JP3663516B2 - 粒子試薬の合成後化学変性 - Google Patents
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Description
本発明は、光散乱凝集アッセイで使用する高感度を有するポリマー粒状試薬、さらに詳しくは、生物学的興味のある化合物の官能基を介して共有結合した粒子試薬に関し、該粒子試薬は、反応性および安定性を高めるために変性剤で処理されている。
従来の技術
粒子試薬は、凝集反応または凝集の阻害の目視または機器検出に対する感度を増大させるための細菌、細胞表面抗原、血清蛋白質または他の検体の定量的検出用のアッセイにおいてハプテン、蛋白質または生物学的興味のある化合物用の担体として使用されてきた。粒子試薬の調製のための種々の方法が知られている。
凝集反応または凝集の阻害を利用する高感度の光散乱イムノアッセイで使用される、高屈折率を持つポリマー内部コア、および生物学的興味のある化合物に直接もしくは間接的に結合した官能基を持つポリマー外側シェルを有する粒子試薬は、米国特許第4,401,765号および第4,480,042号に記載されている。
光散乱技術によって血清または他の流体中の種々の薬物の存在を検出し、該薬物のレベルを定量するためにポリマー粒子試薬を使用するアッセイは商業的に入手可能である。これらのポリマー粒子試薬、特にポリマー粒子の外側シェル上にエポキシ官能基を有するものは、アルカリ性条件下で加熱した場合に活性を喪失することが見い出された。この不安定性は低温、中程度のpHでの貯蔵でさえ観察され、これは免疫反応性の喪失を伴う。活性を失うことなくポリマー粒子試薬の安定性を増大させる方法に対する要望がある。本発明の目的は、安定性および免疫反応性が増大した光散乱イムノアッセイで使用される粒子試薬を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる粒子試薬の製法を提供することにある。
発明の概要
本発明の目的は、生物学的興味のある化合物の共有結合したポリマー粒子を含む粒子試薬の安定性を改良し、該試薬の免疫反応性を増加させるための方法によって達成される。該方法は、ポリマー粒子の反応性官能基を生物学的興味のある化合物の相補的官能基に共有結合させることによってポリマー粒子試薬を合成し、次いで、粒子表面に負電荷を与える変性剤と共に所定のpHおよび温度条件下でポリマー粒子試薬をインキュベートするステップを含む。好ましい変性剤は、メルカプト酢酸およびチオ硫酸塩よりなる群から選択されるアニオン性求核試薬である。粒子上の官能基の非限定的例は、エポキシ、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノおよびアルデヒド基を有するものを含む。生物学的興味のある化合物は、血清、血漿、唾液、尿または乳蛋白質;薬物、ビタミン、ホルモン、酵素、抗体、多糖、細菌、原生動物、菌類、ウイルス、細胞および組織抗原および他の血液細胞または血液流体物質を含む。該化合物は、合成スペーサーアームを介して、または蛋白質材料を介して、直接ポリマーシェルに連結することができる。該化合物が薬物である場合、キニジン、フェノバルビタール、およびバンコマイシン、トブラマイシンおよびゲンタマイシンのごときアミノグリコシド抗体よりなる群から選択できる。生物学的興味のある化合物は、好ましくは、2000未満の分子量を有する。
ポリマー粒子試薬はいずれの公知の粒子試薬であってもよい。好ましい試薬は、(A)内部コアおよび外側シェルを有するポリマー粒子からなり、ここに、内部コアはナトリウムD線の波長で測定して1.54以上の屈折率を有するポリマーであって、外側シェルは生物学的興味のある相補的官能基と反応できる求核性官能基の残基を有するエチレン性不飽和モノマーのポリマーであり、これは(B)生物学的興味のある化合物に共有結合する。
本発明の製法によって生成するポリマー粒子試薬は、特に、免疫学的対反応体が生成できる、生物学的流体、細胞および組織抽出物中の物質を含めた、生物学的興味のある化合物を測定するための光散乱イムノアッセイで使用できる。
