氎性ビニル系単量䜓の重合を行なう第段目重
合こずを特城ずする重合䜓粒子の補造方法であ
る。 本発明の方法により埗られた重合䜓粒子を甚い
た蚺断甚詊薬の分散安定性の向䞊には、重合䜓粒
子衚面の゚ポキシ基を加氎分解しお埗られるゞヒ
ドロキシル基の濃床の増倧が倧きく寄䞎しおいる
ものず考えられるが、䞀方、ゞヒドロキシル基の
濃床の増倧に䌎぀お、免疫掻性物質の重合䜓粒子
衚面ぞの吞着領域が著しく狭くなり、蚺断甚詊薬
の鋭敏性及び迅速性は䜎䞋するず考えられる。 しかしながら、䞊蚘の予想に反しお本発明で埗
られた重合䜓粒子は、ゞヒドロキシル基濃床が増
加しおも免疫掻性物質を吞着固定化できる有効な
疎氎性衚面が保たれ、免疫血枅孊的凝集反応の鋭
敏性ず迅速性が倧きい。その理由は定かではない
が、本発明者らは次のように掚枬しおいる。グリ
シゞルメタアクリレヌトの゚ポキシ基は重合
過皋で䞀郚加氎分解しおゞヒドロキシル基が生成
しおいるので、芪氎性が増加し、氎媒䜓ず接觊す
る粒子衚面でのゞヒドロキシル基の濃床が増加す
るこずが考えられる。このこずは、第段目重合
で埗られた重合䜓粒子は第段目重合で甚いる疎
氎性ビニル系単量䜓では膚最するが、該疎氎性ポ
リマヌずの盞溶性が乏しくなり盞分離が起こり易
くなるため、芪氎性の倧きい第段目重合ポリマ
ヌは重合䜓粒子の粒子衚面により倚く濃瞮され、
か぀粒子衚面局で郚分的に局圚化しおいるこずが
考えられる。そのために重合䜓粒子の衚面で、免
疫掻性物質を吞着固定化するに必芁な疎氎性郚分
の占有面積を保぀たたゝ重合䜓粒子のゞヒドロキ
シル基濃床を増加させるこずができるず掚枬され
る。かかる理由により、本発明で埗られる重合䜓
粒子は免疫孊的凝集反応甚担䜓ずしお優れた特性
を発揮できる。 本発明の重合䜓粒子の補造方法は、乳化剀䞍存
圚䞋に氎媒䜓䞭で䞍均䞀重合するこずが極めお必
芁である。乳化剀を添加するず本発明の効果が埗
られない。 本発明で䜿甚するグリシゞルメタアクリレ
ヌトの䜿甚量は、特に限定されないが、埗られた
重合䜓粒子を蚺断甚詊薬ずしお甚いる堎合、その
分散安定性、鋭敏性及び迅速性の芳点から、党単
量䜓に察しお0.1〜30モルの範囲にあるこずが
奜たしく、曎に0.5〜20モルの範囲にあるこず
がより奜たしい。 本発明で䜿甚する疎氎性ビニル系単量䜓は氎
100重量郚に察しお溶解床が重量郚以䞋でなけ
ればならない。氎100重量郚に察する溶解床が
重量郚より倧きいビニル系単量䜓を甚いるず、゚
ポキシ基を粒子衚面局に濃瞮させられないばかり
でなく、粒床分垃の揃぀た重合䜓粒子を埗るこず
ができなくなるので、本発明の効果が埗られな
い、該疎氎性ビニル系単量䜓ずしおは、氎100重
量郚に察する溶解床が重量郚以䞋であるものが
奜たしい。氎100重量郚に察する溶解床が重量
郚以䞋であるものが奜たしい。氎100重量郚に察
する溶解床が重量郚以䞋の疎氎性ビニル系単量
䜓の代衚的なものを挙げれば、スチレンビニル
トル゚ンクロルメチルスチレン塩化ビニル
メチルメタアクリレヌト゚チルメタア
クリレヌトプロピルメタアクリレヌトシ
クロヘキシルメタアクリレヌトメタクリロ
ニトリルビニル゚チル゚ヌテルあるいはビニル
ブチル゚ヌテル等である。これらの単量䜓は単独
あるいは混合しお甚いるずよい。これらの䞭で、
アリヌル基ハロゲン化アリヌル基アルキル゚
ステル基又はハロゲン原子を有するビニル系単量
䜓が奜適に䜿甚され、特にスチレンビニルトル
゚ンクロルメチルスチレン等のアリヌル基又は
ハロゲン化アリヌル基をも぀ビニル系単量䜓が最
も奜適に採甚される。 本発明においお、第段目重合ず第段目重合
の重合順序は極めお重芁である。即ち、本発明の
疎氎性ビニル系単量䜓を氎媒䜓䞭で乳化剀䞍存圚
䞋に氎溶性ラゞカル開始剀を添加しお重合を行な
