JPS61255907A - 反応性重合体粒子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （窒業上の利用分野） 本発明は水媒体中で分散安定性のよい反応性重合体粒子
及びその製造方法に関する。特に酵素、蛋白質、細菌、
ウィルス、毒素、及び免疫活性物質などを固定化して診
断用試薬として好適に使用し得る反応性重合体粒子及び
その製造方法を提供するものである。

（従来の技術及び発明ｂｔ解決しようとする問題点） 抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査において、凝集
反応は沈降反応、補体結合反応と共和、あるいはこれら
忙比して著しく簡便かつ鋭敏な反応として利用されてい
る。そして、凝集反応は、遊離細胞や細菌膜表面に局在
する抗原を検出する反応と共に、抗原・抗体の精製技術
の進歩により特異性の高い抗血清が得られることによっ
て、特異性の高い抗体を血球粒子、ベントナイト粒子、
カオリン粒子、ラテックス粒子などの粒子担体に固定さ
せておき、対応する抗原を凝集反応によって検査するな
ど、臨床検査における応用範囲が著しく拡大している。

免疫学的凝集反応用としての担体は種々のものが公知で
、該担体を使用した種々の診断用試薬が知られている。

これらを大別すると免疫活性物質を物理的に吸着した診
断用試薬と、免疫活性物質を共有結合させた診断用試薬
になる。これらの試薬にはそれぞれ一長一短があり、現
在なお完全に満足できる診断用試薬は存在しない。

しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の高い抗体
の開発、更には定量分析技術の発展と共に免疫学的凝集
反応は、鋭敏性が高く、非特異的凝集反応が起とらな込
、しかもより保存安定性に優れた等の性状を有する診断
用試薬の開発が要望されている。

診断用試薬の担体としては、一般に重合体粒子が用いら
れてｂるが、免疫学的凝集反応の鋭敏性を向上させるた
めには、免疫活性物質の固定化量が大きいことが望まし
い。しかし、免疫活性物質の固定化量が増加すると重合
体粒子の分散安定性が低下する欠点がある。

かくして、免疫活性物質を固定化した重合体粒子の非特
異的凝集反応を抑制することと、分散安定性を高めるた
めＫ、数多くの方法が開発されている。これらの方法は
免疫活性物質を固定化した重合体粒子に保護コロイドを
添加する方法と、重合体粒子を親水性重合体粒子にする
方法に大別される。前者の方法については、例えば、免
疫活性物質を重合体粒子に固定化した後に、保護コロイ
ドとして牛血清アルブミン、ゼラチンなどの親水性蛋白
質を添加する方法が一般的によ（採用されている。しか
し、この親水性蛋白質は、検定混合物中で非特異的な蛋
白質−蛋白質相互作用に起因する妨害作用を起こすこと
が指摘されている（特開昭５＋５−１５８９４７号公報
）。

また親水性蛋白質は脱着し烏く、一定性能の診断用試薬
を製造することが困難になる。一方、後者の方法につい
ては、例えば、特開昭５６１０４０５号公報、特開昭５
６−１４１５５９号公報には繰返し単位が２．６−シオ
キシプロビルメタクリレート単位から成る親水性架橋共
重合体粒子を用いる方法が、また特開昭５７−１３５８
０１号会報にはスチレン−グリシジルメタクリレート共
重合体粒子を合成し、エポキシ基を加水分解してジヒド
ロキジル基に変換して親水性重合体粒子を得る方法が提
案されている。これらの方法は極めて優れた方法である
。しかし、これらの方法は、親水性基であるジヒドロキ
ジル基濃度を増加させるに従い重合体粒子の安定性を向
上させることが可能であるが、免疫活性物質を共有結合
させる活性点濃度が減少するために免疫学的凝集反応の
鋭敏性が低下する欠点がある。このように免疫活性物質
の固定化重合体粒子の免疫学的凝集反応性と物理的安定
性を同時忙満足させることは従来極めて困難であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は免疫学的凝集反応の鋭敏性に優れると共に
、非特異的凝集反応性が小さく、且つ分散安定性の優れ
た診断用試薬の担体として用い得る重合体粒子について
鋭意研究を重ねてきた結果、グリシジル（メタ）了クリ
レート単量体単位を有する重合体粒子に多数のアミノ基
を導入するととｋよって得られた反応性重合体粒子が前
記した要望を満たすことを見い出し、本発明を完成する
に至った。

即ち、本発明は、グリシジル（メタ）アクリレート単量
体単位を有する重合体粒子にアミノ基が導入されてなる
反応性重合体粒子であって、該反応性重合体粒子の表面
に於けるアミノ基の濃度を（４！１２　（μｍｏｔｓ　
／　ｆ−反応性重合体粒子）、アミノ基の導入に使用さ
れたエポキシ基の濃度をＣｍｐｘ　（μｍｏｔ６　／　
ｙ　−反応性重合体粒子）とするとき、次式 ０式％ を満たす濃度のアミノ基を有することを特徴とする反応
性重合体粒子である。

本発明に於ける重合体粒子は、次式 （但し、Ｒは水素原子又はメチル基である。）で示され
るグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位を有する
。本発明の重合体粒子は、上記したグリシジル（メタ）
アクリレート単量体単位のみを有するものであってもよ
く、該グリシジル（メタ）アクリレート単量体単位と他
の単量体単位とを有する本のであっても良い。上記した
他の単量体単位としては、グリシジル（メタ）アクリレ
ートと共重合可能なモノマーで示される単量体単位であ
ればどのようなものでもよい。就中、本発明に於いて好
まし込他の単量体単位は、次式 （但し、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、Ｒ２は
ハロゲン原子、置換若しくは非置換のフェニル基、アル
コキシカルボニル基。

