JPH05209887A - 濾過膜を介する流速を調整した特異的バインディングリガンドのアッセイ方法、試験デバイス及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 所定の流体サンプルについて少なくとも約２
０秒間の排水時間を提供するように設計された微孔質濾
過膜１６及びそれと流体接触状態である吸収性内部体３
０を担持する試験デバイスを提供する。 【効果】 特異的バインディングアッセイ中に長時間膜
上に流体を保持することは、バックグラウンドを低減し
そしてアッセイ感度を改良する。試験デバイスは診断試
験キットの１部として供給でき、そして多種多様な診断
方法に使用される。詳細には、本発明は歯周疾患に伴う
微生物の検出に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被検体中の特異的バイ
ンディングリガンドの検出に有用な診断方法、試験デバ
イス及び試験キットに関する。この発明は、歯周疾患に
伴う微生物の検出に特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】医療分野において、生物学的流体中に低
濃度で存在する生物学的物質の迅速、正確及び定性的又
は定量的な検出に関する研究及び診断方法の必要性が、
依然として存在する。

【０００３】特定の微生物は、ヒト及び動物の各種の歯
周疾患、例えば、歯肉炎及び歯周炎に対する指標として
関連付けられてきた。このような疾患の重大性は、特に
長生きしている人々のような世代のヒトにとってますま
す重要性が増してきたので、このような疾患の予防は著
しく重要性が増大してきた。

【０００４】歯周疾患に伴う微生物の検出における技術
分野での促進が、ヨーロッパ特許第Ａ，０，４３９，２
１０号明細書に記載及び特許請求されている。この刊行
物は、微孔質濾過膜の限定領域で水不溶性試薬を用いる
イムノメトリック（また、「サンドウイッチ」として既
知である）アッセイにおいて、これらの微生物、詳細に
は、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス
（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジン
ジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）及びプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅ
ｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）の同時検出並
びに区別を記載している。これらの微生物の同時検出及
び区別は、相当な臨床的及び商業的意義を有する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ヨーロッパ特許第Ａ，
０，４３９，２１０号明細書に記載されたアッセイは、
複数の微生物を同時に検出することが可能である。例え
ば、上記３種の微生物の各々に由来する３種の異なる血
清型が、同時に検出できる。しかしながら、それを行う
ために、使い捨て試験デバイス（商標ＳＵＲＥＣＥＬＬ
のもとでイーストマン・コダック・カンパニーより市販
されているものと同様である）においてより大きな試験
ウェルを使用することが望ましいことを見い出した。し
かしながら、これが実施されると、膜を介して複合体化
されていない材料を洗浄する間の流体の流れは、ほとん
ど調節不可能である。更に、同一膜上の極めて近接した
非常に多くの異なる抗体の存在は、非特異的バインディ
ングの増大を助長した。これらの課題のすべてが、個別
にみれば小さなものであるとはいえ、組合わさって望ま
しくないバックグラウンドシグナルを増強した。結果
は、弱い特異的シグナル（低い抗原濃度）が膜上の高い
非特異的バックグラウンドシグナルにより隠されること
により、アッセイ感度が低減した。従来のアッセイに伴
う課題の別の確証は、高いバックグラウンドレベルによ
り真の陽性シグナルを目視可能にすることの困難さが認
識されていることである。

【０００６】従って、ヨーロッパ特許第Ａ，０，４３
９，２１０号明細書に記載された発明を用いて複数の抗
原の試験により存在する利点を保持した状態で、上記高
いバックグラウンドの課題を解決することが望ましかっ
た。

【０００７】米国特許第４，９２３，６８０号明細書
は、所定の液体圧で約３０〜約３００秒間である「導入
時間」（流体が膜を介して流れる時間）を提供するため
に、試験デバイス中の膜上でのポリマー塗膜の使用を記
載している。これには、バックグラウンドの問題を解決
し又は非特異的バインディングを低減するであろうこと
は、言及されていない。更に、或る場合には、製造工程
中に膜上にポリマーを塗布する工程を更に必要とせず
に、流動時間を増大することは望ましいであろう。更
に、膜上のポリマーの存在は、或る場合には、非特異的
バインディングの一因となるかもしれないし、そして更
なる製造工程上の課題を創造するが、これらは適切に回
避されるべきである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】目的の特異的バインディ
ングリガンドについてのアッセイにおける高いバックグ
ラウンドの課題は、下記工程を含んで成る特異的バイン
ディングリガンドの検出方法で解決される。 Ａ．微孔質濾過膜の一表面上に不溶化された標的特異的
バインディングリガンド及びそれらに特異的なレセプタ
ーの複合体を生成する工程であって、膜が、膜を介して
通過する流体を吸収するための内部体（ｍｅａｎｓ）
と、それらの反対側の表面上で流体接触状態であること
を特徴とする工程、 Ｂ．複合体化されていない材料を、膜を介して洗浄溶液
で吸収性内部体中に洗い流す工程であって、膜の平均細
孔サイズ及び吸収性内部体の密度もしくは親水性が、洗
浄時間が少なくとも２０秒間であるようなものであるこ
とを条件とする工程、並びに Ｃ．膜上に不溶化された複合体を検出する工程。

【０００９】また、本発明は、 （ａ）上部反応区画室 （ｂ）下部流体収集区画室、及び （ｃ）これらの区画室を分離する微孔質濾過膜、 を含んで成る試験ウェルを含んで成る試験デバイスであ
って、下部流体収集区画室が、膜を通過する上部区画室
から下部区画室への流体を吸収するための内部体を含有
し、吸収性内部体が膜と流体接触状態であり、膜が有す
る平均細孔サイズ及び吸収性内部体が有する密度もしく
は親水性が、所定量の流体が膜を通過するための時間が
少なくとも２０秒間であるようなものであることを特徴
とする試験デバイスを提供する。

