JPH0611509A - バクテロイデス微生物の測定のための直接バインディングアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）微
生物の測定のための直接バインディングアッセイを提供
する。 【構成】バクテロイデス微生物の血清型１種以上から抽
出した抗原を水不溶性支持体に直接バインディングして
迅速かつ感度よく測定する。このバインディングした抗
原は、適当な抗体とその抗原が対応したとき形成する支
持体上の免疫複合体によって検出できる。この抗体−抗
原複合体は、直接またはそのバクテロイデス抗体に対す
る第二の抗体によって検出できる。 【効果】全体のアッセイを室温中約１５分未満で実施す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、バクテロイデス（Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）微生物の測定のための直接バイ
ンディング方法に関する。この発明は歯科上の検査およ
び健康管理に有用である。

【０００２】

【従来の技術】医療、歯科および獣医学上の試験、研究
および診断法において、生物学的流体または被検体中に
存在する生物学的または化学的物質の迅速、かつ正確な
検出または定量に対する依然とした欲求が存在する。た
とえば、ヒトおよび動物の組織、流体および細胞におけ
る各種微生物の存在は、疾患の診断および有効な処置に
とって非常に有用である。

【０００３】特定の微生物は、ヒトや動物の各種歯周疾
患、例えば歯肉炎および歯周炎に対する指標として関連
付けられてきた。これらの疾患の重要性は、特に長生き
している人々のような世代のヒトにとってますます重要
性が増してきたし、その予防は医療上および商業上著し
く重要性が増大してきた。その上、動物の適切な管理
（歯科上の医療を含む）は、われわれの文化における大
きな関心事である。

【０００４】歯周疾患に随伴する微生物の検出は、培養
技法（一般に時間がかかる）、ＤＮＡプローブ法および
各種の免疫学的な手法、例えば凝集アッセイ、エンザイ
ム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）、免疫蛍光法および免疫沈殿法を用いて行われてき
た。これらの免疫学的な手法は、微生物の抗原部位（そ
れらから抽出された成分上に存在してもよい）とそれに
特異的な対応する抗体との免疫反応を使用する。次に、
得られた免疫反応複合体を各種方法で検出することがで
きる。

【０００５】黒色バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）種はグラム陰性であり、通常、各種の歯周疾患、
歯牙形成部位の膿腫および歯内病変の病因となる嫌気性
杆状菌である。これらの種としては、バクテロイデス・
インターメディウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バクテロイデス・ギンギバリス
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、
バクテロイデス・ホルシサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）およびバクテロイデス・エンド
ドンタリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｎｄｏｄｏｎ
ｔａｌｉｓ）が挙げられる。バクテロイデス・ギンギバ
リスはまた、ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒ
ｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）もしく
はバクテロイデス（ポルフィロモナス）・ギンギバリス
〔Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａ
ｓ） ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ〕として知られている。

【０００６】本明細書で定義される「歯周疾患」とは、
口腔の歯周で発生するヒトおよび動物の多種多様な疾患
を称し、結合組織、歯槽骨と歯肉の喪失に影響を及ぼす
疾患を包含する。それは、人生のいろいろな時期、例え
ば幼時、青年時代、妊娠期間または老年期に発生しうる
疾患を包含する。

【０００７】歯周疾患を引き起こすある細菌種内の一定
の血清群または血清型はこれらの疾患の一定の症状の病
因となりうる。例えば、バクテロイデス・インターメデ
ィウスの血清型Ｂは青年期の歯根膜炎の病因となりえ、
血清型ＢおよびＣは成年期の歯根膜炎の病因となりうる
と〔Ｎａｋａｚａｗａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．，５６（６）１６４７〜１６５１ページ、１９８
８〕などにより信じられている。

【０００８】歯肉間隙の流体および歯肉下の歯プラーク
における前記のような細菌に特異的な臨床上のアッセイ
は、歯周疾患の診断、歯周処置の選択および進捗状況の
評価ならびに時後の歯科試験における患者の状態を決定
する上で有用である。このような生物を同定するのに使
用されている標準的な培養法は、時間および経費がかか
り、そして高水準の経験を持つオペレーターが必要であ
る。また、このような試験は搬入および搬出を通じて厳
密な嫌気性条件が必要であるため低いレベルの生物体の
検出用として十分な感度に欠けるきらいもある。

