JPS61189300A - 親水性重合体粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は水媒体中で分散安定性のよい親水性重合体粒子
の製造方法である。特に酵素。

蛋白質、及び免疫活性物質などを固定化して診断用試桑
として好適に使用し得る親水性重合体粒子の製造方法を
提供するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点） 抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応、補体結合反応と共に、あるいはこれら
に比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてい
る。そして、凝集反応は、遊離細胞や細菌膜表面に局在
する抗原を検出する反応と共に、抗原精製技術の進歩に
より特異性の高い抗血清が得られることによって、特異
性の高い抗体を血球粒子、ベントナイト粒子、カオリン
粒子、ラテックス粒子などの粒子担体に固定させておき
、対応する抗原を凝集反応によって検査するなど、臨床
検査における応用範囲が著しく拡大している。

免疫学的凝集反応用としての担体はわ駄々のものが公知
で、該担体を使用したね々の７Ｂ　＋！９を用試薬が知
られている。これらを大別すると免疫活性物質を物理的
に吸着した診ｔｔ７＋用試薬と免疫活性物質を共南結合
で結合させた診１１１用試薬になる。これらの試薬には
それぞれ一長一短があり現在なお完全に満足出来ろ診力
１用試薬は存在しない。

しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の高い抗体
の開発、更には定Ｌ１分析の発展と共に免疫学的凝集反
応は鋭敏性と迅速性が増加し、非特異的凝集反応が起こ
らない、しかもより保存安定性に優れた等の性状を有す
る診断用試薬の開発が要望されている。

Ｄ’ｌｌ＋用試薬の担体としては、一般に重合体粒子が
用いられており、診断用試薬に適した重合体粒子の製造
方法の開発が望まれている０かくして、免疫活性物質を
固定化した担体の非特異的凝集反応を抑制することと、
保存安定性を高めるために数多くの方法が開発さく３） れている。これらの方法は、免疫活性物質を法と、担体
を親水性重合体粒子にする方法に大別される。前者の方
法については、例えは、免疫活性物質を担体に固定化し
た後に、牛血清アルブミン、ゼラチンなどの親水性蛋白
質を松加する方法が一般的によく採用されて−ろが、検
定混合物干で非特異的な蛋白質−蛋白質相互作用に起因
する妨害作用が指摘されている（特開昭５６−１５８９
４７号公報）。

また後者の方法について、例えば、特開昭５６−３０４
０５号公報、特開昭５６−１４１５５９号公報には繰返
し単位が２．３−ジオキシプロピルメタクリレート単位
から成る親水性架橋共重合体粒子を用いろ方法が、また
特開昭５７−１３５８０１号公報にはスチレン−グリシ
ジルメタクリレート共重合体粒子を合成し、エポキシ基
を加水分解してジヒドロキジル基に変換して親水性重合
体粒子を得ろ方法が提案されている。これらの方法は極
めて秀れた方法である。しかし、親水性基であるジヒド
ロキジル基濃度を増加すると真合体粒子の安定性を向上
させることが５ｆ能であるか、免疫活性物質を共有結合
させる活性点ね度が減少するために免疫活性物質の固定
化−が減少するとか、あるいは免疫活性物質をｇ＆着囚
定化するに有効な疎水性表面が減少−ｒるために、免疫
学的凝集反応の鋭敏性が著しく低下する欠点がある。こ
のように免疫活性物質の固定化担体の免役学的凝集反応
性と物理的安定性を同時に満足させることは従来極めて
因蕗であった。

（問題点を解決−ｒろための手段） 本発明者等は免疫学的凝集反応の鋭敏性に優れると共に
、非特異的凝集反応が低くかつ保存安定性の侵れた免疫
活性物質の固定化担体となる重合体粒子について鋭意研
究を点ねて来た結果、エポキシ基を表面に有する重合体
粒子にエポキシ基と反応する官能基とヒドロキシル基を
イ１゛する有機化合物を反応させることにより、前記要
望を満す優れた効果ｔもたらすことを見い出した。

部ち、本発明は、囚エポキシ基を表面に有する重合体粒
子及びωン分子中にエポキシ基と反応する官能基とヒド
ロキシル基とを有する有機化合物を反応させることを特
徴とする親水性重合体粒子の製造方法である。

本発明で用いられるエポキシ基を表面に有する重合体粒
子は、グリシジル（メタ）アクリレートを単独で恵合す
ることによって、或いは、グリシジル（メタ）アクリレ
ートと共重合可能なビニル系単輩体とを共重合させるこ
とによって得ることができる。グリシジル（メタ）アク
リレートと共重合させるビニル系単に体の代表的なもの
を挙げれば、スチレン、ビニルトルエン、クロルメチル
スチレン。

クロルスチレン、塩化ビニル、臭化ビニル。

メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレ
ート、プロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリ
ロニトリル、酢酸ビニル等の疎水性ビニル系単口体、ま
た、アク９ルｎシクメタクリルｈメ、マレインは、スチ
レンスルホン咳、２−アクリルアミド−２−メチルプロ
パンスルホン嘔、アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキ
シプロピル）メタアクリルアミド、２−ヒドロキシエチ
ルメタアクリレート。

