JP2515954B2 - 特異的バインディングリガンドの検出方法 - Google Patents
特異的バインディングリガンドの検出方法Info
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- JP2515954B2 JP2515954B2 JP4268361A JP26836192A JP2515954B2 JP 2515954 B2 JP2515954 B2 JP 2515954B2 JP 4268361 A JP4268361 A JP 4268361A JP 26836192 A JP26836192 A JP 26836192A JP 2515954 B2 JP2515954 B2 JP 2515954B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、調節性化合物、すなわ
ち、ペルオキシダーゼの基質におけるペルオキシダーゼ
の作用により得られるシグナルを調節する化合物、を用
いる特異的バインディングリガンドの検出方法に関す
る。
ち、ペルオキシダーゼの基質におけるペルオキシダーゼ
の作用により得られるシグナルを調節する化合物、を用
いる特異的バインディングリガンドの検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生物学的流体中に低濃度で存在する生物
学的物質の迅速、正確及び定性的もしくは定量的な検出
に関する研究及び診断方法が、医療分野で必要とされ続
けている。
学的物質の迅速、正確及び定性的もしくは定量的な検出
に関する研究及び診断方法が、医療分野で必要とされ続
けている。
【０００３】リガンド及びレセプター間で生成される複
合体は、各種の既知方法により検出可能である。最も一
般的に用いられる方法は、複合体の成分の一つに既に付
着したか、又は更なる反応を経て複合体の一部となる数
タイプのシグナル発生性部分を使用する。例えば、ビオ
チンとアビジンの複合体の生成では、複合体が、アビジ
ンもしくはビオチンのどちらかの分子上に標識を用いて
検出されうる。このような標識は、ラジオアイソトープ
もしくはアビジン又はビオチンと結合した酵素であって
もよい。あるいは、アビジン−ビオチン複合体は、複合
体のどちらかもしくは両方の部分に特異的である標識さ
れた分子との更なる反応により検出されるかもしれな
い。
合体は、各種の既知方法により検出可能である。最も一
般的に用いられる方法は、複合体の成分の一つに既に付
着したか、又は更なる反応を経て複合体の一部となる数
タイプのシグナル発生性部分を使用する。例えば、ビオ
チンとアビジンの複合体の生成では、複合体が、アビジ
ンもしくはビオチンのどちらかの分子上に標識を用いて
検出されうる。このような標識は、ラジオアイソトープ
もしくはアビジン又はビオチンと結合した酵素であって
もよい。あるいは、アビジン−ビオチン複合体は、複合
体のどちらかもしくは両方の部分に特異的である標識さ
れた分子との更なる反応により検出されるかもしれな
い。
【０００４】ラジオアイソトープに伴う取り扱い及び使
い捨ての問題を回避できるため、特異的バインディング
反応に好ましい標識は酵素である。数多くの酵素がこれ
に関連して有用であることが知られており、ペルオキシ
ダーゼ標識が最も一般的である。
い捨ての問題を回避できるため、特異的バインディング
反応に好ましい標識は酵素である。数多くの酵素がこれ
に関連して有用であることが知られており、ペルオキシ
ダーゼ標識が最も一般的である。
【０００５】医院もしくは診療所において適度な訓練で
迅速かつ容易に使用できるように設計された診断試験で
は、目的の特異的バインディングリガンド（例えば、感
染因子由来の抗原）が、酵素標識とそれに対応する基質
の反応より得られる比色もしくは化学ルミネッセンスシ
グナルを用いて検出されることが多い。リガンドが存在
する場合には、速やかにかつ激しくシグナルを生成する
必要がある。
迅速かつ容易に使用できるように設計された診断試験で
は、目的の特異的バインディングリガンド（例えば、感
染因子由来の抗原）が、酵素標識とそれに対応する基質
の反応より得られる比色もしくは化学ルミネッセンスシ
グナルを用いて検出されることが多い。リガンドが存在
する場合には、速やかにかつ激しくシグナルを生成する
必要がある。
【０００６】しかしながら、また、隣接もしくは周囲の
領域がバックグラウンド対照として使用できるように、
試験デバイスにおける試験区域の限定領域内でシグナル
を生成させることを必要とする。このような場合には、
シグナルの生成は、試験区域とバックグラウンド区域間
に明瞭な差異を提供するために、一定期間後に調節もし
くは停止すべきである。
領域がバックグラウンド対照として使用できるように、
試験デバイスにおける試験区域の限定領域内でシグナル
を生成させることを必要とする。このような場合には、
シグナルの生成は、試験区域とバックグラウンド区域間
に明瞭な差異を提供するために、一定期間後に調節もし
くは停止すべきである。
【０００７】歯周疾患に伴う微生物の検出における技術
分野での促進が、ヨーロッパ特許第Ａ−０，４３９，２
１０号明細書に記載及び特許請求されている。このケー
スは、微孔質濾過膜の限定領域で水不溶性試薬を用いる
イムノメトリック（また、「サンドウイッチ」として既
知である）アッセイにおいて、これらの微生物、詳細に
は、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス
（Actinobacillus actinomycetemcomitans ）、ポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivali
s) ｛以前にバクテロイデス・ジンジバリス（Bacteroid
es gingivalis）として、当該技術分野で既知である｝
及びプレボテラ・インターメディア（Prevotella inte
rmedia）｛以前にバクテロイデス・インターメディアス
（Bacteroides intermedius ）として既知である｝の同
時検出並びに区別を記載している。これらの微生物の同
時検出及び区別は、相当な臨床的及び商業的意義を有す
る。
分野での促進が、ヨーロッパ特許第Ａ−０，４３９，２
１０号明細書に記載及び特許請求されている。このケー
スは、微孔質濾過膜の限定領域で水不溶性試薬を用いる
イムノメトリック（また、「サンドウイッチ」として既
知である）アッセイにおいて、これらの微生物、詳細に
は、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス
（Actinobacillus actinomycetemcomitans ）、ポルフ
ィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivali
s) ｛以前にバクテロイデス・ジンジバリス（Bacteroid
es gingivalis）として、当該技術分野で既知である｝
及びプレボテラ・インターメディア（Prevotella inte
rmedia）｛以前にバクテロイデス・インターメディアス
（Bacteroides intermedius ）として既知である｝の同
時検出並びに区別を記載している。これらの微生物の同
時検出及び区別は、相当な臨床的及び商業的意義を有す
る。
【０００８】ヨーロッパ特許第Ａ−０，４３９，２１０
号明細書に記載されるアッセイは、細菌抗原に特異的な
抗体上に標識としてペルオキシターゼを用いて実施され
る。ペルオキシターゼが適当な基質と反応する場合に、
比色シグナルの生成を停止させるためにアジ化ナトリウ
ムの緩衝化溶液を用いることは、このようなアッセイで
は周知である。多くの場合、低濃度（例えば、０．１重
量パーセント）のアジ化ナトリウムが十分に作用する。
号明細書に記載されるアッセイは、細菌抗原に特異的な
抗体上に標識としてペルオキシターゼを用いて実施され
る。ペルオキシターゼが適当な基質と反応する場合に、
比色シグナルの生成を停止させるためにアジ化ナトリウ
ムの緩衝化溶液を用いることは、このようなアッセイで
は周知である。多くの場合、低濃度（例えば、０．１重
量パーセント）のアジ化ナトリウムが十分に作用する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、アジ化
ナトリウムが高い pＨで使用される場合、特に試薬が容
易に移動できる孔質マトリックス上でシグナルが検出さ
れる場合には、比色シグナルの生成が完全に停止されな
いことが認められている。換言すれば、比色シグナル生
成は、アジ化により低下を示すが、停止されない。これ
は、特異的なシグナルを発生し、そして孔質マトリック
ス上の周辺領域にシグナルを出現させ続ける。このよう
なことが起こるのを防ぐことは望ましい。
ナトリウムが高い pＨで使用される場合、特に試薬が容