【０００９】上記各種のイムノアッセイが開発され、あ
る程度成功裏に使用されてきた。特に有用であるのは、
ラジオイムノ沈殿アッセイおよびＥＬＩＳＡ試験であ
る。米国特許第４，７４１，９９９号明細書は、アクチ
ノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉ
ｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃ
ｏｍｉｔａｎｓ）の抗原に対するモノクローナル抗体と
それらのＥＬＩＳＡアッセイでの使用を記載する。

【００１０】いろいろなバクテロイデス種に対するモノ
クローナル抗体およびポリクローナル抗体が類似のアッ
セイ用として調製されてきた〔例えば、Ｎａｋａｚａｗ
ａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６（６），１６
４７〜１６５１ページ、１９８８、およびＺａｍｂｏｎ
ら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎ．，５６（上述）、３２〜４
０ページ、１９８５、参照〕。一般的に、従来のアッセ
イは時間がかかり、単一の微生物に向けたものであっ
た。多くの場合に、これらのアッセイは関連する種とか
なりの交差反応性を示すので有用性が限定されていた。
本出願と同時に係属する発明の名称「歯周疾患に随伴す
る微生物のスクリーニングアッセイならびにそれに有用
な製品およびキット」の出願（米国特許出願第４６８，
０３４号に対応）では、スクリーニングアッセイが３種
の微生物アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタ
ンス、バクテロイデス・ギンギバリスおよびバクテロイ
デス・インターメディウスのいずれかの存在を検出す
る。このスクリーニング方法は、開業医が歯周の処置を
患者に施す必要があるかを早期に決定できるので彼らに
とって非常に有用である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、スクリ
ーニングが行われてその結果が陽性であることが判明し
たとき、処置を具体的に施しうるには存在する微生物を
決定できることが必要であろう。そうすれば、処置を早
期に開始することができる。現在のところ、分別は上述
の時間のかかる培養法または好ましくない免疫学的な方
法を用いて行われている。さらに、既知の培養法とほぼ
同等の感度であるがより迅速なアッセイを入手すること
が有用であろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記既知の分析方法に付
随する課題は、下記の工程を含んでなるバクテロイデス
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）微生物の測定方法によって
解決される。

【００１３】Ａ．バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）微生物から抽出した抗原少なくとも１種を含有す
ることが疑われる被検体と固体支持体とをそのバクテロ
イデス抗原が前記支持体に直接バインディングするのに
十分な時間接触させる工程、 Ｂ．前記接触の５分以内に、バインディングしたバクテ
ロイデス抗原から未バインディング物質を分離し、次い
でそのバインディングした抗原を前記バクテロイデス抗
原に対する抗体少なくとも１種と接触して前記支持体上
にバインディングした免疫複合体を形成する工程、なら
びに Ｃ．前記抗体と抗原の接触の５分以内に、未複合体化抗
体からバインディングした複合体を分離し、次いで被検
体中のバクテロイデス抗原の存在の指標として前記バイ
ンディングした複合体の存在を測定する工程。

【００１４】以下、この発明を具体的に説明する。この
発明を使用してバクテロイデス種、例えばＢ・インター
メディウス、Ｂ・ギンギバリス、Ｂ・ホルシサス、Ｂ・
エンドドンタリスおよび当業者に自明の他の種の抗原
（例えば、リポ多糖類、莢膜抗原または膜タンパク質）
を迅速かつ感度よく検出できる。Ｂ・インターメディウ
スおよびＢ・ギンギバリスがこの発明を用いて具体的に
検出可能である。抗原は細胞のままその一部として検出
してもよいが、通常、それらは生物学的被検体中に存在
する細胞そのものから適当な方法で抽出される。限定さ
れるものでないが、このような被検体としては、咽喉ま
たは口に由来する粘液、涙液、ヒトまたは動物の組織抽
出物、歯のプラークおよび歯肉間隙の液体が挙げられ
る。一般的に、前記生物体は歯のプラーク、唾液または
歯肉間隙の液体中に検出されている。