グリセロールモノメタクリレート、ポリエチレングリフ
ールモノメタクリレート等の水溶性ビニル系単量体など
が例示される。これらのビニル系単量体は２ｕ以上を混
合して用いろこともできる。さらにまた、会費に応じて
、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレ
ート、ジエチレングリコールジメタクリレート、ビスフ
ェノールＡジグリシジルエーテル等の架橋性単口体も好
適に使用できろ。

本発明で用いろ重合体粒子のグリ、シジル（メタ）アク
リレートの組成は０．０５乃至１００モル％が好適に採
用されろ。免疫活性物質を物理的に吸着させた診帥ｌ用
試薬に本発明の親水性本合体粒子を用いろ場合、グリシ
ジル（メタ）アクリレートの組成は００５〜２０モル％
、サラに０．１〜１５モル％であることが好ｌしい。ま
た、免疫活性物質を共有結合で結合させた診断用試薬に
用いる場合には、１０〜１００モル％、さらに３０〜９
９モル％であることが好ましい。

このような組成とすることによって、表面のエポキシ基
の濃度が前者で０．００１〜０．４モル％富後者で０．
２〜２モル％である重合体粒子を得ることができる。

本発明で用いられるエポキシ基を表面に有する重合体粒
子を得るための製造方法は特に限定されず、公知の製造
方法が好適に採用される。例えば、アニオン性界面活性
剤、非イオン系界面活性剤の存在下に水媒体中で水溶性
ラジカル開始剤を用いて乳化重合する方法、界面活性剤
を使わずに水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて不
均一重合する方法、部分鹸化ポリとニルアルフール、ポ
リビニルビロリドン等の保設コロイドの存在下に懸濁重
合する方法、ビニル系単量体は溶解するが重合体は溶解
しない４機溶媒中で沈澱止金する方法等が採用される。

本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径は特に限定さ
れないが、一般には０．０５乃至１０ミクロンの範囲内
にあるのが好ましい。

該粒子径がｏ、ｏｓ　ミク四ン以下では微弱な免疫学的
凝集反応と針側することが困難になる場合がある。また
粒子径が１０ミクロン以上になると鋭敏性が低下するだ
けでなく、分散安定性、保存安定性が悪くなる場合があ
る。

さらにまた、該重合体粒子の粒子径の標準偏４　　差は
小さいことが望ましい。

本発明に於−て、エポキシ基と反応する官能基とヒドロ
キシル基とを有する有機化合物としては、上記の官能基
を有する公知の有機化合物が何ら制限なく採用される。

エポキシ基と反応する官能基としては、カルボキシル基
、アミノ基、メルカプト基、アミド基等が挙げられる。

就中、エポキシ基と容易に付加反応するアミノ基又はメ
ルカプト基が好ましい。また、エポキシ基と反応する官
能基とヒドロキシル基との間の炭素原子数は２〜３０好
ましくは、３〜１０であることが得られる親水性連合体
粒子の分散安定性が向上するために好ましい。さらに、
またヒドロキシル基を複数個有する有機化合物は、上記
と同様に得られる親水性重合体粒子の分散安定性が向上
するために好ましψ。また、これらの有機化合物の中で
、水溶性の有機化合物が重合体粒子の安定化作用に特に
有効であり、好ましく採用される。

本発明に於いて好適に使用される有機化合物の代表的な
ものを例示すると次のとおりである。例えは、グロン酸
等のヒドロキシカルボン酸類：セリン、トレオニン等の
ヒドロキシアミノ酸類；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
ラクタミド、ラクタミド＋　ｐ−ハン七ノール等のヒド
ロキシアミド類；２−メルカプト基タノール、２−メル
カプトプロパツール、３−メルカブトブロパノール、４
−メルカプト７タノール、３−メルカプト−１，２−プ
ロパンジオール、メルカプトペンタエリスリトール、パ
ントテニル拳ミスティン等のヒドロキシメルカプタン類
；エタノールアミン、プロパツールアミン、ジェタノー
ルアミン、２−アミノ−２−エチル−】、３−プロパン
ジオール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン
ジオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、ジ
グリコールアミン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノ
メタン、ジイソプロパツールアミン、グルコサミン、ガ
ラクトサミン、ＤＬ−イソセリン、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン（８
，Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン等の
ヒドロキシアミン類等の有機化合物をあげることができ
る。

更に好まＬ〈は、エポキシ基と容品に付加反応するヒド
ロキシメルカプタン類又はヒドロキシアミン類の有機化
合物か重合体粒子との反応で苛酷反応条件を必要としな
いので好適に採用されろ。

本発明において、エポキシ基を表面に看する重合体粒子
（以下単に重合体粒子という）と分子中にエポキシ基と
反応する官能基とヒドロキシル基とを４する有機化合物
（以下単に有機化合物という）の反応は、重合体粒子表
面の特定址のエポキシ基と反応させるに必要な鑓の有機
化合物及び重合体粒子を水媒体中、エポキシ基に不活性
な緩揚液中、あるいは、エポキシ基と反応性の極めて乏
りくかつ重合体粒子を溶解させない有機溶媒中で混合す
ればよい。有機溶媒としてはメタノール。