本発明はまた、ポリマー粒子を含む粒子試薬を含み、ここに、該粒子の最外側層は、その表面活性官能基を、生物学的興味のある分子の化合物または類似体の相補的官能基と最初の反応させてある。表面活性官能基の残りは、引き続いて、前記したイムノアッセイ活性および安定性を増加させる方法によって調製された小分子量の負に荷電した化合物と反応したものである。
また、本発明は、生物学的興味のある化合物を測定する方法であって、(1)粒子表面の外側シェル上に負電荷を有しそして直接に又は蛋白質性リンカーを介して生物学的興味のある化合物の相補的官能基に共有結合した官能基を有する粒子試薬を、(2)該生物学的興味のある化合物の含有が疑われる流体、及び(3)凝集剤と共にインキュベートするステップと、次いで測光手段によって粒子サイズの増加を測定するステップと、を含む方法を含む。該生物学的興味のある化合物は薬物、例えば、キニジン、フェノバルビタールおよびバンコマイシン、トブラマイシンおよびゲンタマイシンのごときアミノグリコシド抗生物質であってよい。ポリマー粒子は、ガップリング・インキュベーション・ステップの後に、エポキシド等のような粒子表面上の官能基と反応でき且つ負電荷を担うこうができる官能基を有する低分子量化合物よりなる群から選択できる変性剤で処理されている。これらはアニオン性求核試薬、好ましくはメルカプト酢酸およびチオ硫酸塩である。
【図面の簡単な説明】
本発明の方法によって調製される粒子試薬の安定性の向上を、比較用グラフで説明する。ここに:
図1Aはホウ酸塩中のメルカプト酢酸で処理し、35℃で貯蔵したバンコマイシン試薬の安定性を示す。
図1Bは35℃で貯蔵した未処理バンコマイシン試薬の安定性を示す。
図1Cはホウ酸緩衝液単独中で処理し、35℃で貯蔵したバンコマイシン試薬の安定性を示す。
図2はメルカプト酢酸およびホウ酸塩で処理したバンコマイシン試薬の活性の予期せぬ増加を示す。
発明の詳細な記述
本発明は、ポリマー粒子の外側表面に官能基を有するポリマー粒子試薬の安定性の改良という目的を達成するのみならず、全く予期せぬことに、これらの試薬の免疫反応性を向上させる方法を提供する。該方法は、一般に、ポリマー粒子を生物学的興味のある化合物に共有結合させた後、粒子試薬を、適当なpHおよび温度条件下で、ポリマー表面に負電荷を添加する変性剤で処理するステップを含む。かく処理された粒子試薬は、未処理粒子試薬と比較して、大きな安定性および増大した免疫反応性を共に示す。ポリマー粒子試薬を、メルカプト酢酸またはチオ硫酸塩のような変性剤と共にインキュベートすると、残存する反応性基を同時に変性しつつ、ポリマー粒子表面にアニオン性基を導入し、その結果、驚くべきことに、活性が向上し、かつ安定性が増大する。反応性基を変性しカルボキシル基を導入するために、ポリマー粒子の表面を変性させる他の試薬を使用することができる一方、予期せぬことに、粒子試薬の残存する反応性部位をブロックするのに有用であると一旦は考えられた試薬のすべてが本発明の目的の双方を達成するわけではないことが見出された。例えば、米国特許第4,480,042号は、メルカプトエタノール、メルカプトプロピオン酸、システインまたはアミノ官能基を有する可溶性ポリマーをブロッキング剤として使用して、粒子表面の未占有部位に結合しそれをブロックできると記載している。しかしながら、メルカプトエタノール処理はいくつかの粒子試薬で安定性を改良するが、免疫反応性を改良せず、ある場合には、粒子試薬の活性の低下を引き起こしさえする。
本発明の主題であるポリマー粒子試薬は、凝集の光散乱測定で有用であるものである。多数のタイプの凝集の光散乱測定がある。それらは、濁度検出、比濁検出、粒子計数、準電気的光散乱、自己補正分光法および粒子による光散乱の非対称および偏光の測定を含む。測定系の各タイプは、粒子試薬に異なる拘束をかける。粒子懸濁液の光散乱特性は、粒子サイズ、粒子および懸濁媒質の屈折率、および測定で用いる光の波長のような変数に依存する。すべてのタイプの測定において、選択波長で粒子の屈折率が高くなれば、光散乱シグナルは高くなる。凝集反応の目視観察の間に約400および650nmの間の波長を用いる。凝集反応の間に、有効粒子サイズは増加する。短波長検出での高屈折率の小粒子が濁度検出の高感度に好ましい。蛋白質および他の成分が光を吸収する血清中の試料の測定では、都合よい波長は約320nmを超えるものである。比濁検出では、最適感度は、粒子サイズおよび波長に加えて測定角に依存する。