【００１０】更に、診断試験キットは、（１）標的特異
的バインディングリガンドについてのレセプター分子、
及び（２）上述のような試験デバイス、を含んで成る。

【００１１】

【具体的な態様】本発明は、標的特異的バインディング
リガンドを検出しようとする、いずれかの特異的バイン
ディングアッセイに使用できる試験デバイス及び診断試
験キットを提供する。通常、特異的バインディングリガ
ンドは、そのリガンドと特異的に複合体化するであろう
レセプター分子が存在するか又はそれを製造できるいず
れかの化学的もしくは生物学的材料として当該技術分野
で定義される。多数のこのような特異的バインディング
ペアが既知であり、それらとしては、抗体−抗原、抗体
−抗体、糖−レクチン、アビジン−ビオチン及び当業者
に容易に明らかである別のものが挙げられる。本発明に
関連して、また、核酸が、レセプター分子とみなされる
相補的核酸と「複合体化」（すなわち、ハイブリダイゼ
ーション）する特異的バインディングリガンドとして考
慮される。

【００１２】しかしながら、ほとんどの場合で、リガン
ドは、微生物（もしくは別の生物又はそれらの成分）、
ウイルス粒子、原生動物又は別の細胞材料より抽出さ
れ、それに対応するレセプターと複合体化され、そして
複合体が適当な方法で検出される。

【００１３】本発明方法は、いずれかのヒトもしくは動
物の生物学的流体又は目的の被検体をアッセイするのに
使用でき、限定されるものではないが、それらには、全
血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、精液、
膣分泌物、痰、汗、便検体、組織の流体調整物、歯周組
織、歯垢、歯肉溝液体及び唾液が挙げられる。

【００１４】一度リガンドが複合体化可能となれば、そ
れはそれと対応するレセプターと反応する。複合体は溶
液中で生成されて、次いで膜上の「捕捉」用試験デバイ
スに添加できる。好ましくは、特異的バインディングリ
ガンド及びレセプターを膜上で接触するようにせしめる
ことにより、何らかの方法で複合体が膜上に生成され
る。

【００１５】各種のアッセイプロトコールが、本発明の
実施の際に使用でき、それらには、競合イムノアッセイ
及びエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）として当該技術分野で既知であるものが挙げ
られる。

【００１６】或る好ましい態様では、標的特異的バイン
ディングリガンド（例えば、抽出された抗原もしくは核
酸）は、微孔質濾過膜へ直接付着又は共有結合せしめる
ことにより不溶化できる。一般的には、このようなアッ
セイは、特異的バインディングリガンドが材料に直接結
合し、そして標識レセプター分子（例えば、抗体もしく
は相補的核酸）が不溶化されたリガンドと複合体化する
のに使用されることによる、「直接バインディング」ア
ッセイとして当該技術分野で既知である。あるいは、レ
セプターは標識されていなくてもよく、次いで標識され
かつ第１レセプターに特異的である第２レセプターが使
用できる。

【００１７】本発明の最も好ましい態様は、特異的バイ
ンディングリガンドが、異なる抗原決定部位で、２つの
レセプター分子の一方が適当に標識されており、そして
もう一方が水不溶性支持体上に固定化されている（又
は、例えばアビジン−ビオチン複合体化を介して固定化
可能である）ような２つのレセプター分子と反応する。

【００１８】好ましくは、リガンドが上記のような粒状
材料上に固定化される。これらの粒子は、より好ましく
は、ポリマー製、球形状であり、そして０．０１〜１０
μｍの平均粒子サイズを有する。得られた粒子に付着さ
れたレセプターの試薬は、特異的バインディングリガン
ドの添加前に、それと同時に、又はそれに次いで試験デ
バイスに添加できる。

【００１９】イムノメトリックアッセイに用いられる不
溶化されたレセプターは、材料の表面上の反応性基との
共有結合反応又は付着を包含する物理的もしくは化学的
手段により、水不溶性材料に付着できる。

【００２０】特に有用な粒状材料は、例えば、ヨーロッ
パ特許第Ａ，０，３２３，６９２号明細書に記載される
ポリマービーズであり、それらは活性ハロ原子、活性化
２−置換エチルスルホニルもしくはビニルスルホニル基
を担持する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー
より製造される。反応性カルボキシ基を担持する別の特
に有用な粒子が、同時係属出願ヨーロッパ特許第Ａ，
０，４６６，２２０号明細書に記載されている。

【００２１】また、レセプターは、特異的バインディン
グ複合体、例えば、アビジン−ビオチン、糖とレクチン
もしくは当該技術分野で既知である別のものを用いて不
溶化されるように設計できる。成分が互いに有する高い
親和性により、これらの態様ではアビジン−ビオチン反
応が好ましい。不溶化しようとするレセプター分子は、
ビオチニル化でき（例えば、ビオチニル化抗体もしくは
核酸）、リガンドとのその反応の前に、その間に又はそ
の後に、それは膜もしくは試験ウェル中の別の固形材料
に付着されたアビジンと複合体化できる。被検体中の流
体は、リガンドとの複合体化用レセプターを取り除くこ
とができる。

【００２２】最も好ましくは、上記不溶化されたレセプ
ターが微孔質濾過膜上にコーティング又は堆積される。
有用な膜材料としては、限定されるものではないが、孔
質天然もしくは合成ポリマー類、焼結ガラス、ガラスも
しくはポリマーフィルム又は繊維の膜類、セラミック材
料、セルロース材料及び接着剤もしくはバインダー材料
と共に結合したビーズから成る粒状構造物が挙げられ
る。

【００２３】所望であれば、膜は界面活性剤もしくは非
免疫反応性タンパク質（例えば、カゼインもしくはスク
シニル化カゼイン）でコーティングできる。しかしなが
ら、このような塗膜は、米国特許第Ａ，４，９２３，６
８０号明細書に記載されるポリマー塗膜のように濾過時
間を遅延するようには設計されていない。しかしながら
好ましくは、膜は、いずれかのタイプの界面活性剤、タ
ンパク質もしくはポリマー（固定化されるレセプターと
の混合物の状態で用いられるものを除く）でコーティン
グされない。