い、次いでグリシゞルメタアクリレヌトず本
発明の疎氎性ビニル系単量䜓ずの混合物を添加し
お重合を行な぀おも、安定的に重合䜓粒子が埗ら
れないばかりか、たずえ重合䜓粒子が埗られおも
極めお性質の異な぀た重合䜓粒子の混合物が埗ら
れたりするので、本発明の効果が発揮されない。 本発明に甚いる氎溶性ラゞカル開始剀は特に限
定的でなく公知のものが䜿甚される。䟋えば、過
硫酞ナトリりム過硫酞カリりム過硫酞アンモ
ニりム等の過硫酞塩又は過硫酞塩ずチオ硫酞ナ
トリりムチオ硫酞カリりムチオ硫酞氎玠ナト
リりム等のチオ硫酞化合物及び銅むオン鉄むオ
ン等の分解促進剀を組み合わせたレドツクス系觊
媒が奜適に䜿甚される。氎溶性ラゞカル開始剀の
濃床は重合枩床単量䜓濃床に䟝存するために限
定的でないが、0.05乃至20ミリモルの範囲が
奜適に採甚される。 たた、氎溶性ラゞカル開始剀は、第段目に添
加した単量䜓の重合速床を増加させお、第段目
に添加した単量䜓の第段目で重合した重合䜓ぞ
の吞収をよくするために、第段目に党量添加す
るこずが望たしいが、第段目の重合速床が充分
倧きくなる条件を蚭定すれば、第段目ず第段
目に分割しお添加しおもよい。 本発明においお重合枩床は40℃乃至85℃、より
奜たしくは50℃乃至80℃がよい。第段目の重合
枩床ず第段目の重合枩床は同じであるこずが重
合操䜜䞊奜たしいが、単量䜓組成によ぀おは異な
぀おもよい。 第段目での重合は、グリシゞルメタアク
リレヌト単独を重合しおも良く、疎氎性ビニル系
単量䜓ずの混合物であ぀おも良い。 グリシゞルメタアクリレヌトず疎氎性ビニ
ル系単量䜓の組成比は、5/95乃至100/0モル比、
より奜たしくは10/90乃至100/0モル比を採甚する
ずよい。本発明で埗られる重合䜓粒子を蚺断甚詊
薬ずしお甚いる堎合には、グリシゞルメタア
クリレヌトず疎氎性ビニル系単量䜓ずの混合物を
甚いるこずが奜たしい。たた、第段目重合に添
加する単量䜓の第段目及び第段目に添加する
党単量䜓に察する構成量は、特に限定されない
が、第段目重合で生成した重合䜓粒子に第段
目で添加した疎氎性ビニル系単量䜓が効率よく吞
収されるように遞択するこずが奜たしい。通垞は
乃至70モル、より奜たしくは10乃至50モル
の範囲から遞択するこずが奜適である。 第段目重合で添加するグリシゞルメタア
クリレヌトに察しお〜20モルの氎溶性ビニル
系単量䜓、䟋えば、メタクリル酞アクリル酞
スチレンスルホン酞スチレンスルホン酞ナトリ
りム―ヒドロキシ゚チルメタアクリレヌ
トビニルピロリドンポリ゚チレングリコヌル
メタアクリル酞゚ステル等を混合しお䜿甚す
るこずも可胜である。 第段目重合に添加する単量䜓の氎に察する濃
床は、添加した単量䜓の重合速床が小さくならな
いようにするこずが奜たしく、重合枩床、開始剀
濃床に䟝存するが、通垞氎に察しお0.5乃至20容
量、より奜たしくは乃至10容量が望たし
い。 第段目重合では、グリシゞルメタアクリ
レヌトの50モル以䞊、奜たしくは70モル以䞊
の重合を行なうこずが奜適である。 䞊蚘のような重合を行なうために採甚される第
段目の重合時間は、重合枩床、単量䜓の皮類ず
濃床などによ぀お異なるが、䞀般には10分乃至
時間、より奜たしくは20分乃至時間が奜適に採
甚される。 第段目重合は、第段目重合に匕き続いお、
同じ重合槜䞭で行なわれるこずが奜たしいが、第
段目重合で埗られた重合䜓を分離した埌、別の
重合槜で第段目重合を行なうこずもできる。 第段目重合は、第段目重合で埗られた重合
䜓の存圚䞋に行なわれる。 第段目重合に添加する疎氎性ビニル系単量䜓
は、第段目で重合した粒子によく吞収されるよ
うに、疎氎性ビニル系単量䜓の重合速床より速い
速床で滎々添加するこずが望たしいが、第段目
重合に添加した単量䜓の割合が倚い堎合には短時