易に移動できる孔質マトリックス上でシグナルが検出さ
れる場合には、比色シグナルの生成が完全に停止されな
いことが認められている。換言すれば、比色シグナル生
成は、アジ化により低下を示すが、停止されない。これ
は、特異的なシグナルを発生し、そして孔質マトリック
ス上の周辺領域にシグナルを出現させ続ける。このよう
なことが起こるのを防ぐことは望ましい。
【００１０】この課題を解決するためにより高濃度のア
ジ化ナトリウムを使用することが考慮されるが、アジ化
ナトリウムは周知毒性物質でありまた爆発性を有するの
で、これは受け入れられない。
ジ化ナトリウムを使用することが考慮されるが、アジ化
ナトリウムは周知毒性物質でありまた爆発性を有するの
で、これは受け入れられない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記課題は、下記工程を
含んで成る特異的バインディングリガンドの検出方法を
用いて解決される。 Ａ．特異的バインディングリガンドを、上記リガンドに
特異的である水溶性酵素（ペルオキシダーゼ）標識レセ
プターと反応させる工程、 Ｂ．工程Ａの前、それと同時に、又はそれに続けて、特
異的バインディングリガンドを不溶化させて、不溶化さ
れた特異的バインディング複合体を提供する工程、 Ｃ．不溶化された複合体を、ペルオキシダーゼに応じた
比色もしくは化学ルミネッセンスシグナルを与えるため
の組成物と接触させる工程、並びに Ｄ．不溶化された複合体を、少なくとも０．０５重量パ
ーセントの次式 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含む組成物と接触させることにより、
前記比色もしくは化学ルミネッセンスシグナルを与える
生成物の生成を実質的に停止させる工程。
含んで成る特異的バインディングリガンドの検出方法を
用いて解決される。 Ａ．特異的バインディングリガンドを、上記リガンドに
特異的である水溶性酵素（ペルオキシダーゼ）標識レセ
プターと反応させる工程、 Ｂ．工程Ａの前、それと同時に、又はそれに続けて、特
異的バインディングリガンドを不溶化させて、不溶化さ
れた特異的バインディング複合体を提供する工程、 Ｃ．不溶化された複合体を、ペルオキシダーゼに応じた
比色もしくは化学ルミネッセンスシグナルを与えるため
の組成物と接触させる工程、並びに Ｄ．不溶化された複合体を、少なくとも０．０５重量パ
ーセントの次式 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含む組成物と接触させることにより、
前記比色もしくは化学ルミネッセンスシグナルを与える
生成物の生成を実質的に停止させる工程。
【００１２】さらに、上記検出方法に、特異的バインデ
ィングリガンドを検出するための検出試験キットであっ
て、少なくとも０．０５重量パーセントの次式 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含む pＨ６〜１１の組成物を、シグナ
ル提供性生成物の生成停止剤として含んで成る検出試験
キットを用いてもよい。
ィングリガンドを検出するための検出試験キットであっ
て、少なくとも０．０５重量パーセントの次式 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含む pＨ６〜１１の組成物を、シグナ
ル提供性生成物の生成停止剤として含んで成る検出試験
キットを用いてもよい。
【００１３】
【具体的な態様】本発明の実施に際して用いられる化合
物は、次式により代表されるヒドロキサム酸類もしくは
アシルヒドラジン類又はそれらの等価塩である。 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ 上式中、Ｒ′は、ヒドロキシもしくはアミノである。
Ｒ′がヒドロキシである場合、また、これらの化合物は
ヒドロキサム酸の形〔すなわち、Ｒ−Ｃ（＝ＮＯＨ）−
ＯＨ〕であることができ、そして２種の互変異性体の形
で存在できる。
物は、次式により代表されるヒドロキサム酸類もしくは
アシルヒドラジン類又はそれらの等価塩である。 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ 上式中、Ｒ′は、ヒドロキシもしくはアミノである。
Ｒ′がヒドロキシである場合、また、これらの化合物は
ヒドロキサム酸の形〔すなわち、Ｒ−Ｃ（＝ＮＯＨ）−
ＯＨ〕であることができ、そして２種の互変異性体の形
で存在できる。
【００１４】この構造式では、Ｒは、フェニル、ナフチ
ル、トリル、ｏ−，ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニ
ル、３−アミノ−２−カルバモイルフェニル、及び３−
アミノ−２−カルボキシフェニル金属もしくはアンモニ
ウム塩を包含する芳香核内炭素原子数６〜１０個の置換
もしくは未置換アリールであることができる。Ｒがアリ
ールである場合には、フェニル、３−アミノ−２−カル
バモイルフェニル又は３−アミノ−２−カルボキシフェ
ニル金属もしくはアンモニウム塩が好ましく、そしてフ
ェニルが最も好ましい。
ル、トリル、ｏ−，ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニ
ル、３−アミノ−２−カルバモイルフェニル、及び３−
アミノ−２−カルボキシフェニル金属もしくはアンモニ
ウム塩を包含する芳香核内炭素原子数６〜１０個の置換
もしくは未置換アリールであることができる。Ｒがアリ
ールである場合には、フェニル、３−アミノ−２−カル
バモイルフェニル又は３−アミノ−２−カルボキシフェ
ニル金属もしくはアンモニウム塩が好ましく、そしてフ
ェニルが最も好ましい。
【００１５】しかしながら、また、Ｒは、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、２−
メチルペンチル及びヘプチルを包含する炭素原子数１〜
７個の置換もしくは未置換アルキル、又は限定されるも
のではないが、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシ
クロヘプチルを包含する環内炭素原子数５〜１０個の置
換もしくは未置換シクロアルキルであることができる。
また、Ｒは、芳香環内原子数５〜１０個（少なくともそ
れらの１つが酸素、硫黄もしくは窒素であり、そして残
りが炭素原子である）の未置換もしくは置換芳香族複素
環であることができる。有用な芳香族複素環基として
は、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリ
ル、テトラアゾリル、チエニル、フリル、チアゾリル、
オキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリ
ル、ベンゾオキサゾリル、ピリジル、キノリル、ピリダ
ジニル、ピリミジル、トリアジニル、インドリル及びキ
ノキサリニルが挙げられる。
ル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、２−
メチルペンチル及びヘプチルを包含する炭素原子数１〜
７個の置換もしくは未置換アルキル、又は限定されるも
のではないが、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシ
クロヘプチルを包含する環内炭素原子数５〜１０個の置
換もしくは未置換シクロアルキルであることができる。
また、Ｒは、芳香環内原子数５〜１０個（少なくともそ
れらの１つが酸素、硫黄もしくは窒素であり、そして残
りが炭素原子である）の未置換もしくは置換芳香族複素
環であることができる。有用な芳香族複素環基として
は、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリ
ル、テトラアゾリル、チエニル、フリル、チアゾリル、
オキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリ
ル、ベンゾオキサゾリル、ピリジル、キノリル、ピリダ
ジニル、ピリミジル、トリアジニル、インドリル及びキ
ノキサリニルが挙げられる。
【００１６】好ましくは、Ｒがフェニル、炭素原子数１
〜４個の置換もしくは未置換アルキル、環内炭素原子数
５もしくは６個のシクロアルキル又は核炭素及びヘテロ
原子数５もしくは６個の芳香族複素環である。最も好ま
しくは、Ｒがフェニル、３−アミノ−２−カルバモイル
フェニルもしくは３−アミノ−２−カルボキシフェニル
金属もしくはアンモニウム塩である。好ましい化合物
は、ベンゾヒドロキサム酸及びそれらの等価塩類であ
る。
〜４個の置換もしくは未置換アルキル、環内炭素原子数
５もしくは６個のシクロアルキル又は核炭素及びヘテロ
原子数５もしくは６個の芳香族複素環である。最も好ま
しくは、Ｒがフェニル、３−アミノ−２−カルバモイル
フェニルもしくは３−アミノ−２−カルボキシフェニル