【００２４】固定化されたレセプターは、膜の全表面に
亘って又はそれらの限定領域で膜と付着できる。洗浄時
間が、室温で所定の流体量について少なくとも２０秒間
であることは、本発明に対して臨界的である。従って、
洗浄流体が膜を介して流れる時間が、少なくとも２０秒
間である。洗浄時間は、膜領域及び洗浄容量がどのよう
なものであっても少なくとも２０秒間であるべきであ
る。従って、当業者は、所望の「遅い」排水を達成させ
るために、試験デバイス及び特定の標的リガンドの設計
並びにレセプター分子に対するそのバインディング能力
を初めとするアッセイのタイプによる因子に依存して、
適当な膜細孔サイズ、所定流体容量についての吸収体密
度及び膜領域を容易に決定できる。多くの場合、流体の
量は、３０〜１０００μＬに変化するであろうが、特に
下記好ましい試験デバイスを用いる場合には、４００〜
約６００μＬのサンプルが最も好ましい。一般的には、
洗浄流体と接触される膜領域は、２５〜２５０mm² の範
囲内であり、５０〜１２５mm² の領域が好ましい。

【００２５】この望ましい洗浄時間を達成させるため
に、最大寸法における膜の平均細孔サイズ及び吸収性内
部体（下記）の密度もしくは親水性は、所望の結果を得
るように特に選択される。好ましい態様では、膜の細孔
サイズは調節性パラメーターとして用いられる。吸収性
内部体の密度もしくは親水性は、洗浄時間を都合良く調
節するための望ましいパラメーターでありうる。この結
果を達成するために考案されうる膜細孔サイズ及び吸収
性内部体の数多くの組み合わせが存在し、そして当業者
はこの目的のために、日常実験を実施できる。

【００２６】一般的には、膜の平均細孔サイズは０．１
〜３μｍである。好ましい範囲は０．８〜１．４μｍで
あり、１．２μｍが最も好ましい。

【００２７】不溶化された複合体は膜の一表面上に生成
され、そして吸収性内部体は膜の反対側の表面で流体接
触状態である。一般的には、吸収性内部体が被検体サン
プル及びアッセイ中に用いられるすべての流体を吸い取
るために十分な孔質容量を有するいずれか適する水分吸
収性材料である。限定されるものではないが、有用な吸
収性内部体としては、伝統的な繊維状及びスポンジ様材
料（例えば、酢酸セルロース、ガラス、レーヨン及び綿
の繊維状の詰め物）、弾性スポンジ類、孔質ポリマー類
並びに当業者に容易に明らかである別のものが挙げられ
る。好ましい材料は酢酸セルロースであり、そしてAmer
ican Filtrora Company より各種密度を有するものが市
販されており、入手可能である。一般的には、吸収性内
部体は１．２〜２．５ｇ／cm³ の密度を有する。しかし
ながら、材料の親水性が、密度が範囲内であった場合の
ように作用するような場合には、この範囲外の密度を有
する吸収性内部体が使用できる。換言すれば、幾らか低
密度もしくは高密度の吸収性内部体が、最低排水時間２
０秒間を達成させるために、膜を介してゆっくりと流体
が排出されるような低い親水性を有してもよい。

【００２８】吸収性内部体は膜の一面と「流体接触」状
態である。これは、流体が膜を介して吸収性内部体に容
易に流動できることを意味する。これは、膜を介して吸
収性内部体へ流体を導く構造特性を用いることにより達
成してもよい。好ましくは、吸収性内部体が膜と物理的
に接触状態であり、そして流体は膜を介して少なくとも
毛管現象によりそれの中に流れる。また、重力が、吸収
性内部体への流体の移動における主要因であってもよ
い。吸引は、流体流動を促進するために別の態様で用い
てもよい。

【００２９】一度複合体化が起こると、複合体化されて
いない材料及び被検体由来の抽出材料が、適当な洗浄性
溶液を用いて膜を介して洗浄される。上述のように、膜
を介して洗浄流体を通過させる時間は、少なくとも約２
０秒間であるように調節される。しかしながら、好まし
くは、洗浄溶液５００μＬについての時間は、２５〜４
５秒間の範囲内であり、３５秒間が最適である。別の容
量の流体については、好ましいそして最適の流動時間は
異なるかもしれない。

【００３０】次いで不溶化された複合体は、膜上で適当
な方法で検出される。好ましくは、標識されたレセプタ
ーとリガンドを反応せしめることにより、複合体は検出
される。限定されるものではないが、このような標識と
しては、酵素類、放射性同位体類、蛍光源類、色素源
類、ビオチン、アビジン及びこの技術分野についての多
数の文献より明白であろう別の検出シグナル生成性部分
が挙げられる。各タイプの標識についての検出システム
は、周知である。

【００３１】より詳細には、アッセイが、歯周疾患に伴
う微生物より抽出された抗原を検出するために用いられ
る。詳細には、これらの微生物、アクチノバシラス・ア
クチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎ
ｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙ
ｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）｛以前にバク
テロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）として、当該技術分野で既知で
ある｝及びプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏ
ｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）｛以前にバクテロ
イデス・インターメディアス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）として既知である｝が、個
別にあるいはひとまとめにして検出される。しかしなが
ら、また歯周疾患に伴うと推測される別の微生物が、本
発明で検出又は区別できる。

【００３２】本発明は、所望であれば、吸収性内部体と
流体接触状態である膜を手で支えて実施できる。しかし
ながら、好ましくは膜が水溶性試験デバイス又は膜及び
それらを介して排出される流体を保持するのに適するフ
レーム、区画室及び構造を有する物に設置又は取り付け
られる。