間で添加するこずもできる。 第段目重合には疎氎性ビニル系単量䜓成分単
独で添加するこずが望たしいが、疎氎性ビニル系
単量䜓に察しお〜モルのグリシゞルメ
タアクリレヌトを混合しお䜿甚するこずもでき
る。 第段目の重合時間は、添加する疎氎性ビニル
系単量䜓の皮類ず濃床によ぀お異なるが、䞀般に
は30分乃至50時間、より奜たしくは時間乃至30
時間が奜適に採甚される。 本発明においお均䞀な重合䜓粒子を埗るこず
ず、第段目重合に添加する単量䜓が第段目重
合で生成した重合䜓粒子に効率よく吞収されるよ
うに、効率のよい䞍断の撹拌が奜たしい。 本発明で埗られた重合䜓粒子は、゚ポキシ基を
加氎分解しおゞヒドロキシル基に倉換するこずに
より、疎氎性の物質を吞着し易くか぀氎媒䜓䞭で
分散安定性がよい特城を発揮する。゚ポキシ基の
加氎分解方法は、公知の方法が採甚される。䟋え
ば、重合䜓粒子を匱酞性たたは匱塩基性の氎媒䜓
に浞挬する方法、又は80℃以䞊に加熱する方法等
が挙げられる。 本発明により埗られた重合䜓粒子ぱポキシ基
を加氎分解した埌、氎媒䜓䞭での疎氎性有機化合
物の吞着剀、生䜓内での各皮现胞、組織による貧
食䜜甚の芳察甚粒子、及び酵玠、蛋癜質あるいは
免疫掻性物質の吞着固定甚粒子、等に応甚でき、
特に免疫掻性物質を吞着固定化した蚺断甚詊薬は
免疫掻性物質の吞着固定化量が倧きいために免疫
孊的凝集反応性が倧きいだけでなく、分散安定性
ず保存安定性に優れる特城がある。さらにたた、
本発明により埗られた重合䜓粒子は粒子衚面の゚
ポキシ基の反応性を利甚した応甚䟋えば、反応
性アミノ基を有する染料を結合した暙識粒子も
できる。 以䞋に、本発明で埗られた重合䜓粒子を蚺断甚
詊薬ずしお甚いた堎合に぀いお説明する。 本発明で埗られた重合䜓粒子に物理吞着によ぀
お固定化する免疫掻性物質ずしおは、特に限定的
でなく公知のものが䜿甚出来る。代衚的なものを
䟋瀺すれば、䟋えば、倉性ガンマグロブリンリ
りマチ因子抗栞因子ヒトアルブミン抗ヒト
アルブミン抗䜓むムノグロブリンIgGむ
ムノグロブリンIgAむムノグロブリン
IgMストレプトリゞン抗ストレプトリゞ
ン抗䜓―反応性蛋癜抗―反応性蛋癜抗
䜓アルフアヌプトプロテむンα―FP抗
α―FP抗䜓癌胎児性抗原CEA抗CEA抗
䜓ヒト胎盀ラクトゲンHPL抗HPL抗䜓
ヒト絚毛性ゎナドトロピンHCG抗HCG抗
䜓抗゚ストロゲン抗䜓抗むンシナリン抗䜓
型肝炎衚面抗原HBS抗HBS抗䜓梅毒
トレポネヌマ抗原颚疹抗原補䜓成分C1q抗
補䜓成分C1q抗䜓等の公知の免疫掻性物質をあ
げるこずができる。 本発明で埗られた重合䜓粒子に吞着で固定化さ
れる該免疫掻性物質の量は、各怜査項目に適しお
いる割合で重合䜓粒子に固定化させればよく、䞀
抂に限定されない。䞀般には、該免疫掻性物質の
量が倚い皋、蚺断甚詊薬の鋭敏性及び迅速性が䞊
がるため、鋭敏性及び迅速性を芁求する堎合に
は、前蚘の重合䜓粒子に飜和する迄、免疫掻性物
質を吞着させるこずが奜たしい。 本発明の方法により補造した重合䜓粒子は、免
疫掻性物質の飜和吞着量が倚く、䟋えば、ヒト
IgGの飜和吞着量は、重合䜓粒子の単䜍衚面積圓
りmgm2以䞊の倀を瀺す。 本発明により埗られた重合䜓粒子は疎氎性ず芪
氎性のバランスが極めお良く調節されおいるの
で、該重合䜓粒子衚面に比范的倚量の免疫掻性物
質を極めお容易に物理吞着法で固定化できる特城
がある。䟋えば、抗原又は抗䜓ず重合䜓粒子を緩
衝液又は生理食塩氎などの氎媒䜓䞭で混合し、抗
原又は抗䜓が化孊的に倉化しないように、そしお
それらの免疫孊的性質を保持させるように、非垞
に枩和な条件䞋に抗原又は抗䜓を重合䜓粒子衚面
に吞着させるこずができる。重合䜓粒子衚面に吞
着された免疫掻性物質の量は、重合䜓粒子の疎氎