金属もしくはアンモニウム塩である。好ましい化合物
は、ベンゾヒドロキサム酸及びそれらの等価塩類であ
る。
【００１７】本明細書に記載されるすべての酸につい
て、等価塩類としては、アンモニウム塩、アルカリ金属
塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられる。本明細書に記
載されるアシルヒドラジン類は、一般的には無水物、詳
細には３−ニトロフタル酸無水物を初めとするフタル酸
無水物とヒドラジン水和物との縮合により製造できる。
この具体的な反応で得られるアシルヒドラジンは、塩基
で加水分解でき、そして炭素においてパラジウムの存在
下水素化できる。アンモニアが塩基として使用される場
合、得られる生成物は２−カルバモイル誘導体である。
そうでなければ、２−カルボキシラート塩が得られる。
て、等価塩類としては、アンモニウム塩、アルカリ金属
塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられる。本明細書に記
載されるアシルヒドラジン類は、一般的には無水物、詳
細には３−ニトロフタル酸無水物を初めとするフタル酸
無水物とヒドラジン水和物との縮合により製造できる。
この具体的な反応で得られるアシルヒドラジンは、塩基
で加水分解でき、そして炭素においてパラジウムの存在
下水素化できる。アンモニアが塩基として使用される場
合、得られる生成物は２−カルバモイル誘導体である。
そうでなければ、２−カルボキシラート塩が得られる。
【００１８】本明細書に記載される化合物は、総溶液重
量に基づいて少なくとも０．０５パーセントの濃度で緩
衝化溶液に提供される。一般的には、化合物の量は０．
０１〜５重量パーセントの範囲内であり、０．０５〜１
重量パーセントが好ましい。所望であれば、ヒドロキサ
ム酸類もしくは塩類の混合物が使用できる。
量に基づいて少なくとも０．０５パーセントの濃度で緩
衝化溶液に提供される。一般的には、化合物の量は０．
０１〜５重量パーセントの範囲内であり、０．０５〜１
重量パーセントが好ましい。所望であれば、ヒドロキサ
ム酸類もしくは塩類の混合物が使用できる。
【００１９】一般的には、本明細書に記載されるヒドロ
キサム酸もしくはアシルヒドラジンは、限定されるもの
ではないが、リン酸、３−（４−モルホリノ）プロパン
スルホン酸、２−（４−モルホリノ）エタンスルホン
酸、グリシン及び当業者に容易に明らかである別のもの
を包含する１つ以上の適当な緩衝剤を用いて、 pＨ６〜
１１に緩衝化される。
キサム酸もしくはアシルヒドラジンは、限定されるもの
ではないが、リン酸、３−（４−モルホリノ）プロパン
スルホン酸、２−（４−モルホリノ）エタンスルホン
酸、グリシン及び当業者に容易に明らかである別のもの
を包含する１つ以上の適当な緩衝剤を用いて、 pＨ６〜
１１に緩衝化される。
【００２０】一般的には、上記緩衝化組成物は、数多く
の別個に包装された試薬類、組成物類及び所定のアッセ
イに必要とされる装置を担持する使い捨て試験キットの
一部として供給される。しかしながら、緩衝化組成物が
それ自体により提供されるか又はアッセイ時に製造でき
る。
の別個に包装された試薬類、組成物類及び所定のアッセ
イに必要とされる装置を担持する使い捨て試験キットの
一部として供給される。しかしながら、緩衝化組成物が
それ自体により提供されるか又はアッセイ時に製造でき
る。
【００２１】試験キット中の特異的バインディング種
は、目的のリガンドと特異的に反応する生物学的もしく
は化学的供給源由来のいずれかの分子であることができ
る。例えば、これらの種は、アビジンもしくはそれらの
誘導体型、ビオチンもしくはそれらの誘導体型、抗体、
抗原材料、ハプテン、糖、レクチン又は当該技術分野で
理解される語であるレセプターを有する別の化学的もし
くは生物学的化合物であることができる。本発明に関連
して、また核酸が、この場合にリガンドとみなされる相
補的核酸と「複合体化」（又はハイブリダイゼーショ
ン）する特異的バインディング種として考慮される。
は、目的のリガンドと特異的に反応する生物学的もしく
は化学的供給源由来のいずれかの分子であることができ
る。例えば、これらの種は、アビジンもしくはそれらの
誘導体型、ビオチンもしくはそれらの誘導体型、抗体、
抗原材料、ハプテン、糖、レクチン又は当該技術分野で
理解される語であるレセプターを有する別の化学的もし
くは生物学的化合物であることができる。本発明に関連
して、また核酸が、この場合にリガンドとみなされる相
補的核酸と「複合体化」（又はハイブリダイゼーショ
ン）する特異的バインディング種として考慮される。
【００２２】好ましくは、試験キットに含まれる水溶性
ペルオキシダーゼ標識種が抗体である。好ましくは、上
記種が、いずれかの動物、植物、真菌もしくは細菌供給
源由来のペルオキシダーゼで標識される。
ペルオキシダーゼ標識種が抗体である。好ましくは、上
記種が、いずれかの動物、植物、真菌もしくは細菌供給
源由来のペルオキシダーゼで標識される。
【００２３】本発明方法は、目的の特異的バインディン
グリガンドを検出するのに使用できる。このようなリガ
ンドとしては、オリゴヌクレオチド類、核酸類、タンパ
ク質類、炭水化物類、リポ多糖類、ペプチド類、ポリペ
プチド類、多糖類、糖脂質類、糖タンパク質類及びこれ
らの材料のいずれかの成分が挙げられる。このようなリ
ガンドは、全血、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、脊
髄液、精漿、膣分泌物、痰、汗、便検体、組織調整物、
歯垢、唾液、歯肉溝流体及び精液を包含するいずれかの
ヒトもしくは動物の生物学的流体又は被検体中に検出で
きる。本発明は、唾液、歯垢、歯肉溝流体及び別の口腔
流体もしくは被検体中に見い出される歯周疾患に伴う微
生物の検出に特に有用である。
グリガンドを検出するのに使用できる。このようなリガ
ンドとしては、オリゴヌクレオチド類、核酸類、タンパ
ク質類、炭水化物類、リポ多糖類、ペプチド類、ポリペ
プチド類、多糖類、糖脂質類、糖タンパク質類及びこれ
らの材料のいずれかの成分が挙げられる。このようなリ
ガンドは、全血、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、脊
髄液、精漿、膣分泌物、痰、汗、便検体、組織調整物、
歯垢、唾液、歯肉溝流体及び精液を包含するいずれかの
ヒトもしくは動物の生物学的流体又は被検体中に検出で
きる。本発明は、唾液、歯垢、歯肉溝流体及び別の口腔
流体もしくは被検体中に見い出される歯周疾患に伴う微
生物の検出に特に有用である。
【００２４】より詳細には、微生物類、アクチノバシラ
ス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus
actinomycetemcomitans ）、ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Porphyromonas gingivalis）及びプレボテラ
・インターメディア（Prevotella intermedia）が、本
発明を用いて個別に又はひとまとめにして検出される。
ス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus
actinomycetemcomitans ）、ポルフィロモナス・ジンジ
バリス（Porphyromonas gingivalis）及びプレボテラ
・インターメディア（Prevotella intermedia）が、本
発明を用いて個別に又はひとまとめにして検出される。
【００２５】或る、核酸検出の感度を増強するために実
施できる有用な方法が、ポリメラーゼ・チェーン反応
（ＰＣＲ）として当該技術分野で既知である。一旦、こ
の方法により核酸が増幅されると、ペルオキシダーゼ標
識プローブの使用を包含する各種の検出手段が使用でき
る。次いで本発明を用いて調節できる適当な検出可能な
シグナルを提供するために、酵素標識が使用できる。
施できる有用な方法が、ポリメラーゼ・チェーン反応
（ＰＣＲ）として当該技術分野で既知である。一旦、こ
の方法により核酸が増幅されると、ペルオキシダーゼ標
識プローブの使用を包含する各種の検出手段が使用でき
る。次いで本発明を用いて調節できる適当な検出可能な
シグナルを提供するために、酵素標識が使用できる。
【００２６】本発明の実施に際して、生物学的被検体
（もしくはそれらより得られるリガンド）中の特異的バ
インディングリガンドは、リガンドに特異的な水溶性レ
セプターと反応する。レセプターは、上述のようにペル
オキシダーゼで標識される。酵素で標識された特異的バ
インディング複合体は、それによって生成される。典型
的には、複合体生成は溶液状態で起こるが、それが起こ
る容器もしくは反応ガマの型は臨界的ではない。幾つか
の場合では、溶菌もしくは別の抽出処理後に粗被検体中
に複合体が生成される。別の場合には、何らかの方法で