【００３３】単一試験ウェルを含有する代表的な試験デ
バイスは、図１に具体的に示されている。本発明に従っ
て製造される試験ウェル１０は、上部反応区画室１２、
下部流体収集区画室１４及び２つの区画室間に設置され
かつそれらを分離している微孔質濾過膜１６を担持す
る。適当な内部体、例えば、棚２０が、適所に膜１６を
保持するために使用できる。膜１６は、上記のとおりコ
ーティングされていないことを示す。

【００３４】吸収性内部体３０は、膜１６の底部表面３
２と流体（例えば、物理的）接触状態で区画室１４中に
提供される。有用な吸収性内部体は先に記載されてい
る。区画室１４に大気への排出口をあけるために、開口
部３６が提供される。適当なカバー、例えば蝶番式カバ
ー４０が開口部３６の上に提供される。スライド式カバ
ー（図示せず）を包含する各種の蝶番式カバー４０の代
わりになるものが存在する。膜１６上で流体の単一イン
キュベーションのみが、アッセイで必要とされる場合に
は、膜１６の細孔サイズ及び吸収性内部体３０の密度の
設計された組合わせから、流体流動が遅くなるであろう
から、蝶番式カバー４０は削除できる。

【００３５】単一試験デバイスにおいて、一緒になった
２つ以上の図１に示される試験ウェルを担持することは
有利である。例えば、図２は、被検体試験結果と同様
に、陰性及び両性の両方の対照の結果を提供するために
設計された３つの試験ウェルを担持する使い捨て試験デ
バイスを図示している。

【００３６】より詳細には、図２では、試験デバイス１
１がトップ表面１５及びフロントエッジ１７を担持する
フレーム１３を担持する。試験ウェル１９，２１及び２
３は、上記図１に示されるような微孔質濾過膜２５（部
分的に不明瞭である）を各々含有し、アッセイ中にそれ
らを介して流体及び複合体化されていない材料が下部流
体収集区画室（図示せず）に流入される。

【００３７】上述のように、試験デバイスは陽性及び陰
性の両方の対照に関して設計された試験ウェルを担持で
きる。陽性対照の目的は、アッセイが正しく実施される
場合には常に生じるであろう検出可能なシグナル（例え
ば、色彩変化）を生成させることである。従って、陽性
対照は、標的リガンドが試験被検体中に存在する場合に
は、また生成される同様の検出可能なシグナルが存在す
るため、デバイス及び試薬が機能していることを示す。
陰性対照の目的は、標的リガンドの不存在下においてさ
え、シグナルを生成するアッセイにおけるいずれかのエ
ラーもしくは干渉を検出することである。

【００３８】陽性対照試験ウェル中の検出可能なシグナ
ルは、試験被検体より予測されるものと同一もしくは異
なるものであることができる。例えば、標的リガンドが
検出可能な色素を生成してもよく、同時に陽性対照が色
素シグナルの消失を引き起こしてもよい。明らかに、実
用的理由上、シグナルは同一となるように設計され、そ
して必要とされる試薬のタイプは上述のとおりであり、
一般的及び特異的な詳細は当該技術分野で周知である。
陽性対照シグナルは、試験ウェル中の膜の表面一面に均
一に生成でき、又はそれが前測定型で生成できる。

【００３９】特に、複数のリガンドが同時に検出される
別の態様では、陽性対照ウェルは、アッセイされる各リ
ガンドに適切にアッセイが実施されることを示すために
提供される同一又は異なるシグナルを伴う複数の領域を
有する。

【００４０】一般的に、陽性対照試験ウェルは、そこに
標的リガンド及びそれらのレセプターの両者を有する。
反応体は、試験ウェルの反対側の壁上に存在させるか、
又は一方を壁上に、そしてもう一方を膜上に存在させる
ことができる。好ましい態様では、両者が試験ウェル中
の膜上に、一方がもう一方の上に塗布される。例えば、
不溶化レセプター（粒子に付着した）が膜に塗布されそ
して乾燥され、その後抗原が塗布される。

【００４１】或るタイプの親水性バインダー、例えば、
Ｎ−ビニル−２−ピロリドンのホモもしくはコポリマー
と混合しようとするものに関して、試験ウェル中の標的
リガンドの安定性が改良されることが有用であると見い
出されている。特に有用なコポリマーは、少なくとも５
０重量パーセントの上記エチレン系不飽和重合性モノマ
ーより誘導される単位を有する。これらのポリマーは、
既に膜上に不溶化されたレセプターの塗膜に塗布した場
合に、より限定されたリガンドの塗膜を提供することが
認められている。試験被検体もしくは別の流体が添加さ
れる場合、乾燥した混合物は浸透性となる。ホモもしく
はコポリマーの製造は、標準溶液重合方法を用いて達成
できる。標的リガンドは未処理生物体もしくはそれらよ
り誘導される成分でありうる。混合物中のバインダー及
びリガンドの量は、経費、レセプターの感度及び膜のコ
ーティングしやすさのような実用上の考慮事項に従って
多様に変化できる。一般的には、バインダーは溶液の１
〜１０重量パーセントで存在する。標的リガンド対バイ
ンダーの比は、バインダー０．０５ｇ当り細胞数１０⁴
〜１０¹⁰である。

【００４２】或る態様では、標的リガンドが歯周疾患に
伴う微生物より抽出された抗原である。従って、陽性対
照試験ウェルはバインダー及び目的の抗原の混合物を含
有する。本発明の試験デバイスは、個別に又は好ましく
は個別に包装された成分類、試薬類、アッセイ装置及び
使用説明書を有する診断試験キットの一部として提供で
きる。