アシルオキシ基又はシアノ基である。）で示される疎水
性ビニル系単量体単位である。

ここで、フェニル基の置換基としては特に限定されない
が、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アルキル基等を挙
げることができる。このような疎水性ビニル系単量体単
位の中でもＲ２が置換若しくは非置換のフェニル基、又
は塩素原子である疎水性ビニル系単量体単位が好ましい
。また、他の単量体単位としては次式 （但し、Ｒ，は水素原子又はカルボキシル基であり、Ｒ
４は水素原子又はアルキル基であり、Ｒ５はカルボキシ
ル基、アミノカルボニル基、スルホニルフェニル基、ヒ
ドロキシは１〜２０の整数である。）である。）で示さ
れる親水性ビニル系単量体単位を採用することができる
。

上記したグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位の
重合体粒子に占める割合は特に限定されないが、得られ
る反応性重合体粒子に免疫活性物質を吸着させて診断用
試薬として使用する場合は、グリシジル（メタ）アクリ
レート単量体単位が０．０５〜２０モル％、さらに０．
１〜１５モル％であることが好ましい。また、免疫活性
物質を共有結合させるととｋよって診断用試薬として使
用する場合は２０〜１００モル％、さら１ｃ３０〜９９
モル％であることが好ましい。

上記したグリシジル（メタ）アクリレート単量体単位以
外の他の単量体としては、前記した疎水性ビニル系単量
体単位及び親水性ビニル系単量体単位を用いることが好
ましいが、親水性ビニル系単量体単位の割合が多くなり
過ぎると反応性重合体粒子の分散安定性に不都合を生じ
ることがある。従って、本発明の反応性重合体粒子を吸
着による診断用試薬として用いる場合は、親水性ビニル
系単量体はグリシジル（メタ）アクリレート単量体に対
して０〜２０モル％の範囲で、また、共有結合による診
断用試薬として用いる場合は、グリシジル（メタ）アク
リレート単量体に対して０〜５０モル％の範囲で用いる
ことが好ましい。

以上のような組成とすることによって、一般に、表面の
エポキシ基が０．０５〜４００μｍａｔｅ　／　を−重
合体粒子、より好ましくは０．１〜２００μｍｏＭｅ／
？−重合体粒子の重合体粒子を得ることができる。

以上に述べた重合体粒子の製造方法は、公知の方法が何
ら制限なく使用し得る。Ｒ「ち、グリシジル（メタ）ア
クリレートを単独で重合すること忙よって、或いは、グ
リシジル（メタ）アクリレートと共重合可能なビニル系
単量体とを共重合させるととによって、上記の重合体粒
子を得ることができる。グリシジル（メタ）アクリレー
トと共重合させるビニル系単量体の代表的なものを挙げ
れば、スチレン、ビニルトルエン、クロルメチルスチレ
ン、クロルスチレン、塩化ビニル、Ａ化ビニル、メチル
（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、
プロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロニト
リル、酢酸ビニル等の疎水性ビニル系単量体、また、ア
クリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホ
ン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸、アクリルアミド。

Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド、
２−ヒドロキシエチルメタアクリレート、グリセロール
モノメタクリレート。

ポリエチレングリコールモノメタクリレート等の親水性
ビニル系単量体などが例示される。

これらのビニル系単量体は２種以上を混合して用いるこ
ともできる。さらにまた、必要に応シテ、ジビニルベン
ゼン、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート、ビスフェノールＡジグ
リシジルエーテル等の架橋性単量体も好適に使用できる
。

これらの単量体を用いて重合体粒子を得るための重合方
法は特に限定されず、公知の方法が好適に採用される。

例えば、アニオン性界面活性剤、非イオン系界面活性剤
の存在下に水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて乳
化重合する方法、界面活性剤を使わすに水媒体中で水溶
性ラジカル開始剤を用いて不均一重合する方法、部分鹸
化ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の保
護コロイド存在下に懸濁重合する方法、ビニル系単量体
は溶解するが重合体は溶解しない有機溶媒中で沈澱重合
する方法等が採用される。

本発明で使用する反応性重合体粒子の平均粒子径は特に
限定されないが、凝集反応による診断用試薬に用いる場
合には、その鋭敏性や保存安定性を良好にするために一
般には０．０５乃至１０ミクロンめ範囲内にあることが
好ましい。さらにまた、該反応性重合体粒子は、粒子径
の分散の小さｈ方が、再現性が良いために望ましｂ０従
って、このような粒子径となるような重合体粒子を得る
ことが好着しい。

本発明の反応性重合体粒子は、上記の重合体粒子にアミ
ノ基が導入されたものであり、反応性重合体粒子の表面
に於けるアミノ基の濃度をＣＩＩＨ２（μｍｏｌｅ／ｇ
−反応性重合体粒子）、アミノ基の導入に使用されたエ
ポキシ基の濃度なＣｙｘ　（μｎｏｔｅ／ｇ−反応性重
合体粒子）とするとき、次式 ％式％ を満たす濃度のアミノ基を有する。

アミノ基の導入には、後述するように分子中にアミノ基
を３個以上有する有機化合物とグリシジル（メタ）アク
リレート単量体単位を有する重合体粒子とを反応させる
ことＫよって行なう。即ち、有機化合物のアミノ基とグ
リシジル（メタ）アクリレート単量体単位のエポキシ基
との反応を利用する。この反応は、種々の測定の結果、
下記〔１３式のように進行しているものと推測できる。

従って、アミノ基の導入に使用されたエポキシ基の濃度
ＣＩＰＸ　ｔｌ；ｔ：、アミノ基とエポキシ基の反応に
よって生成するイミノ基の濃度を測定することによって
求めることができる。

このようにして求められた反応性重合体粒子のアミノ基
の濃度ＣＮＨ２とアミノ基の導入に使用されたエポキシ
基の濃度ＣＩＰＸは、ＣＮｊ１２≧　１．５　Ｘ　Ｃ，
Ｐ。

でなければ、診断用試薬として本発明の反応性重合体粒
子を用するときに良好な鋭敏性及び分散安定性を得るこ
とができない。さらにＣＭＢ２とＣＩＰＸとは、次式 ％式％ を満たすことが好ましい。

