JPH01100453A - 染料供給性組成物、診断試験キットおよびペルオキシダーゼ標識レセプターを用いるリガンドの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、過酸化水素およびペルオキシダーゼのような
過酸化物作用性（ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ）物質の存
在下で染料を供給するイミダゾール系ロイコ染料を含ん
でなる染料供給性組成物に関する。また、本発明は、こ
の組成物を含む試験キット並びに前記染料供給性組成物
およびリガンドに対するペルオキシダーゼ標識レセプタ
ーを用いるリガンド測定方法に関する。本発明は、診断
手段にとって有用である。

〔従来の技術〕

低濃度で生物学的流体に存在する生物学的な物質の迅速
かつ正確な測定のための診療、調査および診断方法は、
依然として必要性がある。例えば、血液、尿、唾液、腔
分泌物、精液および他の生物学的流体における医薬、麻
薬、ホルモン、ステロイド、ポリペプチド、プロスタグ
ランデインまたは感染性の生物の存在は、適切な診断ま
たは処置のためには正確かつ迅速公方法で測定しなけれ
ばならない。

かかる測定を実施するために、検出される物質（本明細
書では「リガンド」という）および該物質と特異的に反
応するレセプター間の特異的な結合反応を利用する生物
学的な物質の単離および同定のための多様な方法が提案
されている。放射性、蛍光または酵素標識が、得られる
反応複合体を測定するために使用されてきた。最近では
、酵素標識の使用が、放射性および蛍光標識の使用に対
して種々の利点があることからますます多くの注目を集
めている。酵素標識を用いるアッセイは、当該技術分野
で競合的エンザイムイムノアフセイ（ＥＩＡ）並びに直
接的および間接的な酵素結合性イ　゛ムノソルベントア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）として知られているものを包含す
る。

開発されている別の種類のアッセイは、当該技術分野で
イムノメトリックまたは“サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉ
ｃｈ）”アッセイとして知られている。かかるアッセイ
は、リガンド（例えば、抗原）を妨害しない方法でかつ
別のエピトープ部位で標識化合物に結合した２以上のレ
セプター分子（例えば、抗体）で“はさみ込んだもの（
ｓａｎｄｗｉｃｈｉｎｇ）”を含む、殆どのサンドイッ
チアッセイでは、１以上のレセプター分子が不溶性担体
、例えば小粒子、膜、プレート、または類似の対象物上
に適当に固定化されておＤ、そして他のレセプターは、
例えば酵素により適当に標識されている。

ペルオキシダーゼは、すべての種類の特異的パインディ
ングアッセイを包含するいろいろなアッセイに標識とし
て用いられている酵素の一つである。ペルオキシダーゼ
は、基質としての過酸化水素に作用し、種々の色原体ま
たは染料供給性物質を酸化して、存在するペルオキシダ
ーゼの量に比例した検出可能な種を与えることができる
。多様な染料供給性物質が、当該技術分野で既知であＤ
、ベンジジンおよびそれらの誘導体を包含している。

米国特許筒４，５９６．７７０号明細書には、テトラア
ルキルベンジジンがイムノアッセイのペルオキシダーゼ
標識抗体を伴う染料供給性組成物としてのＮ−メチルピ
ロリドンと一緒に使用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

かかる組成、物は、調製して直ちに溶液アッセイに使用
される場合には有用であるとは言え、テトラアルキルベ
ンジジンの使用は、リガンドが試験液中に低濃度で存在
するような一定のアッセイでは十分な感度を示さないこ
とがわかっている。また、ベンジジン組成物は、かなり
不安定でもある。

さらに、濾過膜を用いて実施される一定のアッセイでは
、テトラメチルベンジジンのようなテトラアルキルベン
ジジンに由来する染料が水溶性であＤ、その他意図する
ところとは無関係に膜を通過する場合があるので、膜を
前処理しなければならない。長期貯蔵のためのキット状
にパッケージ化することができるより安定な染料供給性
組成物を入手することは有用であろう。また、医院や家
庭を含む多様な環境下で使用することを目的として販売
し得る、より感度の高い診断方法を入手することも要望
されるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

上記した課題は、水溶性または水分散性ポリマー、並び
に過酸化水素および過酸化物作用性物質の存在下で染料
を供給し得るイミダゾール系ロイコ染料を含んでなＤ、
前記ポリマー対前記ロイコ染料の重量圧が１０．０００
　：　１〜１００：１で、かつ前記ポリマーがビニルピ
ロリドンの重合体、アクリルアミドの重合体、アクリル
酸の重合体、メタクリル酸の重合体、ポリエチレングリ
コールまたはポリアミンである染料供給性組成物によっ
て解決される。