【００４３】

【実施例】以下の例は、本発明の実施を具体的に説明す
るために包含される。特に断らない限り、すべてのパー
センテージは重量パーセントである。

【００４４】３つの試験ウェル中に組み入れられたＬＯ
ＰＲＯＤＹＮＥ（商標）ナイロン微孔質濾過膜（Ｐａｌ
ｌ Ｃｏｒｐ．、各種の平均細孔サイズ）を含有するＳ
ＵＲＥＣＥＬＬ（商標）使い捨て試験デバイスを用い
た。幾つかの膜（５μｍＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（商標））
を、ＦＣ（商標）１３５非イオン界面活性剤（３Ｍ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でコーティングした後に用い
た。洗浄溶液は、リン酸緩衝溶液（pH７．２）中デシル
硫酸ナトリウム（１．８％）を含んで成るものであっ
た。

【００４５】色素提供性組成物は、４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−
ヒドロキシフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．０
０８％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸
ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル、pH６．８）、過酸化
水素（１０ミリモル）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（０．５ミリモル）及びジエチレントリアミン五酢酸
（１０マイクロモル）を含むように製造した。

【００４６】三種の微生物、アクチノバシラス・アクチ
ノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）
（Ａ．ａ．）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅ
ｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｐ．ｉ．）
及びポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒ
ｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｐ．ｇ．）の
各々に対して向けられたポリクローナル抗体を、ウサギ
の静脈内注射により生成した。ＩｇＧ画分を硫酸アンモ
ニウム沈降により生成し、そしてリン酸緩衝溶液（０．
３〜０．４％溶液）中４℃で保管した。抗血清を生成す
るのに用いた菌株は、H.S.Reynolds (SUNY, Buffalo Sc
hool of Dentistry)より生存培養菌として供給された。
単離体を嫌気性プレート上で継代培養した。微生物は、
以下の寄託番号、Ａ．ａ．（血清型Ａ，Ｂ及びＣ、各
々）に関してはＡＴＣＣ ４３７１７，ＡＴＣＣ ４３
７１８及びＡＴＣＣ ４３７１９、Ｐ．ｉ．（血清型
Ａ，Ｂ及びＣ、各々）に関してはＡＴＣＣ ２５６１
１，ＮＣＴＣ ９３３６及びＡＴＣＣ ４９０４６、並
びにＰ．ｇ．（血清型Ａ，Ｂ及びＣ、各々）に関しては
ＡＴＣＣ ３３２７７，ＡＴＣＣ ５３９７８及びＡＴ
ＣＣ ５３９７７により固定されるものである。ＡＴＣ
Ｃは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(American Type Culture Collection)(Rockville, Mary
land) であり、ＮＣＴＣは、ナショナル・コレクション
・オブ・タイプ・カルチャーズ(National Collection o
f Type Cultures )(London, U.K.) である。

【００４７】各微生物（すべての血清型Ａ，Ｂ及びＣ）
に特異的な抗体を、ヨーロッパ特許第Ａ，０，３２３，
６９２号明細書の製造方法を用いて製造されたポリ〔ス
チレン−コ−４−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕（モル比９５．５：４．５）のポリマー
粒子（平均直径１μｍ）に対して共有結合せしめること
により、水不溶性試薬を製造した。所定の微生物に特異
的な抗体（血清型Ａ，Ｂ及びＣ各々０．２５mg／mLで最
終溶液０．７５mg／mL）を、試験管中のホウ酸塩緩衝剤
（０．０５モル、pH８．５）の溶液に添加してよく混合
することにより、共有結合は達成された。ポリマー粒子
（３％固体、平均直径約１μｍ）を緩衝化混合物に添加
し、そして粒子に抗体を共有結合させるまで、室温で４
〜２４時間、得られた懸濁液を転倒回転した。次いで懸
濁液を２８００rpm で１０分間遠心分離にかけた。上清
を取り除き、そしてペレットをメルチオレート（商標）
（０．０１％）を含有するグリシン緩衝剤（０．１％、
pH８．５）に懸濁せしめた。

【００４８】上記試薬のコーティング懸濁液（０．９５
％固体）を、グリシン緩衝剤（０．１モル、pH８．５）
中ポリアクリルアミドバインダー（５％）を有するよう
に製造した。別個の抗原に向けられた各試薬を、上記試
験デバイスにおける膜の限定領域に塗布した。

【００４９】Yoshitake 他、Eur.J.Biochem., 101 39
5, 1979の方法を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼに
結合した各微生物に向けられた抗体を用いて、酵素−抗
体結合体を製造した。結合体を含んで成る各結合体組成
物（例１〜５については１mL当り各抗体７．５〜１５μ
ｇ、及び例６については１mL当り各抗体５．６〜１１．
３μｇ）を、緩衝剤（０．１モル、pH７．５）中カゼイ
ン〔０．５％、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸緩衝剤０．１モルへの１％溶液より、pH７．５〕、
ＴＷＥＥＮ（商標）２０非イオン界面活性剤（０．３％
ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．）、メルチオレ
ート（商標）（０．０１％）及び４′−ヒドロキシアセ
トアニリド（１０ミリモル）の溶液に添加した。

【００５０】Ａ．ａ．（すべての血清型）及びＰ．ｇ．
（すべての血清型）に特異的な抗体の量は、１０μｇ／
mLであった。Ｐ．ｉ．（血清型Ａ及びＣ）についての量
は、７．５μｇ／mLであり、そしてこの微生物の血清型
Ｂについての量は１５μｇ／mLであった。

【００５１】試験デバイスの流体収集区画室に用いられ
た吸収剤は、以下のものと同一である。「Ｒ１２０２
２」吸収剤は、密度約２．２ｇ／cm³ を有し、American
Filtrona Company より購入した。「Ｒ１３５２８」吸
収剤は、密度約１．８ｇ／cm³ を有し、American Filtr
ona Company より購入した。「Ｒ１３５３１」吸収剤
は、密度約１．６ｇ／cm³ を有し、American Filtrona
Company より購入した。他のすべての試薬を、イースト
マン・コダック・カンパニーもしくは別の周知化学薬品
及び試薬の供給元より得た。