複合体を「捕捉」できる特定の支持体、プレートもしく
は膜上に複合体が生成される。
（もしくはそれらより得られるリガンド）中の特異的バ
インディングリガンドは、リガンドに特異的な水溶性レ
セプターと反応する。レセプターは、上述のようにペル
オキシダーゼで標識される。酵素で標識された特異的バ
インディング複合体は、それによって生成される。典型
的には、複合体生成は溶液状態で起こるが、それが起こ
る容器もしくは反応ガマの型は臨界的ではない。幾つか
の場合では、溶菌もしくは別の抽出処理後に粗被検体中
に複合体が生成される。別の場合には、何らかの方法で
複合体を「捕捉」できる特定の支持体、プレートもしく
は膜上に複合体が生成される。
【００２７】工程Ａの前に、同時にもしくは次いで特異
的バインディングリガンドが不溶化されるので、また、
得られる複合体も不溶化され、そして適当な方法で溶液
から取り除かれる。これは、アッセイのフォーマットが
何年にも亘って開発されてきた多種多様な形式であるこ
とができることを意味する。
的バインディングリガンドが不溶化されるので、また、
得られる複合体も不溶化され、そして適当な方法で溶液
から取り除かれる。これは、アッセイのフォーマットが
何年にも亘って開発されてきた多種多様な形式であるこ
とができることを意味する。
【００２８】或る態様では、特異的バインディングリガ
ンド（例えば、抽出された抗原）は、ポリマー、磁気も
しくはガラスの粒子類、濾過膜類、セルロース製フィル
ターペーパー類、固体ポリマーもしくは樹脂コートフィ
ルム類、ガラス製スライド類もしくは試験管の壁面、及
びガラスもしくはポリマーキュベット類並びに別の材料
を初めとする固体材料への直接吸着又は共有結合により
不溶化できる。一般的には、このようなアッセイは、特
異的バインディングリガンドが材料に直接結合する「直
接バインディング」アッセイとして当該技術分野で既知
であり、そしてペルオキシダーゼ標識レセプター分子
（例えば抗体）は不溶化されたリガンドと複合体化する
のに使用される。あるいは、レセプターは標識せずに、
次いでペルオキシダーゼで標識されかつ第一レセプター
に特異的である第二レセプターが使用できる。本発明の
好ましい態様は、抽出されたリガンドが異なる抗原決定
部位で、２つのレセプター分子の一方がペルオキシダー
ゼで標識されており、もう一方が固定化されている（又
は、例えばアビジン−ビオチン複合体化を介して固定化
できる）ような２つのレセプター分子と反応する。限定
されるものではないが、或るレセプターが固定化される
適当な材料としては、有機体より生成される粒状キャリ
アー材料、天然もしくは合成ポリマー類、ガラス、セラ
ミック類、珪藻土もしくは磁化可能な粒子類、マイクロ
タイタープレート類、ガラス製スライド類もしくは管
類、膜類、ポリマーもしくはセルロース製ペーパー類又
はフィルム類が挙げられる。好ましくは、粒状材料が用
いられる。これらの粒子は０．０１〜１０μｍの平均粒
子サイズを有する。
ンド（例えば、抽出された抗原）は、ポリマー、磁気も
しくはガラスの粒子類、濾過膜類、セルロース製フィル
ターペーパー類、固体ポリマーもしくは樹脂コートフィ
ルム類、ガラス製スライド類もしくは試験管の壁面、及
びガラスもしくはポリマーキュベット類並びに別の材料
を初めとする固体材料への直接吸着又は共有結合により
不溶化できる。一般的には、このようなアッセイは、特
異的バインディングリガンドが材料に直接結合する「直
接バインディング」アッセイとして当該技術分野で既知
であり、そしてペルオキシダーゼ標識レセプター分子
（例えば抗体）は不溶化されたリガンドと複合体化する
のに使用される。あるいは、レセプターは標識せずに、
次いでペルオキシダーゼで標識されかつ第一レセプター
に特異的である第二レセプターが使用できる。本発明の
好ましい態様は、抽出されたリガンドが異なる抗原決定
部位で、２つのレセプター分子の一方がペルオキシダー
ゼで標識されており、もう一方が固定化されている（又
は、例えばアビジン−ビオチン複合体化を介して固定化
できる）ような２つのレセプター分子と反応する。限定
されるものではないが、或るレセプターが固定化される
適当な材料としては、有機体より生成される粒状キャリ
アー材料、天然もしくは合成ポリマー類、ガラス、セラ
ミック類、珪藻土もしくは磁化可能な粒子類、マイクロ
タイタープレート類、ガラス製スライド類もしくは管
類、膜類、ポリマーもしくはセルロース製ペーパー類又
はフィルム類が挙げられる。好ましくは、粒状材料が用
いられる。これらの粒子は０．０１〜１０μｍの平均粒
子サイズを有する。
【００２９】特に有用な粒状材料は、例えば、ヨーロッ
パ特許第Ａ，０，３２３，６９２号明細書に記載される
ポリマービーズであり、それらは活性ハロ原子、活性化
２−置換エチルスホニルもしくはビニルスルホニル基を
担持する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーよ
り製造される。反応性カルボキシ基を担持する別の特に
有用な粒子が、ヨーロッパ特許第Ａ，０，４６６，２２
０号明細書に記載されている。
パ特許第Ａ，０，３２３，６９２号明細書に記載される
ポリマービーズであり、それらは活性ハロ原子、活性化
２−置換エチルスホニルもしくはビニルスルホニル基を
担持する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーよ
り製造される。反応性カルボキシ基を担持する別の特に
有用な粒子が、ヨーロッパ特許第Ａ，０，４６６，２２
０号明細書に記載されている。
【００３０】より好ましくは、上記固定化されたレセプ
ター類が、化学もしくは生物学的反応に不活性である微
孔質濾過膜上にコーティング又は付着されている。一般
的には、それは、形状もしくは機能を失うことなくそれ
に反応又は付着するように試薬に関して十分な完全性を
有する１つ以上の天然又は合成支持体で構成される。そ
れは、その上に生成される複合体から実質的にすべての
複合体化されていない材料を取り除くのに必要とされる
濾過に関して十分に孔質である。有用な膜材料として
は、孔質天然もしくは合成ポリマー類、焼結ガラス、ガ
ラスもしくはポリマーフィルム又は繊維の膜、セラミッ
ク材料、セルロース材料及び接着剤もしくはバインダー
材料と共に結合したビーズから成る粒状構造物が挙げら
れる。一般的には、膜は最長寸法での平均細孔サイズ
０．５〜５μｍを有する。
ター類が、化学もしくは生物学的反応に不活性である微
孔質濾過膜上にコーティング又は付着されている。一般
的には、それは、形状もしくは機能を失うことなくそれ
に反応又は付着するように試薬に関して十分な完全性を
有する１つ以上の天然又は合成支持体で構成される。そ
れは、その上に生成される複合体から実質的にすべての
複合体化されていない材料を取り除くのに必要とされる
濾過に関して十分に孔質である。有用な膜材料として
は、孔質天然もしくは合成ポリマー類、焼結ガラス、ガ
ラスもしくはポリマーフィルム又は繊維の膜、セラミッ
ク材料、セルロース材料及び接着剤もしくはバインダー
材料と共に結合したビーズから成る粒状構造物が挙げら
れる。一般的には、膜は最長寸法での平均細孔サイズ
０．５〜５μｍを有する。
【００３１】水不溶性レセプターは、膜の全表面上に亘
ってもしくはそれらの限定領域で膜と付着できる。それ
らは、塗膜に更なる完全さを提供するために、親水性バ
インダー類との混合物状で使用できる。
ってもしくはそれらの限定領域で膜と付着できる。それ
らは、塗膜に更なる完全さを提供するために、親水性バ
インダー類との混合物状で使用できる。
【００３２】膜は、アッセイにおいて手で支えて、それ
らの上に抽出されたリガンド及びレセプターの複合体化
に要する部位を提供できる。しかしながら、好ましくは
膜が使い捨て試験デバイス又は膜及びそれらを介して流
動される流体を保持するのに適する構成及び構造を有す
る物に設置又は取り付けられる。多くのこのような試験
デバイスが当該技術分野で既知である。特に有用な試験
デバイスは、商標 SURECELL （商標）試験デバイスのも
とでイーストマン・コダック・カンパニー（Eastman Ko
dak Company)により市販されているものである。
らの上に抽出されたリガンド及びレセプターの複合体化
に要する部位を提供できる。しかしながら、好ましくは
膜が使い捨て試験デバイス又は膜及びそれらを介して流
動される流体を保持するのに適する構成及び構造を有す
る物に設置又は取り付けられる。多くのこのような試験
デバイスが当該技術分野で既知である。特に有用な試験
デバイスは、商標 SURECELL （商標）試験デバイスのも
とでイーストマン・コダック・カンパニー（Eastman Ko
dak Company)により市販されているものである。
【００３３】一旦不溶化された複合体が生成されると、
本発明方法の次工程（工程Ｃ）は、複合体中のペルオキ
シダーゼ標識に応じて比色もしくは化学ルミネッセンス