本発明に於いては、有機化合物の持つアミノ基の少くと
も１つは、エポキシ基との反応に使用されるが、その他
のアミノ基は、未反応のまま重合体粒子に導入すること
ができる。

従って、本発明ではアミノ基を２個しか持たない有機化
合物の使用の場合に比して、より多くのアミノ基を有す
る反応性重合体粒子を得ることができる。しかも、アミ
ノ基の導入により親水性である水酸基が生成し、このた
めに分散安定性の優れた反応性重合体粒子が得られる。

前記した特定量以上のアミノ基の濃度、を持つ反応性重
合体粒子を得るために、本発明に於いては、分子中にア
ミノ基を６個以上有する有機化合物を重合体粒子の表面
のエポキシ基と反応させてアミノ基の導入が行なわれる
。

本発明に於いて用いられる有機化合物は、分子中にアミ
ノ基を３個以上有するものであれば何ら制限されず用い
得る。本発明に於いて好ましく使用される有機化合物を
一般式で示すと次のとおりである。

Ｈ２ ＮＨ２−Ｒｘ−ｎ２ このような有機化合物を具体的に例示すると、例えば次
のとおりである。１−アミノ−２，２−ビス（アミノメ
チル）プロパン−１−オール、　　１．２．３−１’リ
アミノプロパン。

テトラ（アミノメチル）メタン、　　１，３．５−トリ
アミノベンゼン、　　１．２．４−トリアミノベンゼン
、　　１．２，３．４−テトラアミノベンゼン、ヘプタ
アミノベンゼン、ヘキサアミノベンゼン等の公知の有機
化合物を挙げることができる。

本発明において重合体粒子と有機化合物の反応は、重合
体粒子と重合体粒子の特定量のエポキシ基と反応させる
べき有機化合物を水媒体中、エポキシ基に不活性な緩衝
液中、ある込はエポキシ基と反応性の極めて大きくかつ
重合体粒子を溶解させないメタノール、エタノール、イ
ンプロパツール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル等
の水と親和性の大きい有機溶媒中、あるいはこれらの混
合溶媒中で混合して反応すればよい。特に水媒体中での
反応が好ましく採用される。また、反応温度は重合体粒
子の分子構造やエポキシ基濃度。

有機化合物の分子構造、及び反応媒体によって異なるが
、一般的には４℃乃至１００’Ｃ１好ましくは４℃乃至
６０℃の範囲が好適に採用される。反応媒住処有機溶媒
を用りる場合には重合体粒子を溶解させない反応温度を
選ぶことが重要である。さらＫまた、有機化合物の濃度
は、重合体粒子の分子構造、エポキシ基濃度、反応すべ
きエポキシ基濃度、有機化合物の分子構造、及び反応条
件によって異なるが、重合体粒子の粒子表面のエポキシ
基濃度に対して０．０１〜２００モル倍となるように選
べばよい。アミノ基を３個以上有する有機化合物が複数
のエポキシ基と架橋構造をとると、重合体粒子に導入さ
れるアミノ基の濃度が低下する。従りて、架橋構造をと
らないように、アミノ基を５個以上有する有機化合物の
濃度を、重合体粒子の表面のエポキシ基に対して１０〜
２００モル倍とすることが好ましい。さらｋまた、反応
時間は一概に限定できなりが、一般には１０分乃至１０
０時間が好ましく、更には３０分乃至５０時間がより好
ましく採用される。重合体粒子と有機化合物の混合方法
は特に限定的でない。一般的には、重合体粒子の懸濁媒
体中へ有機化合物の溶液を一括添加する方法もしくは滴
々添加する方法、あるいは有機化合物の溶液中へ重合体
粒子の懸濁液を一括もしくは滴々添加する方法が好まし
く採用される。

このようにして得られた反応性重合体粒子の表面には、
前記（Ｉ）式で示されるようにアミノ基、水酸基が存在
し、場合によっては、未反応のエポキシ基が存在する。

この未反応のエポキシ基は反応性重合体粒子の分散安定
性を向上させるために加水分解して水酸基とすることが
好ましい。即ち、本発明に於いて好ましい態様は、アミ
ノ基の濃度が０．１〜１０００μｍｏｌｅ／ｇ−反応性
重合体粒子、より好ましくは０．２〜５００μｍｏｌｅ
／ｇ−反応性重合体粒子であり、且つ水酸基の濃度が０
．０５〜６００μｍｏＡｅ　／　ｆ−反応性重合体粒子
、より好ましくは０．１〜４００μｍｏｌｅ　／？−反
応性重合体粒子である反応性重合体粒子である。

また、前記の未反応のエポキシ基と２−メルカプトエタ
ノール、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール等
のメルカプトアルカノール類とを反応させる、チオグリ
コール酸。

チオプロピオン酸等のメルカプトカルボン酸類とを反応
させる、ジェタノールアミン、トリス（ヒドロキシエチ
ル）アミノメタン等のヒドロキシアミン類と反応させる
。あるｂはグアノシン、Ｎ−）リス（ヒドロキシエチル
）メチルグリシン等の力Ｎポキシル化アミン類と反応さ
せる、ことによって重合体粒子を親水化させることがで
きる。この親水化は、前記のアミノ基を３個以上有する
有機化合物と重合体粒子との反応の前であっても良く、
後であっても良−０ 本発明で得られた反応性重合体粒子は、生体内での各種
細胞１組織による貧食作用の観察用粒子、及び酵素、生
物学的活性物質、ハプテン類、あるいは免疫活性物質の
固定化担体粒子等に応用でき、特に免疫活性物質を共有
結合法で固定化した診断用試薬は免疫学的凝集反応性が
大きいだけでなく、分散安定性と保存安定性に優れる特
徴がある。