エタノール、インプロパツール、ア七トン。

酢酸メチル、酢酸エチルあるいはこれらの混合溶媒等の
水と親和性の大きい有機溶媒が好ましい。反応温度は重
合体粒子の分子格造やエポキシ基潟度、有機化合物のエ
ポキシ基と反応する官能基の種類、及び反応媒体により
て異なるが、一般的には４℃乃至１００℃。

好ましくは４℃乃至６０℃が好適に採用される。反応媒
体に万機溶媒を用いる場合には重合体粒子を溶解させな
ψ処理温度を選ぶことが１檄である。

本発明の反応における重合体粒子の濃ＢＬは、反応中に
重合体粒子が非特異的に凝集しないように遠択すればよ
く、一般的には０．０１乃至２０％の範囲にあるＣとが
好ましく、更に０．０５乃至ｌＯ≦の範囲にあることが
より好ましい。また、有機化合物のね反は、重合体粒子
の表面のエポキシ基濃度、反応すべきエポキシ基濃度、
及び反応条件によって異なるが、一般的には重合体粒子
の表面のエポキシ基濃度に対して、モル比で０．５〜２
００の［囲で遁択される。免疫活性４１を物理的に吸着
させた診断用試薬に本発明の親水性本合体粒子を用いる
場合は、有機化合物の濃度は重合体粒子の表面のエポキ
シ基温度に対してモル比で１〜２００の範囲とすること
が好ましい。

また、免疫活性物質を共有結合によって結合させた診断
用試薬に用いる場合は、モル比で０．５〜２５の範囲と
することが好ましい。

本発明の反応における反応時間は、重合体粒子のエポキ
シ基濃度、有機化合物の濃度及びエポキシ基との反応性
２反応温度によって異なるので特に限定的でないが、一
般に１０分乃至１００時間が好ましく、更には３０分乃
至５０時間がより好ましく採用される。

本発明の反応における重合体粒子と有機化合物の混合方
法は、特に限定的でない。一般的には、重合体粒子の懸
濁媒体中へ有機化合物の水又は有機溶媒の希釈溶液を一
括に添加する方法もしくは満々添加する方法、あるいは
有機化合物の反応媒体中へ重合体粒子の水又は有機溶媒
の希釈１％！濁液を一括に添加する方法もしくは満々添
加する方法が好ましくは採用されろ。

本発明により得られた親水性重合体粒子は、水媒体中で
の疎水性有機化合物の吸着剤、生（］４） 体内での各椋細胞、組鉱による貧食作用の観察用粒子、
及び酵素１缶白質あるいは免疫活性物質の固定化用粒子
等に応用でき、特に免疫活性物質を駁七法もしくは共有
結合法で固定化した診断用試薬は免疫学的凝集反応性が
大きいだけでなく、分散安定性と保存安定性に優れる特
徴がある。

以Ｆに、本発明で得られた親水性重合体粒子を診断用試
薬として用いた場合について説明する。

本発明で得られた親木性１（合体粒子に吸着法もしくは
共有結合法によって固定化する免疫活性物質としては、
特に限定的でなく公知のものが使用出来る。代表的なも
のを例示すれば、例えば、変性カンマグロブリン、抗核
因子、ヒトアルブミン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノ
グロブリンＧ　（ＩｇＧ）、抗ヒトＩｇＧ抗体、イムノ
グロブリンＡ　（ＩｇＡ）、抗ヒトＩｇＡ抗体、イムノ
グロブリンＭ　（ＩｇＭ）、抗ヒトＩｇＭ抗体、ストレ
プトリジンＯ，ストレプトキナーゼ、ヒアルロンダーゼ
、抗ストレプトリジンＯ抗体、Ｃ−反応性魚白、抗Ｃ−
反応性蛋白抗体、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ
）。

抗ＡＦＰ抗体、癌胎児性抗＊　（ＣＥＡ）、抗ＣＥＡ抗
体、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、抗ＨＣＧ　
抗体、抗エストロゲン抗体、抗インシュリン抗体、Ｂ壓
肝炎表面抗原（ＨＢｓλ抗）ＩＢｓ抗体、梅毒トレポネ
マ抗原、風疹抗原、インフルエンザ抗原、補体成分Ｃ１
ｑｌ抗Ｃ１ｑ抗体。

抗Ｃ３ｑ　抗体１等の公知の免疫活性物質をあげること
かできる。

本発明で得られた親水性重合体粒子に固定化される該免
疫活性物質の址は、各検査項目に適している割合で親水
性重合体粒子に固定化させればよく、−概に限定されな
い。一般には、該免疫活性物質の社が多い程、診断用試
薬の鋭敏性が上がるため、鋭敏性を要求ずろ場合には、
前記の親水性重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質を
吸着させることが好ましい。

本発明により得られた親水性重合体粒子は免疫活性物質
の固定化能力と親水性のバランスが極めて良く調節され
１いるので、抗原又は抗体と親水性重合体粒子なｔｉ２
ｉ液又は生理食塩水などの水媒体中で混合し、抗原又は
抗体が化学的に変化しないように、そしてそれらの免疫
学的性質を保持させるように、非常に温和な条件下に抗
原又は抗体を親水性重合体粒子表面に固定化させること
ができるだけでなく、該媒体中で極めて安定性が高い特
徴がある。親水性重合体粒子表面に固定化された免疫活
性物質の社は、重合体粒子の蛋白結合部位を飽和又はブ
ロックされるように選ぶことが好ましいが、残存する蛋
白結合部位を免疫学的に不活性な適当な物質でブロック
又は不活性化させることができる。