さらに本発明が提供するのは、ペルオキシダーゼの触媒
作用に由来する被分析物の測定のための診断試験キット
であって、 （ａ）ペルオキシダーゼに対する基質、および（ｂ）前
記の染料供給性組成物を含んでなる前記キットである。

またさらに、 Ａ、リガンドに対するペルオキシダーゼ標識レセプター
と、液体試料を接触させてレセプターとりガントの反応
生成物を形成し、 Ｂ、接触段階（Ａ）より前にか、それと同時にか、また
はその後に、前記の染料供給性組成物と液体試料を接触
し、 Ｃ０接触段階（Ｂ）より前にか、それと同時にか、また
はその後に、未反応物質から前記反応生成物を分離し、
そして Ｄ、前記反応生成物の存否を測定すること、を含んでな
る水溶液におけるリガンドの測定方法も本発明により提
供される。

〔実施の態様〕

本発明の組成物は、ペルオキシダーゼのような過酸化物
作用性物質および過酸化水素の存在下で染料を供給する
ことにより有用である。本発明の組成物は、過酸化水素
またはペルオキシダーゼ、あるいは１以上の反応により
反応して過酸化水素を生ずるすべての被分析物の測定に
使用することができる。例えば、組成物は、一連の反応
にペルオキシダーゼが使用される場合に、被分析物の存
在の結果として検出可能な種を生ずるグルコース、ガラ
クトース、アミノ酸、尿酸、トリグリセリド、タレアチ
ンキナーゼ（そのものまたはそれらのアイソザイム）、
コレステロールおよび当該技術分野で既知のその他のも
のの如き被分析物のアッセイに有利に用いることができ
る。好ましくは、本発明の組成物は、以下により詳細に
記載されるように、イムノアッセイのような特異的なパ
インディング（ｂｉｎｄｉｎｇ）反応を伴うアッセイに
おいて使用される。

本発明の組成物は、１以上の水溶性または水分散性ポリ
マー、例えばビニルピロリドンの重合体、アクリルアミ
ドの重合体、アクリル酸の重合体、メタクリル酸の重合
体、ポリエチレングリコールおよびポリアミン類を含む
。これらのポリマーは、ホモポリマーかコポリマーのい
ずれであってもよい。限定されるものでないが、有用な
ポリマーの代表例としては、ポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、コポリ　（アクリル酸−アクリル酸メチル）
（重量比、９０：１０）、ポリアクリルアミド、コポリ
　（アクリルアミド−アクリル酸）（重量比、５０：５
０）、米国特許第３．７０２．２４９号明細書および同
第４．６８９．３５９号明細書に記載されているものの
ようなポリアミン類が挙げられる。これらのポリマーは
、水溶液におけるロイコ染料の維持を容易にし、ならび
に濾過膜のような支持体上に、その膜の前処理を要する
ことなく得られる染料の固定化を促進する。

また、これらのポリマーは、本発明の機能またはロイコ
染料を妨害しない他のエチレン系不飽和重合性モノマー
を少量（即ち、５０モル％未満）含むこともできる。殊
に、ポリビニルピロリドンが好ましいポリマーである。

また、本発明の組成物は、過酸化水素および過酸化物作
用性物質の存在下で染料を供給し得る１以上のロイコ染
料も含む。得られる染料は、一般に電磁スペクトラムの
可視領域（通常４００〜７００ｎｍ）で検出できる。好
ましくは、染料は５００〜６５０ｎｍで測定される。

本発明において有用なイミダゾール系ロイコ染料は、ジ
アリールイミダゾール系ロイコ染料であるか、またはト
リアリールイミダゾール系ロイコ染料である。数多くの
有用な化合物は、当該技術分野で既知であＤ、米国特許
第４，０８９．７４７号明細書並びにそこに引用されて
いるヨーロッパ特許出願公開第１２２．６４１号公報お
よび特開昭５８−４５，５５７号公報に記載されている
ものが含まれる。

次の一般式 （上式中、Ｒ１，ＲｔおよびＲ３は、それらの少な（と
も１つが、炭素原子数１８以下のオルソまたはパラ−ヒ
ドロキシ置換アリール基であるような有ａ基であＤ、他
の２つの基は、炭素をベースにした電極を用いる標識カ
ロメル電極に対してサイクリック・ボルタンミトリー（
ｃｙｃｌｉｃ　ｖｏｌｔａｍ−ｍｅ　ｔｒｙ）により測
定した場合に、イミダゾール酸化電位が一７０〜＋１１
０ｍＶであるように選ばれる了り−ル基である。）で示
されるトリアリールイミダゾール類が特に有用である。

なお、酸化電位の測定は、通常の電気化学的な手段（例
えば、Ｓａｗｙｅｒ等、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｓ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、１９７４　、参照）に従い行うことができる。好ま
しいトリアリールイミダゾール化合物類およびそれらの
製造方法のより詳細は、米国特許第４．０８９．７４７
号明細書に示されている。

