JPS5847258A - 光散乱イムノアツセイ用粒子試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はそのコアの高い屈折率が光散乱測定に高い感度
を与えそしてそのシェルが生物学的関心のある化合物と
共有結合的に結合しうる官能基を有しているようなシェ
ル−コア粒子よシ成る新しい粒子試薬に関する。特に生
物学的関心ある化合物は抗体または抗原でありそしてこ
の粒子試薬は光散乱イムノアツセーに使用すべく意図さ
れている。

凝集反応は、広範囲の桓々の届１閉、細胞表面抗原、血
清蛋白またはその他の臨圧的に興味あるアナライトのた
めの視覚的（半定掘的）および定量的アツセーに長い間
便用されて来た。凝集は二価抗体と多価の関心ある抗原
との間の反応から生じて凝集物を生成させ、そしてこの
凝集物は種々の方法で検出および／−！１．たは測足す
１２− ることかできる。同様に、同じ反応は相当する抗原の添
加によシ生ぜしめられる凝集反応によって特異抗体を検
出するのに使用することができる。

大きな交叉結合凝集塊を生成させるためには、抗原上の
反応性部位の数は２以上でなくてはならない。従って、
−価ハプテンの検出が所望される場合にはその反応スキ
ームは次のように修正され／（。すなわち、多価形態の
抗原１シ１１えばハプテン−蛋白コンジュゲートを生成
させ、そして試料中に存在するハプテンを抗体の；ｂ効
結付部位に対して多価形態のものと拮抗させ七扛によっ
て凝集ｔを減少させる。この技術は凝集阻害と呼ばれて
いる。

多価形態のハプテンの製造は当技術分野では古いもので
ある。往々にしてこのハブテ／は免疫源の製造において
なさｎるようにキャリア蛋１３− 白に結合されている。反応の化学量論性を調整して蛋白
質１分子当シロまたはそれ以上のハプテンを置くことが
できる。正確な数はその物質が使用される特定のアツセ
ーの要求によって決定される。

凝集またはその阻害の視覚または機器による検出の感度
の増大は可溶性蛋白または蛋白コンジュゲートではなく
て担体としての粒子試薬の使用によって達成することが
できる。例えば鶏卵アルブミンに対する抗血清唸鶏アル
ブミン自体を沈殿させるよシも、コロジオ７粒子上にコ
ーティングさせた鶏卵アルプばン沈殿において２０００
倍もよシ感受性であることが示された〔［工ｍｍｕｎｏ
１ｏｇｙＪ第６９４頁（１９７４））。

抗体粒子試薬もまた知られている。そのような試薬製造
の一般的方法は、抗体を適当な吸着媒の表面に９１１．
着させることによる。ポリステレ１４− ンベースラテックス粒子がこの目的に対して広く使用さ
れている。しかしながらこれら試薬は保存または使用の
間に脱着を受けて試薬の性質の変動を導く。これは次い
でアツセーの感度および再現性に悪影響を与えうる。

この脱着の問題を克服するために粒子表面に生物学的関
心ある化合物を共有結合的に結合させることによって粒
子試薬を製造することができる。ポリスチレノ重付体を
変性させて、共有結合的蛋白質結合をなしうるような官
ｈヒ基を包含させる。米国特許第４，０６４，０８０号
明細書は末端アミノフェニル基およびそれに蛋白を結合
せしめたスチレン重合体を開示している。米国特許第４
，１８１，６３６号明細書は水溶性活性化剤を介して免
疫学的に活性な物質にカップリングさせたカルボキシル
化ラテックス重合体および凝集試験における診断用薬剤
としてのそれらの使用を開示している。米国特許第４，
２１０，７２３号明細書は粒子表面に遊離エポキシ基を
有する０、１５〜１．５μｍ直径のシェル−コアラテッ
クス重合体粒子およびこれらエポキシ基を介しての蛋白
のカップリングを記載している。

免疫学的に活性の物質の後での結合のためにその他の重
合体系が開発された。米国特許第４．２６４，７６６号
明細書は０．０１〜０．９μｍの粒子サイズを有しそし
て活性基例えば水溶性ポリヒドロキシ化合物を共有結合
的に結合させることのできるカルボキシルおよびアミン
基を有するラテックス重合体を開示している。活性化剤
例えばカルボジイミドの使用によって免疫学的に活性な
物質はこのラテックス粒子／ポリヒドロキシ化合物担体
に結合されて診断的に有用な試薬を生成させる。

光散乱凝果アツセーに便用するための高い成度を有しそ
して便利には生物学的関心ある化合物を粒状担体に共有
結合的に結合させることによシ製造できる安定な粒子状
試薬に対する需要が存在している。

本発明の粒子試薬は高い屈折率を有し、そして本質的に （Ａ）　　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
コアがナトリウムＤ線の波長で側足して１．５４以下で
ない屈折率を南しそして外側シェルが （１）　　エポキシ、カルボキシ、アミン、ヒドロキシ
およびアルデヒドよシ成る群から選ばれた生物学的に関
心ある化合物と反応しうる官能基を有するエチレン性不
飽和単量体、（２）場合によシその他のエチレン性不飽
和単量体、および （６）　　外側シェルの１０重量部を越えない内側−１
〒− コアの単量体 の重合体であり且つこの外部シェルは前記内側コアの存
在下での重合によって製造されるものである０、０６〜
０．１μｍの大組の直径範囲を有する重合体粒子と、 （ＢＪ　　前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
いる生物学的に関心のある化合物、その抗原またはその
抗体 とからなる。

