JPH0215566B2 - - Google Patents

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JPH0215566B2
JPH0215566B2 JP60028388A JP2838885A JPH0215566B2 JP H0215566 B2 JPH0215566 B2 JP H0215566B2 JP 60028388 A JP60028388 A JP 60028388A JP 2838885 A JP2838885 A JP 2838885A JP H0215566 B2 JPH0215566 B2 JP H0215566B2
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JP
Japan
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polymer particles
hydrophilic polymer
concentration
group
reaction
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JP60028388A
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JPS61189300A (ja
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Katsuo Mitani
Yoshito Eda
Shinichi Kimura
Takashi Maehara
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Tokuyama Corp
Original Assignee
Tokuyama Corp
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Publication date
Application filed by Tokuyama Corp filed Critical Tokuyama Corp
Priority to JP60028388A priority Critical patent/JPS61189300A/ja
Publication of JPS61189300A publication Critical patent/JPS61189300A/ja
Publication of JPH0215566B2 publication Critical patent/JPH0215566B2/ja
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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description

【発明の詳现な説明】
産業䞊の利甚分野 本発明は氎媒䜓䞭で分散安定性のよい芪氎性重
合䜓粒子の補造方法である。特に酵玠蛋癜質
及び免疫掻性物質などを固定化しお蚺断甚詊薬ず
しお奜適に䜿甚し埗る芪氎性重合䜓粒子の補造方
法を提䟛するものである。 埓来の技術及び発明が解決しようずする問題
点 抗原・抗䜓反応を利甚する免疫孊的怜査におい
お、凝集反応は沈降反応補䜓結合反応ず共に、
あるいはこれらに比しお著しく簡䟿か぀鋭敏な反
応ずしお利甚されおいる。そしお、凝集反応は、
遊離现胞や现菌膜衚面に局圚する抗原を怜出する
反応ず共に、抗原粟補技術の進歩により特異性の
高い抗血枅が埗られるこずによ぀お、特異性の高
い抗䜓を血球粒子ベントナむト粒子カオリン
粒子ラテツクス粒子などの粒子担䜓に固定させ
おおき、察応する抗原を凝集反応によ぀お怜査す
るなど、臚床怜査における応甚範囲が著しく拡倧
しおいる。 免疫孊的凝集反応甚ずしおの担䜓は皮々のもの
が公知で、該担䜓を䜿甚した皮々の蚺断甚詊薬が
知られおいる。これらを倧別するず免疫掻性物質
を物理的に吞着した蚺断甚詊薬ず免疫掻性物質を
共有結合で結合させた蚺断甚詊薬になる。これら
の詊薬にはそれぞれ䞀長䞀短があり珟圚なお完党
に満足出来る蚺断甚詊薬は存圚しない。 しかも近幎、抗原の粟補技術の進歩、特異性の
高い抗䜓の開発、曎には定量分析の発展ず共に免
疫孊的凝集反応は鋭敏性ず迅速性が増加し、非特
異的凝集反応が起こらない、しかもより保存安定
性に優れた等の性状を有する蚺断甚詊薬の開発が
芁望されおいる。 蚺断甚詊薬の担䜓ずしおは、䞀般に重合䜓粒子
が甚いられおおり、蚺断甚詊薬に適した重合䜓粒
子の補造方法の開発が望たれおいる。 かくしお、免疫掻性物質を固定化した担䜓の非
特異的凝集反応を抑制するこずず、保存安定性を
高めるために数倚くの方法が開発されおいる。こ
れらの方法は、免疫掻性物質を固定化した担䜓に
保護コロむドを添加する方法ず、担䜓を芪氎性重