具体的に有用なトリアリールイミダゾールロイコ染料と
しては、 ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾール
、 ２−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）−
４，５−ジフェニルイミダゾール、２−（３−ブロモ−
５−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾール、 ４．５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（
４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール、４．５−ビス
（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキ
シ−３−メトキシフェニル）イミダゾール、 ２−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾール、および ４．５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（
４−ヒドロキシ）−３，５−ジメトキシフェニルイミダ
ゾールが挙げられる。

本発明の組成物におけるロイコ染料およびポリマーは、
組成物の使用方法に応じて多様であることができる。一
般に、ロイコ染料は、１ｏ−６〜１０−’モル濃度、好
ましくはｉｏ−’〜１０−４モル濃度で存在する。ポリ
マー量は、使用されるロイコ染料の量に依存する。一般
に、前述の優位性を達成するには、ポリマー対ロイコ染
料の重量比は、通常１０．０００　：　１〜１００：１
、好ましくは５．０００：１〜５００：１である。

前記組成物の成分は、多数の供給源から商業的に容易に
入手できる。他方、これらは、米国特許第４．０８９．
７４７号明細書および他に上記の引例に記載されている
ような公知の出発原料および公知の　　−方法を用いて
製造することもできる。

組成物は、−ｇに、たとえ−の態様では水性媒体中で存
在するとしても、ロイコ染料または他の疎水性試薬を溶
解するために少量の水混和性の有機溶媒を含むことがで
きる。この様式では、メタノールまたは他のアルコール
類、アセトンまたはアセトニトリルが有用である。好ま
しくは、ロイコ染料は、直接ポリマー水溶液中に溶解さ
れる。

また、本発明の組成物は、具体的な使用の必要に応じて
他の成分を含むことができる。例えば、組成物は、過酸
化水素か、または過酸化物作用性物質のどちらかを含む
こともできるが、添加後にロイコ染料が早期に酸化され
ることから、両者を同時に含ませることはできない。過
酸化物作用性物質は、過酸化水素または他の過酸化物に
よって、他の物質の酸化を促進し得るものである。限定
されるものでないが、かかる物質は、天然および合成ペ
ルオキシダーゼ、チトクローム、ヘミン、ヘモグロビン
構成物、アルカリヘマチン、チオシアン化鉄、タンニン
酸鉄およびクロム酸塩等を包含する。ペルオキシダーゼ
が、特に有用な過酸化物作用性物質である。

また、本発明の組成物は、過酸化物作用性物質が結合し
ている特異的パインディング化合物、例えばペルオキシ
ダーゼ標識免疫反応性化合物を含むこともできる。特異
的パインディング化合物は、他の化合物と特異的に反応
する化学的または生物学的な物質、例えばビオチンに対
するアビジン、または対応する抗原に対する抗体である
。これらの物質は、以下にさらに詳細に記載する。

電子移動剤、すなわち、酸化−還元反応における化合物
間で１以上の電子の移動を促進する化合物を、組成物中
に含ませることもできる。数多くの有用な電子移動剤が
、当該技術分野で既知であＤ、例えば米国特許第４．７
４６．６０７号明細書に記載されているようなフェナジ
ンメトスルフェート、ベンゾキノンまたはナフトキノン
が挙げられる。

特に有用な電子移動剤は、ヨーロッパ特許出願公開第２
５２．７４７号公報に記載されているフェノール類およ
びアニリン類である。

本発明の好ましい組成物は、ｐＨ６〜８に緩衝化され、
そして過酸化水素、フェノール系の電子移動剤、ポリビ
ニルピロリドンおよび最も好ましいものとして２−（４
−ヒドロキシ−３，５−ジ−メトキシフェニル）−４，
５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールを有す
る前述の好ましいロイコ染料の一覧から選ばれるトリア
リールイミダゾール系ロイコ染料を含んでなる。

本発明の診断試験キットは、前述の組成物、並びに１以
上の他の試薬、アッセイのための試験装置または試験容
器を包含する。該キットは、ペルオキシダーゼに対する
基質、即ち、過酸化水素の如き適当な過酸化物を含む。

かる装置は、１以上の試験区画（例えば試験ウェル）を
有する水不溶性の支持体からなる。支持体は、水不溶性
物質、例えばガラス、高分子材料、セルロース系材料お
よび当該技術分野で既知の他の材料から製造される。か
かる装置は、反応のための区画を有する試験管、ペトリ
皿、濾紙または試験ストリップであってもよい。また、
それは、多数のアッセイが実施できる試験ウェルを有す
る試験プレートであることもできる。