【００１５】抗原抽出は、たとえば米国特許第４，７４
１，９９９号（上述）に記載される浸透ショック法〔例
えば、Ｄｉｒｉｅｎｚｏらの、Ｉｎｆｅｃｔ．＆Ｉｍｍ
ｕｎ．，４７（１）、３１〜３６ページ、１９８５、参
照〕または音波処理〔例えば、Ｚａｍｂｏｎらの、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．＆Ｉｍｍｕｎ．，４１（１）、１９〜２７ペ
ージ、１９８３、参照〕のような標準的方法を用いるか
洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコー
ル酸ナトリウムまたはデシル硫酸ナトリウム）を用いる
物理的または化学的手段によって都合よく行われる。

【００１６】この発明の実施に際して使用される抗体類
は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよ
い。モノクローナル抗体は、米国特許第４，７４１，９
９９号明細書に記載されるような標準的な方法で調製す
ることができる。一方、ポリクローナル抗体は、例えば
Ｚａｍｂｏｎらの上記引例に記載されるような標準的な
方法で調製することができる。一般的に、哺乳類（例え
ば、ウサギ）を目的とする適当量の抗原成分または細菌
細胞そのもので１度以上感作する。力価が許容できる適
当時間後、抗血清をその哨乳類から採取する。抗体は、
必要があれば既知の方法で抗血清から精製採取すること
ができ、使用するまで緩衝溶液中で凍結保存することが
できる。これらは、同一微生物の１種以上の血清型と反
応することができる。このような操作のさらなる詳細
は、当該技術分野で周知である。

【００１７】必要があれば、抗原物質を被検体そのもの
から採取することができ、あるいは被検体を水もしくは
適当な緩衝液で希釈するか、または異物を除去するため
に濾過し、アッセイにおける抗原と抗体の複合体化を促
進してもよい。

【００１８】一般的に、適当な方法で抗体を単離する
と、必要があれば防腐剤を含み、そして１種以上の適当
な緩衝剤を含む緩衝液を用いて保存することができる。
好ましくは、それらを凍結状態で保存する。緩衝液で
は、一般的にｐＨを６〜９、好ましくは６．５〜８．５
に維持する。有用な緩衝剤としては、リン酸緩衝溶液、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリシン、
ビシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸および当業者に自明の他の緩衝
剤が挙げられる。

【００１９】抗原が微生物から抽出されると、ある場合
には、被検体を予備濾過して細胞残屑または他の妨害性
物質を除去することが好ましい。抽出した抗原（抽出抗
原）は、その抗原が速やかにバインディングできる適当
な固体支持体と接触する。有用な支持体としては、ポリ
マー、ガラス、セラミック、セルロース系材料および当
業者に既知の他の材料によって調製されるものが挙げら
れる。ポリマー材料が特に有用であり、抗原のバインデ
ィング性を向上させる材料で予備処理もしくはそれを塗
布するか、あるいはこのような予備処理もしくは塗布を
することなく使用することができる。

【００２０】好ましい固体支持体は、平均細孔サイズ１
〜１０μｍ、好ましくは５μｍを有するポリマー微孔質
膜である。このような膜は、所期の多孔度を有する薄い
膜に成形できる各種のポリマー材料、例えばポリアミ
ド、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリカーボネ
ート、セルロース系材料およびエチレン系不飽和重合性
モノマー類から製造できる付加ポリマー類より製造でき
る。

【００２１】ある態様では、ポリマー支持体は正に帯電
しており、その支持体表面上に正のゼータ電位を与え
る。ゼータ電位は、支持体とそれに接触する流体間の電
位として知られており、一般的に、流体が支持体と接触
したときに発生する電圧を測定することによって決定さ
れる。ゼータ電位を測定する他の技法は知られている。
一般的に、このような支持体上のカチオン基は、第四級
アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級スルホ
ニウム塩、第四級ピリジニウム塩、第四級ピリミジニウ
ム塩または第四級イミダゾリウム塩である。