合䜓粒子にする方法に倧別される。前者の方法に
぀いおは、䟋えば、免疫掻性物質を担䜓に固定化
した埌に、牛血枅アルブミンれラチンなどの芪
氎性蛋癜質を添加する方法が䞀般的によく採甚さ
れおいるが、怜定混合物䞭で非特異的な蛋癜質―
蛋癜質盞互䜜甚に起因する劚害䜜甚が指摘されお
いる特開昭56―158947号公報。たた埌者の方
法に぀いお、䟋えば、特開昭56―30405号公報
特開昭56―141559号公報には繰返し単䜍が
―ゞオキシプロピルメタクリレヌト単䜍から成る
芪氎性架橋共重合䜓粒子を甚いる方法が、たた特
開昭57―135801号公報にはスチレン―グリシゞル
メタクリレヌト共重合䜓粒子を合成し、゚ポキシ
基を加氎分解しおゞヒドロキシル基に倉換しお芪
氎性重合䜓粒子を埗る方法が提案されおいる。こ
れらの方法は極めお秀れた方法である。しかし、
芪氎性基であるゞヒドロキシル基濃床を増加する
ず重合䜓粒子の安定性を向䞊させるこずが可胜で
あるが、免疫掻性物質を共有結合させる掻性点濃
床が枛少するために免疫掻性物質の固定化量が枛
少するずか、あるいは免疫掻性物質を吞着固定化
するに有効な疎氎性衚面が枛少するために、免疫
孊的凝集反応の鋭敏性が著しく䜎䞋する欠点があ
る。このように免疫掻性物質の固定化担䜓の免疫
孊的凝集反応性ず物理的安定性を同時に満足させ
るこずは埓来極めお困難であ぀た。 問題点を解決するための手段 本発明者等は免疫孊的凝集反応の鋭敏性に優れ
るず共に、非特異的凝集反応が䜎くか぀保存安定
性の優れた免疫掻性物質の固定化担䜓ずなる重合
䜓粒子に぀いお鋭意研究を重ねお来た結果、゚ポ
キシ基を衚面に有する重合䜓粒子に゚ポキシ基ず
反応する官胜基ずヒドロキシル基を有する有機化
合物を反応させるこずにより、前蚘芁望を満す優
れた効果をもたらすこずを芋い出した。 即ち本発明は、(A)゚ポキシ基を衚面に有する重
合䜓粒子、及び(B)分子䞭に、カルボキシル基ア
ミノ基メルカプト基及びアミド基よりなる矀か
ら遞ばれた少くずも皮の゚ポキシ基ず反応する
官胜基ずヒドロキシル基ずを有する有機化合物を
反応させ、芪氎性重合䜓を埗るこずを特城ずする
芪氎性重合䜓の補造方法である。 本発明で甚いられる゚ポキシ基を衚面に有する
重合䜓粒子は、グリシゞルメタアクリレヌト
を単独で重合するこずによ぀お、或いは、グリシ
ゞルメタアクリレヌトず共重合可胜なビニル
系単量䜓ずを共重合させるこずによ぀お埗るこず
ができる。グリシゞルメタアクリレヌトず共
重合させるビニル系単量䜓の代衚的なものを挙げ
れば、スチレンビニルトル゚ンクロルメチル
スチレンクロルスチレン塩化ビニル臭化ビ
ニルメチルメタアクリレヌト゚チルメ
タアクリレヌトプロピルメタアクリレヌ
トメタアクリロニトリル酢酞ビニル等の
疎氎性ビニル系単量䜓たた、アクリル酞メタ
クリル酞マレむン酞スチレンスルホン酞
―アクリルアミド――メチルプロパンスルホン
酞アクリルアミド――ヒドロキシプロ
ピルメタアクリルアミド―ヒドロキシ゚チ
ルメタアクリレヌトグリセロヌルモノメタクリ
レヌトポリ゚チレングリコヌルモノメタクリレ
ヌト等の氎溶性ビニル系単量䜓などが䟋瀺され
る。これらのビニル系単量䜓は皮以䞊を混合し
お甚いるこずもできる。さらにたた、必芁に応じ
お、ゞビニルベンれン゚チレングリコヌルゞメ
タクリレヌトゞ゚チレングリコヌルゞメタクリ
レヌトビスプノヌルゞグリシゞル゚ヌテル
等の架橋性単量䜓も奜適に䜿甚できる。 本発明で甚いる重合䜓粒子のグリシゞルメ
タアクリレヌトの組成は0.05乃至100モルが
奜適に採甚される。免疫掻性物質を物理的に吞着
させた蚺断甚詊薬に本発明の芪氎性重合䜓粒子を
甚いる堎合、グリシゞルメタアクリレヌトの
組成は0.05〜20モルさらに0.1〜15モルで
あるこずが奜たしい。たた、免疫掻性物質を共有
結合で結合させた蚺断甚詊薬に甚いる堎合には、
10〜100モルさらに3099モルであるこずが
奜たしい。 このような組成ずするこずによ぀お、衚面の゚
ポキシ基の濃床が前者で0.001〜0.4モル埌者
で0.2〜モルである重合䜓粒子を埗るこずが
できる。 本発明で甚いられる゚ポキシ基を衚面に有する
重合䜓粒子を埗るための補造方法は特に限定され
ず、公知の補造方法が奜適に採甚される。䟋え
ば、アニオン性界面掻性剀非むオン系界面掻性
剀の存圚䞋に氎媒䜓䞭で氎溶性ラゞカル開始剀を
甚いお乳化重合する方法、界面掻性剀を䜿わずに
氎媒䜓䞭で氎溶性ラゞカル開始剀を甚いお䞍均䞀
重合する方法、郚分鹞化ポリビニルアルコヌル
ポリビニルピロリドン等の保護コロむドの存圚䞋
に懞濁重合する方法、ビニル系単量䜓は溶解する
が重合䜓は溶解しない有機溶媒䞭で沈柱重合する
方法等が採甚される。 本発明で䜿甚する重合䜓粒子の平均粒子埄は特
に限定されないが、䞀般には0.05乃至10ミクロン
の範囲内にあるのが奜たしい。該粒子埄が0.05ミ
クロン以䞋では埮匱な免疫孊的凝集反応ず蚈枬す
るこずが困難になる堎合がある。たた粒子埄が10
ミクロン以䞊になるず鋭敏性が䜎䞋するだけでな