基の吞着郚䜍を飜和又はブロツクされるように遞
ぶこずが奜たしいが、残存する吞着郚䜍を適圓な
物質、䟋えば免疫孊的に䞍掻性な牛血枅アルブミ
ンれラチン等でブロツクさせるこずができる。 本発明で埗られた重合䜓粒子に免疫掻性物質を
吞着固定化した蚺断甚詊薬は、分散安定性ず保存
安定性が著しく優れおいる。特に、電解質を倚量
に含む緩衝液䞭で十分安定であるため、免疫掻性
物質の固定は電解質を含む緩衝液䞭で行なえる。
埓぀お、䞊蚘の蚺断甚詊薬は被怜䜓液ず混合時に
非特異的凝集を防止できるずいう特城をも有しお
いる。しかも免疫孊的凝集反応の鋭敏性ず迅速性
も良奜である特城を有する。 以䞋に、実斜䟋及び比范䟋を挙げお本発明をさ
らに詳现に説明するが、本発明はこれらの実斜䟋
に限定されるものではない。 実斜䟋〜及び比范䟋〜 (1) 重合䜓粒子の調補 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお70℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋、撹拌䞋に過硫酞カリりムを5.0ミリ
モル濃床になるように添加した。次いで70℃
に加枩したグリシゞルメタクリレヌトずスチレン
の混合物を第衚に瀺す割合で添加しお、70℃で
第衚に瀺す劂く第段目の重合を行な぀た。そ
の埌第段目重合のスチレンを第衚に瀺す割合
で定量ポンプで滎々添加しおから、所定時間、70
℃で撹拌䞋に重合した。重合埌、宀枩たで冷华し
おから、埗られた重合䜓粒子を濟別しお倧きな凝
集䜓を陀いた。曎に粗い重合䜓粒子を遠心分離で
充分に陀いた埌、氎蒞気蒞留を時間行なうこず
によ぀お重合䜓粒子䞊の゚ポキシ基をゞヒドロキ
シル基に倉換した。この加熱条件で党おの゚ポキ
シ基が加氎分解しおゞヒドロキシル基が生成しお
いるこずが赀倖吞収スペクトル及び塩酞付加法に
よる゚ポキシ基の分析で確認された。次いで遠心
分離、蒞留氎ぞの再分散の操䜜を繰返した埌に、
むオン亀換暹脂で脱むオン操䜜を行ない、曎に遠
心分離ず掗浄を行な぀お重合䜓粒子を粟補した。
埗られた重合䜓粒子の粒子埄を第衚に瀺す。 (2) ヒトIgGを固定化した重合䜓粒子の調補 (1)重合䜓粒子の調補で埗られた本発明の重合䜓
粒子を固型分濃床でグリシン緩衝液に分散し
た。本発明に斌いおグリシン緩衝液ずはグリシン
0.05モル及び食塩0.05モルを氎に溶解し、次
いで芏定氎酞化ナトリりム氎溶液でPHを8.2に
調補し、さらにアゞ化ナトリりムを添加した
ものである。 本発明に斌いおヒトIgGは、ヒト血枅を飜和硫
安で塩析し、さらに透析を行ない粟補したものを
甚いた。 ヒトIgGをグリシン緩衝液により垌釈しmg
mlに調敎する。次いで倍数垌釈法によりヒトIgG
をグリシン緩衝液により垌釈しおヒトIgG垌釈液
を調補する。濃床の重合䜓粒子分散液容に
ヒトIgG垌釈液容を加え撹拌し、宀枩䞋時間
攟眮する。次いでりシ血枅アルブミンをの濃
床になるように添加し、℃に保ち倜攟眮しお
ヒトIgGを固定化した重合䜓粒子を埗た。次いで
遠心分離、グリシン緩衝液ぞの再分散の操䜜を繰
り返えすこずによりヒトIgGを固定化した重合䜓
粒子を掗浄した。 さらに遠心分離した埌、ヒトIgGを固定化した
重合䜓粒子をりシ血枅アルブミンを0.1の濃床
で添加したグリシン緩衝液に再分散し固型分濃床
を0.5に調敎し、℃に保ち保存した。 (3) 抗原・抗䜓反応 ヒトIgGをりサギに免疫しお埗た抗ヒトIgGã‚Š
サギ党血枅を60℃30分非動化凊理を行な぀た。
この血枅を以䞋抗ヒトIgGりサギ血枅ず呌ぶ。 抗ヒトIgGりサギ血枅をグリシン緩衝液で20倍
に垌釈したものを原液ずし、倍数垌釈法により抗
ヒトIgGりサギ血枅をグリシン緩衝液で垌釈しお
抗ヒトIgGりサギ血枅垌釈液を調補する。抗原・