シグナルを提供するのに適する組成物とそれを接触させ
る工程である。単に、このような組成物は、所望のシグ
ナルを提供するために、そこで反応するペルオキシダー
ゼの基質であることができる。より望ましくは、それ
が、シグナルを提供するために１つ以上の反応で機能す
る２つ以上の試薬である。ペルオキシダーゼにより触媒
されて色素もしくは化学ルミネッセンスシグナルを生成
する試薬を記載するかなりの従来技術文献が存在するの
で、必要とされる特定な試薬は当業者に容易に明らかで
あろう。一般的には、組成物は過酸化水素及びそれに応
じてシグナルを提供する化合物を包含する。あるいは、
ペルオキシダーゼが化学ルミネッセンスシグナルを提供
するために１つ以上の反応で使用できる。
本発明方法の次工程（工程Ｃ）は、複合体中のペルオキ
シダーゼ標識に応じて比色もしくは化学ルミネッセンス
シグナルを提供するのに適する組成物とそれを接触させ
る工程である。単に、このような組成物は、所望のシグ
ナルを提供するために、そこで反応するペルオキシダー
ゼの基質であることができる。より望ましくは、それ
が、シグナルを提供するために１つ以上の反応で機能す
る２つ以上の試薬である。ペルオキシダーゼにより触媒
されて色素もしくは化学ルミネッセンスシグナルを生成
する試薬を記載するかなりの従来技術文献が存在するの
で、必要とされる特定な試薬は当業者に容易に明らかで
あろう。一般的には、組成物は過酸化水素及びそれに応
じてシグナルを提供する化合物を包含する。あるいは、
ペルオキシダーゼが化学ルミネッセンスシグナルを提供
するために１つ以上の反応で使用できる。
【００３４】本発明の利点は、上記ヒドロキサム酸の組
成物を用いて生成されるシグナルの効果的な調節（変化
又は完全な停止）である。これは、シグナル生成が開始
した後、適する時間、シグナルを生成する複合体と組成
物を接触させることにより行われる。一般的には、この
接触は、色素シグナル生成開始後少なくとも２分間以内
に起こり、そして好ましくは６０〜７５秒後に起こる。
この時点で、色素シグナルは存在するが、その強度は増
強するのを止める。化学ルミネッセンスシグナルに関し
ては、組成物は複合体から光の生成を停止する。
成物を用いて生成されるシグナルの効果的な調節（変化
又は完全な停止）である。これは、シグナル生成が開始
した後、適する時間、シグナルを生成する複合体と組成
物を接触させることにより行われる。一般的には、この
接触は、色素シグナル生成開始後少なくとも２分間以内
に起こり、そして好ましくは６０〜７５秒後に起こる。
この時点で、色素シグナルは存在するが、その強度は増
強するのを止める。化学ルミネッセンスシグナルに関し
ては、組成物は複合体から光の生成を停止する。
【００３５】
【実施例】以下の例は、本発明の実施を具体的に説明す
るために挙げられるが、いずれかの方法に限定されるこ
とを意味するものではない。すべてのパーセンテージは
特に断らない限り重量パーセントである。
るために挙げられるが、いずれかの方法に限定されるこ
とを意味するものではない。すべてのパーセンテージは
特に断らない限り重量パーセントである。
【００３６】例についての材料及び方法 ３つの試験ウェル中に組み入れられた LOPRODYNE（商
標）ナイロン微孔質濾過膜（平均細孔サイズ１．２μ
ｍ）を含有する SURECELL （商標）使い捨て試験デバイ
スを用いた。膜は、いずれか更なる処理を施すことなく
用いた。
標）ナイロン微孔質濾過膜（平均細孔サイズ１．２μ
ｍ）を含有する SURECELL （商標）使い捨て試験デバイ
スを用いた。膜は、いずれか更なる処理を施すことなく
用いた。
【００３７】色素提供性組成物は、４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−
ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．０
０８％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸
ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル、 pＨ6.8 ）、過酸化
水素（１０ミリモル）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ミリモル）及びジエチレントリアミン五酢酸（１
０マイクロモル）を含むように製造した。
メトキシフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−
ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．０
０８％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸
ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル、 pＨ6.8 ）、過酸化
水素（１０ミリモル）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ミリモル）及びジエチレントリアミン五酢酸（１
０マイクロモル）を含むように製造した。
【００３８】三種の微生物、アクチノバシラス・アクチ
ノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomyce
temcomitans)（Ａ．a.) 、プレボテラ・インターメディ
ア（Prevotella intermedia）（Ｐ.i.)及びポルフィロ
モナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）
（Ｐ．g.）の各々に対して向けられたポリクロナール抗
体を、ウサギの静脈内注射により生成した。一般的に
は、この方法は、最初に免疫化量の抗原をウサギに注射
する工程、次いで第一回目の注射後２日間〜１４日間の
間に促進量の抗原をその動物に注射する工程を包含し
た。第一回目の注射後の第１５日目から始まって、少な
くとも７日間単位で４回の期間、少なくとも７日毎に３
回、促進量の抗原をウサギに注射した。最終の促進量の
抗原の注射後、抗血清をウサギから採取した。ＩｇＧ画
分を硫酸アンモニウム沈降により生成し、そしてリン酸
緩衝溶液（０．３〜０．４％溶液）中４℃で保存した。
単離体を嫌気性プレート上で継代培養した。微生物は、
以下の寄託番号、Ａ．a.（血清型Ａ，Ｂ及びＣ）に関し
ては ATCC 43717, ATCC 43718 及び ATCC 43719 、Ｐ．
i.（血清型Ａ，Ｂ及びＣ）に関しては ATCC 25611, NCT
C 9336及び ATCC 49046 、並びにＰ．g.（血清型Ａ，Ｂ
及びＣ）に関しては ATCC 33277, 53978及び 53977によ
り同定されるものである。
ノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomyce
temcomitans)（Ａ．a.) 、プレボテラ・インターメディ
ア（Prevotella intermedia）（Ｐ.i.)及びポルフィロ
モナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）
（Ｐ．g.）の各々に対して向けられたポリクロナール抗
体を、ウサギの静脈内注射により生成した。一般的に
は、この方法は、最初に免疫化量の抗原をウサギに注射
する工程、次いで第一回目の注射後２日間〜１４日間の
間に促進量の抗原をその動物に注射する工程を包含し
た。第一回目の注射後の第１５日目から始まって、少な
くとも７日間単位で４回の期間、少なくとも７日毎に３
回、促進量の抗原をウサギに注射した。最終の促進量の
抗原の注射後、抗血清をウサギから採取した。ＩｇＧ画
分を硫酸アンモニウム沈降により生成し、そしてリン酸
緩衝溶液（０．３〜０．４％溶液）中４℃で保存した。
単離体を嫌気性プレート上で継代培養した。微生物は、
以下の寄託番号、Ａ．a.（血清型Ａ，Ｂ及びＣ）に関し
ては ATCC 43717, ATCC 43718 及び ATCC 43719 、Ｐ．
i.（血清型Ａ，Ｂ及びＣ）に関しては ATCC 25611, NCT
C 9336及び ATCC 49046 、並びにＰ．g.（血清型Ａ，Ｂ
及びＣ）に関しては ATCC 33277, 53978及び 53977によ
り同定されるものである。
【００３９】各微生物（血清型Ａ，Ｂ及びＣのすべて）
に特異的な抗体を、ヨーロッパ特許第Ａ，０，３２３，
６９２号明細書の製造方法を用いて製造されたポリ〔ス
チレン−コ−４−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕（モル比９５．５：４．５）のポリマー
粒子（平均直径１μｍ）に対して共有結合せしめること
により、水不溶性試薬を製造した。抗体（Ｐ．g.につい
て０．７５mg／mL、総血清型、並びにＡ．a.及びＰ．i.