く、分散安定性保存安定性が悪くなる堎合があ
る。さらにたた、該重合䜓粒子の粒子埄の暙準偏
差は小さいこずが望たしい。 本発明で䜿甚する䞊蚘重合䜓粒子ず反応させる
有機化合物は、分子内に䞊蚘重合䜓粒子の衚面に
有る゚ポキシ基ず反応する特定の官胜基ず該重合
䜓粒子に芪氎性を付䞎するためのヒドロキシ基ず
を䜵せ有する有機化合物である。゚ポキシ基ず反
応する官胜基ずしおは、カルボキシル基アミノ
基メルカプト基アミド基等が挙げられる。就
䞭、゚ポキシ基ず容易に付加反応するアミノ基又
はメルカプト基が奜たしい。たた、゚ポキシ基ず
反応する官胜基ずヒドロキシル基ずの間の炭玠原
子数は〜30奜たしくは、〜10であるこずが埗
られる芪氎性重合䜓粒子の分散安定性が向䞊する
ために奜たしい。さらに、たたヒドロキシル基を
耇数個有する有機化合物は、䞊蚘ず同様に埗られ
る芪氎性重合䜓粒子の分散安定性が向䞊するため
に奜たしい。たた、これらの有機化合物の䞭で、
氎溶性の有機化合物が重合䜓粒子の安定化䜜甚に
特に有効であり、奜たしく採甚される。 本発明に斌いお奜適に䜿甚される有機化合物の
代衚的なものを䟋瀺するず次のずおりである。䟋
えば、グロン酞等のヒドロキシカルボン酞類セ
リントレオニン等のヒドロキシアミノ酞類
――ヒドロキシ゚チルラクタミドラクタ
ミド―パンセノヌル等のヒドロキシアミド
類―メルカプト゚タノヌル―メルカプト
プロパノヌル―メルカプトプロパノヌル
―メルカプトブタノヌル―メルカプト―
―プロパンゞオヌルメルカプトペンタ゚リス
リトヌルパントテニル・ミステむン等のヒドロ
キシメルカプタン類゚タノヌルアミンプロパ
ノヌルアミンゞ゚タノヌルアミン―アミノ
――゚チル――プロパンゞオヌル―
アミノ――メチル――プロパンゞオヌ
ル―アミノ――プロパンゞオヌルゞ
グリコヌルアミントリスヒドロキシ゚チル
アミノメタンゞむ゜プロパノヌルアミングル
コサミンガラクトサミンDL―む゜セリン
―トリスヒドロキシメチルメチル――ア
ミノプロパンスルホン酞―トリスヒドロキ
シメチルメチルグリシン等のヒドロキシアミン
類等の有機化合物をあげるこずができる。曎に奜
たしくは、゚ポキシ基ず容易に付加反応するヒド
ロキシメルカプタン類又はヒドロキシアミン類の
有機化合物が重合䜓粒子ずの反応で苛酷反応条件
を必芁ずしないので奜適に採甚される。 本発明においお、゚ポキシ基を衚面に有する重
合䜓粒子以䞋単に重合䜓粒子ずいうず分子䞭
に゚ポキシ基ず反応する官胜基ずヒドロキシル基
ずを有する有機化合物以䞋単に有機化合物ずい
うの反応は、重合䜓粒子衚面の特定量の゚ポキ
シ基ず反応させるに必芁な量の有機化合物及び重
合䜓粒子を氎媒䜓䞭、゚ポキシ基に䞍掻性な緩衝
液䞭、あるいは、゚ポキシ基ず反応性の極めお乏
しくか぀重合䜓粒子を溶解させない有機溶媒䞭で
混合すればよい。有機溶媒ずしおはメタノヌル
゚タノヌルむ゜プロパノヌルアセトン酢酞
メチル酢酞゚チルあるいはこれらの混合溶媒等
の氎ず芪和性の倧きい有機溶媒が奜たしい。反応
枩床は重合䜓粒子の分子構造や゚ポキシ基濃床、
有機化合物の゚ポキシ基ず反応する官胜基の皮
類、及び反応媒䜓によ぀お異なるが、䞀般的には
℃乃至100℃奜たしくは℃乃至60℃が奜適
に採甚される。反応媒䜓に有機溶媒を甚いる堎合
には重合䜓粒子を溶解させない凊理枩床を遞ぶこ
ずが重芁である。 本発明の反応における重合䜓粒子の濃床は、反
応䞭に重合䜓粒子が非特異的に凝集しないように
遞択すればよく、䞀般的には0.01乃至20の範囲
にあるこずが奜たしく、曎に0.05乃至10の範囲
にあるこずがより奜たしい。たた、有機化合物の
濃床は、重合䜓粒子の衚面の゚ポキシ基濃床、反
応すべき゚ポキシ基濃床、及び反応条件によ぀お
異なるが、䞀般的には重合䜓粒子の衚面の゚ポキ
シ基濃床に察しお、モル比で0.5〜200の範囲で遞
択される。免疫掻性物質を物理的に吞着させた蚺
断甚詊薬に本発明の芪氎性重合䜓粒子を甚いる堎
合は、有機化合物の濃床は重合䜓粒子の衚面の゚
ポキシ基濃床に察しおモル比で〜200の範囲ず
するこずが奜たしい。たた、免疫掻性物質を共有
結合によ぀お結合させた蚺断甚詊薬に甚いる堎合
は、モル比で0.5〜25の範囲ずするこずが奜たし
い。 本発明の反応における反応時間は、重合䜓粒子
の゚ポキシ基濃床有機化合物の濃床及び゚ポキ
シ基ずの反応性反応枩床によ぀お異なるので特
に限定的でないが、䞀般に10分乃至100時間が奜
たしく、曎には30分乃至50時間がより奜たしく採
甚される。 本発明の反応における重合䜓粒子ず有機化合物
の混合方法は、特に限定的でない。䞀般的には、
重合䜓粒子の懞濁媒䜓䞭ぞ有機化合物の氎又は有
機溶媒の垌釈溶液を䞀括に添加する方法もしくは
滎々添加する方法、あるいは有機化合物の反応媒
䜓䞭ぞ重合䜓粒子の氎又は有機溶媒の垌釈懞濁液
を䞀括に添加する方法もしくは滎々添加する方法
が奜たしくは採甚される。 本発明により埗られた芪氎性重合䜓粒子は、氎