また、本発明のキットは、水不溶性の分離特異性パイン
ディング試薬（該試薬と特異的に反応することにより他
の化合物を不溶化し、そして不溶化物を他の物質から分
離するもの）、ペルオキシダーゼ標識特異的パインディ
ング化合物（例えば、ペルオキシダーゼ標識抗体）、洗
浄液、ビオチンを結合した抗体、緩衝溶液、試薬溶液、
試薬ビン、ピペット、試験装置、予備濾過装置、および
アッセイを容易にするために診断キットにおいて有用で
あることが知られている他の材料の１以上を含むことも
できる。

本発明は、リガンド（検出される物質）とレセプター（
リガンドと特異的に反応する化合物）との間の検出可能
な複合体を得ることによる測定方法を提供する。好まし
くは、本発明の方法は、簡便であＤ、そのために医院ま
たは家庭で実施して、直ちに結果を得ることができるも
のである。この試験キットを用いて、生物学的流体のよ
うな水溶液における一価、多価、または複数抗原決定基
（ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を有するリガン
ドの存否を検出することができる。好ましくは、それは
、ｈＣＧのような複数抗原決定基のリガンドの検出に使
用される。

一価のリガンドは、複合体化のためのただ１個のエピト
ープ部位を有する。多価のリガンドは、同一の特異的パ
インディングレセプターの複数のものと複合するための
２個以上のエピトープ部位を有する。複数抗原決定基の
リガンドは、多様な種々のレセプターと複合するための
２以上のエピトープ部位を有する。

より具体的には、本発明は、天然起源のまたは合成的に
調製した特異的パインディングレセプターの存在下で水
溶液中のりガントの測定（定性または定量分析）に使用
することができる。この測定は、リガンドの存否だけを
測定するか、またはりガントの量を定量的に測定するこ
とにより実施することができる。就中、本発明は、動物
、ヒトまたは植物の生物学的液体をアッセイするために
使用することができるが、好ましくはヒトの生物学的液
体に対して使用することができる。限定されるものでな
いが、かかる流体は、全血、血漿、血清、リンパ液、胆
汁、尿、を髄液、精液、涙液、膣分泌液、喀痰および汗
等、並びに便通検体を包含する。また、ヒトまたは動物
の組織、例えば骨格筋、心臓、腎、肺、脳、骨髄および
皮膚等の液状調製物をもアッセイすることが可能である
。

興味の対象となるリガンドは、（１）免疫担当宿主が存
在する場合に、ある物質とパインディングしうる特異的
な抗体の産生をもたらす可能性のあるすべての物質、ま
たは（２）そのように産生される抗体が、抗原−抗体反
応に関与するリガンド、である免疫学的な種であること
ができる。ある態様では、アビジン、ビオチンまたはア
ビジンもしくはビオチンの誘導体、あるいは酵素または
他の標識がリガンドと特異的に反応するレセプター分子
に適当に結合されている。

本発明により検出し得る代表的なリガンドは、−級アミ
ン、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク、リ
ポタンパク、糖タンパク、医薬、ハプテン、酵素、ステ
ロイド、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、多糖、糖脂
質、アルカロイド、生物（細菌、プロトシア、カビ、レ
トロウィルスを含むウィルスおよびリケッチア等）およ
びそれらの構成要素、血液成分、細胞および器官の抗原
、並びに当業者に既知の他の物質を包含する。代表的な
リガンドとしては、医薬、ホルモン、抗生物質または抗
原的な特性を備える他の化合物に対して向けられる抗体
が挙げられる。他のリガンドは、抗原的物質であっても
よい。さらに他の態様では、免疫学的な種は、別の抗体
（即ち、抗−抗体）に対して向けられる抗体である。モ
ノクローナルおよびポリクローナルのいずれの抗体も使
用することができそれらは分子全体またはそれらの種々
の断片であることもできる。本発明のアッセイでは、好
ましくはモノクローナル抗体が使用される。

好ましい態様では、本発明の方法は、妊娠初期の指標と
してのｈＣＧの検出にとって有用である。

この態様では、種々のエピトープ部位でｈＣＧと複合体
を形成するところの試薬を提供する目的で、ｈｃｃに対
する１以上の種々の抗体が、試験装置内に固定化される
。

一般に、本発明の方法は、試験装置内に存在するいずれ
かのりガントとレセプターの反応生成物を形成するよう
な方法で、リガンドを含有すると思われる液体試料を、
目的とする対象のリガンドに対するペルオキシダーゼ標
識レセプターと接触することにより実施される。一般に
、液体試料は、試験装置の形状に応じて、試験装置の試
験区分に供給されるか、または試験ウェル中に置かれる
。

次に、反応生成物の存否は、本発明の染料供給性組成物
と接触させた後、次いで未反応物質から反応生成物を分
離して適当な方法で測定される。

分離は、染料形成と同時にか、または前後の何時に生じ
てもよい。

本発明の方法は、標識したレセプターと標識していない
レセプターの両方を用いる競合的パインディングイムノ
アッセイであることができる。結合（即ち、複合化した
）または未結合（即ち、複合化していない）物質のどち
らかを測定することができる。結合および未結合物の物
理的な分離は、所望によＤ、何等かの適当な分離方法を
用いて実施することができる。