以下に本発明で得られた反応性重合体粒子を診断用試薬
として用すた場合について説明する。

本発明で得られた反応性重合体粒子は粒子表面に反応性
に富むアミノ基を有しているので、公知の方法を利用し
て免疫活性物質を共有結合法で固定化できる。例えば、
（１）グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて免疫活性
物質のアミノ基と共有結合する方法、（２）１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ハイドロクロライド等の架橋剤を用いて免疫活性物質の
カルボキシル基と共有結合する方法、６）ジフェニルホ
スホリルアジド等の架橋剤を用すて免疫活性物質のカル
ボキシル基と共有結合する方法、等が例示される。

さら忙また、本発明で得られた反応性重合体粒子の表面
に免疫活性物質を吸着させることｋよって固定化し、ア
ミノ基を親水性基である水酸基等の導入に使用して粒子
の分散安定化を計ることもできる。

本発明で得られた反応性重合体粒子に共有結合法或いは
吸着法で固定化する免疫活性物質としては、特に限定的
でなく公知のものが使用できる。代表的な本のを例示す
れば、例えば、変性ガンマグロブリン、抗咳因子、ヒト
アルブミン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリン
Ｇ　（ＩｇＧ）　、抗ヒトＩｇＧ抗体。

イムノグロブリンＡ　（ＩｇＡ）　、　抗ヒトＩ　ｇＡ
抗体、イムノグロブリンＭ（ｒｇＭ）、　　抗ヒトＩｇ
Ｍ抗体、　抗ヒトエｇＥ抗体、ストレプトリジン０．ス
トレプトキナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｃ−反応性蛋白
（ＣＲＰ）、抗ヒトＣＲＰ抗体、アルファーフェトプロ
ティン（ＡＦＰ）。

抗ＡＦＰ抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗ヒトＣｇＡ
抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＣ））、抗ＨＣ
’Ｇ抗体、抗エストロゲン抗体、抗インシュリン抗体、
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、抗ＨＢ８抗体、梅毒トレ
ボネマ抗原、風疹抗原、インフルエンザ抗原、補体Ｃ１
ｑ、抗Ｃ１ｑ抗体、抗Ｃ３抗体、抗Ｃ４抗体。

抗トランスフェリン抗体１等の公知の免疫活性物質をあ
げることができる。

本発明で得られた反応性重合体粒子に固定化される該免
疫活性物質の量は、各検査項目に適している割合で反応
性重合体粒子に固定化させればよく、−概に限定されな
い。一般には、該免疫活性物質の量が多い糧、診断用試
薬の鋭敏性が向上するため、鋭敏性を要求する場合には
、前記の反応性重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質
を固定化することが望ましい。

本発明により得られた反応性重合体粒子は免疫活性物質
の固定化能力と分散安定性を同時に高めるととができる
ので、抗原又は抗体と反応性重合体粒子を緩衝液又は生
理食塩水などの水媒体中で混合し、抗原又は抗体が化学
的に変化しないように、かつそれらの免疫学的性質を保
持させるようｋ、非常に温和な条件下に抗原又は抗体を
反応性重合体粒子表面に固定化することができるだけで
なく、該媒体中で極めて安定性が高い特徴がある。反応
性重合体粒子表面に固定化された免疫活性物質の量は、
反応性重合体粒子の免疫活性物質結合部位を飽和又はブ
ロックさせるように選ぶことが望ましいが、残存する結
合部位を免疫学的に不活性な物質、例えばグリシン。

チオグリセロール、アルブミン、ゼラチン等の不活性物
質で不活性化もしくはブロックさせることもできる。

（効果及び作用） 本発明の反応性重合体粒子を用いた診断用試薬は、免疫
学的凝集反応の鋭敏性が大きいぞけでなく、分散安定性
や保存安定性がすぐれるという特徴がある。その理由は
必ずしも明らかではないが、本発明者等は次のように推
測している。本発明の方法で得られる反応性重合体粒子
は免疫活性物質を共有結合法で固定化する重合体粒子の
官能基の数或込は免疫活性物質を吸着する表面のエリア
の広さと、分散安定性と保存安定性に寄与する親水基の
数とが独立函数になることにある。この事実は診断用試
薬の合成上極めて重要な因子である。免疫活性物質を固
定化する官能基濃度或いは表面のエリアの広さが多けれ
ば多い糧、診断用試薬の鋭敏性は向上するが、重合体粒
子の分散安定性と保存安定性が低下する欠点がある。一
方１重合体粒子の親水基濃度が多ければ多い程診断用試
薬の分散安定性と保存安定性が増加するが、鋭敏性が著
しく低下する欠点が生じる。しかしながら１本発明の反
応性重合体粒子は、これらの矛盾を解決し、鋭敏性及び
分散安定性の共和優れたものである。従って、本発明の
反応性重合体粒子は、新規な診断用試薬の開発に於いて
極めて重要な位置を占めるものである。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではな−。

尚、実施例及び比較例に於けるアミノ基。

イミノ基及び水酸基の定量は以下の方法により行なった
。

Ｉ　アミノ基、イミノ基及び水酸基の総量の定量 ［Ｃ，Ｌ、Ｏｇｇら、１ｎｄ、Ｅｎｇ、Ｃｈｅｍ、。

Ａｎａｌ、　Ｅｄ、、　　１７巻、３９４頁、１９４５
年〕に記載されている方法を利用して、測定した。即ち
、乾燥した反応性重合体粒子に無水酢酸とピリジンで完
全にアセチル化し、これを正確に中和することにより、
空試験の結果で補正して定量した。

■　アミノ基の定量 乾燥した反応性重合体粒子をピリジン溶媒中でベンズア
ルデヒドと反応させ、生成するＨ２Ｏ量を微量水分測定
装置（三菱化成製、ＣＡ−０２型）を利用して測定した
。