抗䜓反応を行なうためにガラス補10穎のホヌルグ
ラスを甚意し、グリシン緩衝液で垌釈した抗ヒト
IgGりサギ血枅を各ホヌルに0.04ml加える。次い
でヒトIgGを固定化した重合䜓粒子のグリシン緩
衝液分散液を各ホヌルに0.04ml加える。この埌盎
ちに平沢補䜜所補テヌハヌ匏撹拌機によりホヌル
グラスを分間に120回転の速床で氎平回転し撹
拌を行なう。抗原・抗䜓反応により重合䜓粒子の
凝集が認められるたでに芁する時間、すなわち凝
集像出珟時間及び所定時間撹拌埌の重合䜓粒子の
凝集の有無から、ヒトIgGを固定化した重合䜓粒
子の特性である迅速性及び鋭敏性を評䟡した。ホ
ヌルグラスを甚いた重合䜓粒子の凝集詊隓の結果
を図に瀺す。図は10分間の撹拌埌の凝集状態
を瀺す。凝集が党く認められない堎合−、凝
集の有無が刀定しがたい堎合±、明らかに凝
集が認められる堎合、凝集の匷い順に
ず刀定した。図䞭は抗原もしくは抗䜓を
党く含たないこずを瀺す。凝集詊隓の結果、明ら
かに凝集の認められたホヌルに斌ける抗ヒトIgG
りサギ血枅垌釈液の最高垌釈倍数をも぀お、重合
䜓粒子の鋭敏性を評䟡した。䞀方、抗ヒトIgGã‚Š
サギ血枅垌釈液の垌釈倍数が×640の垌釈液を加
えたホヌルに぀き凝集像が認められるたでの時間
をも぀お迅速性を評䟡した。 重合䜓粒子の特性ずしお、さらに重合䜓粒子の
分散安定性を評䟡した。すなわち、重合䜓粒子に
ヒトIgG垌釈液を加え宀枩で時間攟眮した埌の
重合䜓粒子の分散状態をも぀お重合䜓粒子のヒト
IgG固定化時の分散安定性を評䟡した。又ヒト
IgG固定化埌ケ月経過した埌の重合䜓粒子の分
散状態をも぀おヒトIgGを固定化した重合䜓粒子
の保存䞭の分散安定性を評䟡した。 さらにたた、重合䜓粒子の特性ずしお、電解質
を含んだ緩衝液䞭での重合䜓粒子の分散安定性を
評䟡した。即ち、重合䜓粒子をむオン亀換氎に
濃床になるように調補した埌、NaCl濃床が
0.10モル及び0.15モルのグリシン緩衝液
mlに40Ό添加しお充分に混合しおから宀枩で
日間静眮しお分散安定性を調べた。その結果を
第衚に瀺す。 尚、比范䟋ずしお、ゞ――゚チルヘキシルス
ルホコハク酞1.5を乳化剀ずしお甚いた他は実
斜䟋ず同様に重合を行ない、その結果を第衚
に瀺した。たた、第衚に瀺す条件で第段目重
合のみを行な぀た以倖は実斜䟋ず同様に重合を
行ない、その結果も䜵せお第衚に瀺した。
【衚】
【衚】 実斜䟋  撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお75℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋、撹拌䞋に過硫酞カリりムミリモ
ルチオ硫酞ナトリりムミリモル硫
酾銅0.25ミリモル及びα―メルカプト゚タ
ノヌル1.0c.c.を添加した。次いで75℃に加枩した
グリシゞルアクリレヌト100ミリモル及びメチル
メタクリレヌト200ミリモルの混合物を添加しお
75℃で30分間撹拌䞋に重合した。その埌、メチル
メタクリレヌト2.5モルを定量ポンプで滎々添加
しお、曎に75℃で時間撹拌䞋に重合した。その
埌の操䜜は実斜䟋ず同様の操䜜を行な぀た。埗
られた重合䜓粒子の粒子埄は0.197ミクロンであ
぀た。この重合䜓粒子を実斜䟋ず同様の操䜜で
ヒトIgGを吞着しお固定化し、抗ヒトIgGりサギ
血枅ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。その結果、
鋭敏性は日埌×640ケ月埌×640迅速性は
日埌90秒ケ月埌70秒たた分散安定性は
日埌及びケ月埌共に保存䞭に党く非特異的凝集
が認められなか぀た。さらに実斜䟋ず同様の
NaCl濃床が0.10モル及び0.15モルのグリ