【００５２】アッセイプロトコール すべての例で、このプロトコールを用いた。グリシン緩
衝剤（０．１モル、pH８．５）中、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（５％）及びＥＭＣＯＬ（商標）ＣＣ−９カチオン
界面活性剤（５％、Witco Chemical Co.) の溶液（４０
０μＬ）を、試験デバイスの試験ウェルに添加した。ペ
ルオキシダーゼ標識結合体のサンプル（約４０μＬ）
を、各試験ウェルに添加し、続いて室温で２分間インキ
ュベーションした。洗浄溶液（５００μＬ）を各試験ウ
ェルに添加し（それらの半分まで満たし）、そして排水
せしめた。これをもう一度繰り返した。

【００５３】最終洗浄溶液の排水後、色素提供性組成物
（８０μＬ）を各試験ウェルに添加し、続いて室温で１
分間インキュベーションした。次いで得られた色素シグ
ナルを観測し、そして１０が最高色素濃度を表す１〜１
０までの値を有するカラー強度スコアカードと比較し
た。また、色素シグナルの周囲領域において認められた
バックグラウンドに対して値を得た。また、反射濃度と
しての色素シグナルを、伝統的なＷｉｌｌｉａｍｓ−Ｃ
ｌａｐｐｅｒ変換（J.Optical Soc.Am. , 43, 595, 195
3 を参照）を用いて透過濃度（Ｄ_T ）値に変換した。

【００５４】例１〜５：膜及び吸収性内部体の各種の組
合わせを用いたアッセイ 上記プロトコールを用いて、吸収性内部体及び平均細孔
サイズの異なる膜の各種の組合わせを有する試験デバイ
スを用いて、アッセイを実施した。アッセイは、以下の
ように行った。

【００５５】対照Ａ：膜は、界面活性剤でコーティング
され、かつ平均細孔サイズ５μｍを有するものであっ
た。吸収性内部体は「Ｒ１２０２２」として先に同定さ
れたものであった。 対照Ｂ：膜は、界面活性剤でコーティングされ、かつ平
均細孔サイズ５μｍを有するものであった。吸収性内部
体は「Ｒ１３５２８」として先に同定されたものであっ
た。 例１：膜は、コーティングされておらず、かつ平均細孔
サイズ３μｍを有するものであった。吸収性内部体は
「Ｒ１３５２８」として先に同定されたものであった。 例２：膜は、コーティングされておらず、かつ平均細孔
サイズ１．２μｍを有するものであった。吸収性内部体
は「Ｒ１２０２２」として先に同定されたものであっ
た。 例３：膜は、コーティングされておらず、かつ平均細孔
サイズ１．２μｍを有するものであった。吸収性内部体
は「Ｒ１３５３１」として先に同定されたものであっ
た。 例４：膜は、コーティングされておらず、かつ平均細孔
サイズ１．２μｍを有するものであった。吸収性内部体
は「Ｒ１３５２８」として先に同定されたものであっ
た。 例５：膜は、コーティングされておらず、かつ平均細孔
サイズ０．４５μｍを有するものであった。吸収性内部
体は「Ｒ１２０２２」として先に同定されたものであっ
た。

【００５６】アッセイの結果を図３の棒グラフに具体的
に示す。バックグラウンドについてのＤ_T 値は、図の側
面に記載し、スコアカード値は各棒上に記載する。膜の
平均細孔サイズが減少することが、アッセイにおけるバ
ックグラウンドシグナルを低減する際の最も重要な因子
であることが明らかである。

【００５７】図４は、グリシン緩衝剤（０．１モル、pH
８．５）中ドデシル硫酸ナトリウム（５％）及びＥＭＣ
ＯＬ（商標）ＣＣ−９カチオン界面活性剤（５％）を含
有する流体サンプル（５００μＬ）についての、試験デ
バイスの試験ウェルを介して完全に排水するまでの時間
を図示している。受け入れられる低いバックグラウンド
を提供する試験デバイス（例１〜５）は、少なくとも約
２０秒間の流動時間を有した。また、これらの結果は図
５のグラフプロットに示される。

【００５８】例６ 試験デバイスにおける陽性対照の製
造及び同一のものを用いたアッセイ 本例は、試験デバイス中の陽性対照試薬の製造におけ
る、微生物との混合物への各種水溶性バインダーの使用
を示す。膜上の抗体−ビーズ試薬の塗膜に微生物を塗布
するだけで、不鮮明な陽性対照色素画像が得られること
が認められた。特定のバインダーが、不鮮明な画像を低
減又は排除した。

【００５９】以下のポリマーをバインダーとして評価し
た。 ポリマーＡ：ポリアクリルアミド ポリマーＢ：ポリ〔アクリルアミド−コ−Ｎ−（３−ア
セトアセタミドプロピル）メタクリルアミド〕（モル比
９５：５）、 ポリマーＣ：ポリビニルピロリドン（分子量３６０，０
００）、及び ポリマーＤ：ポリビニルピロリドン（分子量４０，００
０）。

【００６０】Ａ．ａ．，Ｐ．ｇ．及びＰ．ｉ．の３種の
血清型の各々の保存溶液（１００μＬ）を、リン酸緩衝
溶液（７００μＬ）と組み合わせた。各保存溶液は、リ
ン酸緩衝溶液中１０⁹ 細胞数／mL及びメルチオレート
（０．２％）を含有した。得られた抗原溶液を、ピペッ
トを用いて膜に塗布した。

【００６１】別個の抗原溶液を、膜上にプリントするこ
とにより、堆積するように製造した。全３種のＡ．ａ．
血清型の別個の抗原溶液（各血清型保存溶液１００μ
Ｌ）をリン酸緩衝溶液（７００μＬ）と組合わせた。