（効果及び作用） 本発明で得られた親水性重合体粒子に免疫活性物質を固
定化した診断用試薬は、分散安定性と保存安定性が著し
く優れている。特に、電解質を多針に含む緩衝液中で十
分安定であるため、免疫活性物質の固定は電解質な含む
緩衝液中で行なえる。従って、上記の診断用試薬は被検
体液と混合時に非特異的凝集を防止できろという特徴を
も看している。しかも免疫学的凝集反応の鋭敏性も良好
である特徴を有する。

本発明により得られた親水性重合体粒子が、このような
優れた性質を有する理由は明らかでないが、本発明者等
は次のように推測している。エポキシ基を有する重合体
粒子とヒドロキシル基を有する有機化合物とを反応させ
ることにより、ヒドロキシル基を親水性重合体粒子の表
面から遠ざけることが可能になるので免疫学的活性物質
を固定化した親水性重合体粒子のコロイド学的安定性が
高まると推定される。また、抗体を共有結合法で重合体
粒子に固定化した場合、抗体のＦ＆ｂ　部分の先端に存
在する抗原認識部位は重合体粒子表面と反対の方向を向
くことが望ましい。型光゛　　　明の方法では、親水性
ｍ合体粒子表面から離れた位置にあるヒドロキシル基あ
るいはまたヒドロキシル基を七する毛根化合物が立体障
害となるために、共有結合で固定化したわＬ体のｐ’ａ
ｂの抗原紹駄部位が親水性−合体粒子の表面に向くこと
が阻害されハくなろ。そのため、抗体を共有結合で固定
化した免疫学的診１・鵬用試薬の性０ヒが長期間保持さ
れると推定されろ。さらに、有機化合物として複数個の
ヒドロキシル基′ｆｔ有するものをＩわいた場合には、
上記の有機化合物と親水性重合体粒子の持つエポ午シ基
とが反応してヒドロキシル基が生成するだけでなく、有
機化合物の持つヒドロキシＡ／基によって親水性が付与
され、親水性重合体粒子の分散安定性と保存安定性が増
加すると推定される。ヒドロ牛シル基泊度が増加すると
重合体粒子の分散安定性と保存安定性が増加すると考え
られる。ｍ合体粒子のヒドロキシル基濃度を増加させる
ために重合体粒子の重合の段階でヒドロキシル基を有す
る七ツマ−を多鑓に使用することが閏えられろが、この
方法は、免疫活性物質を共鳴結合活性点が減少したり、
１だ免疫活性物質を吸着固定化するに有効な疎水性表面
が減少するために、免疫学的凝集反応の鋭敏性が低下す
る欠点が生じる。しかしながら、本発明の方法によれば
、これらの免疫活性物質の共有結合活性点濃度もしくは
吸着固定化する疎水性表面積を減少させることなく、親
水性のヒドロキシル基濃度を増加させることが可能にな
るので、免疫学的診断用試薬の鋭敏性を損うことなく、
分散安定性と保存安定性が高まると考えられる。

以下に本発明をさらに具体的に説明するために、実施例
及び比較例を掲げるが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。

実施例１〜９及び比較例１〜２ （１）　重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００　ＣＣ加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウムを５．０　ミリモルｌＩ
Ｑ度になるように添加した。次いでジー２−エチルへキ
シルスルホフハクｉ７１．５．９を乳化剤として添加し
た後、７０℃に加温したグリシジルメタクリレート３０
ミリモルとスチレン１００ミリモルの混合物を添加して
１時間重合を行なった。

その後スチレン２．６モルを定社ポンプで滴々飽加して
から７０℃で２９時間投押下に重合した。重合後、室温
まで冷却してから、得られた１合体粒子を濾紙（Ａ２）
で濾別して大きな凝集体を除いた。次いで透析を行なっ
た後に、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を繰返した
後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠
心分離と洗浄を行なって１１合体粒子を精製した。得ら
れたｍ合体粒子の粒子径は０．２３７μｍであった。

（２）親水性重合体粒子の調製 得られたｍ合体粒子を２％温度で蒸留水に分散した懸＠
液１００ｄと、南様化合物の水溶液もしくはメタノール
溶液を第１表に示す添加割合で混合し、第１表に示す温
度で所定時間反応した。反応後、親水性重合体粒子を濾
紙（Ａ２）で濾別した後に、遠心分離、蒸留水への再分
散の操作を３回繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イオ
ン操作を行な―、更に遠心分離と洗浄を行なって親水性
重合体粒子を得た。かくして得られた親水性重合体粒子
を微り１ｍ素分析計及び微社硫黄分析計を利用して反応
した有機化合物の反応縁を分析した。その結果を第１表
に示す。

の調製 （２）で得られた本発明の親木性真合体粒子を固凰分濃
度１％でグリシン緩衝液に分散した。

本発明に於いてグリシン緩衝液とはグリシン０．０５モ
ル及び食塩０．０５モルを水１１に溶屏し、次いで２規
定水酸化ナトリウム水溶液でＰＨを８．２に調製し、さ
らにアジ化ナトリウムを１ｇ添加したものである。