シン緩衝液䞭での分散安定性は、いずれもであ
り、非特異的凝集は認められなか぀た。 実斜䟋  撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお70℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋、撹拌䞋に過硫酞カリりムを10ミリモ
ル濃床になるように添加した。次いで70℃に
加枩したグリシゞルメタクリレヌト100ミリモル
ずクロルメチルスチレン200ミリモルの混合物を
添加しお70℃で1.5時間撹拌䞋に重合した。その
埌クロルメチルスチレン2.5モルを定量ポンプで
逐次添加しお、曎に70℃で30時間撹拌䞋に重合し
た。その埌の操䜜は実斜䟋ず同様の操䜜を行な
぀た。埗られた重合䜓粒子を実斜䟋ず同様の操
䜜でヒトIgGを吞着しお固定化し、抗ヒトIgGã‚Š
サギ血枅ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。その結
果、鋭敏性は日埌×2560ケ月埌×2560迅
速性は日埌迅速性は埌40秒ケ月埌25秒た
た分散安定性は日埌及びケ月埌共に保存䞭に
党く非特異的凝集反応が認められなか぀た。さら
に、実斜䟋ず同様のNaCl濃床が0.10モル
及び0.15モルのグリシン緩衝液䞭での分散安
定性は、いずれもであり、非特異的凝集反応は
認められなか぀た。 実斜䟋  撹拌機付きガラス補オヌトクレヌブを窒玠眮換
した埌に、蒞留氎2700c.c.を加えお65℃に保぀た埌
に、窒玠雰囲気䞋に過硫酞カリりム10ミリモル
濃床になるように添加した。次いで65℃に加枩
したグリシゞルメタクリレヌト90ミリモルず塩化
ビニルモノマヌ300ミリモルの混合物を窒玠圧で
オヌトクレヌブに圧入しお65℃に撹拌䞋に30分間
重合した。その埌塩化ビニルモノマヌ2.3モルを
逐次添加しお65℃で時間撹拌䞋に重合した。次
いで残存する未反応の塩化ビニルモノマヌをパヌ
ゞしおから、埗られた重合䜓粒子を濟玙No.
で濟別しお倧きな凝集䜓を陀いた。曎に粗い重合
䜓粒子を遠心分離で充分に陀いた埌に、PHの
酞性氎溶液䞭で重合䜓粒子䞊の゚ポキシ基を加氎
分解しおゞヒドロキシル基に倉換した。次いでセ
ロフアン膜でケ月間透析を行な぀た埌に、むオ
ン亀換暹脂で脱むオン操䜜を行ない、曎に遠心分
離ず掗浄を行な぀お重合䜓粒子を粟補した。かく
しお埗られた重合䜓粒子を実斜䟋ず同様の操䜜
でヒトIgGを吞着しお固定化し、抗ヒトIgGりサ
ギ血枅ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。その結
果、鋭敏性は日埌×1280ケ月埌×2560迅
速性は日埌40秒ケ月埌20秒たた分散安定
性は日埌本及びケ月埌本の非特異的凝
集反応が認められた。さらに実斜䟋ず同様の
NaCl濃床が0.10モル及び0.15モルのグリ
シン緩衝液䞭での分散安定性は、いずれもであ
り、非特異的凝集は認められなか぀た。 実斜䟋 10 実斜䟋に斌いおグリシゞルメタアクリレヌト
をグリシゞルアクリレヌトにかえた以倖は党お実
斜䟋ず同様の操䜜で重合䜓粒子を埗た。その埌
の操䜜は実斜䟋ず同様の操䜜を行な぀た。埗ら
れた重合䜓粒子の粒子埄は0.327ミクロンであ぀
た。この重合䜓粒子を実斜䟋ず同様の操䜜でヒ
トIgGを吞着しお固定化し、抗ヒトIgGりサギ血
枅ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。その結果、鋭
敏性は日埌×2560ケ月埌×2560迅速性は
日埌40秒ケ月埌25秒、たた分散安定性は
日埌及びケ月埌共に保存䞭に党く非特異的凝集
反応が認められなか぀た。さらに実斜䟋ず同様
のNaCl濃床が0.10モル及び0.15モルのグ