好ましい態様では、前記の方法は、イムノメトリックア
ッセイとして当該技術分野で既知のものである。かかる
アッセイの詳細は、米国特許第４．４８６．５３０号明
細書に示されている。かかるアッセイを用いれば、前述
したような多価のまたは複数抗原決定基のリガンドを測
定することができ、即ち、２以上のレセプター分子が免
疫反応のための２以上のエピトープ部位を有するからで
ある。

サンドイッチアッセイでは、試験装置とりガントとの接
触（従って、第１のレセプターとりガントの接触）より
前にか、それと同時にか、それともその後に第２のレセ
プターがリガンドとの接触に供される。その結果、２つ
の相違するレセプターとりガントとの複合体が形成する
ことになる。好ましくは、レセプターの少なくとも１つ
はビオチン化したものである。最も好ましくは、第１の
レセプターがＥ゛オチン化たものである。不溶性相のア
ビジンと第ルセブタ一部としてのビオチンが反応する場
合、得られる複合体は不溶性となＤ、こうして得られた
不溶性複合体は試験装置における未反応物質から分離す
ることができる。不溶性複合体の検出のためにレセプタ
ーかまたは不溶性相の一方を標識することができる。

好ましい態様としては、次の Ａ、１以上の試験区画を有し、該試験区画の少なくとも
１つが固定化したｈＣＧに対するビオチン化抗体を有す
る水不溶性支持体を含んでなる試験装置を液体試料と接
触させて、第１のエピトープ部位でビオチン化抗体とｈ
ＣＧの反応生成物を形成し、 Ｂ、接触段階（Ａ）より前にか、それと同時にか、また
はその後に、標識され、かつ、第２のエピトープ部位で
ｈｃｃと反応するｈＣＧに対する第２の抗体を液体試料
と接触させて、第１および第２の抗体とｈＣＧの複合体
を形成し、 Ｃ，アビジンを結合した不溶性相を含んでなる不溶化し
た分離特異性試薬と前記複合体を接触させ、ビオチンと
アビジンの反応を介して不溶性複合体を形成し、 Ｄ、接触段階（Ｃ）より前にか、それと同時にか、また
はその後に、過酸化水素の存在下で本明細書に記載され
ている染料供給性組成物を前記複合体と接触し、 Ｅ、得られる標識化し、不溶化した複合体を未反応物か
ら分離し、そして Ｆ、前記複合体と関連する染料の量を測定することによ
Ｄ、標識化し、不溶化した複合体の存否を測定する、段
階を含んでなる水性溶液中のｈＣＧ−の測定方法が提供
される。

この方法は、医院または家庭において、尿試料をアッセ
イすることにより妊娠の早期測定を実施することができ
る。

以下の例は、本発明の実施の代表例を示すものであＤ、
本発明の範囲の限定を意図するものでない。

次の染料供給性組成物は、本発明の実施におけるＬＨの
測定に有用である。

ロイコ染料４．５−ビス（４−メトキシフェニル）−２
−（３，４−ジメトキシ−４−ヒドロキシ）イミダゾー
ルのメタノール溶液（１５■／−）を調製した。

リン酸二水素ナトリウム（１００ミリモル濃度、ｐＨ７
）、ポリビニルピロリドン（１％）、キレート剤ジエチ
レントリアミン五酢酸（５ミリモル濃度）および電子移
動剤４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度
）を水酸化ナトリウムでｐ１１７に調節した溶液５００
　＋ｄに前記試料溶液（５−）を添加した。

例２．　　ｈ（：Ｇの２　　に　　　な　　゛本発明の
実施に従い、次の組成物を調製し、ｈＣＧの測定に使用
した。

第１水溶液は、リン酸二水素ナトリウム（１０ミリモル
濃度）、キレート剤ジエチレントリアミン五酢酸（１０
ミリモル濃度）および電子移動剤４′−ヒドロキシアセ
トアニリド（５ミリモル濃度）により調製した。この溶
液を１０モル濃度の水酸化ナトリウムでｐＨ６，８に調
節した。