媒䜓䞭での疎氎性有機化合物の吞着剀生䜓内で
の各皮现胞、組織による貧食䜜甚の芳察甚粒子
及び酵玠蛋癜質あるいは免疫掻性物質の固定化
甚粒子等に応甚でき、特に免疫掻性物質を吞着法
もしくは共有結合法で固定化した蚺断甚詊薬は免
疫孊的凝集反応性が倧きいだけでなく、分散安定
性ず保存安定性に優れる特城がある。 以䞋に、本発明で埗られた芪氎性重合䜓粒子を
蚺断甚詊薬ずしお甚いた堎合に぀いお説明する。 本発明で埗られた芪氎性重合䜓粒子に吞着法も
しくは共有結合法によ぀お固定化する免疫掻性物
質ずしおは、特に限定的でなく公知のものが䜿甚
出来る。代衚的なものを䟋瀺すれば、䟋えば、倉
性ガンマグロブリン抗栞因子ヒトアルブミ
ン抗ヒトアルブミン抗䜓むムノグロブリン
IgG抗ヒトIgG抗䜓むムノグロプリン
IgA抗ヒトIgA抗䜓むムノグロブリン
IgM抗ヒトIgM抗䜓ストレプトリゞン
ストレプトキナヌれヒアルロンダヌれ抗スト
レプトリゞン抗䜓―反応性蛋癜抗―反
応性蛋癜抗䜓アルフアヌプトプロテむン
AFP抗AFP抗䜓癌胎児性抗原CEA
抗CEA抗䜓ヒト繊毛性ゎナドトロピン
HCG抗HCG抗䜓抗゚ストロゲン抗䜓抗
むンシナリン抗䜓型肝炎衚面抗原HBs
抗HBs抗䜓梅毒トレポネマ抗原颚疹抗原
むンフル゚ンザ抗原補䜓成分C1q抗C1q抗䜓
抗C3q抗䜓等の公知の免疫掻性物質をあげるこ
ずができる。 本発明で埗られた芪氎性重合䜓粒子に固定化さ
れる該免疫掻性物質の量は、各怜査項目に適しお
いる割合で芪氎性重合䜓粒子に固定化させればよ
く、䞀抂に限定されない。䞀般には、該免疫掻性
物質の量が倚い皋、蚺断甚詊薬の鋭敏性が䞊がる
ため、鋭敏性を芁求する堎合には、前蚘の芪氎性
重合䜓粒子に飜和する迄、免疫掻性物質を吞着さ
せるこずが奜たしい。 本発明により埗られた芪氎性重合䜓粒子は免疫
掻性物質の固定化胜力ず芪氎性のバランスが極め
お良く調節されおいるので、抗原又は抗䜓ず芪氎
性重合䜓粒子を緩衝液又は生理食塩氎などの氎媒
䜓䞭で混合し、抗原又は抗䜓が化孊的に倉化しな
いように、そしおそれらの免疫孊的性質を保持さ
せるように、非垞に枩和な条件䞋に抗原又は抗䜓
を芪氎性重合䜓粒子衚面に固定化させるこずがで
きるだけでなく、該媒䜓䞭で極めお安定性が高い
特城がある。芪氎性重合䜓粒子衚面に固定化され
た免疫掻性物質の量は、重合䜓粒子の蛋癜結合郚
䜍を飜和又はブロツクされるように遞ぶこずが奜
たしいが、残存する蛋癜結合郚䜍を免疫孊的に䞍
掻性な適圓な物質でブロツク又は䞍掻性化させる
こずができる。 効果及び䜜甚 本発明で埗られた芪氎性重合䜓粒子に免疫掻性
物質を固定化した蚺断甚詊薬は、分散安定性ず保
存安定性が著しく優れおいる。特に、電解質を倚
量に含む緩衝液䞭で十分安定であるため、免疫掻
性物質の固定は電解質を含む緩衝液䞭で行なえ
る。埓぀お、䞊蚘の蚺断甚詊薬は被怜䜓液ず混合
時に非特異的凝集を防止できるずいう特城をも有
しおいる。しかも免疫孊的凝集反応の鋭敏性も良
奜である特城を有する。 本発明により埗られた芪氎性重合䜓粒子が、こ
のような優れた性質を有する理由は明らかでない
が、本発明者等は次のように掚枬しおいる。゚ポ
キシ基を有する重合䜓粒子ずヒドロキシル基を有
する有機化合物ずを反応させるこずにより、ヒド
ロキシル基を芪氎性重合䜓粒子の衚面から遠ざけ
るこずが可胜になるので免疫孊的性物質を固定化
した芪氎性重合䜓粒子のコロむド孊的安定性が高
たるず掚定される。たた、抗䜓を共有結合法で重
合䜓粒子に固定化した堎合、抗䜓のFab郚分の先
端に存圚する抗原認識郚䜍は重合䜓粒子衚面ず反
察の方向を向くこずが望たしい。本発明の方法で
は、芪氎性重合䜓粒子衚面から離れた䜍眮にある
ヒドロキシル基あるいはたたヒドロキシル基を有
する有機化合物が立䜓障害ずなるために、共有結
合で固定化した抗䜓のFabの抗原認識郚䜍が芪氎
性重合䜓粒子の衚面に向くこずが阻害され易くな
る。そのため、抗䜓を共有結合で固定化した免疫
孊的蚺断甚詊薬の性胜が長期間保持されるず掚定
される。さらに、有機化合物ずしお耇数個のヒド
ロキシル基を有するものを甚いた堎合には、䞊蚘
の有機化合物ず芪氎性重合䜓粒子の持぀゚ポキシ
基ずが反応しおヒドロキシル基が生成するだけで
なく、有機化合物の持぀ヒドロキシル基によ぀お
芪氎性が付䞎され、芪氎性重合䜓粒子の分散安定
性ず保存安定性が増加するず掚定される。ヒドロ
キシル基濃床が増加するず重合䜓粒子の分散安定
性ず保存安定性が増加するず考えられる。重合䜓
粒子のヒドロキシル基濃床を増加させるために重
合䜓粒子の重合の段階でヒドロキシル基を有する
モノマヌを倚量に䜿甚するこずが考えられるが、
この方法は、免疫掻性物質を共有結合掻性点が枛
少したり、たた免疫掻性物質を吞着固定化するに
有効な疎氎性衚面が枛少するために、免疫孊的凝
集反応の鋭敏性が䜎䞋する欠点が生じる。しかし
ながら、本発明の方法によれば、これらの免疫掻
性物質の共有結合掻性点濃床もしくは吞着固定化
する疎氎性衚面積を枛少させるこずなく、芪氎性