【００６２】上記各抗原溶液を、フルオレセイン（堆積
した混合物の検出を促進する）を含有するポリマーバイ
ンダー溶液と混合した。得られた混合物は、抗原溶液１
容量部をバインダー溶液２．５容量部〔フルオレセイン
（０．０５％）及び下記表中に示される量でポリマーを
含有する〕に含有させた。

【００６３】本例は、試験ウェル中にＬＯＰＲＯＤＹＮ
Ｅ（商標）濾過膜（細孔サイズ１．２μｍ）及び膜の下
部に「Ｒ１３５３１」吸収剤を含有するＳＵＲＥＣＥＬ
Ｌ（商標）使い捨て試験デバイスを用いて実施した。数
個の膜はコーティングしていない状態で試験し、一方他
のものは、抗体を付着させた粒子から成る試薬の懸濁液
でコーティングした後に試験した。試薬をピペットを用
いてその上に懸濁液（２４μＬ）として堆積させ、そし
て乾燥させた。抗体−ビーズ試薬を以下のように製造し
た。

【００６４】Ａ．ａ．，Ｐ．ｉ．及びＰ．ｇ．のすべて
の血清型に特異的な抗体（上記のように製造される）
を、ヨーロッパ特許第Ａ，０，３２３，６９２号明細書
の製造方法を用いて製造されたポリ〔スチレン−コ−４
−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕
（モル比９５．５：４．５）の粒子（平均直径１μｍ）
に対して共有結合せしめることにより、水不溶性試薬を
製造した。所定の微生物に特異的な抗体（Ｐ．ｇ．の血
清型Ａ，Ｂ及びＣ各々０．２５mg／mLで最終溶液０．７
５mg／mL、Ａ．ａ．の血清型Ａ，Ｂ及びＣ各々０．１７
mg／mLで最終溶液０．５２mg／mL、並びにＰ．ｉ．の各
血清型Ａ及びＣ０．１３mg／mL及びＰ．ｉ．の血清型Ｂ
０．２６mg／mLで最終溶液０．５２mg／mL）を、試験管
中のホウ酸塩緩衝剤（０．０５モル、pH８．５）の溶液
に添加してよく混合することにより、共有結合は達成さ
れた。粒子（３％固体）を緩衝化混合物に添加し、そし
て共有結合させるまで、室温で４〜２４時間、得られた
懸濁液を転倒回転した。得られた試薬の懸濁液を２８０
０rpm で１０分間遠心分離にかけた。次いで上清を取り
除き、そしてペレットをメルチオレート（商標）（０．
０１％）を含有するグリシン緩衝剤（０．１％、pH８．
５）に再懸濁せしめた。

【００６５】上記水不溶性試薬のコーティング懸濁液
（０．９５％固体）を、グリシン緩衝剤（０．１モル、
pH８．５）中ポリアクリルアミドバインダー（５％）を
有するように製造した。この懸濁液のサンプル（２３m
g）を幾つかの膜上に塗布し、そして乾燥した。

【００６６】陽性対照試薬をスクリーニングする際に、
ピペットのチップに一滴の雫を滴らせ、そしてその一滴
の雫を膜表面と接触させることにより、従って膜の毛管
現象が試薬の流体をピペットチップから流出させ、そし
て流体を吸収せしめることにより、試薬（１．５μＬ〜
１．８μＬ）を（コーティングされた又はコーティング
されていない）膜上に堆積させた。陽性対照試薬を乾燥
させた後、各々を画像形成について、下記アッセイ方法
を実行することにより試験した。

【００６７】上記ペルオキシダーゼ標識結合体の変性さ
れたサンプル（５６μＬ）を各試験ウェルに添加し、続
いて室温で２分間インキュベーションした。結合体溶液
を２５％未満の抗体を有することにより変性し、緩衝剤
はリン酸緩衝溶液（０．０５モル、pH７．３）であり、
そして更にＬＯＮＺＡＩＮＥ（商標）Ｃ両性界面活性剤
（０．００３５％、Ｌｏｎｚａ Ｃｏｒｐ）を含有し
た。

【００６８】洗浄溶液（約５００μＬ）を添加しそして
排水する工程を２回行った。この溶液は、グリシン緩衝
剤（０．１モル、pH１０）中、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（商
標）４アニオン界面活性剤（１．３５％、Ｕｎｉｏｎ
Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ．）、カゼイン（０．５％）
及びチルチオレート（０．０１％）を含有するものであ
った。

【００６９】最終洗浄液の排水後、色素提供性組成物
（１２０μＬ）を各試験ウェルに添加し、続いて室温で
１分間インキュベーションした。色素提供性組成物は、
４′−ヒドロキシアセトアニリドを５ミリモルで存在さ
せたことを除いて上記のものであった。次いで得られた
色素シグナルを観測し、そして１０が最高色素濃度を表
す１〜１０までの値を有するカラー強度スコアカードと
比較した。結果を下記第Ｉ表に記載する。

【００７０】発色した色素シグナルは、サイズ及び鮮鋭
さにおいて変化可能である。例えばそれは、明瞭に凝集
された単一ドットの形であることができ、それは好まし
い。あるいは、色素を拡散させて、中心ドット周囲に望
ましくない濃度のブロードな同一中心バンドを形成させ
てもよい。中心ドット及びバンドは、より高い望ましく
ない色素濃度の外部リングと同様に相互に対照される。
中心スポット及びブロードバンド間の対照は、最も重要
である。従って、第Ｉ表中の結果は、中心スポット、ブ
ロードバンド及び外部リングにおける色素スコアとして
存在する。最良の結果は、中心スポット及びブロードバ
ンド間のカラースコアにおける差異が最大である場合に
得られる。結果は、ポリアクリルアミド及びポリビニル
ピロリドンが最良の結果を提供することを示す。

【００７１】

【表１】

【００７２】陽性対照試薬を塗布するのに好ましい方法
はプリンティングによるものである。試薬は、特定パタ
ーンで形成されたプリンティング表面を有する孔質アプ
リケーターを介して供給される。プリンティング表面が
試薬コーティング膜と接触されるので、特異的プリンテ
ィングパターンがアプリケーターの形状と一致する際に
陽性対照試薬はそこへ移動される。