について０．２５mg／mL、総血清型）を、試験管中のホ
ウ酸塩緩衝剤（０．０５モル、 pＨ８．５）の溶液に添
加してよく混合することにより、共有結合は達成され
た。ポリマー粒子（３％固体）を緩衝化混合物に添加
し、そして粒子に抗体を共有結合させるまで、室温で４
〜２４時間、得られた懸濁液を転倒回転した。次いで懸
濁液を２８００rpm で１０分間遠心分離にかけた。上清
を取り除き、そしてペレットをメルチオレート（商標）
（０．０１％）を含有するグリシン緩衝剤（０．１％、
pＨ８．５）に懸濁せしめた。
に特異的な抗体を、ヨーロッパ特許第Ａ，０，３２３，
６９２号明細書の製造方法を用いて製造されたポリ〔ス
チレン−コ−４−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕（モル比９５．５：４．５）のポリマー
粒子（平均直径１μｍ）に対して共有結合せしめること
により、水不溶性試薬を製造した。抗体（Ｐ．g.につい
て０．７５mg／mL、総血清型、並びにＡ．a.及びＰ．i.
について０．２５mg／mL、総血清型）を、試験管中のホ
ウ酸塩緩衝剤（０．０５モル、 pＨ８．５）の溶液に添
加してよく混合することにより、共有結合は達成され
た。ポリマー粒子（３％固体）を緩衝化混合物に添加
し、そして粒子に抗体を共有結合させるまで、室温で４
〜２４時間、得られた懸濁液を転倒回転した。次いで懸
濁液を２８００rpm で１０分間遠心分離にかけた。上清
を取り除き、そしてペレットをメルチオレート（商標）
（０．０１％）を含有するグリシン緩衝剤（０．１％、
pＨ８．５）に懸濁せしめた。
【００４０】上記試薬のコーティング懸濁液（０．３５
％固体）を、グリシン緩衝剤（０．１モル、 pＨ８．
５）中、ポリアクリルアミドバインダー（５％）、 TWE
EN（商標）２０非イオン界面活性剤（０．１％）、メル
チオレート（商標）（０．０１％）及び UVITEX （商
標）蛍光増白剤（０．０００５％、Ciba−Geigy ）を有
するように製造した。別個の抗原に向けられた各試薬
を、上記試験デバイスにおける膜の限定領域に塗布し
た。
％固体）を、グリシン緩衝剤（０．１モル、 pＨ８．
５）中、ポリアクリルアミドバインダー（５％）、 TWE
EN（商標）２０非イオン界面活性剤（０．１％）、メル
チオレート（商標）（０．０１％）及び UVITEX （商
標）蛍光増白剤（０．０００５％、Ciba−Geigy ）を有
するように製造した。別個の抗原に向けられた各試薬
を、上記試験デバイスにおける膜の限定領域に塗布し
た。
【００４１】Yoshitake他、Eur. J. Biochem.，101 ，3
95, 1979 の方法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ
に結合した各微生物に向けられた抗体を用いて、酵素−
抗体結合体を製造した。結合体を含んで成る各結合体組
成物（各々１mL当り５．６〜１１．２５μg ）を、カゼ
イン（０．０５％、０．０５モル リン酸緩衝溶液への
１％溶液より、 pＨ７）、 TWEEN（商標）２０非イオン
界面活性剤（０．３％）、メルチオレート（商標）
（０．０１％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（１
０ミリモル）及び LONZAINE （商標）Ｃ両性界面活性剤
（０．００３５％、Lonza Corp.)の溶液に添加した。
Ａ．a.（すべての血清型）及びＰ．g.（すべての血清
型）について特異的な抗体の量は７．５μg ／mLであっ
た。Ｐ．i.（血清型Ａ及びＣ）についての量は５．６μ
g ／mLであり、血清型Ｂについての量は１１．２５μg
／mLであった。
95, 1979 の方法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ
に結合した各微生物に向けられた抗体を用いて、酵素−
抗体結合体を製造した。結合体を含んで成る各結合体組
成物（各々１mL当り５．６〜１１．２５μg ）を、カゼ
イン（０．０５％、０．０５モル リン酸緩衝溶液への
１％溶液より、 pＨ７）、 TWEEN（商標）２０非イオン
界面活性剤（０．３％）、メルチオレート（商標）
（０．０１％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（１
０ミリモル）及び LONZAINE （商標）Ｃ両性界面活性剤
（０．００３５％、Lonza Corp.)の溶液に添加した。
Ａ．a.（すべての血清型）及びＰ．g.（すべての血清
型）について特異的な抗体の量は７．５μg ／mLであっ
た。Ｐ．i.（血清型Ａ及びＣ）についての量は５．６μ
g ／mLであり、血清型Ｂについての量は１１．２５μg
／mLであった。
【００４２】使用した洗浄溶液は、カゼイン（０．５
％）及びメルチオレート（商標）（０．０１％）を含有
するグリシン緩衝剤（０．１モル、 pＨ１０）中、TERG
ITOL（商標）４アニオン界面活性剤（１．３５％）を含
んで成った。
％）及びメルチオレート（商標）（０．０１％）を含有
するグリシン緩衝剤（０．１モル、 pＨ１０）中、TERG
ITOL（商標）４アニオン界面活性剤（１．３５％）を含
んで成った。
【００４３】抗原抽出は、グリシン緩衝剤（０．１モ
ル、 pＨ８．５）への、 EMCOL（商標）CC−９カチオン
界面活性剤（５％、Witco Chemical Co.）及びドデシル
硫酸ナトリウム（５％）の溶液を用いて達成された。
ル、 pＨ８．５）への、 EMCOL（商標）CC−９カチオン
界面活性剤（５％、Witco Chemical Co.）及びドデシル
硫酸ナトリウム（５％）の溶液を用いて達成された。
【００４４】例１ 色素シグナルを調節又は停止するた
めの各種組成物の使用 本例は、本発明の実施及びペルオキシダーゼ標識抗体を
用いる色素シグナルの生成を調節するためのベンゾヒド
ロキサム酸の使用を具体的に示すものである。
めの各種組成物の使用 本例は、本発明の実施及びペルオキシダーゼ標識抗体を
用いる色素シグナルの生成を調節するためのベンゾヒド
ロキサム酸の使用を具体的に示すものである。
【００４５】抽出及びアッセイプロトコール 抗原抽出は、微生物被検体を上記抽出溶液（４５０μL
）と室温で約１分間混合することにより達成した。最
終溶液中の細胞の量は、Ｐ．g.について７×１０ 5 細胞
数／mLであった。
）と室温で約１分間混合することにより達成した。最
終溶液中の細胞の量は、Ｐ．g.について７×１０ 5 細胞
数／mLであった。
【００４６】上記抽出方法により提供された抽出物のサ
ンプル（４５０μL ）を、上記使い捨て試験デバイスの
各試験ウェルに添加することにより、アッセイを実施し
た。膜上で抽出された抗原が免疫学的試薬（抗体を含有
する）と複合体を生成するように、流体を試験ウェル中
の膜を介して流し入れた。
ンプル（４５０μL ）を、上記使い捨て試験デバイスの
各試験ウェルに添加することにより、アッセイを実施し
た。膜上で抽出された抗原が免疫学的試薬（抗体を含有
する）と複合体を生成するように、流体を試験ウェル中
の膜を介して流し入れた。
【００４７】直ちに、ペルオキシダーゼ及び抗体の結合
体（８０μL ）を試験ウェルに添加し、室温で約２分間
インキュベーションすることにより、サンドウイッチ複
合体生成を促進せしめた。次いで、各試験ウェルを洗浄
溶液（約５００μL ）で半分程満たし、次いでそれらは
膜を介して流れていった。これを、もう一度繰り返し
た。
体（８０μL ）を試験ウェルに添加し、室温で約２分間
インキュベーションすることにより、サンドウイッチ複
合体生成を促進せしめた。次いで、各試験ウェルを洗浄
溶液（約５００μL ）で半分程満たし、次いでそれらは
膜を介して流れていった。これを、もう一度繰り返し
た。
【００４８】最終洗浄後、色素提供性組成物（１２０μ
L ）を各試験ウェルに添加し、続いて室温で１分間イン
キュベーションした。このインキュベーション期間の終
点で、「停止」溶液を添加して色素シグナルの生成を調
節し、そしてシグナルを、１０が最高濃度を表す１〜１
０の濃度値を有するカラースコアカードと比較すること
により、それを目視的に評価した。また、濃度スコア
は、全く色素が出現しない膜上でのバックグラウンドに
対して付与される。
L ）を各試験ウェルに添加し、続いて室温で１分間イン