のヒドロキシル基濃床を増加させるこずが可胜に
なるので、免疫孊的蚺断甚詊薬の鋭敏性を損うこ
ずなく、分散安定性ず保存安定性が高たるず考え
られる。 以䞋に本発明をさらに具䜓的に説明するため
に、実斜䟋及び比范䟋を掲げるが、本発明はこれ
らの実斜䟋に限定されるものではない。 実斜䟋〜及び比范䟋〜 (1) 重合䜓粒子の調補 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.加えお70℃に保぀た埌に、窒玠
雰囲気䞋、撹拌䞋に過硫酞カリりムを5.0ミリモ
ル濃床になるように添加した。次いでゞ―
―゚チルヘキシルスルホコハク酞1.5を乳化剀
ずしお添加した埌、70℃に加枩したグリシゞルメ
タクリレヌト30ミリモルずスチレン100ミリモル
の混合物を添加しお時間重合を行な぀た。その埌
スチレンモルを定量ポンプで滎々添加しお
から70℃で29時間撹拌䞋に重合した。重合埌、宀
枩たで冷华しおから、埗られた重合䜓粒子を濟玙
No.で濟別しお倧きな凝集䜓を陀いた。次い
で透析を行な぀た埌に、遠心分離蒞留氎ぞの再
分散の操䜜を繰返した埌に、むオン亀換暹脂で脱
むオン操䜜を行ない、曎に遠心分離ず掗浄を行な
぀お重合䜓粒子を粟補した。埗られた重合䜓粒子
の粒子埄は0.237ÎŒmであ぀た。 (2) 芪氎性重合䜓粒子の調補 埗られた重合䜓粒子を濃床で蒞留氎に分散
した懞濁液100mlず、有機化合物の氎溶液もしく
はメタノヌル溶液を第衚に瀺す添加割合で混合
し、第衚に瀺す枩床で所定時間反応した。反応
埌、芪氎性重合䜓粒子を濟玙No.で濟別した
埌に、遠心分離蒞留氎ぞの再分散の操䜜を回
繰返した埌に、むオン亀換暹脂で脱むオン操䜜を
行ない、曎に遠心分離ず掗浄を行な぀お芪氎性重
合䜓粒子を埗た。かくしお埗られた芪氎性重合䜓
粒子を埮量窒玠分析蚈及び埮量硫黄分析蚈を利甚
しお反応した有機化合物の反応量を分析した。そ
の結果を第衚に瀺す。 (3) ヒトIgGを固定化した芪氎性重合䜓粒子の調
補 (2)で埗られた本発明の芪氎性重合䜓粒子を固型
分濃床でグリシン緩衝液に分散した。本発明
に斌いおグリシン緩衝液ずはグリシン0.05モル及
び食塩0.05モルを氎に溶解し、次いで芏定
氎酞化ナトリりム氎溶液でPHを8.2に調補し、さ
らにアゞ化ナトリりムを添加したものであ
る。 本発明に斌いおヒトIgGは、ヒト血枅を飜和硫
安で塩析し、さらに透析を行ない粟補したものを
甚いた。 ヒトIgGをグリシン緩衝液により垌釈しmg
mlに調敎する。次いで倍数垌釈法によりヒトIgG
をグリシン緩衝液により垌釈しおヒトIgG垌釈液
を調補する。濃床の芪氎性重合䜓粒子分散液
容にヒトIgG垌釈液容を加え撹拌し、宀枩䞋
時間攟眮する。次いでりシ血枅アルブミンを
の濃床になるように添加し、℃に保ち倜攟
眮しおヒトIgGを固定化した芪氎性重合䜓粒子を
埗た。次いで遠心分離グリシン緩衝液ぞの再分
散の操䜜を繰り返えすこずによりヒトIgGを固定
化した芪氎性重合䜓粒子を掗浄した。 さらに遠心分離した埌、ヒトIgGを固定化した
芪氎性重合䜓粒子をりシ血枅アルブミンを0.1
の濃床で添加したグリシン緩衝液に再分散し固型
分濃床を0.5に調敎し、℃に保ち保存した。 (4) 抗原・抗䜓反応 ヒトIgGをりサギに免疫しお埗た抗ヒトIgGã‚Š
サギ党血枅を60℃30分非動化凊理を行な぀た。
この血枅を以䞋抗ヒトIgGりサギ血枅ず呌ぶ。 抗ヒトIgGりサギ血枅をグリシン緩衝液で20倍
に垌釈したものを原液ずし、倍数垌釈法により抗
ヒトIgGりサギ血枅をグリシン緩衝液で垌釈しお
抗ヒトIgGりサギ血枅垌釈液を調補する。抗原・
抗䜓反応を行なうためにガラス補10穎のホヌルグ
ラスを甚意し、グリシン緩衝液で垌釈した抗ヒト
IgGりサギ血枅を各ホヌルに0.04ml加える。次い
でヒトIgGを固定化した芪氎性重合䜓粒子のグリ
シン緩衝液分散液を各ホヌルに0.04mlを加える。
この埌盎ちに平沢補䜜所補テヌハヌ匏撹拌機によ
りホヌルグラスを分間に120回転の速床で氎平
回転し撹拌を行なう。抗原・抗䜓反応により芪氎
性重合䜓粒子の凝集が認められるたでに芁する時
間、すなわち凝集像出珟時間及び所定時間撹拌埌
の芪氎性重合䜓粒子の凝集の有無から、ヒトIgG
を固定化した芪氎性重合䜓粒子の特性である鋭敏
性を評䟡した。ホヌルグラスを甚いた実斜䟋の
芪氎性重合䜓粒子の凝集詊隓の結果を図に瀺
す。図は10分間の撹拌埌の凝集状態を瀺す。凝
集が党く認められない堎合−、凝集の有無が
刀定しがたい堎合±、明らかに凝集が認めら
れる堎合、凝集の匷い順にず刀定した。
図䞭は抗原もしくは抗䜓を党く含たないこずを
瀺す。凝集詊隓の結果、明らかに凝集の認められ
たホヌルに斌ける抗ヒトIgGりサギ血枅垌釈液の
最高垌釈倍数をも぀お、重合䜓粒子の鋭敏性を評
䟡した。 芪氎性重合䜓粒子の特性ずしお、さらに芪氎性
重合䜓粒子の分散安定性を評䟡した。すなわち、
芪氎性重合䜓粒子にヒトIgG垌釈液を加え宀枩で