第２水溶液は、２　Ｑ　（ｗ／ｗ）％ポリビニルピロリ
ドンおよび例１の０．０１％のロイコ染料を用いて調製
した。

第２水溶液の１重量部を、第１水溶液の１９重量部に添
加した。過酸化水素（３０％、９．７モル濃度）を添加
し、１０ミリモル濃度の過酸化水素最終濃度とした。

以下に略述される３種の溶液を、以下に示した速度によ
り８０℃で脱酸素化した水を含有する１３６５ｄの容器
に連続的に添加した。

溶液１：スチレン（７３９ｇ）　、ｍおよびｐ−（２−
クロロエチルスルホニルメチル）スチレン（８２ｇ）お
よび１〜ドデカンチオール（８，２ｇ）。

２．５ｇ／分の速度で、３８０分間で添加。

溶液２：過硫酸アンモニウム（１９，７ｇ　）および蒸
留し、脱酸素化した水（１１５２ｇ　）。２．１４ｇ／
分の速度で、３８０分間で添加。

溶液３：ピロ亜硫酸ナトリウム（９，９ｇ）および蒸留
水（１１５２ｇ　）。２．２７ｇ／分の速度で、３８０
分間で添加。

３８０分後、反応を停止して固体が３３．４％のラテッ
クス約１２１８　ｇを得た。このラテックスを３日間透
析して、２７．３％の固体を有し、そしてｐＨ５のラテ
ックスを得た。このラテックスを１３．５％の固体まで
希釈した。ＮＭＲ分析で、スチレン対第２モノマーのモ
ル比９６：４が確認された。得られたラテックス粒子は
、透過型電子顕微鏡により測定したところ約０．６７−
の平均直径を有していた。

前記のラテックス試料（０，７５ｔｌ）を、硼酸緩衝液
（５０ミリモル濃度、ｐｉ　ａ、　５　）で２０ｄに希
釈し、次いでアビジン（５■）を添加した。得られた懸
濁液を３７℃で１８時間ぐるぐる回転させながら撹拌し
、次いで遠心した。上澄を廃棄し、緩衝液を用いて粒子
を遠心により１度洗浄し、そして硼酸緩衝液１０−に再
び懸濁した。

ビオチンパインディング分析（即ち、トリチウム標識ビ
オチンによる滴定）は、アビエチンが前記粒子に共有結
合（０，３％のビーズ懸濁液光たり７Ｘ１０−ｈモル濃
度パインディング部位）し、本発明の試薬を形成したこ
とを示した。

次の方法で試験装置を使用して尿試料中のｈｃｃを測定
した。３つの試験ウェルを含むこの装置は、スクシニル
化したカゼイン（１，０７ｇ　／　ｍ）で被覆した市販
のナイロン膜から成る濾過膜をそれぞれ備えている。

試験装置の陰性対照の試験ウェルは、ポリアクリルアミ
ド（６０■）中、ＭＯＰＳ緩衝剤（２■）を含有してい
る。試験試料ウェルは、それに固定化されているビオチ
ン化した抗−ｈＣＧ抗体（３ＩｎＺ）を含み、そしてＭ
ＯＰＳ緩衝剤をそれらの別の場所に加えた。陽性対照の
試験ウェルは、ビオチン化した抗−ｈＣＧ抗体（３Ｉ！
ｇ）、それらの別の場所にＭＯＰＳ緩衝剤（２■）およ
びｈＣＧ（４００ｍ１．Ｕ、）を含ませた。

濾過して不純物を除去し、ｈＣＧ約５０＋ｗ１．Ｕ、／
ｄを含有した尿検体を試験装置の各ウェルに添加し、次
いでペルオキシダーゼ標識抗−ｈＣＧ抗体（１０−”モ
ル濃度溶液の４０４）を添加した。１分間インキエベー
ションした後、前述の不溶性試薬を各ウェルに添加（０
，４２％の分散物の４０ｄ）Ｌ、そして流動物を各ウェ
ル中の膜を通して徐々に排出した。

次に、洗浄した後、例２に記載したロイコ染料溶液（４
０Ｊ！１）を各試験ウェルに添加した。２分後、各ウェ
ルの膜上に形成された色を標準的な反射率測定装置およ
び測定方法を用いて測定し、ウィリアムス−クラッパ−
（Ｗｉ　１１　ｆａＩｌｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換を用
いて透過率濃度に換算した。測定される染料の量は、試
験された尿検体中のｈＣＧ量を示すものであった。

チオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ　：消毒剤）（
０，０１％）を含有する硼酸緩衝溶液（５０−１０，０
５モル濃度、ｐｉ　ｓ、　５　）を、ポリプロピレン製
遠心管に入れ、次いで脱イオン化蒸留水６−に溶解した
卵白アビジン（６■）の溶液６−を加えた。この遠心管
に蓋をした後、激しく振盪し、次いでコポリ　〔スチレ
ン−ｍおよヒｐ　−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕　（モル比、９５．５　：　４．５　）
のビーズ（平均径２．５４Ｊｌｌｌ＋）の分散液（固体
、１５．５％）１．３５１Ｒ１を添加し、そして２４時
間ぐるぐる回転させた。