【００２２】荷電支持体は、正電荷を有するポリマーま
たは荷電物質でオーバーコートした未荷電のポリマーか
ら構成することができる。限定されるものでないが、有
用な荷電微孔質膜としては、Ｐｏｓｉｄｙｎｅ（商標）
およびＢｉｏｄｙｎｅ（商標）微孔質膜（ＰａｌｌＣｏ
ｒｐ．から入手可能）が挙げられる。さらに有用な膜の
詳細およびその調製の詳細は米国特許第４，３４０，４
７９号明細書ならびにＰａｌｌ Ｃｏｒｐ．の商品説明
書ＰＳＤ−７５０ａ（１９８３年３月、１〜２０ペー
ジ）およびＮＭ−９００ｃ（１９８４年７月、１〜２８
ページ）に見られる。有用な膜は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒ
ｐ．からＢｉｏｄｙｎｅ（商標）ＡおよびＬｏＰｒｏｄ
ｙｎｅ（商標）微孔質として市販されている。

【００２３】上記支持体（および特に微孔質膜）は、場
合によって流速および抗原のバインディング性を改良す
るために１種以上の界面活性剤によって塗布してもよ
い。各種の有用なアニオン性、非イオン性および両性界
面活性剤がＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆ
ｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，１９８６
版、（ＭｃＣｕｔｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ Ｐｏｃｋ，Ｎ．
Ｊ）に記載されており、例えば、Ｚｏｎｙｌ（商標）Ｆ
ＳＮ（ＤｕＰｏｎｔ）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４
０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびＦｌｕｏｎ
ｅｔ（商標）ＯＴ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ）が挙げられる。

【００２４】本明細書で開示する支持体は、アッセイを
実施するに際し、他の備品（例えば、ボトル、ビーカ
ー、試験管またはカップ）と組み合わせて使用すること
ができる。別法として、好ましくは、支持体はアッセイ
が実施されそしてすべての流体が収容される試験デバイ
スに固定されている膜である。試験デバイスの有用な形
態は、例えば米国特許第３，８２５，４１０号、同３，
９７０，４２９号、同４，４４６，２３２号ならびにヨ
ーロッパ特許公開第３０８，２３１号および同３２１，
２６１号公報に記載されている。

【００２５】最も好ましくは、試験デバイスが３つの試
験ウェル（２つの試験ウェルが正対照および負対照であ
る）の各々に微孔質膜を含む。抽出抗原は、適当な抗体
類と免疫複合体を形成するために試験ウェル中の膜にバ
インディングされる。このような試験デバイスは試験ウ
ェルが使用に都合がよいように設置された水不溶性シェ
ルを有する。上記文献に記載されたもの以外の具体的な
態様は、当業者に自明であろう。

【００２６】支持体と抽出抗原の接触とほぼ同時に、抗
原はそれに対して直接バインディングする。「直接」と
は、抗原が支持体に付着した連結成分または生物学的化
合物（例えば、抗体）を介してその支持体にバインディ
ングするものでないことを意味する。抗原のある程度の
吸着は生じるとはいえ、このアッセイは本格的な吸着に
とって短い時間、不十分な条件下で行われるので問題に
ならないものと考えられる。抗原は、被検体中に存在す
るかも知れない多量の他の物質、細胞成分、全血または
粘液に抗して膜にバインディングすることが好ましい。

【００２７】支持体と抗原の接触の１０分以内に、好ま
しくは１〜５以内に、そして最も好ましくは２分以内
に、バインディングした抗原をそれに向けた（対する）
抗体類１種以上と接触して支持体上に免疫複合体を形成
する。流体および未バインディング物質は、例えば微孔
質膜を介する排液によってその時速やかに除去できる。