本発明が適用されるポリマー粒子試薬は、高屈折率の内部コア、および生物学的興味のある化合物(それに結合する抗原類似体または抗体含む)に共有結合した外側シェルを有するポリマー粒子である。生物学的興味のある化合物の抗原類似体は、本発明目的では、抗原決定基を有し、従って、生物学的興味のあるその化合物に対する抗体の結合特異性に関して生物学的興味のある化合物と実質的に同様に挙動するいずれの物質または物質群でもある。
ポリマー粒子の内部コアは、高屈折率を持つ大きな群から選択できる。乳化重合によって調製できる物質が、粒子の均一性およびサイズを制御する能力のために好ましい。濁度検出のごとき光散乱凝集アッセイ用の屈折率の重要性のため、コア物質は所望のアッセイ感度のために許容されるシグナル変化を生じなければならない。高濃度(μg/mL範囲)の検体については、該選択は臨界的ではなく、ナノグラム/mL範囲の検体に関しては、高屈折率を有する粒子が必要である。屈折率は波長の関数である。従って、測定の波長は散乱特性に影響する。屈折率は、一般に、短波長では大きい。好ましくは、内部コアは、ナトリウムD線569nmの波長で測定して1.54以上の屈折率を有するポリマーである。高芳香族性および高原子量置換基のコアポリマーが脂肪族ポリマーよりも好ましい。コアモノマーは、高屈折率を与えるハライド、芳香族、複素環、不飽和または炭素環基のごとき置換基に加えてビニルまたはアリル基を含有するものから選択される。
外側シェルは、内部コアの存在下での重合によって形成されるエチレン性不飽和モノマーのポリマーであって、生物学的興味のある化合物の相補的官能基と反応できる官能基を有する。外側シェルは、所望により、水溶性ポリマー粒子を生じるのに十分な量の他のエチレン性不飽和モノマーを有していてもよい。例えば、エポキシ基を含有するシェルモノマーは、メタクリル酸グリシジル、アクリル酸グリシジル、ビニルグリシジルエーテルおよびメタリルグリシジルエーテルを含む。ポリマー粒子の合成に続き、生物学的興味のある化合物をポリマー粒子に共有結合させて所望の粒子試薬を得る。本発明が適用されるポリマー粒子試薬は、引用してその開示を一体化させる米国特許第4,401,765号および第4,480,042号に記載の手法により作製できる。
貯蔵の間に粒子試薬で従前に観察されていた活性の低下は、生物学的興味のある化合物とポリマーの表面の未占有エポキシド結合部位との間の二次結合により生じるのではないかと考えられる。本発明の製法では、前記ポリマー粒子試薬は、例えば、ポリマー表面にカルボキシル基を導入することによって、残存エポキシドの低下および負電荷の添加を行う条件下で、所定時間、変性剤と共にインキュベートする。反応のpHはポリマー粒子に結合する生物学的興味のある化合物に固有の公知の制限に従って変化するであろう。生物学的興味のある化合物との反応のための最適pHの選択に関するガイダンスは、J.F.King, R.Rathore, J.Y.L.Lamb, Z.R.GuoおよびD.F.Klasseh, 「水中における求核反応のpH最適化」, Journal of the American Chenical Society, 114巻,3028-33頁(1992)に供されている。
反応温度は、生物学的興味のある化合物の活性喪失を引き起こす温度未満であって、凍結する温度を超えなければならない。好ましい温度は、4ないし100℃の間、より好ましくは室温を超え、最も好ましくは、約40ないし70℃の間である。しかしながら、反応は室温、すなわち約20℃で首尾よく進行し、いくつかの場合には、100℃で起こる。前記したごとく、温度およびpHについての制限は、ポリマー粒子に結合した生物学的興味のある個々の化合物に依存し、変化するであろう。かかる化合物が活性を喪失する温度およびpHは公知であるか、あるいはよく知られた技術によって比較的容易に決定できる。変性剤はその上に官能基を有し、粒子試薬と共にインキュベートするステップの間は緩衝化されて、pHを変性剤の反応性官能基のpKaを超えて維持する。
後記アミン官能性薬物でもって反応を説明する。まず、ポリマー粒子を生物学的興味のある化合物(この場合、アミン官能性を有する薬物)に共有結合させる。
次いで、試薬をXと名付けた変性剤と反応させる。