ポリマービーズにアビエチンが共有結合したビーズを、
０．０１％のチオメルサールを含有するグリシン緩衝液
（０，１モル濃度、ｐａｔ　ａ、　５　）で洗浄した後
、０．０１％のチオメルサールを含有するグリシン緩衝
液（０，１モル濃度）に再懸濁し、不溶性分離特異性パ
インディング試薬（固体、０．３％）を含有する分散液
を調製した。

４匡どＬ１±Ａ− 本アッセイでは、カゼインで前処理した５Ｉ！ｍのナイ
ロン濾過膜を各ウェル中に備え、例３に記載した如き３
種の試験ウェルを有する試験装置を使用した。また本ア
ッセイでは、前述のｈＣＧに対するビオチン化抗体と同
様に調製した、ＬＨに対するビオチン化抗体（リン酸塩
で緩衝化した生理食塩水中、０．０４４■／ｄ）、ＬＨ
に対するワサビペルオキシダーゼで標識した抗体（０，
５％のウシ血清を含有するリン酸塩で緩衝化した生理食
塩水中、０．００１５■／ｄ）、およびビーズに固定し
たアビジンを含む前述の試薬（固体、０．９％、ｐＨ８
，５）を使用した。

このアッセイでは、次の種々の尿試料を試験した。

（ａ）　　１８ｍ１．Ｕ、　ＬＨ／−を含有する女性の
月経周期の第１３日日に採取した試料、および（ｂ）　
６４ｍ１．Ｕ、　ＬＨ／−を含有する前記女性の月経周
期の第１４日月に採取した試料。

これらの両試料を同一人から採取し、Ｌｌｌ含量を、ダ
イアゴノスティック・プロダクツ・コーポレーション（
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ）から入手したＬＨラジオイムノアッセイ
のキットで測定した。

尿試料（ａ　）　（２００ｍ）　、ペルオキシダーゼ標
識抗体（３５ｍ）およびビオチン化抗体（１０ｍｆ）の
混合物を調製し、室温で２分間インキュベーションした
。その後、不溶化アビジン試薬（４０ｄ）を、前記混合
物に添加し、さらに５分間インキュベーションを継続し
た。次に、試験装置の１の試験ウェルに混合物を移し、
インキュベーション過程で濾過膜上に形成される不溶化
した複合体を残して、流動物および未反応物を徐々に排
出させた。

残存する不溶化生成物を、界面活性剤ツウイーン（ＴＷ
Ｅｔ！Ｎ）　　２０の０．１％を含有するリン酸塩緩衝
化生理食塩水（１２５＋ｄ）で２度洗浄した後、再度濾
過し、次いで例１の染料供給性組成’１％（５０Ｉｌｌ
）と接触させた。

尿試料（ｂ）は、試験装置の第２の試験ウェルを用いて
同様にアッセイした。

どちらの試験装置とも、５分以内で濾過膜上に色が観察
された。第１ウエルにおける色彩は、淡いピンクであっ
たが、一方、第２ウエルにおける色彩は、明るい赤色で
あった。

地方病院から入手したストレプトコッカスＡの単離物（
２０ｍ）を、亜硝酸ナトリウム（８モル濃度、１２０μ
りおよびクエン酸（１，２モル濃度、１０Ｊ１りを用い
て処理して抗原を抽出した。次に、抽出液を、３−（Ｎ
−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（２モル濃度
）およびエチレンジアミン四酢酸（２５ミリモル濃度、
ｐＨ７，５）の溶液１２０バを用いて中和した。

使い捨て装置に取り付けたナイロン膜をスクシニル化カ
ゼイン（１，０７ｇ／ｒｒｒ）で被覆した。

ストレプトコッカスＡ〔バクト・ストレプトコッカス０
抗血清（Ｂａｃｔｏ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ａ
ｎｔｉｓｅｒｕｍ）、Ａ群、ロット１１２６７２−５０
．Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ製〕に対するラビット抗血清由
来のＩｇＧ画分を、４５％の飽和硫酸アンモニウムで沈
殿させて精製し、次いで透析して過剰の塩を除去した。

次に、精製したＩｇＧ画分を、コポリ　〔スチレン−ｍ
およびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチ
レン〕ビーズ（モル比、９０　：　１０）上に固定化し
、防腐剤として０．０１％のチオメルサール（またはチ
メロサル）を含有する０、０５モルのグリシン緩衝液（
ｐＨ８，５）中で分散試薬（固体、０．３％）を得た。

他方、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等の方法（Ｂｕｒ、Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｎ、１０１＋３９５〜３９９．１９７９）と同
様な方法で、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１〜カルボキシレートを用いて
ワサビペルオキシダーゼに精製１ｇＧ画分を抱合させ、
次いで希釈して０．１％カゼイン中にＩｇＧを９　ｎ　
／　ｍｌ含む抱合体溶液を得た。