時間攟眮した埌の芪氎性重合䜓粒子の分散状態
をも぀お芪氎性重合䜓粒子のヒトIgG固定化時の
分散安定性を評䟡した。又ヒトIgG固定化埌ケ
月経過した埌の芪氎性重合䜓粒子の分散状態をも
぀おヒトIgGを固定化した芪氎性重合䜓粒子の保
存䞭の分散安定性を評䟡した。 さらにたた、芪氎性重合䜓粒子の特性ずしお、
電解質を含んだ緩衝液䞭での芪氎性重合䜓粒子の
分散安定性を評䟡した。即ち、芪氎性重合䜓粒子
をむオン亀換氎に濃床になるように調補した
埌、NaCl濃床が0.10モル及び0.15モルの
グリシン緩衝液mlに40ÎŒl添加しお充分に混合し
おから宀枩で日間静眮しお分散安定性を調べ
た。その結果を第衚に瀺す。 尚、比范䟋ずしお、(1)で埗られた粟補重合䜓
粒子を濃硫酞でPH2.0に調節した酞性氎媒䜓に
濃床で分散させ、宀枩で週間凊理し、重合䜓
粒子の゚ポキシ基を加氎分解しおゞヒドロキシル
基に倉換した。次いで濟玙No.で濟別した埌
透析を行な぀た。その埌遠心分離蒞留氎ぞの再
分散の操䜜を繰返した埌に、むオン亀換暹脂で脱
むオン操䜜を行ない、曎に遠心分離ず掗浄を行な
぀お重合䜓粒子を粟補した。埗られた重合䜓粒子
を実斜䟋ず同様の操䜜で性胜を調べた。その結
果を第衚に瀺す。 たた、ポリスチレンラテツクスずしおダり瀟
0.497ÎŒmのラテツクスを実斜䟋ず同様の操䜜で
性胜を調べた結果を、比范䟋ずしお第衚に瀺
す。
【衚】
【衚】
【衚】 実斜䟋10ず比范䟋 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.加えお70℃に保぀た埌に、窒玠
雰囲気䞋、撹拌䞋に過硫酞カリりムミリモル
濃床になるように添加した。次いで70℃に加枩
したグリシゞルメタアクリレヌト210ミリモル及
びスチレン100ミリモルの混合物を添加しお70℃
で時間撹拌䞋に重合した。その埌スチレン2.5
モルを定量ポンプで滎々添加しおから、70℃で29
時間撹拌䞋に重合した。その埌の操䜜は実斜䟋
ず同様の操䜜を行な぀た。埗られた重合䜓粒子の
粒子埄は0.345ÎŒmであ぀た。この重合䜓粒子を蒞
留氎100mlに濃床になるように調補し、グル
コサミン0.8mmoleを加えた。その埌PHを8.0に調
補し、宀枩で48時間反応した。反応埌は実斜䟋
ず同様の操䜜を行な぀お芪氎性重合䜓粒子を埗
た。埗られた芪氎性重合䜓粒子を実斜䟋ず同様
の操䜜でヒトIgGを吞着しお固定化し、抗ヒト
IgGりサギ血枅ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。
その結果、鋭敏性は日埌×1280ケ月埌×
2560たた分散安定性は日埌本ケ月埌
本の非特異的凝集反応が認められた。さらに実斜
䟋ず同様のNaCl濃床が0.10モル及び0.15モ
ルのグリシン緩衝液䞭での分散安定性は、い
ずれもの評䟡であ぀た。 尚比范䟋ずしお、䞊蚘で埗られた重合䜓粒子
を氎蒞気蒞留を時間行な぀お重合䜓粒子䞊の゚
ポキシ基を加氎分解しおゞヒドロキシルに倉換し
た。次いで重合䜓粒子を濟玙No.で濟別した
埌に、遠心分離蒞留氎ぞの再分散操䜜を回繰
返した埌に、むオン亀換暹脂で脱むオン操䜜を行
ない、曎に遠心分離ず掗浄を行な぀おゞヒドロキ
シル基を含有する重合䜓粒子を埗た。かくしお埗
られた粒子を実斜䟋ず同様の操䜜でヒトIgGを
吞着しお固定化し、抗ヒトIgGりサギ血枅ずの抗
原・抗䜓反応を行な぀た。その結果、鋭敏性は
日埌×1280ケ月埌×1280たた分散安定性は
日埌本ケ月埌本の非特異的凝集反応が
認められた。さらに実斜䟋ず同様のNaCl濃床
が0.10モル及び0.15モルのグリシン緩衝
液䞭での分散安定性は各及びの評䟡であ぀
た。 実斜䟋 11 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお75℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋撹拌䞋に過硫酞カリりムミリモ
ルチオ硫酞ナトリりムミリモル硫
酾銅0.25ミリモルを添加した。次いで75℃に
加枩したグリシゞルアクリレヌト15ミリモル及び
メチルメタクリレヌト250ミリモルの混合物を添
加しお75℃で30分間撹拌䞋に重合した。その埌、
メチルメタクリレヌトモルを定量ポンプで
滎々添加しお、曎に75℃で時間撹拌䞋に重合し
た。その埌の操䜜は実斜䟋ず同様の操䜜を行な
぀た。埗られた重合䜓粒子の粒子埄は0.208ÎŒmで
あ぀た。この重合䜓粒子を蒞留氎100mlに濃
床になるように調補トリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン100ÎŒmoleを加えた。その埌、
PH9.0に調補し、宀枩で48時間反応した。反応埌
は実斜䟋ず同様の操䜜を行な぀お芪氎性重合䜓
粒子を埗た。埗られた芪氎性重合䜓粒子を実斜䟋
ず同様の操䜜でヒトIgGを吞着しお固定化し、
抗ヒトIgGりサギ血枅ずの抗原・抗䜓反応を行な