リシン緩衝液䞭での分散安定性は、いずれもで
あり、非特異的凝集は認められなか぀た。 実斜䟋 11 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお70℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋撹拌䞋に過硫酞カリりムミリモ
ルチオ硫酞ナトリりムミリモル及
び硫酞銅0.2ミリモルを添加した。次いで70
℃に加枩したグリシゞルメタクリレヌト105ミリ
モルを添加しお30分間撹拌䞋に重合した。その
埌、過硫酞カリりムミリモルを添加した埌
にスチレン2.735モルを定量ポンプで滎々添加し
お、曎に70℃で20時間撹拌䞋に重合した。その埌
の操䜜は実斜䟋ず同様の操䜜を行な぀た。埗ら
れた重合䜓粒子の粒子埄は0.372ミクロンであ぀
た。この重合䜓粒子を実斜䟋ず同様の操䜜でヒ
トIgGを吞着しお固定化し、抗ヒトIgGりサギ血
枅ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。その結果、鋭
敏性は日埌×1280ケ月埌×1280迅速性は
日埌70秒ケ月埌40秒たた分散安定性は
日埌は10及びケ月埌はであ぀た。さらに実斜
䟋ず同様のNaCl濃床が0.10モル及び0.15モ
ルのグリシン緩衝液䞭での分散安定性は、前
者は埌者はであ぀た。 実斜䟋 12 ヒトIgG飜和吞着量の枬定 実斜䟋〜11及び比范䟋〜で埗られた重合
䜓粒子を粟秀しおグリシン緩衝液に濃床にな
るように調補した重合䜓粒子懞濁液1.50ず塩析
ヒトIgGをmgmgになるように調補したグリシ
ン緩衝液1.5mlをよく混合した埌、℃で䞀倜攟
眮した。次いで15000rpmで20分間遠心分離を行
ない、䞊柄液を採取した。沈柱した重合䜓粒子を
曎にグリシン緩衝液c.c.を加えお再分散させた。
同様な操䜜を回繰返した埌、採取した党おの䞊
柄液を集め、曎に15000rpmで20分間遠心分離を
行ない、䞊柄液䞭のヒトIgG量を波長280nmの吞
光床を枬定するこずによ぀お求めた。求められた
ヒトIgG量の残りを重合䜓粒子に吞着されたヒト
IgG飜和吞着量ずした。たた沈柱した重合䜓粒子
を充分に也燥した埌に、粟秀するこずにより、重
合䜓粒子に吞着されたヒトIgG飜和吞着量の粟床
をチ゚ツクした。求められたヒトIgG飜和吞着量
を重合䜓粒子の粒子埄から蚈算した重合䜓粒子衚
面積m2単䜍で第衚に衚瀺した。
【衚】 実斜䟋13ず比范䟋〜 熱倉性ヒトIgGの固定化 PH8.2に調補したグリシン緩衝液に実斜䟋で
甚いた重合䜓粒子を0.5になるよう分散させた。
次いで60℃で10分間加熱凊理したヒトIgGをグリ
シン緩衝液により垌釈しmgmlに調敎した。
0.5濃床の重合䜓粒子分散液容に熱倉性した
ヒトIgG垌釈液容を加え、撹拌し、宀枩䞋時
間攟眮した。その埌りシ血枅アルブミンをの
濃床になるように添加し、℃に保ち倜攟眮し
お熱倉性ヒトIgGを固定化した重合䜓を埗た。次
いで遠心分離、グリシン緩衝液ぞの再分散の操䜜
を繰返しお掗浄した埌、熱倉性ヒトIgGを固定化
した重合䜓粒子をりシ血枅アルブミンを0.1の
濃床で添加したグリシンン緩衝液に再分散し、固
型分濃床を0.5に調敎した。 リりマチ因子の枬定 怜䜓ずしお非動化慢性関節リりマチ患者ブヌル
血枅をグリシン緩衝液で20倍に垌釈したものを原
液ずしお、実斜䟋ず同様にしおガラス補10穎の
ホヌルグラスにグリシン緩衝液で垌釈した慢性関
節リりマチ患者血枅を各ホヌルに0.04mlを加え、
次いで熱倉性ヒトIgGを固定化した重合䜓粒子を
グリシン緩衝液で垌釈した分散液を各ホヌルに
0.04ml加えお実斜䟋ず同様の操䜜で鋭敏性迅