本発明に於いてヒ）ＩｇＧは、ヒトｌ１１１？＋７を鮎
和硫安で塩析し、さらに透析を行ない精製したものを用
いた。

ヒ）ＩｇＱをグリシン緩衝液により希釈し１　ｍｇ　／
　ｍｌに１１！整する０次いで倍数る釈法によりヒトＩ
ｇＧをグリシン＆２＆Ｊ液により希釈し−（ヒ）ＩｇＧ
希釈液を印、山イろ０１％ｉ！、１良の親水性重合体粒
子分散液１容にヒ）ＩｇＧ希釈液１容を加えＮ拌し、室
温）２時１ｆｔｌ放置する。次いでウシ血清アルブミン
を１％のし度になるように臨月し、４℃に保ち１夜放置
してヒ）ＩｇＧを固定化した親水性重合体粒子を得た。

次いで遠心分離、グリシン猛（資）液への再分散の操作
を繰り返えすことによりヒトＩｇＧを固定化した親水性
重合体粒子を洗浄した。

さらに遠心分離した後、と）ＩｇＧを固定化した親水性
重合体粒子をウシｌ１１１清アルブミンを０．１％のね
度で添加したグリシンυ御液に再分散し固型分濃度を０
．５％にｅ″ｉＵし、４℃に保ち保存した。

（４）抗原・抗体反応 ヒ）ＩｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒトＩｇＧウサギ
全面清を６０℃、３０分非動化処理を行なった。この血
清を以下抗ヒ）ＩｇＧウサギ血清と呼ぶ。

抗ヒトＩｇＧウサギ血清をグリシンｖ衡液で２０倍に希
釈したものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒトＩｇＧ
ウサギ血清をグリシン緩衝液で希釈して抗ヒ）１ｇＣウ
サギ血清希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なうた
めにガラス製１０穴のホールグラスを用意し、グリシン
緩衝液で希釈した抗ヒトＩｇＧウサギ血清を各ホールに
０．０４ν加える。次いでヒ）ＩｇＧを固定化した親水
性重合体粒子のグリシン級衝液分散液を各ホールに０．
０４−加えろ。この後直ちに平沢製作所製チーへ一式攪
拌機によりホールグラスを１分間に１２０回転の速度で
水平回転し攪拌を行なう。

抗原・抗体反応により親水性重合体粒子の凝集が認めら
れるまでに要する時間、すなわち−集像出現時ＩＴｏ及
び所定時間攪拌後の親木性重合体粒子の凝集のイｊ無か
ら、ヒ）ＩｇＧを固定化した親水性重合体粒子の特性で
ある鋭敏性を１＋伯した。ホールグラスを用いた実施例
１の親水性重合体粒子の酸３４Ｓ試験の結果を図１に示
す。図１は１０分間の攪拌後の凝集状態を示す。凝集が
全く認められない場合（−）、凝集の有無が判定しがた
い場合（±入切らかに凝集が認められる場合、凝集の強
い順に刺ネ−１−１−，ｆと判定した。図中Ｃは抗原も
しくは抗体を全く含まないことを示−ｔｏ凝集試験の結
果、明らかに凝集の絽められたホールに於けろ抗ヒ）Ｉ
ｇＧウサギ血清希釈液の最ｉ；６希釈４ｇ数をもって、
重合体粒子の鋭敏性を評価した０ 親水性重合体粒子の特性として、さらに親水性重合体粒
子の分散安定性を１＋価しノと。すなわち、親水性重合
体粒子にと）ＩｇＧ希釈液を加え室温で２時間数ムした
後の親木性重合体粒子の分数状態をもって親水性重合体
粒子のと）ＩｇＧ固定固定化分散安定性を評他した。又
ヒ）ＩｇＧ固定化後３ケ月経過した後の親水性重合体粒
子の分数状態をもってヒ）ＩｇＧを固定化した親水性重
合体粒子の保存中の分散安定性を評価した。

さらにまた、親水性重合体粒子の特性として、電解質を
含んだ緩絢液甲での親水性重合体粒子の分散安定性を評
価した。即ち、親水性重合体粒子をイオン交換水に１％
襲度になるように調製した後、Ｎ＆ＣＩＢ度が０．ｌＯ
モル／ｌ及び０．１５モル／ｌのグリシン緩衝液１１に
４０μｌ添加して充分に混合してから寄渇で３日間静置
して分散安定性を調べた。

その結果を第１表に示”ｆｏ 尚、比較例１として、（１）で得られた精製重合体粒子
を濃硫酸でＰＨｚＯに調節した酸性水媒体に１％濃度で
分散させ、室温で】逸聞処理し、重合体粒子のエポキシ
基を加水分解してジヒドロ午シル基に変換した。次いで
象紙（＆２）で謔別した後込析を行なった。その後遠心
分離、蒸貿水への再分数の操作を繰返した後に、イオン
交換０脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄
を行なって瓜合体粒子を精製した。得られた止合体粒子
を実施例１と同様の操作で性能を調べた。その結果を第
１表に示す。