[式中、Rは薬物または薬物類似体、例えば、バンコマイシン;Xは負電荷を持つ官能基および粒子と反応するもう1つの官能基を有する低分子量の官能性化合物を示す]
前記反応は、生物学的に興味ある化合物をラテックス粒子に連結するのに適した一般的反応体(エポキシドと反応するアミン)の1の相補的対を示す。生物学的に興味ある化合物をエポキシドにカップリングさせるのに適した他の相補的対は、とりわけ、スルフヒドリル、イミドおよびフェノールを含む。生物学的に興味ある化合物を粒子にカップリングさせる反応体の他の相補的対はよく知られており、例えば、アルデヒドおよびアミン、アルデヒドおよびチオール、クロロメチルフェニル基およびアミン、ビニルスルホンおよびチオール、アミンおよび活性化カルボキシル基を含むが、これらに限定されるものではない。
種々の薬物で実験を行った。アミノグリコシド抗生物質、バンコマイシン、フェノバルビタールおよびキニジンを用いる粒子試薬の合成およびテストを以下に述べる。
実施例
実施例1
アミノグリコシド抗生物質(バンコマイシン)試薬の変性
材料および方法
Sigma Co. から得たバンコマイシン塩酸塩およびフラクションVウシ血清アルブミン(BSA)、Rhone-Poulene Co. から入手したIBEX EP-110界面活性剤、およびSupelco Co. から入手した微生物阻害剤を除き、粒子試薬合成で使用した材料はAldrich Co. から入手した。未誘導体化エポキシドシェル/コアラテックス(エポキシドラテックス)は米国特許第4,480,042号に記載された従前に公開されている手法に従って調製した。テストで使用した抗体は、バンコマイシングルタルアルデヒドキイホールリンペットヘモシアニン免疫原で免疫化してあるマウスからの脾臓細胞の融合によって得たマウスハイブリドーマ細胞系から得た。抗体は抗−バンコマイシンIgG1タイプ抗体であった。それはマウスで生産され、プロテインA親和性精製によって単離した。抗体希釈剤は、150mM塩化ナトリウムおよび1%フラクションV BSAを含有する、pH5.5のリン酸ナトリウムの100nM溶液であった。
透析濾過は、商業的に入手可能な中空繊維透析濾過カートリッジを用いて行った。遠心はDuPont Sorval ▲R▼RRC285遠心機を用いて行った。免疫アッセイテストは、Roche Diagnostics Co. からのCobas Bio自動アナライザーを用いて行った。該アナライザーは37℃で作動するようにプログラムした。検出波長は340nmであった。まず、51μLの水、150μLの粒子試薬とアッセイ緩衝液の混合物を添加した。アッセイ緩衝液は25nMホウ砂、172mMホウ酸、600mM塩化ナトリウム、および1%のアニオン性界面活性剤の混合物であった。次いで、3μLのキャリブレーター、続いて20μLの水の試料を添加し、この混合物を30秒間インキュベートした。キャリブレーターはプールしたヒト血清中の既知量のバンコマイシンの溶液から作成した。「補助的読み」と同一である、吸光度単位(AU)で測定した光学密度の読み(1AUは対数スケールで10のファクターだけ光の低下を引き起こす吸収に等しい)を採用し、次いで、10μLの抗体溶液を添加して反応を開始させた。反応が開始した後、4分間10秒間隔で読みを採取した。キャリブレーターに応答するアッセイは、2つの方法(i)補助的読みを最終読みから減じて、4分終点測定を得ることによって、あるいは(ii)最初の読みの後に最初の10秒間の反応の間に光学密度の変化から初期速度を計算して速度測定を得ることいずれかによって計算した。
試薬合成
a.粒子試薬の合成
合成では2種の緩衝液を使用した。最初のものはカップリング緩衝液(約pH9.2)であって、これは、2.0%EP-110(最終混合物1リットル当たり、製造業者から受け取った製品66.7mL)を含む50mM四ホウ酸ナトリウム十水物(19.05g/L)であった。第2の緩衝液は試薬貯蔵緩衝液であって、これは、1.2%EP-110を含む15mM,pH7.8リン酸緩衝液であった。これは、2.07gのNaH2PO4・H2O、13.1mLの1N NaOH、および40.0mLのEP-110を混合し、水で1.0Lとすることによって調製した。