■　アミノ基及びイミノ基の総量の定量反応性重合体粒
子を含む冷酸性水溶液に亜硝酸ナトリウムを滴下し、ヨ
ウ素デンプン紙を用いてその滴定終点から測定した。

ＩＫより得られた値から■で得られた値を引算すること
により水酸基の濃度を求め゛、■で得られた値から■で
得られた値を差引くことによってイミノ基の濃度を求め
た。

実施例１と比較例１ （１）重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウム４ミリモル／１．チオ硫
酸ナトリウム２ミリモル／１．及び硫酸鋼０．２ミリモ
ル／ｌを添加した。次いで７０℃に加温したグリシジル
メタクリレート１．５モル及びスチレン０．５モルの混
合物を添加して７０℃で６時間重合した。重合後、室温
まで冷却してから得られた重合体粒子を瀘厭（ム２）で
濾別して大きな凝集体を除いた。次いで透析を行なった
後に遠心分離、蒸留水への再分散の操作を繰返した後に
、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分
離と洗浄を行なって重合体粒子を精製した。得られた重
合体粒子の粒子径は肌６０４μｍであった。

（２）反応性重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２％濃度で蒸留水に分散した懸濁
液１００−と、２０　ｍｍｏｔｅ　のテトラ（アミノメ
チル）メタンの水溶液２０〇−を混合し、室温で４８時
間攪拌下に反応した。反応後、反応性重合体粒子を遠心
分離、蒸留水への再分散の操作を６回繰返した後Ｋ、９
８℃で２時間加熱することにより反応性重合体粒子の未
反応のエポキシ基を加水分解した。次すで重合体粒子を
濾紙Ｃ＆２）で濾別した後に、遠心分離、蒸留水への再
分散の操作を６回繰返して精製した。かぐして得られた
反応性重合体粒子のアミノ基、イミノ基及び水酸基の濃
度は、それぞれ２１０，７５゜１００μｍｏｌｅ　／　
ｆ−反応性重合体粒子であった。

の調製 反応性重合体粒子を固形分濃度１％でホウ酸緩衝液（０
，１モルのホウ酸−ホウ砂、０．０５モルのＮａ、ＣＬ
を蒸留水１ｔに溶解した後に、ｐＨ＝８．２に調節した
）に分散した。

本発明忙於いてヒトＩｇＧは、ヒト血清を飽和硫安で塩
析し、さら忙透析を行ない精製したものを用いた。

ヒトＩｇＧをホウ酸緩衝液により希釈し、１１ＩＩＰ／
ｇＩ４に調製した。次いで倍数希釈法忙よりヒｈＩｇＧ
をホウ酸緩衝液忙より希釈してヒ）ＩｇＧ希釈液を調製
した。１％濃度の反応性重合体粒子１容にヒトＩｇ（）
希釈液１容及びグルタルアルデヒドを３０μｍ０２９ノ
〜濃度で含有する水溶液１容を加え、攪拌下に室温で１
時間放置した。その後ウシ血清アルブミノを０．２％の
濃度になるように添加し４℃にて２０時間ゆっくり攪拌
した。その後遠心分離した後に固型分濃度が０．５％と
なるように０．０５％のウシ血清アルブミンを含むホウ
酸緩衝液に調製し、４℃で保存した。

（４）抗原・抗体反応 ヒトエｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒトＩｇＧウサギ
全血清を６０℃、３０分間非動化処理を行なった。この
血清を以下抗ヒトエｇ（）ウサギ血清と呼ぶ。

抗ヒトＩｇＧウサギ血清をホウ酸緩衝液で２０倍に希釈
したものを原液とし、倍数希釈法により抗ヒトＩｇＧウ
サギ血清をホウ酸緩衝液で希釈して抗ヒトＩｇＧウサギ
血清希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行なうために
ガラス製１０穴のホールグラスを用意し、ホウ酸緩衝液
で希釈した抗ヒトＩｇＧウサギ血清を各ホールに４０μ
を加える。次いでヒトＩｇＧを固定化した反応性重合体
粒子のホウ酸緩衝液分散液を各ホールに４０μを加える
。この後直ちに平沢製作所製テーバ一式攪拌４ｉ！＆Ｃ
よりホールグラスを１分間に１２０回転の速度で水平回
転し攪拌を行なう。抗原・抗体反応により反応性重合体
粒子の凝集の有無から、ヒ）ＩｇＧを固定化した反応性
重合体粒子の特性である鋭敏性を評価した。ホールグラ
スを用いた反応性重合体粒子の凝集試験の結果を図１に
示す。図１は１０分間の攪拌後の凝集状態を示す。凝集
が全く認められない場合（−）、凝集の有無が判定しが
たい場合（±）、明らかに凝集が認められる場合、凝集
の強込順に＋＋十、　＋＋　、十と判定した。図中Ｃは
抗原もしくは抗体を全く含まなｈことを示す。凝集試験
の結果、明らかに凝集の認められたホールに於ける抗ヒ
トＩｇＧウサギ血清希釈液の最高希釈倍数をもって、反
応性重合体粒子の鋭敏性を評価した。

また反応性重合体粒子の特性として、分散安定性を評価
した。すなわち、反応性重合体粒子にヒ）ＩｇＧ希釈液
を加え室温で２時間放置し、次いで４℃で７日間放置し
た後の反応性重合体粒子の分散状態をもって７日後の分
散安定性を評価した。またヒトＩｇＧ固定化後３ケ月経
過した後の反応性重合体粒子の分散状態をもってヒトＩ
ｇＧを固定化した反応性重合体粒子の保存中の分散安定
性を評価した。