また、ポリスチレンラテックスとしてダウＡ１０．４９
７μｍのラテックスを実施例１と同様の操作で性能な肖
べた結果を、比較例２として第１表に示す。

１：ミ王余白 実施例１０と比較例３ 撹拌機付きカラス塾７ラスフを窒素難役した後に、蒸留
水２７００Ｃｅ加えて７０℃に保った彼に、窒素雰囲気
下、攪拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／ｌね度になる
ようにふ加した。次いで７０℃に加温したグリシジルメ
タアクリレート２１０ミリモル及びスチレン１００ミリ
モルの混合物を添加して７０℃で１時ｒＩｊｍ押下に重
合した。その後スチレン２５モルを定置ポンプで滴々添
加してから、７０℃で２９時間攪拌下に重合した。その
後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得られた
重合体粒子の粒子径は０３４５μ扉であった。この重合
体粒子を蒸留水ＩＱＱｓｕ？に１％濃度になるように調
製し、グルコサミン０８ｙ（ｍ　ｏ　１６を加えた。そ
の後ＰＨ？：８．０に調製し、室温で４８時間反応した
。反応後は実施例１と同様の操作を行なって親木性真合
体粒子を得た。得られた親水性重合体粒子を実施例１と
同様の操作でヒｌ１ｇＧをｇ＆着して固定化し、抗ヒト
ＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体反工６を行なった。そ
の結果、鋭敏性は１目抜Ｘ１２８０．３＋月後Ｘ２５６
０．１７．：分散安定性は１日後２本、３ケ月後３本の
非特異的凝集反応か認められた。さらに実施例１と同様
のＮ＆Ｃ７濃度が０．１０　モル／ｌ及び０．１５モル
／ｌのグリシン緩衝液中での分散安定性は、いずれもｌ
の評価であった。

尚比較例３として、上記で得られた重合体粒子を水蒸気
蒸留を３時向行なって重合体粒子上のエポキシ基を加水
分解してジヒドロキジルに変換した。次いで重合体粒子
を種紙ム２）で濾別した後に、遠心分離、蒸留水への再
分散操作を３回繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イオ
ン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なってジヒド
ロキジル基を含有する重合体粒子１に得た。かくして得
られた粒子を実施例１と同様の操作でヒ）ＩｇＧを吸着
して固定化し、抗ヒトＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体
反応を行なった。その結果、鋭敏性は１目抜Ｘ１２８０
．３ケ月後Ｘ１２８０゜また分散安定性は１日後３本、
３テ月後４本の非特異的凝集反応が紹められた。さらに
実施例Ｉと同様のＮ　ａ　Ｃｌ濃度が０．１０モル／ｌ
及び０．１５モル／ｌのグリシン緩衝液中での分散安定
性は各１及び２の評価であった。

実施例１１ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７５℃に保った後に、窒累雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／１１．・チ
オ硫酸ナトリウム５ミリモル／１．硫酸銅０．２５　　
ミリモル／ｌを添加した。次いで７５℃に加温したグリ
シジルアクリレート１５ミリモル及びメチルメタクリレ
ート２５０ミリモルの混合物を添加して７５℃で３０分
［…攪拌下に重合した。

その後、メチルメタクリレート２，６モルを定量ポンプ
で滴Ａ添加して、更に７５℃で２時間旋拌下に重合した
。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得
られた重合体粒子の粒子径は０．２０８μｍであった。

この重合体粒子を蒸留水１００ｄに１％濃度になるよう
にｉｉｉ！ｌｌ７１．）リス（ヒドロキシメチル）アミ
／メタン１００μｍｏｌｅを加えた。その偽ＰＨ９，０
に調製し、室温で４８時間反応した。

反応後は実施例１と同様の操作を行なって親水性重合体
粒子を得た。得られた親水性重合体粒子を実施例１と同
様の操作でヒ）ＩｇＧを吸着して固定化し、抗ヒトＩｇ
Ｇウサギ血清との抗原・抗体反応を行なった。その結果
、鋭敏性は１８後Ｘ１２Ｂ０．３ケ月後Ｘ］２８０゜ま
た分散安定性は１日後１本、３ケ月後３本の非特異的凝
集反応が認められた。さらに実施例１と同様のＮｈＣ１
ｆｌＡ度が０．１０モル／ｌ及び０．１５モル／ｌのグ
リシン緩衝液中での分散安定性は、いずれもｌの評他で
あった。

実施例１２と比較例４ 熱変性ヒトＩｇＧの固定化 ＰＨ８，２に１ｌｌｉｌしたグリシン駿衝液に実施例３
で用いた親水性重合体粒子を０．５％になるよう分散さ
せた。次ｐで６０℃で１０分間ｂＯｋ処理したヒトＩｇ
Ｇをグリンン緩に液により希釈し１＋＋９７ｍに自ロシ
た。０．５％ね度の親水性本合体粒子分散液１容に熱変
性したヒ）ＩｇＧ希釈ｆ＆ｌ容を加え、攪拌し、家出下
２時間放置した。その後ウシ血清アルブミンを１％の濃
度になるように冷加し、４℃に保ち１夜放置して熱変性
ヒ）ＩｇＧを固定化した親木外患合体を得た。次いで遠
心分離。

グリシン緩衝液への再分散の操作を繰返して洗浄した後
、熱変性ヒ）ＩｇＧを固定化した親水性重合体粒子をウ
シ血清アルブミンを０．１％の濃度で添加したクリシン
級税液に再分散し、固壓分１４度を０．５％に調整した
。