50mLの20%固形物65nmエポキシドラテックスを46mLのカップリング緩衝液と混合した。この懸濁液に、4mLの水中の400mgのバイコマイシン塩酸塩を撹拌しつつ添加した。この混合物を、40℃で循環水浴中で22時間加熱した。生成物は、10psiの作動圧、150〜190mLの作動容量のラテックスを用い、H1MPO1-43中空繊維カートリッジを用いる透析濾過によって精製した。前記カップリング緩衝液および貯蔵緩衝液の1:1混合液からなる洗浄緩衝液を、流出物を収集するのと同じ速度を添加した。2Lの流出液を収集した後、仕上げ緩衝液を洗浄緩衝液から精製貯蔵緩衝液に変えた調合を終える前に貯蔵緩衝液600mLを溶出した。精製されたラテックスを濃縮し、透析濾過カートリッジを貯蔵緩衝液ですすぎ、濃縮物およびすすぎ液の最終容量を200mLとした。この試薬は実施例1の引き続いてのセクションで試薬1Aと同一である。
b.合成後化学変性
試薬1Aの2の10mLアリコットを28000RPMで1時間遠心して清澄な上清が得られ、これをデカントし、捨てた。1の試料からのラテックス粒子ペレットをカップリング緩衝液中で撹拌しつつ再懸濁し、他のものを100mMメルカプト酢酸ナトリウム(BMA)(11.4g/L)を含有するカップリング緩衝液(ホウ酸塩)に再懸濁させた。両ラテックスを40℃で18時間インキュベートし、次いで、前記したごとくに遠心し、貯蔵緩衝液で同一容量まで再懸濁し、第2の遠心を行い、第2の再懸濁を行って所蔵緩衝液で同一容量とした。これらの生成物は実施例1の引き続いてのセクションでは、各々、試薬2Aおよび2Bと同一である。
試薬テスト
c.比較活性試薬テスト
粒子試薬を各々アッセイ緩衝液に1/45希釈した。この濃度の試薬は、Cobas Bio自動アナライザーでテストすると、1cmの経路長にて約1AUの光学密度を与えた。抗体試薬で使用した抗体の濃度は111μg/mLであった。検出の速度様式につき前記したごときアッセイ条件を用いて試薬1A、2Aおよび2Bをテストした。得られた標準曲線を表1に示す。
図2は、BMAで処理した試薬の改良された活性を示す。頂部の曲線はホウ酸塩緩衝液中BMAでの処理後における粒子試薬である。第2の曲線は未処理であって、底部の曲線はホウ酸塩単独で処理した試薬である。予期された結果はホウ酸塩緩衝液処理で得られた活性である。予期せぬ結果は頂部曲線によって示された:BMAで処理した試薬についての活性の増加。活性の喪失は、バンコマイシンは反応条件下では転位することが知られているので予測される。ホウ酸塩緩衝液中、BMAで処理したバンコマイシン試薬は活性の増加を示した。
d.比較安定性試薬テスト
前記した試薬1A、2Aおよび2Bの各々の試料を35℃で貯蔵し、他方、すべての他の試薬を4℃で貯蔵した。試料を採取し、前記したごとくにバンコマイシンハについてのアッセイで使用した。この場合、比較データは前記した4分間の終点アッセイ応答モデルを用いて採取した。アッセイは、粒子試薬を35℃貯蔵に置いた後、0、1、4、7および11の後に行った。該アッセイの目的は、引き続いての日に凝集反応が第0日と同一速度で進行するか否かを判断するためである。各試薬の応答を図1A、1Bおよび1Cに示す。このシリーズのグラフでは、mAUでのアッセイ応答をテストの各日につき示す。図は未処理バンコマイシン試薬と比較してBMAで処理したバンコマイシン試薬の増大した安定性を示す。BMAで処理したバンコマイシン試薬の活性は1、4、7および11日に0日と同じであり、これは、冷温で貯蔵した場合の経時的試薬の安定性を示す。図1Bは、バンコマイシン試薬が未処理である場合の経時的活性の喪失を示す。4℃で貯蔵した未処理試薬(◆)の試薬は11日後に安定であるようだが、35℃で貯蔵した試料(◆)はその期間にその活性を約20%喪失した。また、ホウ酸緩衝液のみで処理したバンコマイシン試薬は第0日の640までmAUにつき経時的に活性減少し、第0日の850を超えてmAUにつき経時的に増加した。活性の増加または減少が望ましくない。粒子試薬の活性は貯蔵期間に拘わらず一定であるべきである。BMAのごとき変性剤での処理による粒子試薬の合成後変性は所望の安定性および増大した免疫活性を与える。
実施例2
キニジンのアッセイ
a.粒子試薬合成