぀た。その結果、鋭敏性は日埌×1280ケ月
埌×1280たた分散安定性は日埌本ケ月
埌本の非特異的凝集反応が認められた。さらに
実斜䟋ず同様のNaCl濃床が0.10モル及び
0.15モルのグリミン緩衝液䞭での分散安定性
は、いずれもの評䟡であ぀た。 実斜䟋12ず比范䟋 熱倉性ヒトIgGの固定化 PH8.2に調補したグリシン緩衝液に実斜䟋で
甚いた芪氎性重合䜓粒子を0.5になるよう分散
させた。次いで60℃で10分間加熱凊理したヒト
IgGをグリシン緩衝液により垌釈しmgmlに調
敎した。0.5濃床の芪氎性重合䜓粒子分散液
容に熱倉性したヒトIgG垌釈液容を加え、撹拌
し、宀枩䞋時間攟眮した。その埌りシ血枅アル
ブミンをの濃床になるように添加し、℃に
保ち倜攟眮しお熱倉性ヒトIgGを固定化した芪
氎性重合䜓を埗た。次いで遠心分離グリシン緩
衝液ぞの再分散の操䜜を繰返しお掗浄した埌、熱
倉性ヒトIgGを固定化した芪氎性重合䜓粒子をり
シ血枅アルブミンを0.1の濃床で添加したグリ
シン緩衝液に再分散し、固型分濃床を0.5に調
敎した。 リチりム因子の枬定 怜䜓ずしお非動化慢性関節リりマチ患者プヌル
血枅をグリシン緩衝液で20倍に垌釈したものを原
液ずしお、実斜䟋ず同様にしおガラス補10穎の
ホヌルグラスにグリシン緩衝液で垌釈した慢性関
節リりマチ患者血枅を各ホヌルに0.04mlを加え、
次いで熱倉性ヒトIgGを固定化した芪氎性重合䜓
粒子をグリシン緩衝液で垌釈した分散液を各ホヌ
ルに0.04ml加えお実斜䟋ず同様の操䜜で鋭敏性
及び分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は
日埌×1280ケ月埌×1280であり、分散安定
性は日埌及びケ月埌に共に非特異凝集反応は
認められなか぀た。 尚、比范䟋ずしお比范䟋で甚いた重合䜓粒
子を甚いお䞊蚘ず同様の操䜜でテストするず、鋭
敏性は日埌×1280ケ月埌は非特異凝集のた
め評䟡できなか぀た。 実斜䟋 13 アルフアヌプトプロテむンの抗䜓の固定化 PH8.2に調補したグリシン緩衝液に実斜䟋で
甚意した芪氎性重合䜓粒子を1.0になるように
分散させた。次いで家兎の産生したアルフア―フ
゚トプロテむン以䞋α―EPず略すの抗䜓を
アフむニテむ―クロマトグラフむヌにより粟補し
お埗た粟補α―FP抗䜓を、グリシン緩衝液で
500ÎŒgmlの濃床に垌釈した。芪氎性重合䜓粒子
分散液容ず粟補α―FP抗䜓の垌釈液容ずを
加え、撹拌し、宀枩䞋時間攟眮した。その埌り
シ血枅アルブミンをの濃床になるように添加
し、℃に保ち倜攟眮しおα―FP抗䜓を固定
化した芪氎性重合䜓粒子を埗た。次いで遠心分
離グリシン緩衝液ぞの再分散の操䜜を繰り返し
お掗浄した埌、α―FP抗䜓を固定化した芪氎性
重合䜓粒子をりシ血枅アルブミンを0.1の濃床
で添加したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃
床を0.5に調敎した。 アルフア―プトプロテむンの枬定 怜䜓ずしおヒト血枅䞭のα―FPの濃床が
1000ÎŒgmlであるものを原液ずし、グリシン緩
衝液で10倍ごずの垌釈系列を調補した。実斜䟋
ず同様にしお、ガラス補10穎のホヌルグラスにグ
リシン緩衝液で垌釈したα―FPを各ホヌルに
0.04ml加え、次いでα―FP抗䜓を固定化した芪
氎性重合䜓粒子の分散液を各ホヌルに0.04ml加え
お、実斜䟋ず同様の操䜜で鋭敏性分散安定性
を調べた。その結果、鋭敏性は日埌10ÎŒgml
ケ月埌10ÎŒgmlであ぀た。分散安定性は日
埌及びケ月埌共に非特異凝集反応は党く認めら
れなか぀た。 実斜䟋14ず比范䟋 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお70℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋撹拌䞋に過硫酞カリりムミリモ
ルチオ硫酞ナトリりムミリモル及び
硫酞銅0.2ミリモルを添加した。次いで70℃
に加枩したグリシゞルメタクリレヌト1.5モル及
びスチレン0.5モルの混合物を添加しお70℃で
時間重合した。その埌の操䜜は実斜䟋ず同様の
操䜜を行な぀た。埗られた重合䜓粒子の粒子埄は
0.304ÎŒmであ぀た。 埗られた重合䜓粒子を蒞留氎100mlに濃床
になるように調補し、ゞ゚タノヌルアミン
10ÎŒmoleを加えおからPH9.5に調補埌、宀枩で
時間反応した。反応埌は実斜䟋ず同様の操䜜を
行な぀お芪氎性重合䜓粒子を埗た。かくしお埗ら
れた芪氎性重合䜓粒子をPH7.5に調補し、氎蒞気
蒞留を行な぀お、残存する゚ポキシ基をゞヒドロ
キシル基に倉換した。次いで蒞留氎100mlに0.8
濃床になるように再分散しおからH2SO4でPH
3.0に調補した。その埌NaIO49mmoleを加えお40
℃で18時間反応しお、ゞヒドロキシル基をアルデ
ヒド基に倉換した。埗られたアルデヒド基含有芪
氎性重合䜓粒子を濟玙No.で濟別した埌に、