リウマチ因子の測定 検体として非動化慢性間％′Ｊリウマチ患者プール血清
をグリシン緩衝液で２０倍に希釈したものを原液として
、実施例１と同様にしてガラス製ｌＯ穴のホールグラス
にグリシン緩衝液で希釈した慢性関節リウマチ患者血清
を各ホールに０．０４ｄを加え、次いで熱変性と）Ｉｇ
Ｇを固定化した親水性真合体粒子なグリシン緩衝液で希
釈した分数液を各ホールにＱ、Ｑ４ｍ加えて実施例１と
同様の操作で鋭敏性及び分散安定性を調べた。その結果
、鋭敏性は１８後Ｘ１２８０．３ケ月後８１２８０゜で
あり、分散安定性は１日後及び３り月ｋに共に非特１４
凝集反応は詔められなかった。

尚、比較例４として比較例１で用いた重合・体位子を用
いて上記と同様の操作でテストすると、鋭敏性は１口径
Ｘ１２８０・　３ケ月後は非特Ｕ凝集のため評価できな
かった。

実施例】３ アル７デーフエトプロテインの抗体の固定ＰＨ８，２に
調製したグリシン緩衝液に実施例１で用意した親水性重
合体粒子を１．０％になるように分散させた。次いで家
兎の産生したアルファーフェトプロティン（以下α−Ｅ
Ｐと略す）の抗体を７フイニテイークロマトグラフイー
により精製して得た精製α−ＦＰ抗体を、グリシン緩衝
液で５００μｇ７ｔｔの濃度に希釈した。親水性重合体
粒子分散液１容と精製α−ＦＰ抗体の希釈液ｌ容とを加
え、攪拌し、室温下２時間放置した。その後ウシ血清ア
ルブミンを１％の濃度になるように添加し、４℃に保ち
１夜放置してα−ＦＰ抗体を固定化した親水性重合体粒
子を得た。次いで遠心分離、グリシン緩衝液への再分散
の操作を繰り返して洗浄した後、α−ＦＰ抗体を固定化
した親水性重合体粒子をウシ血清アルブミンを０．１％
の濃度で添加したグリシン縁衝液に再分散し、固型分濃
度を０．５％に調整したＯ アルファ−フェトプロティンの測定 検体としてヒト血清中のα−ＦＰのね度が１０００μＩ
／ｄであるものを原液とし、グリシン緩−液で１０倍ご
との希釈系列を！！製した。実施例１と同様にして、ガ
ラス製ｌＯ大のホールグラスにグリシン緩衝液で希釈し
たα−ＦＰを各ホールに０．０４１ｔＡ！加え、次いで
α〜ＦＦ抗体を固定化した親水性重合体粒子の分散液を
各ホールに０゜０４１１７加えて、実施ＳＳ＋　１と同
様の操作で鋭敏性１分散安定性を調べた。その結果、鋭
敏性は１目抜１０μＩ／ｍ、３ケ月後１０μ、９／ｄで
あった。分数安定性は１日後及び３ケ月後共に非特！Ａ
凝集反応は全く認められなかった。

実施例１４と比較例５ 攪拌機付きカラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ｃｃｆｔ加えて７０”Ｃに保った後に、窒素
雰囲気下、攪拌下に過硫酸カリウム４ミリモル／ｌチオ
硫酸ナトリウム２ミリモル／１．及び硫酸銅０．２ミリ
モル／！を添加した。次いで７０℃に加温したグリシジ
ルメタクリレート１，５モル及びスチレン０．５モルの
混合物を添加して７０’Ｃで６時間重合した。その後の
操作は実施例１と同様の操作を行なった。得られた重合
体粒子の粒子径は０．３０４μｍであった。

〜られた再合体粒子を蒸留水１０Ｑｍｌに１％ｒ４度に
なるようにｉ製し、ジェタノールアミン１０７１ｍｏｌ
ｅを力１．・えてからＰ　）（９，５にシイ１後、室温
で４時間反尾、した。反応後は実施例］と同様の操作を
行なって親水柱石合体粒子を得た。かくしてＣ，ｔられ
た親水性止合体粒子をＰ　Ｈ７，５に′ＦＡ製し、水蒸
気蒸留を行なって、残存するエポキシ基をジヒドロキジ
ル基に変換した。次いで蒸留水１００ｍに０．８％ね度
になるように再分散してからＨ２ＳＯ，でＰ　Ｈ＝３．
０にＦＪｌｉした。その後ＮａＩＯ４９ｍ１ｏｌｅを加
えて４０℃で１８時１１Σ反応して、ジヒドロキジル基
をアルデヒド基に変換した。イυられたアルデヒド２１
！−含有親水性重合体粒子なム紙（＾２）で−別した後
に、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を６回ｉｆｆ返
した。その後イオン′５１：換樹脂で脱イオン操作を行
ない、更に遠心分離と洗浄を行なって精製した。かくし
て？ｎもれたアルデヒド基苫イ１親水性重合体粒子を緩
＆Ｉ沿をグリシンｕｈｓ液から０１０モルのホウ酸−ホ
ウ砂とＮａＣ１０，０５モルを蒸留水１１に浴九ｔした
Ｐ　１１：＆　２にルーレしたホウ６Ｖｔｖｉｂ液に変
えたことと、ウシ血清アルブミンを全工程でだ一加しな
かったこと以外は全て実施例１と同様の操作でヒ）Ｉｇ
Ｇを固定化し、抗ヒ）ＩｇＧウサギ血清との抗原・抗体
反応を行なった。その結果、鋭敏性は１目抜×２５６０
．３ケ月後Ｘ２５６０．また分散安さ性は１日後２本、
３ケ月後４本の非特異的凝集反応が認められた。