キュベーションした。このインキュベーション期間の終
点で、「停止」溶液を添加して色素シグナルの生成を調
節し、そしてシグナルを、１０が最高濃度を表す１〜１
０の濃度値を有するカラースコアカードと比較すること
により、それを目視的に評価した。また、濃度スコア
は、全く色素が出現しない膜上でのバックグラウンドに
対して付与される。
【００４９】評価された「停止」溶液は、以下のとおり
であった。 対照Ａ：リン酸緩衝溶液（０．０５モル、 pＨ７．３）
中にアジ化ナトリウム（０．１％）。 対照Ｂ：３−（４−モルホリノ）プロパンスルホン酸
（１モル、 pＨ７）中にアジ化ナトリウム（０．１
％）。 対照Ｃ：２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（１
モル、 pＨ６）中にアジ化ナトリウム（０．１％）。 対照Ｄ：３−（４−モルホリノ）プロパンスルホン酸
（１モル、 pＨ７）中にアジ化ナトリウム（１％）。 対照Ｅ：２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（１
モル、 pＨ６）中にアジ化ナトリウム（１％）。 対照Ｆ：クエン酸（１モル、 pＨ４）。 対照Ｇ：クエン酸（１モル、 pＨ３）。 対照Ｈ：クエン酸（１モル、 pＨ２）。 対照Ｉ：エタノールアミン（１モル、 pＨ１０）。 対照Ｊ：エタノールアミン（１モル、 pＨ１１）。 対照Ｋ：２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（１
モル、 pＨ６）中に、アジ化ナトリウム（０．１％）、
ポリ（ビニルピロリドン）（６．２５％）及びTERGITOL
（商標）４アニオン界面活性剤（０．１％）。 例１：リン酸緩衝溶液（０．０５モル、 pＨ７．３）中
にベンゾヒドロキサム酸（０．１％）。
であった。 対照Ａ：リン酸緩衝溶液（０．０５モル、 pＨ７．３）
中にアジ化ナトリウム（０．１％）。 対照Ｂ：３−（４−モルホリノ）プロパンスルホン酸
（１モル、 pＨ７）中にアジ化ナトリウム（０．１
％）。 対照Ｃ：２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（１
モル、 pＨ６）中にアジ化ナトリウム（０．１％）。 対照Ｄ：３−（４−モルホリノ）プロパンスルホン酸
（１モル、 pＨ７）中にアジ化ナトリウム（１％）。 対照Ｅ：２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（１
モル、 pＨ６）中にアジ化ナトリウム（１％）。 対照Ｆ：クエン酸（１モル、 pＨ４）。 対照Ｇ：クエン酸（１モル、 pＨ３）。 対照Ｈ：クエン酸（１モル、 pＨ２）。 対照Ｉ：エタノールアミン（１モル、 pＨ１０）。 対照Ｊ：エタノールアミン（１モル、 pＨ１１）。 対照Ｋ：２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸（１
モル、 pＨ６）中に、アジ化ナトリウム（０．１％）、
ポリ（ビニルピロリドン）（６．２５％）及びTERGITOL
（商標）４アニオン界面活性剤（０．１％）。 例１：リン酸緩衝溶液（０．０５モル、 pＨ７．３）中
にベンゾヒドロキサム酸（０．１％）。
【００５０】下記第Ｉ表は、「停止」溶液添加後の、非
特異的バインディングによる色素発色が認められた時間
（分）を示す。これは、複合体より解離した膜の領域に
おける標識抗体の望ましくないバインディングである。
本発明のベンゾヒドロキサム酸を含有する「停止」溶液
が、非特異的バインディング由来の色素シグナルが認め
られる前に、最も長い時間を提供したことが認められ
る。
特異的バインディングによる色素発色が認められた時間
（分）を示す。これは、複合体より解離した膜の領域に
おける標識抗体の望ましくないバインディングである。
本発明のベンゾヒドロキサム酸を含有する「停止」溶液
が、非特異的バインディング由来の色素シグナルが認め
られる前に、最も長い時間を提供したことが認められ
る。
【００５１】
【表１】
【００５２】下記第II表は、所定期間後に色素シグナル
の生成後、非特異的バインディングにより影響を受ける
膜の領域を定量するものである。「１＋」〜「４＋」の
値は、膜上の色素シグナルの出現領域における強度及び
サイズを表し、１＋の値は膜の小さな部分が低い色素シ
グナルの影響を受けることを表し、そして４＋の値は全
ての膜が非常に高い色素シグナルを有することを表す。
これらのデータは、本発明のみが、全試験期間（１時
間）に亘って全く望ましくない色素シグナルを一貫して
提供しなかったことを示す。
の生成後、非特異的バインディングにより影響を受ける
膜の領域を定量するものである。「１＋」〜「４＋」の
値は、膜上の色素シグナルの出現領域における強度及び
サイズを表し、１＋の値は膜の小さな部分が低い色素シ
グナルの影響を受けることを表し、そして４＋の値は全
ての膜が非常に高い色素シグナルを有することを表す。
これらのデータは、本発明のみが、全試験期間（１時
間）に亘って全く望ましくない色素シグナルを一貫して
提供しなかったことを示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】下記第 III表は、所定の「停止」溶液につ
いて所定の期間後、Ｐ．g.（血清型Ｂ、７×１０5 細胞
数／mL）の存在に応じて発生する色素シグナルを示す。
アッセイは、１５分後に最も適する色素シグナルを提供
する本発明に従って実施した。色素シグナルは、１０が
最高色素濃度を表す１〜１０のスケールにより評価し
た。
いて所定の期間後、Ｐ．g.（血清型Ｂ、７×１０5 細胞
数／mL）の存在に応じて発生する色素シグナルを示す。
アッセイは、１５分後に最も適する色素シグナルを提供
する本発明に従って実施した。色素シグナルは、１０が
最高色素濃度を表す１〜１０のスケールにより評価し
た。
【００５５】
【表３】
【００５６】要するに、データは、本発明に従って色素
シグナルを調節又は停止するためのベンゾヒドロキサム
酸の使用が極めて好結果であることを示す。それは、色
素シグナルを長期間安定化されるのみならず、思いがけ
なくシグナルが発生する膜を介して試薬の逆流により生
じるバックグラウンドシグナルを取り除く。より小さな
バックグラウンド及びより安定なシグナルによって、こ
れは、本アッセイの使用者に、色素シグナルを評価する
のに十分な時間を与え、そして半定量的な結果を提供す
る。
シグナルを調節又は停止するためのベンゾヒドロキサム
酸の使用が極めて好結果であることを示す。それは、色
素シグナルを長期間安定化されるのみならず、思いがけ
なくシグナルが発生する膜を介して試薬の逆流により生
じるバックグラウンドシグナルを取り除く。より小さな
バックグラウンド及びより安定なシグナルによって、こ
れは、本アッセイの使用者に、色素シグナルを評価する
のに十分な時間を与え、そして半定量的な結果を提供す
る。
【００５７】
【発明の効果】本発明は、特異的バインディングアッセ
イにおける酵素的反応により提供される比色もしくは化
学ルミネッセンスシグナルの生成を調節又は停止するの
に有効な方法を提供する。この有効性は、ペルオキシダ
ーゼが関与する酵素である場合に、特に顕著である。微
孔質膜で実施されるアッセイでは、膜上もしくは膜より
上での試薬由来の比色シグナル又は膜を介して逆流する
試薬由来の比色シグナルは、実質的に取り除かれる。こ
れらの利点は、上述のように、ペルオキシダーゼ標識を
担持する不溶化された特異的バインディング複合体を、
ヒドロキサム酸もしくはアシルシドラジンと接触させる
ことにより達成される。使用される酸の濃度に依存し
て、酵素とその基質との酵素的反応からのシグナルの生
成は、完全に停止できるか又は反応速度を調節して遅く
できる。
イにおける酵素的反応により提供される比色もしくは化
学ルミネッセンスシグナルの生成を調節又は停止するの
に有効な方法を提供する。この有効性は、ペルオキシダ
ーゼが関与する酵素である場合に、特に顕著である。微
孔質膜で実施されるアッセイでは、膜上もしくは膜より
上での試薬由来の比色シグナル又は膜を介して逆流する
試薬由来の比色シグナルは、実質的に取り除かれる。こ
れらの利点は、上述のように、ペルオキシダーゼ標識を
担持する不溶化された特異的バインディング複合体を、
ヒドロキサム酸もしくはアシルシドラジンと接触させる
ことにより達成される。使用される酸の濃度に依存し