【００２８】ある態様では、免疫複合体の検出のために
標識した抗体を使用して支持体上にバインディングした
複合体を形成する。有用な標識は当該技術分野で既知で
あり、適当な方法および装置を用いて直接検出できる化
学的化合物および生物学的化合物ならびに検出可能な種
を提供するさらなる化学反応または特異的バインディン
グ反応を介して検出できる化合物である。有用な標識の
具体例としては、放射性同位体、酵素、蛍光性化合物、
化学発光性化合物、リン光性化合物、ビオチンもしくは
その誘導体、アビジンもしくはその誘導体、フェリチ
ン、磁性粒子、色素粒子、金ゾル、色素ゾル、着色スタ
フィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細胞および当業者に自明の他の
標識が挙げられる。放射性同位体および酵素が好ましい
標識である。標識は、既知の技法を用いて抗体に付着さ
れる。標識が直接検出できない場合には、検出可能な反
応生成物または特異的バインディング生成物を生じさせ
るのにさらなる試薬または化合物が必要である。例え
ば、標識がビオチンである場合には、ビオチンと抗体の
結合物を適当な酵素と結合したアビジンと反応させるこ
とができる。適切な基質を使用して、前記で得られるア
ビジン−ビオチンの特異的バインディング複合体から検
出可能な種を提供できるであろう。標識が酵素、例えば
グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−グルコシダーゼ
である場合には、適当な基質および色素生成組成物も必
要である。

【００２９】好ましい態様では、標識がペルオキシダー
ゼであり、アッセイのある時点で過酸化水素および適当
な色素生成試薬が加えられて免疫複合体の存在下で検出
可能な色素を提供する。限定されるものでないが、有用
な色素生成試薬としては、トリアリールイミダゾールロ
イコ染料（例えば、米国特許第４，０８９，７４７号明
細書に記載されるようなもの）が挙げられる。

【００３０】好ましい態様では、微生物Ｂ・インターメ
ディウスの血清型１種以上の測定方法は、次の工程を含
んでなる。 Ａ．生物学的被検体中に存在するＢ・インターメディウ
スの血清型１種以上から少なくとも１種の抗原を抽出す
る工程、 Ｂ．前記抽出抗原と固体支持体とをその支持体にその抽
出抗原が直接バインディングするのに十分な時間接触す
る工程、 Ｃ．前記接触の２分以内に、未バインディング物質をバ
インディングした抗原から分離し、次いでこのバインデ
ィングした抗原をその抗体に対する標識した抗体と接触
して前記支持体上にバインディングした免疫複合体を形
成する工程、 Ｄ．工程Ｃの接触の５分以内に、標識したバインディン
グ複合体を未複合体化物質から分離する工程、ならびに Ｅ．支持体上の標識したバインディング複合体を被検体
中のＢ・インターメディウスの血清型１種以上の量の測
定値として測定する工程。

【００３１】この同じ方法が、Ｂ・ギンギバリスの血清
型１種以上の測定についても実施できる。この発明のも
う一つの態様は、バクテロイデス抗原に対する第一の抗
体が標識されておらず、そして得られるバインディング
した免疫複合体の検出は前記未標識抗体に特異的であ
り、かつ適当に標識されている第二の抗体（後述する）
を用いて行われる。

【００３２】この方法で使用される抗体は、支持体上の
非特異的な相互作用を低減する各種のタンパク質および
界面活性剤を含んでいてもよい組成物として供給でき
る。限定されるものでないが、有用なタンパク質として
は、α−カゼイン、カゼイン、ウシ胎児血清およびブタ
γ−グロブリンが挙げられる。限定されるものでない
が、有用な界面活性剤としては、Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商
標）Ｃ両性界面活性剤として市販されているもののよう
な両性界面活性剤およびＴｗｅｅｎ（商標）非イオン界
面活性剤として市販されているもののような非イオン界
面活性剤が挙げられる。

【００３３】免疫複合体が支持体上で形成されると、一
般的に、室温（ほぼ１８〜２５℃）で５分以内のインキ
ュベーションが行われる。これらは、直接バインディン
グ方法によって他の抗原のアッセイに使用されるもの
（例えば、米国特許第４，４９７，８９９号、参照）に
比し非常に温和なインキュベーション条件である。

【００３４】複合体の形成およびインキュベーション
後、この複合体は１回以上洗浄して未バインディング物
質を除去する。一般的に、洗液は、ｐＨ７〜１２を有
し、１種以上の非イオン性もしくはカチオン性の界面活
性剤を含む。特に有用な洗液は、３−（シクロヘキシル
アミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸緩
衝液（ｐＨ１０）中にカチオン界面活性剤〔例えば、Ｅ
ｍｃｏｌ（商標）ＣＣ−９として販売されているもの）
を含む。