尚、比較例５として、本発明のジェタノールアミンと本
合体粒子のエポキシ基の反応を行なわずに上記と同様の
操作を行なった。その結果、ヒ）ＩｇＧ′ｔｔ固定化し
ていないものまで非特大的凝集反応がみられたために正
確な鋭敏性が判定できなかった。また、分散安定性は１
日後７本、３り列後１０本の非特異的凝集反応が詔めら
れた。

実施例１５と比較例６ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素散換した後に、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、攪拌下に過Ｃ１酸カリウム５．０　ミリモル／ｌ
、チオＣ（乙に１！ナトリウム５ミリモル／ｌ！、及び
硫ｙ４ｏ、２ｓ　　ミリモル／／を添加した。次いで７
０℃に加湿したグリシジルメタクリレート２０モル及び
エチレングリフールジメタクリレート３０ミリモルの混
合物を添加して７０℃で２時ｆｌｕ　Ｙ１ｇ合した。そ
の後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得られ
た再合体粒子の粒子径は０２６１μｍであった。

得られた再合体粒子を蒸留水ＩＱＱｍｌに２％濃度にな
るようにｅｌ製し、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−３−アミノプロパンスルホン酸８μ＋ｎｏ１ｅを
加えてからＰＨ９，０に調製した後、３７℃で６時間反
応した。反応後は実施−１と同様の操作を行なって親水
性重合体粒子を得た。かくしてず与られた親木性ｎ（合
体粒子をＰＨ７，５にＩｌｌ！験し、水蒸気蒸留を行な
って残存するエポキシ基をジヒドロキシル基に変換した
。次いで蒸留水１００１１１７に１６％濃度になるよう
にＶｉ製し、予めＣＨ３ＣＯ０Ｈ２０ミリモルとＮａＩ
Ｏ３２０ミリモルを溶解した水溶液１００ｄを加えて４
０℃で２０時間反応して、ジヒドロキジル基をアルデヒ
ド基に変換した。得られたアルデヒド基含有親水性重合
体粒子を濾紙（＆２）で濾別した後に、遠心分離、蒸留
水への再分散の操作を６回繰返した。その後、イオン９
！ｉｔ！樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と
洗浄を行なって精製した。かくして得られたアルデヒド
基含有親水性重合体粒子を緩衝液をグリシン！＆液から
０．１０モルのホウ酸−ホウ砂とＮａＣＪ０．０５モル
を蒸留水ｌｌに溶解したＰＨ＝８．２に調製したホウ酸
級衝液に変えたことと、ウシ血清アルブミンを全行程で
株加しなかった以外は全て実施＠ｌと同様の操作でヒト
ＩｇＧを固定化し、抗ヒ）ＩｇＧウサギ血清との抗原・
抗体反応を行なった◇その結果、＃！Ａ敏性は１目抜Ｘ
２５６０，３ケ列後Ｘ２５６０．また分数安定性は１８
後１本、３ケ月後３本の非特異的凝集反応か詔められた
〇 尚、比較例６として、本発明のＮ−）リス（ヒトＩ２千
ジエチル〕　メチＡ　−３−アミノプロパンスルホン酸
と止合体粒子のエポキシ基の反応を行なわすに上記実施
例と同様の操作を行なった。その結果、ヒ）ＩｇＧ′？
：固定化していないものまで非特異的凝集反応かみられ
たために正確な鋭敏性が判定できなかった。

また、分散安定性は１８後３一本、３ケ月後に７本の非
特）′４的凝集反応が紹められた。

【図面の簡単な説明】

第１因は、実施例１で得られた親水性１合体粒子を用い
た診ｌ１７を用試益の凝集状すを示す。 特許出し１人 徳山曹達株式会社 雲ソエ３Φ◇訃Ｗ剖−十で苛４ 手続補正書 昭和６０年　５月３１　　日 特許庁長官　　志　賀　　学　殿 ｌ、事件の表示　　　特願昭Ｇｏ−２８３８８号２、発
明の名称 親水性１合体粒子の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ５、Ｍ正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第２８頁第１人 反応量の欄の 以上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）（Ａ）エポキシ基を表面に有する重合体粒子及び （Ｂ）分子中にエポキシ基と反応する官能基とヒドロキ
   シル基とを有する有機化合物 を反応させることを特徴とする親水性重合体粒子の製造
   方法。
2. （２）エポキシ基と反応する官能基が、メルカプト基又
   はアミノ基である特許請求の範囲（１）記載の製造方法
   。
3. （３）分子中にエポキシ基と反応する官能基とヒドロキ
   シル基とを有する有機化合物が、複数個のヒドロキシル
   基を有することを特徴とする特許請求の範囲（１）記載
   の製造方法。