キニジン粒子試薬はキニジン誘導体のコア/シェルラテックス粒子のカップリングから合成した。コア/シェルラテックス粒子は高屈折率ポリスチレンコアおよびエチレングリコールジメチクリレートと架橋したメタクリル酸グリシジルシェルからなる。粒子表面のエポキシド官能基は求核部位との反応に従うものである。使用したキニジン誘導体は11−(2−カルボキシエチルチオ)ジヒドロキニジン(QAD)およびスペーサー基(2,2’−(エチレンジオキシ)ジエチルアミン)との間のアミノ含有アダクトであった。
QADは、2,2’−アゾビス(イソブチルニトリル)を最初のフリーラジカル源として用い、3−メルカプトプロピオン酸をキニジンの二重結合に付加することによって作成される。
b.合成後化学変性
実施例2のセクションに記載されたプロセスによって合成したキニジン粒子試薬の試料を対照として使用した。表面エポキシドが不活化された粒子試薬し以下のクエンチ手法によって調製した。キニジン粒子試薬(5.0mL)を遠心し、上清を捨てた。固形物をクエンチ緩衝液(5mL、50mM炭酸ナトリウム溶液、pH9.0)に再懸濁した。変性剤(メルカプト酢酸ナトリウム、43mg、またはチオ硫酸ナトリウム五水和物,48mg)を引き続いて添加した。各反応のpHを9.5に調整した。混合物を混合し、次いで、70℃で16時間インキュベートした。次いで、遠心および粒子洗浄緩衝液(15mMリン酸緩衝液、1.0%アニオン性界面活性剤,pH7.4)への再懸濁(3×)によって、種々のキニジン粒子試薬を精製した。最終ペレットを粒子貯蔵緩衝液(15mMリン酸緩衝液、0.5%アニオン性界面活性剤)に再懸濁し、吸光度比A340/A600が10.0を超えるまで音波処理した。
c.アッセイ分析
得られた粒子をリン酸アッセイ緩衝液(105mM、pH7.0、0.4%アニオン性界面活性剤、0.002%チメロサール)に希釈した(1AUの340nmにおける吸光度を与1:50)。抗体試薬はモノクローナル抗体(5mg/mL、pH6.7の50mMリン酸ナトリウム緩衝液、75mM塩化ナトリウム、0.1%アジ化ナトリウム、0.05%チメロサールに1:45希釈)の腹水試料であった。DuPont aca▲R▼ Discrete Clinical Analyzer用のキニジンキャリブレーターを用いて標準曲線を得た。比濁法イムノアッセイは、以下のごとく変性させて(粒子試薬(240μL)、試料(4μL)、および水(14μL)をインキュベートした(30秒))実施例1に記載した測定の終点タイプを利用して、37℃でRoche Diagnostics Co. からのCobas Bioクリニカルアナライザーで行った。反応は抗−キニジン(20μLの水フラッシュを含む20μL)で開始させた。反応速度は、220秒間隔にわたって終点から初期補助読みを減じることによって計算した。キニジン粒子試薬対照−対−BMAを介して変性させた試薬の種々のキャリブレーションレベルに対する凝集反応を表2に示す。
結果は、試薬合成後にメルカプト酢酸で処理した試薬は対照と比較して顕著に改良された活性を有することを示す。増加した凝集シグナルは、抗体濃度減少は対照粒子試料のそれと同等のキャリブレーション標準曲線を確立するので、免疫特異的であることが確認される。
実施例3
フェノバルビタールアッセイ
a.粒子試薬合成
カップリング緩衝液(164mL、20mMホウ酸緩衝液、0.3% IBEX EP-110、0.005%チメロサール、pH8.0)、フェノバルビタール/PEPAコンジュゲート(10%DMSO溶液12mL、フェノバルビタール3−(5−吉草)酸およびポリエチレンポリアミンリンカー間のアダクト)、および粒子原料(20%固体物24mL、70nmポリスチレン/ポリメタクリル酸グリシジルコア/シェルラテックス粒子)を順次反応容器に添加した。pHは8.0に調整した。溶液を70℃で6時間加熱した。次いで、pHを6.5に添加した。この粒子を、次いで、中空繊維カラム(Amicon 0.10μカートリッジ)を通す溶媒透析濾過(20mMホウ酸緩衝液2L、0.30%IBEX EP-110、0.005%チメロサール、pH8.0)により精製した。これに続き、粒子貯蔵緩衝液(5mMクエン酸緩衝液1.2L、0.30%IBEX EP-110、pH5.5)への第2の透析濾過を行った。得られた粒子残渣を粒子貯蔵緩衝液に入れて200mLとした。