その結果、鋭敏性は７８後Ｘ６４０．！１ケ月後Ｘ１２
８０．分散安定性は７日後には非特異凝集が認められな
かった力ｔ、３ケ月後には１本の非特異凝集が認められ
た。

尚、比較例１として得られた精製重合体粒子について本
発明のテトラ（アミノメチル）メタンの代りにヘキサメ
チレンジアミンを用いた以外は実施例１と同様の操作を
行ない、性能を調べた。アミノ基及びイミノ基の濃度は
それぞれ８０及び９０μｍｏｌｅ／ｇ−反応性重合体粒
子であった。鋭敏性は７日後×８０゜６ケ月後×１６０
であった。また分散安定性は７日後には非特異凝集が認
められなかったが、３ケ月後には３本の非特異凝集反応
が認められた。

実施例　２ 実施例１で得られた精製重合体粒子を２％濃度で蒸留水
に分散した懸濁液１００−に５００μｍｏｔｅジェタノ
ールアミンの水溶液５０−と２０　ｍｎｏｔｅ　の１．
２．３−トリアミノプロパンの水溶液２００−を混合し
４０℃で１夜攪拌下に反応した。反応後、反応性重合体
粒子を遠心分離−蒸留水への再分散の操作を３回繰返し
た後に、９８℃で２時間加熱することにより反応性重合
体粒子の未反応のエポキシ基を加水分解した。次いで反
応性重合体粒子を濾紙（墓２）で濾別した後に、遠心分
離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返して精製した。

かくして得られた反応性重合体粒子のアミノ基、イミノ
基及び水酸基の濃度を実施例１と同様の操作で測定する
と、それぞれ１３０，６５，１１０μｍｏＡｅ　／　を
−反応性重合体粒子であった。

また、実施例１と同様の操作でヒ）ＩｇＧを感作し、抗
ヒトＩｇＧウサギ血清の抗原・抗体反応を調べた結果、
鋭敏性は７日後、３ケ月後共ＫＸ６４０であり、また分
散安定性は７日後、３ケ月後共に全く非特異凝集反応が
認められなかったつ 実施例３と比較例２ 実施例１で得られた反応性重合体粒子を固形分濃度１％
でホウ酸緩衝液に分散させた。

次すでヤギの産生じたアルファーフェトプロティンＣ以
下ＡＦＰと略す）の抗体をアフィニテイクロマトにより
精製して得た精製ＡＦＰ抗体を１１１Ｆ／−濃度に含有
するホウ酸緩衝液を調製した後に倍数希釈法により希釈
してＡＦＰ抗体希釈液を調製ｌ、た。１％濃度の反応性
重合体粒子１容ＶｃＡＦＰ抗体希釈液１容及びグルタル
アルデヒドを２５μｍｏｌｅ　／　Ｌ濃度で含有する水
溶液１容を加え攪拌下に室温で２時間放置した。その後
ウシ血清アルブミンを０．２％濃度になるように添加し
４℃にて２０時間ゆっくり攪拌した。その後遠心分離し
た後忙固型分濃度が０．５％となるように０．０５％濃
度のウシ血清アルブミンを含むホウ酸緩衝液に調製し、
４℃に保存した。

検体としてヒト血清中のＡＦＰ濃度が１０００μｔ／−
であるものを原液とし、ホウ酸緩衝液で希釈系列を調製
した。実施例１と同様にしてガラス製１０大のホールグ
ラスにホウ酸緩衝液で希釈したＡＦＰを各ホールＫＯ，
０４−加え、次いでＡＦＰ抗体を固定化した反応性重合
体粒子の分散液を各ホールに０．０４−加えて実施例１
と同様の操作で鋭敏性２分散安定性を調べた。その結果
、鋭敏性は７日後、３ケ月後共ＶＣ５０μｔ／−であっ
た。分散安定性は７日後には非特異的凝集が認められな
かったが、３ケ月後には１本の非特異凝集が認められた
。

比較例２として比較例１で得られた反応性重合体粒子を
用いて、上記実施例と同一の操作で性能を調べた結果、
鋭敏性は７日後、３ケ月後共に２００μｔ／−であった
。また分散安定性は７日後には１本、３ケ月後には３本
の非特異凝集反応が認められた。

実施例　４ （１）反応性重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後釦、蒸留
水２７００ｃｃを加えて７０’ＣＫ保った後に、窒素雰
囲気下に過硫酸カリウム５．０ミリそル／１．チオ硫酸
ナトリウム５．。

ミ１３モル／１．硫酸鋼０．２５ミリモル／１゜及びメ
ルカプトエタノール０．５ミリモル／ｌを添加した。次
いで７０℃に加温したグリシジルメタクリレート２．０
モル及びエチレングリコールジメタクリレート４ｏミリ
モルの混合物を添加して７０℃で２時間攪拌下に重合し
た。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。

得られた重合体粒子の粒子径は０．２４５μｍであった
。

得られた重合体粒子を蒸留水１００−に２％濃度になる
ように調製し、チオグリコール酸１０μｍｏｌｅ　　を
加えて室温で攪拌下忙２４時間反応した。反応後、遠心
分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返した後に１０
０−に調製した。次すで２５　ｍｎｏｔｅの１．２．５
．４−テトラアミノベンゼンの水溶液４００ｓｄを加え
室温で攪拌下に４０時間反応した。反応後、遠心分離、
蒸留水への再分散の操作を３回繰返した後に、イオン交
換樹脂で脱イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を
行なって反応性重合体粒子を精製した。かくして得られ
た反応性重合体粒子のアミノ基、イミノ基及び水酸基の
濃度を実施例１と同様の操作で求めると、それぞれ２２
０．８０．１４０μｍｏｔｅ　／　ｆ−反応性重合体粒
子であった。