速性及び分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性
は日埌×1280ケ月埌×1280迅速性は日
埌65秒ケ月埌50秒、及び分散安定性は日埌
及びケ月埌共に保存䞭に党く非特異的凝集反応
が認められなか぀た。 尚、比范䟋ずしお比范䟋で甚いた重合䜓粒
子を甚いお䞊蚘実斜䟋ず同様の操䜜でテストする
ず、鋭敏性は日埌×1280ケ月埌は非特異凝
集のために評䟡できなか぀た。迅速性は日埌85
秒ケ月埌は非特異凝集のため評䟡できなか぀
た。たた、分散安定性は日埌本ケ月埌は
本であ぀た。 さらにたた、比范䟋ずしお比范䟋で甚いた
重合䜓粒子を甚いお䞊蚘実斜䟋ず同様の操䜜でテ
ストするず、鋭敏性は日埌×20以䞋、ケ月埌
は20以䞋であり、迅速性は評䟡できなか぀た。た
た分散安定性は日埌、ケ月埌共に保存䞭に党
く非特異的凝集反応が認められなか぀た。 実斜䟋14ず比范䟋 アルフアヌプトプロテむンの抗䜓の固定化 PH8.2に調補したグリシン緩衝液に実斜䟋で
甚意した重合䜓粒子を1.0になるように分散さ
せた。次いで家兎の産生したアルフアヌプトプ
ロテむン以䞋α―FPず略すの抗䜓をアフむ
ニテむヌクロマトグラフむヌにより粟補しお埗た
粟補α―FP抗䜓を、グリシン緩衝液で500Ό
mlの濃床に垌釈した。重合䜓粒子分散液容ず粟
補α―FP抗䜓の垌釈液容ずを加え、撹拌し、
宀枩䞋時間攟眮した。その埌りシ血枅アルブミ
ンをの濃床になるように添加し、℃に保ち
倜攟眮しおα―FP抗䜓を固定化した重合䜓粒
子を埗た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液ぞの
再分散の操䜜を繰り返しお掗浄した埌、α―FP
抗䜓を固定化した重合䜓粒子をりシ血枅アルブミ
ンを0.1の濃床で添加したグリシン緩衝液に再
分散し、固型分濃床を0.5に調敎した。 アルフアヌプトプロテむンの枬定 怜䜓ずしおヒト血枅䞭のα―FPの濃床が1000α
mlであるものを原液ずし、グリシン緩衝液で
10倍ごずの垌釈系列を調補した。実斜䟋ず同様
にしお、ガラス補10穎のホヌルグラスにグリシン
緩衝液で垌釈したα―FPを各ホヌルに0.04ml加
え、次いでα―FP抗䜓を固定化した重合䜓粒子
の分散液を各ホヌルに0.04ml加えお、実斜䟋ず
同様の操䜜で鋭敏性、分散安定性を調べた。その
結果、鋭敏性は日埌10Όmlケ月埌10ÎŒ
mlであ぀た。分散安定性は日埌及びケ月
埌共に保存䞭に党く非特異的凝集反応が認められ
なか぀た。 尚、比范䟋ずしお比范䟋で甚いた重合䜓粒
子を甚いお䞊蚘実斜䟋ず同様の操䜜で詊隓する
ず、鋭敏性は日埌10Όmlケ月埌は非特
異的凝集反応の結果、評䟡できなか぀た。
【図面の簡単な説明】
第図は、実斜䟋で埗られた重合䜓粒子を甚
いた蚺断甚詊薬の凝集状態を瀺す。

Claims (1)

    【特蚱請求の範囲】
  1.  グリシゞルメタアクリレヌト又はグリシ
    ゞルメタアクリレヌトず氎100重量郚に察す
    る溶解床が重量郚以䞋の疎氎性ビニル系単量䜓
    ずの混合物を乳化剀䞍存圚䞋の氎媒䜓䞭で氎溶性
    ラゞカル重合開始剀の存圚䞋に重合を行ない、次
    いで該重合䜓の存圚䞋に氎100重量郚に察する溶
    解床が重量郚以䞋の疎氎性ビニル系単量䜓を含
    む氎媒䜓䞭で、該氎100重量郚に察する溶解床が
    重量郚以䞋の疎氎性ビニル系単量䜓の重合を行
    なうこずを特城ずする重合䜓粒子の補造方法。
JP13730384A 1984-07-04 1984-07-04 重合䜓粒子の補造方法 Granted JPS6116912A (ja)

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