【００７３】色素シグナル画像を上記方法により現像し
た。プリントされた色素画像の評価は、５が最高発色シ
グナルパターンを表す１〜５までの値で行った。色素シ
グナル画像は移動パターンの強度及び面積で変化でき
る。パターンの面積が孔質プリンティング表面の面積と
一致することが好ましい。

【００７４】ポリマーＡ，Ｃ及びＤのみを、この方法を
用いてバインダーとして試験した。結果を下記第II表に
提供する。ポリマーＣが好ましいとはいえ、ポリマーＤ
が同様に許容される結果を提供したことが認められる。

【００７５】

【表２】

【００７６】

【発明の効果】本発明は、各種の特異的バインディング
リガンド、例えば歯周疾患に伴う微生物の鋭敏な検出方
法の改良方法を提供する。アッセイは、特異的バインデ
ィング複合体を収集するための微孔質濾過膜を用いて迅
速かつ鋭敏なリガンドの検出に有利に使用できる。従来
のアッセイで注目されたバックグラウンドは、著しく低
減され、低濃度の標的リガンドに対する感度は増強す
る。これは、同一試験ウェル中の複数のリガンドの検出
について、結果として多大な信頼性を与える。これらの
利点は、洗浄溶液の流速を低減することで達成された。
より良好な感度及び低減されたバックグラウンドが、洗
浄液容量を増大せしめることにより又は流速を増強せし
めることにより達成されることが予想された。実際は、
そうではない。所定量の流体について洗浄時間が少なく
とも約２０秒間であるように、膜の細孔サイズあるいは
膜と流体接触状態である吸収性内部体の密度もしくは親
水性を調整することにより、又は両者を調整することに
より、流速は臨界的に調節できることを本発明者らは見
い出している。細孔サイズの調整はより重要であるが、
それが可能でないか又は完全に有効ではない場合には、
また所望のゆるやかな流速を達成させるために吸収性内
部体が調節でき、そしてアッセイ結果が改良されうる。
更に本発明の利点は、米国特許第４，９２３，６８０号
明細書の教示に反して、膜上にポリマー塗膜を使用する
ことなく達成される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の単一試験ウェルを含んで成る
試験デバイスの垂直断面図を部分的にみた概略図であ
る。

【図２】図２は、本発明の好ましい試験デバイスの遠近
図である。

【図３】図３は、上記例１〜５に記載されたアッセイで
用いられた各種の試験デバイスについてのバックグラウ
ンドシグナルのグラフである。

【図４】図４は、上記例１〜５に記載されたアッセイで
用いられた各種の試験デバイスを介する流体サンプルの
流速のグラフである。

【図５】図５は、上記例１〜５に記載されたアッセイで
用いられた各種の試験デバイスについてのバックグラウ
ンド濃度値対流体流速のグラフプロットである。

【符号の説明】

１０…試験ウェル １１…試験デバイス １２…上部反応区画室 １３…フレーム １４…下部流体収集区画室 １５…トップ表面 １６…微孔質濾過膜 １７…フロントエッジ １９…試験ウェル ２０…棚 ２１…試験ウェル ２３…試験ウェル ２５…微孔質濾過膜 ３０…吸収性内部体 ３２…底部表面 ３６…開口部 ４０…蝶番式カバー

フロントページの続き (72)発明者 ジェラルディン アン ペラネク アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，レイク ロード 1377 (72)発明者 リチャード カルビン サットン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，ウィンブルドン ロード 113

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ．微孔質濾過膜の一表面上に不溶化さ
   れた標的特異的バインディングリガンド及びそれらに特
   異的なレセプターの複合体を生成する工程であって、膜
   が、膜を介して通過する流体を吸収するための内部体
   （ｍｅａｎｓ）と、それらの反対側の表面上で流体接触
   状態であることを特徴とする工程、 Ｂ．複合体化されていない材料を、膜を介して洗浄溶液
   で吸収性内部体中に洗い流す工程であって、 膜の平均細孔サイズ及び吸収性内部体の密度もしくは親
   水性が、洗浄時間が少なくとも２０秒間であるようなも
   のであることを条件とする工程、並びに Ｃ．膜上に不溶化された複合体を検出する工程、を含ん
   で成る特異的バインディングリガンドの検出方法。
2. 【請求項２】 （ａ）上部反応区画室 （ｂ）下部流体収集区画室、及び （ｃ）これらの区画室を分離する微孔質濾過膜、を含ん
   で成る試験ウェルを含んで成る試験デバイスであって、 下部流体収集区画室が、膜を通過する上部区画室から下
   部区画室への流体を吸収するための内部体を含有し、吸
   収性内部体が膜と流体接触状態であり、 膜が有する平均細孔サイズ及び吸収性内部体が有する密
   度もしくは親水性が、所定量の流体が膜を通過するため
   の時間が少なくとも２０秒間であるようなものであるこ
   とを特徴とする試験デバイス。
3. 【請求項３】 （１）標的特異的バインディングリガン
   ドについてのレセプター分子、及び （２）（ａ）上部反応区画室 （ｂ）下部流体収集区画室、及び （ｃ）これらの区画室を分離する微孔質濾過膜、を含ん
   で成る試験ウェルを含んで成る試験デバイスであって、 下部流体収集区画室が、膜を通過する上部区画室から下
   部区画室への流体を吸収するための内部体を含有し、吸
   収性内部体が膜と流体接触状態であり、 膜が有する平均細孔サイズ及び吸収性内部体が有する密
   度もしくは親水性が、所定量の流体が膜を通過するため
   の時間が少なくとも２０秒間であるようなものであるこ
   とを特徴とする試験デバイス、を含んで成る診断試験キ
   ット。