実施例　５ 実施例４で得られた反応性重合体粒子を固屋分濃度１％
でｐ）！＝６．０のリン酸緩衝液忙分散させた。次いで
ヤギの産生じた抗ＣＲＰ血清を塩析と透析でｒ−グロブ
リンに濃縮した後アフィニティクロマトにより精製して
得た精製ＣＲＰ抗体を１０００μｆ／−濃度に含有する
リン酸緩衝液を調製した後に倍数希釈法により希釈して
ＣＲＰ抗体希釈液を調製した。１％濃度の反応性重合体
粒子１容にＣＲＰ抗体希釈液１容及びエチル（Ｎ、ＩＮ
’−ジメチルアミノプロピル）カーポジイミドを２０μ
ｍｏｔｅ／−濃度で含有する水溶液１容を加え、攪拌下
に室温で２時間放置する。その後ウシ血清アルブミンを
０．５％の濃度になるように添加し、４℃にて２０時間
攪拌してＣＲＰ抗体を固定化した反応性重合体粒子を得
た。

次いで遠心分離した後、ウシ血清アルブミンを０．０５
％の濃度で添加したリン酸緩衝液に再分散し、固型分濃
度を０．５％に調製した。

次いで検体として濃度既知のＣＲＰ患者血清を５６℃で
３０分間加熱処理して非動化した後、リン酸緩衝液で希
釈系列を調節した。実施例１と同様の操作で、ガラス製
１０穴のホールグラスを利用して抗原）抗体反応を訓べ
た。その結果、鋭敏性は７日後及び３ケ月後１ｃ２０μ
ｔ／−であった。分散安定性は７日後、６ケ月後共忙非
特異凝集反応は認められなかった。

実施例　６ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲
気下に過硫酸カリウム５．０ミリモル／ｌを添加した。

次いで７０℃に加温したグリシジルアクリレート６３０
ミリモル、メタクリル酸１０ミリモル、及びスチレン２
．０モルの混合物を添加して７０℃で３０時間攪拌下に
重合した。重合後、実施例１と同様の操作で重合体粒子
を精製した。得られた重合体粒子の粒子径は０．３０μ
ｍであった。

得られた重合体粒子を蒸留水１００ｍに２％濃度になる
ように調製し、２０　ｍｍｏｔｅの１−アミノ−２，２
−ビス（アミノメチル）プロパン−１−オール水溶液２
００−を加えて室温で攪拌下に４８時間反応した。反応
後遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返した後
に、９８℃で１時間加熱処理し、更に遠心分離、蒸留水
への再分散を行なった。

得られた反応性重合体粒子のアミノ基、イミノ基及び水
酸基の濃度はそれぞれ３５．２０゜３５μｍｏｌｅ／？
−反応性重合体粒子であった。

かくして得られた反応性重合体粒子を固型分濃度１％で
ホウ酸緩衝液に分散させた。次いでヒト胎盤ラクトゲン
（ＨＰＬ）を２０００１ｕ／−濃度に含有するホウ酸緩
衝液を調製した後に倍数希釈法によりＨＰ、Ｌをホウ酸
緩衝液により希釈してＨＰＬ希釈液を調製した。

１％濃度の反応性重合体粒子１容にＨＰＬ希釈液１容及
びグルタルアルデヒド５μｍｏｌｅ／−濃度で含有する
水溶液１容を加え攪拌下に室温で２時間放置した後、ウ
シ血清アルブミンを０．２％濃度になるように添加し４
℃で攪　１拌下に２０時間放置した。次いで遠心分離し
た後にウシ血清アルブミンを０．０５％濃度で添加した
ホウ酸緩衝液に再分散し、固型分濃度を０．５％に調製
した。

精製した抗ＨＰＬウサギ血清をホウ酸緩衝液で２０倍に
希釈したものを原液とし、倍数希釈法により抗ＨＰＬウ
サギ血清をホウ酸緩衝液で希釈して抗ＨＰＬウサギ血清
希釈液を調製する。実施例１と同様忙して、ガラス製１
０大のホールグラスにホウ酸緩衝液で希釈した抗ＨＰＬ
血清を各ホールに４０μを加える。

次騒でＨＰＬを固定化した反応性重合体粒子の分散液を
各ホールに４０μを加えて、実施例１と同様の操作で鋭
敏性１分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は７日後
、３ケ月後共にＸ４０であった。分散安定性は７日後。

３ケ月後共に非特異的凝集反応が認められなかった。

実施例　７ ：１）重合体粒子の調製 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、蒸留
水２７００ＣＣを加えて７５℃に保った後ｋ、窒素雰囲
気下、攪拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／１．チオ硫
酸ナトリウム５ミリモルｌｂ、硫酸鋼０．２５ミリモル
／ｌを添加した。次いで７５℃に加温したグリシジルア
クリレート１５ミリモル及びメチルメタクリレート２５
０ミリモルの混合物を添加して７５℃で５０分間攪拌下
に重合した。

その後、メチルメタクリレート２．６モルを定量ポンプ
で滴々添加して、更に７５℃で２時間攪拌下に重合した
。その後の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得
られた重合体粒子の粒子径は０．２０８μｍであった。

（２）反応性重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２％濃度で蒸留水に分散した懸濁
液１００−と１００μｍｏｌｅの１−アミノ−２，２−
ビス（アミノメチル）プロパン−１−オールを混合し、
室温で４８時間攪拌下に反応した。反応後１反応性重合
体校子を遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返
して精製した。かくして得られた反応性重合体粒子のア
ミノ基濃度は０．８μｍｏｌｅ／を一反応性重合体粒子
であり、イミノ基濃度は０，４μｍｏ　ｔｅ　／　を−
反応性重合体粒子であった。次いで該反応性重合体粒子
を蒸留水１００−に分散し２００μｍｏｌｅのテトラエ
チレングリコールジグリシジルエーテルヲ加えて室温で
４８時間攪拌下に反応した。反応後、遠心分離、蒸留水
への再分散の操作を６回繰返した後に、９８℃で２時間
加熱することにより反応性重合体粒子のエポキシ基を加
水分解した。次いで反応性重合体粒子を濾紙ＣＡ２）で
濾別した後に、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を６
回繰返して精製した。