【００３５】上述の態様のいずれにおいても、１種また
は２種いずれかの抗体を使用して支持体にバインディン
グした標識複合体を形成する場合、バインディングした
複合体の洗浄後比較的速やかに（すなわち、一般的に１
０分以内、好ましくは５分以内）その複合体を直接また
は間接的に検出する。場合によって、試薬類が許容する
ならば適当な温度（例えば、室温）でインキュベーショ
ンすることによって検出を早やめてもよい。

【００３６】以下のポリクローナル抗体類の調製は、そ
れらの調製の好ましい方法である。前記細菌株は、Ｈｏ
ｍｅｒ Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＳＵＮＹ Ｂｕｆｆａ
ｌｏ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ）によ
って生存培養物として供給された。分離株をヘミン（５
μｇ／ｍｌ）およびメナジオン（０．５μｇ／ｍｌ）で
強化したＣＤＣ嫌気性プレート（ＢＢＬ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）で嫌気的
に培養した。

【００３７】次に、これらのプレートを嫌気性チャンバ
ー中３７℃で２４〜４８時間インキュべーションした。
各菌株に対する凍結保存試料は、白金耳で細胞コロニー
を採取し、スキムミルクで細胞懸濁液を調製し、次いで
この懸濁液を−７０℃で凍結することによって調製し
た。凍結保存試料の生存性は、凍結保存試料の一部をＣ
ＤＣ嫌気性プレート上に置き、そして上記のようにイン
キュベーションすることによって試験した。生存性が確
認されると、各菌株に対する新鮮な分離株を同様にして
得た。細胞懸濁液は、白金耳でコロニーを採取し、リン
酸緩衝液（ｐＨ７．５、１ｍｌ）にその白金耳を置き、
次いで約１分間激しく撹拌することによって調製した。

【００３８】細胞懸濁液の濃度は、６２０ｎｍにおける
濁度を測定することによって分光測光的に測定した。適
当な希釈物を調製して光学濃度範囲を０．１〜１にし
た。濃度は１マクファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）
標準（ＯＤ_６２０＝０．１８０で、約３×１０^８細胞／
ｍｌに相当する）を用いて測定した。ニュージーランド
白色ウサギに、１ｍｌ当たり総生細胞約５×１０^８個を
含有するそれぞれの免疫原のリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．
３）０．５ｍｌを静脈内注射した。これらの注射は、Ｍ
ｃＣａｒｔｙおよびＬａｎｃｅｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，１０２，１〜２８ページ、１９５５）に
示される方法に準じて行った。

【００３９】２度のブースター注射は次のように行っ
た：最初の注射１週間して各ウサギに再度同量の免疫原
を注射し、さらに１週間後同様な注射を各ウサギにし
た。最初の注射後１５日目に開始し、さらに合計１１週
間各ウサギに対し、１週当たり３度の免疫原（５×１０
^８細胞／ｍｌ）１ｍｌのブースター注射をした。ブース
ター注射は各７日間を通じて１日おきに間隔をとった。
これらのウサギから数度抗血清（各血清型に対する）試
料を集め、その都度抗体の性質を調べた。例えば、抗血
清試料は最初の免疫原注射から３週間、６週間および９
週間間隔で採取した。次に、最初の注射から１３週目に
ウサギを殺し、抗血清を集めた（ウサギ１ワ当たり約１
００ｍｌ）。