フェノバルビタール3−(5−吉草)酸は、フェノバルビタールおよび5−ブロモ吉草酸エチルとの間の置換反応、続いてのエステルの加水分解から調製できる。これらのタイプの反応はJ.March「進歩した有機化学」357,349頁(McGraw-Hill 1977年出版)に記載されている。ポリエチレンポリアミンリンカーはW.A.FreyおよびD.M.Simonsに対する米国特許第4,581,337号に前記載されている。
b.合成後化学変性
各反応容器に順次、水(0.5mL)、フェノバルビタール粒子試薬(2.0mL)、およびクエンチ緩衝液(2.5mL、100mMリン酸緩衝液、2%IBEX EP-110、pH6.5)を添加した。1の対照をこの時点で実験当たり別に用意する。クエンチすべき試料をさらに(i)BMA(57mg)または(ii)チオ硫酸ナトリウム五水和物(124mg)または(iii)5,50ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)(50mg)およびジチオスレイトール(DTT)(19mg)、または(iv)DTNB(50mg)およびDTT(19mg)およびβ−メルカプトエタノール(2ME)(9μL)の混合物で処理する。各反応のpHを6.5に調整する。混合物を撹拌し、次いで、70℃で1.5時間インキュベートした。種々のフェノバルビタール粒子試薬を、次いで、遠心および粒子貯蔵緩衝液への再懸濁(3×)によって精製した。
c.アッセイ分析
比濁法イムノアッセイはDuPont Dimension▲R▼クリニカルアナライザーで行った。一般的プロトコルは、アッセイ緩衝液(150μL、200mmリン酸緩衝液、0.64%アニオン性界面活性剤、約0.01%抗微生物保存剤、pH7.0)へのフェノバルビタール粒子試薬(40μL、粒子希釈剤への1:5希釈)および水(40μL)への懸濁を含む。反応は、抗−フェノバルビタールモノクローナル抗体(10mMリン酸緩衝液40μL中の約10μg/アッセイ、1M塩化ナトリウム、約0.01%抗微生物保存剤、1%BSA)および水(40μL)の添加によって開始させた。反応速度は、240秒当たりのmAUにての測定の終点方法を用いて計算した。
対照およびBMAまたはチオ硫酸塩いずれかを介して処理したエポキシドを持つフェノバルビタール粒子試薬についての比濁法イムノアッセイ結果を表3に示す。表3に記載する結果は、BMAおよびチオ硫酸塩での合成後化学変性は共にフェノバルビタール試薬の活性を増加させることを示す。チオ硫酸塩での処理はBMAでの処理よりもフェノバルビタール粒子試薬につき良好な結果を与える。
対照およびDTNBおよびDTTの混合物またはDTNB、DTT、および2MEいずれかを介して処理したエポキシドを持つフェノバルビタール粒子試薬についての比濁法イムノアッセイ結果を表4に示す。これらの結果は、他の負に荷電した変性剤は活性を改良することを示す。しかしながら、別の実験で、2ME単独での処理は活性を改良しないことが判明した。
表3のチオ硫酸塩活性値はキャリブレーション値0、10および20につき高い。該値が非特異的凝集ではなくチオ硫酸塩処理のためであることを証明するために、アッセイの化学量論を再度最適化した。増強されたシグナルを持つ標準曲線は、アッセイにおいて抗体試薬をさらに希釈することによって得た。チオ硫酸塩処理粒子についての標準曲線最適化結果は表5に示す。同様に、DTNB/DTTおよびDTNB/DTT/2ME処理粒子についての標準曲線最適化結果を表6に示す。
種々の試料を35℃で貯蔵し、安定性につき実施例1に記載したごとくテストした。結果を表7に示す。
表7の安定性値は0からのシフトを表す。図1A、BおよびCに関して前記したごとく、安定な試薬は0%変化を供する活性の無変化を示すべきである。活性の増加は正の数によって表される。活性の低下は負の数によって表される。表7の未加工対照試料はベースラインを表す。表7の対照の上方の変性剤で処理した試薬は対照よりも良好に挙動すると考えられる。対照の下方の変性剤で処理した試薬は対照よりも安定でなかった。2MEおよびモノチオグリセロール単独での表7の粒子試薬の処理は、試薬の安定性を増加させた。しかしながら、未処理対照試薬と、2MEおよびモノチオグリセロール処理試薬の活性を比較するアッセイの結果は、活性の有意な変化を示さなかった。かくして、BMAまたはチオ硫酸塩での合成後変性のみが、共に、フェノバルビタール粒子試薬の安定性を経時的に増強し、活性を増大させた。BMAまたはチオ硫酸塩処理はポリマー表面に負の電荷を付加する。本明細書で規定する反応条件下では2MEおよびモノチオグリセロール処理はそうしない。