て、酵素とその基質との酵素的反応からのシグナルの生
成は、完全に停止できるか又は反応速度を調節して遅く
できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブライアン アンソニー スナイダー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14626, ロチェスター，ハーベスト ドライブ 226 (72)発明者 トーマス ロバート キッセル アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，ウィロウッド ドライブ 200
Claims (1)
- 【請求項１】 Ａ．特異的バインディングリガンドを、
上記リガンドに特異的である水溶性ペルオキシダーゼ標
識レセプターと反応させる工程、 Ｂ．工程Ａの前、それと同時に、又はそれに続けて、特
異的バインディングリガンドを不溶化させて、不溶化さ
れた特異的バインディング複合体を提供する工程、 Ｃ．不溶化された複合体を、ペルオキシダーゼに応じた
比色もしくは化学ルミネッセンスシグナルを与えるため
の組成物と接触させる工程、並びに Ｄ．不溶化された複合体を、少なくとも０．０５重量パ
ーセントの次式 Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ′ （上式中、Ｒは、芳香核内炭素原子数６〜１０個のアリ
ール、炭素原子数１〜７個のアルキル、環内炭素原子数
５〜１０個のシクロアルキルもしくは環内原子の少なく
とも１つが酸素、窒素もしくは硫黄原子である環内原子
数５〜１０個の芳香族複素環であり、そしてＲ′は、ヒ
ドロキシもしくはアミノである）で示される化合物又は
それらの等価塩を含む組成物と接触させることにより、
前記比色もしくは化学ルミネッセンスシグナルを与える
生成物の生成を実質的に停止させる工程、 を含んで成る特異的バインディングリガンドの検出方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77306391A | 1991-10-08 | 1991-10-08 | |
| US773063 | 1991-10-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219990A JPH05219990A (ja) | 1993-08-31 |
| JP2515954B2 true JP2515954B2 (ja) | 1996-07-10 |
Family
ID=25097095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4268361A Expired - Lifetime JP2515954B2 (ja) | 1991-10-08 | 1992-10-07 | 特異的バインディングリガンドの検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5460946A (ja) |
| EP (1) | EP0537826B1 (ja) |
| JP (1) | JP2515954B2 (ja) |
| AU (1) | AU2114992A (ja) |
| CA (1) | CA2077015A1 (ja) |
| DE (1) | DE69216356T2 (ja) |
| FI (1) | FI924546A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5455176A (en) * | 1994-03-14 | 1995-10-03 | University De Montreal | Microbial contamination test device |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3427381A (en) * | 1966-11-23 | 1969-02-11 | Procter & Gamble | Oral compositions for retarding dental plaque formation comprising benzohydroxamic acid |
| US3480392A (en) * | 1967-08-24 | 1969-11-25 | Sinclair Research Inc | Hydroxylamine solutions stabilized with a hydroxamic acid and method for their preparation |
| JPS54141763A (en) * | 1978-04-22 | 1979-11-05 | Asahi Chem Ind Co Ltd | O-(maleimidoacyl)hydroxamic acid derivative |
| JPS61126010A (ja) * | 1984-11-20 | 1986-06-13 | Lion Corp | 口腔用組成物 |
| US4737457A (en) * | 1986-02-26 | 1988-04-12 | Eastman Kodak Company | Analytical composition, element and method for the determination of hydrogen peroxide |
| US5017474A (en) * | 1988-02-12 | 1991-05-21 | Eastman Kodak Company | Wash solution, test kit and method for the determination of an immunological ligand |
| CA2028681A1 (en) * | 1990-01-22 | 1991-07-23 | Brian A. Snyder | Differentiation of microorganisms associated with periodontal diseases, article and kit useful therein |
-
1992
- 1992-08-20 AU AU21149/92A patent/AU2114992A/en not_active Abandoned
- 1992-08-27 CA CA002077015A patent/CA2077015A1/en not_active Abandoned
- 1992-10-03 EP EP92203042A patent/EP0537826B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-03 DE DE69216356T patent/DE69216356T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-07 JP JP4268361A patent/JP2515954B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-08 FI FI924546A patent/FI924546A/fi unknown
-
1993
- 1993-04-06 US US08/043,246 patent/US5460946A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69216356T2 (de) | 1997-07-17 |
| AU2114992A (en) | 1993-04-22 |
| FI924546A0 (fi) | 1992-10-08 |
| DE69216356D1 (de) | 1997-02-13 |
| JPH05219990A (ja) | 1993-08-31 |
| CA2077015A1 (en) | 1993-04-09 |
| EP0537826A1 (en) | 1993-04-21 |
| EP0537826B1 (en) | 1997-01-02 |
| US5460946A (en) | 1995-10-24 |
| FI924546A (fi) | 1993-04-09 |
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