【００４０】次に、最後の血清を硫酸アンモニウム沈殿
によって精製した。４５％飽和が達成されるまで、飽和
硫酸アンモニウム溶液を氷で冷却した各血清試料に撹拌
しながら滴下した。添加後、混合物をさらに１０分間撹
拌し、遠心し、次いで上澄を廃棄した。このペレットを
もとの精製された試料の量に等しい容量のリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７．３）に再懸濁した。次に、混合物を透析バ
ッグに移し、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）に対して４
℃で撹拌しながら約１５時間透析した。約２００〜１
０，０００倍を越える透析緩衝液を使用した。さらに６
時間新鮮な緩衝液で透析を繰り返した。透析バッグから
溶液を取り出し、０．２２μｍのフィルターを通して濾
過した。濾液の一部をリン酸緩衝溶液で１：１０〜１：
１００の範囲内に希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度を
読み取った。抗体濃度は次の式により決定した： Ａ_２８０÷〔１．４×（希釈）〕＝抗体濃度（ｍｇ／ｍ
ｌ） 次に抗体溶液をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）およびマ
ーシオレート（０．０１重量％）で２〜４ｍｇ／ｍｌに
希釈し、次いで４℃で保存した（少量は４℃で、一方多
量の試料は−７０℃で保存）。

【００４１】

【実施例】下記の例はこの発明を具体的に説明する目的
で提供するものであって、この発明の範囲を限定するこ
とを意図するものでない。すべてのパーセンテージは、
別に指摘しない限り重量基準である。 例１ バクテロイデス・インターメディウスについての
直接バインディングアッセイ

【００４２】この例は、Ｂ・インターメディウスのすべ
ての血清型対するアッセイについてのこの発明の実施を
具体的に説明する。材料および方法 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）試験デバイス（Ｅａｓｔｍａ
ｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）に、その３つの試験ウェルに
Ｚｏｎｙｌ（商標）ＦＳＮ非イオン界面活性剤（０．０
５ｇ／ｍ^２、ＤｕＰｏｎｔ）で被覆した５μｍのＢｉｏ
ｄｙｎｅ（商標）Ａ微孔質膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）
を含めて使用した。

【００４３】ブロッキング組成物は、３−（Ｎ−モルホ
リノ）プロパンスルホン酸（０．０１モル濃度、ｐＨ
７．５）中にカゼイン（０．５％）およびマーシオレー
ト防腐剤（０．０１％）を含めた。Ｂ・インターメディ
ウスの血清型Ａ（ＡＴＣＣ ２５６１１）、血清型Ｂ
（ＮＣＴＣ ９３３６）および血清型Ｃ（ＡＴＣＣ ４
９０４６）に対するポリクローナル抗体は、上述した方
法を用いて白色ニュージランドウサギの静脈注射によっ
て得た。ＩｇＧ画分を硫酸アンモニア沈殿によって調製
し、次いでリン酸緩衝溶液（０．０３〜０．０４％）中
４℃で保存した。ＡＴＣＣは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）でありＮ
ＣＴＣはナショナル・カルチャー・タイプ・コレクショ
ン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）である。

【００４４】抗血清を産生するのに用いた上記細菌株
は、Ｈｏｍｅｒ Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄ（Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＳＵＮＹ Ｂｕｆｆａｌ
ｏ）より生存培養物として供給された。酵素−抗体（上
記各血清型に対する）結合物は、Ｙｏｓｉｔａｋｅら
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５ペー
ジ、１９７９））によって記載された方法により特定の
ウサギポリクローナル抗体にワサビペルオキシダーゼを
共有結合することによって調製した。結合組成物は、上
記ブロッキング組成物中に各結合物（５μｌ／ｍｌ）含
ました。

【００４５】上記血清型に対応する細菌株由来の抗原類
は、室温中約１分間リン酸緩衝溶液を用いて抽出した。
洗液は、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキ
シ−１−プロパンスルホン酸緩衝剤（０．０５モル濃
度）、Ｅｍｃｏｌ（商標）ＣＣ−９カチオン界面活性剤
（０．７５％、Ｗｉｔｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）およびマーシオレート（０．０１％）を含めた。
この溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム（０．０５規定）
を加えることによって１０に調節した。

【００４６】色素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾール（０．００８％）、ポ
リ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸ナトリウム緩
衝剤（１０ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、過酸化水素
（１０ミリモル濃度）、４′−ヒドロキシアセタニリド
電子移動剤（２ミリモル濃度）およびジエチレントリア
ミン五酢酸キレート剤（１０マイクロモル濃度）を含む
ように調製した。