（３）　　ヒトエｇＧを固定化した反応性重合体粒子の
調製 （２）で得られた本発明の反応性重合体粒子を固型分濃
度１％でグリシン緩衝液に分散した。

本発明に於いてグリシン緩衝液とはグリシン０．０５モ
ル及び食塩０．０５モルを水１ｔＫ溶解し、次いで２規
定水酸化ナトリウム水溶液で、Ｈを８．２に調製し、さ
らにアジ化ナトリウムを１ｆ添加したものである。

とｈ工ｇＧをグリシン緩衝液により希釈し１■／−に調
整する。次いで倍数希釈法によりヒトＩｇＧをグリシン
緩衝液により希釈してヒト１ｇＧ希釈液を調製する。１
％濃度の反応性重合体粒子分散液１容にヒトＩｇＧ希釈
液１容を加え攪拌し、室温下２時間放置する。次論でウ
シ血清アルブミンを１％の濃度になるように添加し、４
℃に保ち１夜放置してヒトＩｇＧを固定化した反応性重
合体粒子を得た。次りで遠心分離、グリシン緩衝液への
再分散の操作を繰り返すことにより、ヒトＩｇＧを固定
化した反応性重合体粒子を洗浄した。

さらに遠心分離した後、ヒト１ｇＧを固定化した反応性
重合体粒子をウシ血清アルブミンを０．１％の濃度で添
加したグリシン緩衝液に再分散し固を分濃度を０．５％
に調製し、４’Ｃ＆Ｃ保ち保存した。

（４）抗原・抗体反応 実施例１と同様の操作で抗ヒｈＩｇＧウサギ血清との抗
原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１８後Ｘ
１２８０　、３ケ月後ＸＩ　２８０　、ｆた分散安定性
は１８後０本。

３ケ月後１本の非特異的凝集反応が認められた。

実施例　８ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後釦、蒸留
水２７００ＣＣ加えて７０℃に保った後に、窒素雰囲気
下、攪拌下忙過硫酸カリウム５ミリモル／を濃度忙なる
ように添加した。次いで７０℃に加温したグリシジルメ
タアクリレート２１０ミリモル及びスチレン１００ミリ
モルの混合物を添加して７０℃で１時間攪拌下に重合し
た。その後スチレン２．５モルを定量ポンプで滴々添加
してから、７０℃で２９時間攪拌下に重合した。その後
の操作は実施例１と同様の操作を行なった。得られた重
合体粒子の粒子径は０．３４５μｍであつた。この重合
体粒子を蒸留水１００−に２％濃度になるように調製し
、８００μｍｏ　ｔｓの１．２．５−ｈリアミノプロパ
ンの水溶液１００−を添加し、室温で４８時間攪拌下に
反応した。反応後、反応性重合体粒子を遠心分離、蒸留
水への再分散の操作を３回繰返して精製した。かくして
得られた反応性重合体粒子のアミノ基濃度は１５μｍｏ
ｌｅ／ｇ−反応４゜性重合体粒子であり、イミノ基濃度
け　８μｍｏｌｅ／ｇ−反応性重合体粒子であった。次
込で該反応性重合体粒子を蒸留水１００−に分散し、　
１　ｍｍｏｌｅのオクタエチレングリコールジグリシジ
ルエーテルを加えて室温で４８時間攪拌下に反応した。

反応後、遠心分離、蒸留水への再分散の操作を３回繰返
した後に９８℃で２時間加熱することにより反応性重合
体粒子のエポキシ基を加水分解した。次いで反応性重合
体粒子を濾紙（墓２）で濾別した後に、遠心分離、蒸留
水への再分散の操作を６回繰返して精製した。

得られた反応性重合体粒子に実施例７と同様の操作でヒ
トエｇＧを吸着固定化し、抗ヒトエｇＧウサギ血清との
抗原・抗体反応を行なった。その結果、鋭敏性は１８後
Ｘ１２８０゜６ケ月後Ｘ２５６０．また分散安定性は１
日後１本、６ケ月後２本の非特異的凝集反応が認められ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた反応性重合体粒子を用い
た診断用試薬の凝集状態を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グリシジル（メタ）アクリレート単量体単位を有
   する重合体粒子にアミノ基が導入されてなる反応性重合
   体粒子であつて、該反応性重合体粒子の表面に於けるア
   ミノ基の濃度をＣ＿Ｎ＿Ｈ＿２（μｍｏｌｅ／ｇ−反応
   性重合体粒子）、アミノ基の導入に使用されたエポキシ
   基の濃度をＣ＿Ｅ＿Ｐ＿Ｘ（μｍｏｌｅ／ｇ−反応性重
   合体粒子）とするとき、次式 Ｃ＿Ｎ＿Ｈ＿２≧１．５×Ｃ＿Ｅ＿Ｐ＿Ｘ を満たす濃度のアミノ基を有することを特徴とする反応
   性重合体粒子。
2. （２）グリシジル（メタ）アクリレート単量体単位を有
   する重合体粒子と、分子中にアミノ基を３個以上有する
   有機化合物とを反応させることを特徴とするグリシジル
   （メタ）アクリレート単量体単位を有する重合体粒子に
   アミノ基が導入されてなる反応性重合体粒子であつて、
   該反応性重合体粒子の表面に於けるアミノ基の濃度をＣ
   ＿Ｎ＿Ｈ＿２（μｍｏｌｅ／ｇ−反応性重合体粒子）、
   アミノ基の導入に使用されたエポキシ基の濃度をＣ＿Ｅ
   ＿Ｐ＿Ｘ（μｍｏｌｅ／ｇ−反応性重合体粒子）とする
   とき、次式 Ｃ＿Ｎ＿Ｈ＿２≧１．５×Ｃ＿Ｅ＿Ｐ＿Ｘ を満たす濃度のアミノ基を有する反応性重合体粒子の製
   造方法。