遠心分離蒞留氎ぞの再分散の操䜜を回繰返し
た。その埌むオン亀換暹脂で脱むオン操䜜を行な
い、曎に遠心分離ず掗浄を行な぀お粟補した。か
くしお埗られたアルデヒド基含有芪氎性重合䜓粒
子を緩衝液をグリシン緩衝液から0.10モルのホり
酞―ホり砂ずNaCl0.05モルを蒞留氎に溶解
したPH8.2に調補したホり酞緩衝液に倉えたこ
ずず、りシ血枅アルブミンを党工皋で添加しなか
぀たこず以倖は党お実斜䟋ず同様の操䜜でヒト
IgGを固定化し、抗ヒトIgGりサギ血枅ずの抗
原・抗䜓反応を行な぀た。その結果、鋭敏性は
日埌×2560ケ月埌×2560たた分散安定性は
日埌本ケ月埌本の非特異的凝集反応が
認められた。 尚、比范䟋ずしお、本発明のゞ゚タノヌルア
ミンず重合䜓粒子の゚ポキシ基の反応を行なわず
に䞊蚘ず同様の操䜜を行な぀た。その結果、ヒト
IgGを固定化しおいないものたで非特異的凝集反
応がみられたために正確な鋭敏性が刀定できなか
぀た。たた、分散安定性は日埌本ケ月埌
10本の非特異的凝集反応が認められた。 実斜䟋15ず比范䟋 撹拌機付きガラス補フラスコを窒玠眮換した埌
に、蒞留氎2700c.c.を加えお70℃に保぀た埌に、窒
玠雰囲気䞋撹拌䞋に過硫酞カリりム5.0ミリモ
ルチオ硫酞ナトリりムミリモル及
び硫酞銅0.25ミリモルを添加した。次いで70
℃に加枩したグリシゞルメタクリレヌト2.0モル
及び゚チレングリコヌルゞメタクリレヌト30ミリ
モルの混合物を添加しお70℃で時間重合した。
その埌の操䜜は実斜䟋ず同様の操䜜を行な぀
た。埗られた重合䜓粒子の粒子埄は0.261ÎŒmであ
぀た。 埗られた重合䜓粒子を蒞留氎100mlに濃床
になるように調補し、―トリスヒドロキシメ
チルメチル――アミノプロパンスルホン酞
8ÎŒmoleを加えおからPH9.0に調補した埌、37℃で
時間反応した。反応埌は実斜䟋ず同様の操䜜
を行な぀お芪氎性重合䜓粒子を埗た。かくしお埗
られた芪氎性重合䜓粒子をPH7.5に調補し、氎蒞
気蒞留を行な぀お残存する゚ポキシ基をゞヒドロ
キシル基に倉換した。次いで蒞留氎100mlに1.6
濃床になるように調補し、予めCH3COOH20ミ
リモルずNaIO420ミリモルを溶解した氎溶液100
mlを加えお40℃で20時間反応しお、ゞヒドロキシ
ル基をアルデヒド基に倉換した。埗られたアルデ
ヒド基含有芪氎性重合䜓粒子を濟玙No.で濟
別した埌に、遠心分離蒞留氎ぞの再分散の操䜜
を回繰返した。その埌、むオン亀換暹脂で脱む
オン操䜜を行ない、曎に遠心分離ず掗浄を行な぀
お粟補した。かくしお埗られたアルデヒド基含有
芪氎性重合䜓粒子を緩衝液をグリシン緩衝液から
0.10モルのホり酞―ホり砂ずNaCl0.05モルを蒞留
氎に溶解したPH8.2に調補したホり酞緩衝
液に倉えたこずず、りシ血枅アルブミンを党行皋
で添加しなか぀た以倖は党お実斜䟋ず同様の操
䜜でヒトIgGを固定化し、抗ヒトIgGりサギ血枅
ずの抗原・抗䜓反応を行な぀た。その結果、鋭敏
性は日埌×2560ケ月埌×2560たた分散安
定性は日埌本ケ月埌本の非特異的凝集
反応が認められた。 尚、比范䟋ずしお、本発明の―トリスヒ
ドロキシ゚チルメチル――アミノプロパンス
ルホン酞ず重合䜓粒子の゚ポキシ基の反応を行な
わずに䞊蚘実斜䟋ず同様の操䜜を行な぀た。その
結果、ヒトIgGを固定化しおいないものたで非特
異的凝集反応がみられたために正確な鋭敏性が刀
定できなか぀た。たた、分散安定性は日埌
本ケ月埌に本の非特異的凝集反応が認めら
れた。 比范䟋  実斜䟋〜の項の(1)ず同様にしお重合䜓粒子
を埗た。埗られた重合䜓粒子を濃床で蒞留氎
に分散した懞濁液100mlに、実斜䟋〜の項の
(2)ず同様な操䜜でポリ゚チレングリコヌル平均
分子量600の氎溶液をml50Όモルを
加えた。これに觊媒ずしお硫酞を100mg加えたず
ころ、重合䜓粒子が激しく凝集した。凝集状態を
実斜䟋〜の(4)の刀定基準に埓い肉県で刀定し
たずころ極めお匷い凝集であ぀た。ヒ
トIgGを固定化する以前に非特異的凝集反応がお
こ぀たために、抗原・抗䜓反応の詊隓が実斜でき
なか぀た。
【図面の簡単な説明】
第図は、実斜䟋で埗られた芪氎性重合䜓粒
子を甚いた蚺断甚詊薬の凝集状態を瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】 (A) ゚ポキシ基を衚面に有する重合䜓粒子及び (B) 分子䞭に、カルボキシル基アミノ基メル
    カプト基及びアミド基よりなる矀から遞ばれた
    少くずも皮の゚ポキシ基ず反応する官胜基ず
    ヒドロキシル基ずを有する有機化合物、 を反応させ芪氎性重合䜓を埗るこずを特城ずする
    芪氎性重合䜓の補造方法。  有機化合物が耇数個のヒドロキシル基を有す
    る有機化合物である特蚱請求の範囲蚘茉の芪氎
    性重合䜓の補造方法。
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