BMAでの粒子試薬の合成後変性は安定性を向上させ、驚くべきことに、テストしたすべての粒子試薬で免疫反応性を改良した、チオ硫酸塩処理はキニジン粒子試薬の活性を改良しなかったが、フェノバルビタール粒子試薬の活性および安定性は改良した。
Claims (16)
- ポリマー粒子の外側層上に、生物学的興味のある化合物の相補的官能基と反応し得る表面のエポキシ基を有し、かつ該生物学的興味のある化合物が該表面のエポキシ基へ共有結合している該ポリマー粒子よりなる試薬粒子の活性および安定性を増大させるための方法であって、
該ポリマー粒子の外側層へ負の電荷を与えかつ未反応のエポキシ基を変性するため、メルカプト酢酸またはチオ硫酸塩から選ばれたアニオン性求核試薬と共に該粒子試薬を所定のpHおよび温度においてインキュベートするステップを含んでいる方法。 - 前記生物学的興味のある化合物はキニジンであり、前記アニオン性求核試薬はメルカプト酢酸である請求項1の方法。
- 前記生物学的興味のある化合物は2000未満の分子量を有する請求項1の方法。
- 前記アニオン性求核試薬は官能基を有しており、そしてインキュベーションステップの間アニオン性求核試薬の官能基のpKaより上のpHを維持するように緩衝化されている請求項1の方法。
- 前記インキュベーション温度は4ないし100℃の範囲内である請求項1の方法。
- 生物学的興味のある化合物を測定するための方法であって、
(1)(a)生物学的興味のある化合物の相補的官能基に直接または蛋白性リンカーを介して共有結合したエポキシ基から誘導された第1の官能基と、(b)メルカプト酢酸またはチオ硫酸塩から選ばれたアニオン性求核試薬との反応により開環されかつ負の電荷を付与された未反応エポキシ基から誘導された第2の官能基とを外側層上に有するポリマー粒子試薬、
(2)該生物学的興味のある化合物の含有が疑われる液体、および
(3)凝集剤
をインキュベートするステップ;そして
増大した粒子サイズを測光手段によって測定するステップ、を含んでいる方法。 - 前記生物学的興味のある化合物は、アミノグルコキシド抗生物質、キニジンおよびフェノバルビタールよりなる群から選ばれた薬物である請求項6の方法。
- アミノグルコシド抗生物質は、バンコマイシン、トブラマイシンおよびゲンタマイシンである請求項7の方法。
- 前記ポリマー粒子試薬の外側層上の第2の官能基は、エポキシ基へ生物学的興味のある化合物を共有結合により取り付けた後、該外側層上の未反応エポキシ基を変性するためのアニオン性求核試薬を用いて調製される請求項6の方法。
- 請求項1の方法によって活性および安定性が増大された粒子試薬。
- 前記生物学的興味のある化合物は薬物である請求項10の粒子試薬。
- 前記薬物は、アミノグルコシド抗生物質、キニジンおよびフェノバルビタールよりなる群から選ばれる請求項11の粒子試薬。
- (1)生物学的興味のある化合物の相補的官能基と反応することができるエポキシ基を有する外側シエルを持っているポリマー粒子、および(2)該生物学的興味のある化合物よりなる粒子試薬を製造するための方法であって、該方法は、
生物学的興味のある化合物へ、ポリマー粒子のエポキシ基を共有結合することによって粒子試薬を合成するステップ;次に
所定のpHおよび温度条件下、該粒子試薬を、メルカプト酢酸またはチオ硫酸塩から選ばれたアニオン性求核試薬と、前記ポリマー粒子の外側シエルの表面上の未反応エポキシ基を変性し、かつ該ポリマー粒子に負の電荷を付与することを許容するのに十分な時間インキュベートするステップ、を含んでいる方法。 - 前記生物学的興味のある化合物は、アミノグルコシド抗生物質、キニジンおよびフェノバルビタールよりなる群から選ばれた薬物である請求項13の方法。
- 前記アニオン性求核試薬は官能基を有しており、そしてインキュベーションステップの間アニオン性求核試薬の官能基のpKaより上のpHを維持するように緩衝化されている請求項13の方法。
- 前記インキュベーション温度は4ないし100℃の範囲内である請求項13の方法。
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