ビーズｇ、濁液（４０ＩＪ１）を、使い捨て装置に加え
、次いで抗原抽出物（４０ｍ）、０．１％のカゼイン（
１２０Ｉｌりおよび抱合体（４０Ｉｌｌ）を添加した。

この混合物を２５℃で２分間、膜上でインキュベーショ
ンした。次に、膜をリン酸塩で緩衝化した生理食塩水（
３２０ｔ！１）で洗浄した後、ロイコ染料２−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾール（０，００５
重量％）、リン酸ナトリウム（５ミリモル濃度、ｐＨ６
、８＞　、ポリビニルピロリドン（１％）、過酸化水素
（１０ミリモル濃度）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ミリモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢
酸（１０ミリモル濃度）を含む染料供給性組成物を加え
た。

３分後、さらに洗浄し、膜上の染料を反射率によって読
み取った。読み値をウィリアムス−クラッパ−（Ｗｉ　
１１　ｔａｎｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換によりＤ７に換
算した。抗原の各レベル（コロニー形成単位、ＣＦＵ）
に対する２または３種の試験の平均として、以下の表に
結果を示した。

３　ＸＩＯ’　　　　　　　　　　０．１？４１、４　
Ｘ　１０’　　　　　　　　　　０．１４９６、４　Ｘ
　１０’　　　　　　　　　　０．１１５３、　Ｏｘ　
１０’　　　　　　　　　　０．１０１１、４　Ｘ　１
０’　　　　　　　　　　０．０７？６、４　ｘ　１０
３０．０４７ 細胞の存在なしくバックグラウンド”）　　０．０４４
〔発明の効果〕 本発明は、アッセイ系にペルオキシダーゼまたは他の過
酸化物作用性物質を含む場合に、有利に使用することが
できる大幅に改良された染料供給性組成物を提供する。

この染料供給性組成物は、過酸化水素およびペルオキシ
ダーゼのような過酸化物作用性物質の存在下で染料に酸
化されるイミダゾール系のロイコ染料と特有な水溶性ま
たは水分散性ポリマーの組み合わせであるので、改善さ
れた安定性を有する。

この染料供給性組成物は、感度の著しい低下を伴うこと
なく輸送や長期間の貯蔵をすることができる診断試験キ
ットとして容易にパッケージ化することができる。染料
供給性組成物が高感度であるために、本発明を用いて非
常に低濃度のペルオキシダーゼ標識と特異的にパインデ
ィングする化合物を測定することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水溶性または水分散性ポリマー並びに過酸化水素お
   よび過酸化物作用性物質の存在下で染料を供給し得るイ
   ミダゾール系ロイコ染料を含んでなり、前記ポリマー対
   前記ロイコ染料の重量比が１０，０００：１〜１００：
   １で、かつ前記ポリマーがビニルピロリドンの重合体、
   アクリルアミドの重合体、アクリル酸の重合体、メタク
   リル酸の重合体、ポリエチレングリコールまたはポリア
   ミンである染料供給性組成物。 ２、ペルオキシダーゼの触媒作用に由来する被分析物の
   測定のための診断試験キットであって、（ａ）ペルオキ
   シダーゼに対する基質、および（ｂ）水溶性または水分
   散性ポリマー並びに過酸化水素および過酸化物作用性物
   質の存在下で染料を供給し得るイミダゾール系ロイコ染
   料を含んでなり、前記ポリマー対前記ロイコ染料の重量
   比が１０，０００：１〜１００：１で、かつ前記ポリマ
   ーがビニルピロリドンの重合体、アクリルアミドの重合
   体、アクリル酸の重合体、メタクリル酸の重合体、ポリ
   エチレングリコールまたはポリアミンである染料供給性
   組成物、を含んでなる前記キット。 ３、Ａ．リガンドに対するペルオキシダーゼ標識レセプ
   ターと、液体試料を接触させてレセプターとリガンドの
   反応生成物を形成し、 Ｂ、接触段階（Ａ）より前にか、それと同時にか、また
   はその後に、水溶性または水分散性ポリマー、並びに過
   酸化水素および過酸化物作用性物質の存在下で染料を供
   給し得るイミダゾール系ロイコ染料を含んでなり、前記
   ポリマー対前記ロイコ染料の重量比が１０，０００：１
   〜１００：１で、かつ前記ポリマーがビニルピロリドン
   の重合体、アクリルアミドの重合体、アクリル酸の重合
   体、メタクリル酸の重合体、ポリエチレングリコールま
   たはポリアミンである染料供給性組成物と、前記液体試
   料を接触し、 Ｃ、接触段階（Ｂ）より前にか、それと同時にか、また
   はその後に、未反応物質から前記反応生成物を分離し、
   そして Ｄ、前記反応生成物の存否を測定すること、を含んでな
   る水溶液におけるリガンドの測定方法。