【００４７】アッセイ 上記抽出抗原溶液（各細胞濃度５０μｌ）を別々の試験
デバイスの２つの試験ウェルに加え、試験ウェル中の膜
にバインディングした。リン酸緩衝溶液（５０μｌ）を
各デバイスの１つの試験ウェルに加え、負対照とした。

【００４８】上記結合組成物（５０μｌ）を各試験ウェ
ルに加え、その試験デバイスを５分間室温でインキュべ
ーションした。次に、各試験ウェル中で得られた免疫複
合体の先端に洗液（２４０μｌ）を２度加え、次いで色
素生成組成物（５０μｌ）を加えた。２分間室温でのイ
ンキュベーション後、膜上に形成した色素を視覚的に評
価し、反射濃度値の検量カラーチャートと比較し、次い
でＷｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ変換（Ｊ．Ｏｐ
ｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．，４３，５９５ページ、１９５３）
によって透過率濃度（Ｄ_Ｔ）に変換した。

【００４９】表１に示すアッセイの結果は、この発明が
直接バインディングアッセイを用いてＢ・インターメデ
ィウスの３種すべての血清型を検出できることを示す。
アッセイのバックグランド（０．０１１Ｄ_Ｔ）は低く、
試験した細胞濃度はそれ以上で検出可能である。

【００５０】

【表１】

【００５１】例２：バクテロイデス・ギンギバリスにつ
いての直接バインディングアッセイ この例は、Ｂ．ギンギバリスのすべての血清型に対する
アッセイについてこの発明の方法を具体的に説明する。
この例で使用した材料および方法は、本例で使用するポ
リクローナル抗体がＢ・ギンギバリスの血清型Ａ（ＡＴ
ＣＣ ３３２７７）、血清型Ｂ（ＡＴＣＣ ５３９７
８）および血清型Ｃ（ＡＴＣＣ ５３９７７）に対する
ものであり、そしてペルオキシダーゼ標識結合体がこれ
らの抗体を用いて調製したものであることを除き例１の
ものと同一であった。

【００５２】アッセイは、例１に記載した方法を用いて
実施し、そして試験デバイス中の色素形成の結果を下記
表２に示す。バックグランドは比較的低いが、すべての
細胞濃度において色素濃度がバックグランドより高く検
出可能であるように、この直接バインディングアッセイ
はＢ・ギンギバリスの血清型を検出するのに有用であっ
たことが明らかである。

【表２】

【００５３】

【発明の効果】この発明の方法は、迅速かつ信頼性があ
りそして使用が簡便である。例えば、室温で１５分以内
に実施できる。従って、当該技術分野で既知の時間のか
かる培養法および免疫アッセイは不要になる。それはバ
クテロイデス微生物から抽出した抗原の検出に高い信頼
性がある。

【００５４】この発明は、簡単な固体支持体を抽出した
抗原の「捕捉」に使用する直接バインディングアッセイ
によって実施される。この方法でバインディングした抗
原は、適当な抗体と接触して容易に検出できる免疫複合
体を形成する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャサリン テレサ アブラムス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14609, ロチェスター， プレスク ストリート 95 (72)発明者 ジョージフ ジェイムス ザンボン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14221, アムハースト， プレジデンツ ウォー ク 133 (72)発明者 ホーマー スタンリー レイノルズ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14150, トナワンダ， ノース ブライア 168

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ．バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
   ｄｅｓ）微生物から抽出した抗原少なくとも１種を含有
   することが疑われる被検体と固体支持体とをそのバクテ
   ロイデス抗原が前記支持体に直接バインディングするの
   に十分な時間接触させる工程、 Ｂ．前記接触の５分以内に、バインディングしたバクテ
   ロイデス抗原から未バインディング物質を分離し、次い
   でそのバインディングした抗原を前記バクテロイデス抗
   原に対する抗体少なくとも１種と接触して前記支持体上
   にバインディングした免疫複合体を形成する工程、なら
   びに Ｃ．前記抗体と抗原の接触の５分以内に、未複合体化抗
   体からバインディングした複合体を分離し、次いで被検
   体中のバクテロイデス抗原の存在の指標として前記バイ
   ンディングした複合体の存在を測定する工程、を含んで
   なるバクテロイデス微生物の測定方法。