生物学的関心のある化合物は直接または蛋白物質を介し
て重合体粒子に結合させることができる。

本発明の生物学的に興味ある化合物を測定するための方
法は、 （Ａ）（４）本質的に （ａｌ　　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
コアがす）　ＩＪウム〕線の波長で測１８− 定して１．５４以下でない屈折率を有しそして外側シェ
ルが （１）　　エポキシ、カルボキシ、アばノ、ヒドロキシ
およびアルデヒドより成る群 から選ばれた生物学的に関心ある化合 物と反応しうる官能基を有するエチレ ン性不飽和単量体、 （：１）場合によシその他のエチレン性不飽和単量体、
および 曲）外側シェルの１０重滑部を越えない内側コアの単量
体 の重合体であｐ且つこの外部シェルは前記内側コアの存
在下での重合によって製造されるものである０、０６〜
０．１μｍの大組の直径範囲を有する重合体粒子と、 （ｂｌ　　前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
いる生物学的に関心のある化合物またはその抗体 とからなる高屈折率を有する粒子試薬、（２）生物学的
に関心のある化合物を含有していると推定される液体、
および （３）凝集剤 を培養すること、そして （Ｂ）　　凝集から生じた増大した粒子サイズを分光分
析的に測定すること の各段階を包含する。

蛋白測定のための本発明の方法は適当な補体的粒子試薬
を使用して？Ｍ果剤なしで直接実施することができる。

本発明は感反の習い光散乱イムノアツセーにおける使用
に最適の性質を有する新規な粒子試薬に関する。この粒
子試薬はｈ）　１ｌｉｆｉい屈折率のコア物質よ多形成
されること、（２）生物学的関心のある化付物と共不結
合的に結合しうるシェル物質を有していること、そして
（６）イムノアツセーにおける至適感度のだめの小形粒
子サイズのものであることによって、イムノアツセー感
度を最大とすべく構成されている。

粒子懸濁液の光散乱性はいくつかの変数、最も重要には
粒子サイズ、コアおよび懸濁媒体の屈折率、および測定
に便用される光の波長に依存する。すなわちコア物質、
粒子サイズおよび凝集反応検出用波長の選択はすべてア
ツセーの感度至適化における重要なファクターである。

と扛らファクターは便用さｎる光赦乱検出手段のタイプ
によって決定することができる。凝集反応の視覚的観察
の間、約４００〜６５０ｎｍの間の広い波長のバンドが
１更用される。光散乱応答性はこの波長範囲にわたって
変動するのであるから視覚的観測はある粒子サイズおよ
び屈折率に対する至適波長を選択するよｐもよシ低い感
２１一 度の多くの波長の効果を平均化させる結果となる。光の
波長に比べて小さい粒子に対して散乱は波長の４乗の逆
数で増大しそしてその大きさは屈折率に依存する。光の
波長が粒子の吸収バンドに近づいた場合、屈折率は増大
しそして従って光散乱性は散乱エレメントの光学的分散
にもまた敏感とな９そして波長画数は４乗を越えうる。

ある与えら扛た測定波長における粒子サイズ変化の濁度
計による検出のためには、注意して粒子サイズおよび屈
折率を選ぶことが重要である。その理由は濁度計シグナ
ルはピークにおいてはほとんどかまたは全く感度のない
二重値応答を示しつつ最大値を通過するからである。四
に勾配感度はピークの小粒子サイズ側において大なる側
におけるよシも大であシ、そしてこれは媒体に対する粒
子屈折率比が増大するにつれ２２− て上昇する＠ これらの理由の故に、高い感度のためには、短波長検出
を伴なう高い屈折率の小粒子が好ましい。蛋白およびそ
の他の成分による光吸収の故に、血清中の試料測定に対
しては紫外部には実際的限界が存在する。す々わち便利
な波長は約３２０ｎｍ以上のものである。より長い波長
はよシ低い感度をもって使用することができる。

小形粒子すなわち約０．１１１以下の直径のものが上昇
した傾斜感度および反応速度の両方の故に好ましい。安
定性および会成の便利さの理由の故に１約０．０６μｍ
以上の粒子サイズが好ましい。

一般に０．０６〜０．１μｍの粒子サイズ範囲を本発明
の粒子試薬に使用することができる。よシ短い例えば３
４０ｎｍの波長は例えば４００ｎｍのよシ長い波長より
も一層大なるシグナル差を与える。

比濁検出のためには至適感度は粒子サイズおよび波長の
みならず６１１１定角度にも依存しうる。

比濁計は関連するビームからある角度で散乱される光の
測定を意味する。至適感展のだめの粒子サイズは角度依
存性ならびに波長依存性を有している。

凝集反応のその他のタイプの光散乱測定としては粒子計
算、準弾性的光散乱、自動補正スペクトロスコピーおよ
び粒子の不対称または分極の測定があげられる。これら
タイプの測定は粒子試薬に対して異った制限を与える。

しかしながらすべてのタイプの測定において選ばれた波
長における粒子の屈折率がより高い程、光散乱シグナル
はよシ高い。

本発明の粒子試薬使用の免疫反応の測定の好ましい方法
は、濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）によるものである。そ
の理由は七扛が臨床実験呈で一般に利用可能な分光光度
計以外の特別の装置を何も要求しないからである。この
分光光度計は凝集反応から生じた粒子サイズ上昇に由来
する吸収の上昇を測定する。この上昇した吸収はアナラ
イトによシ生ぜしめられた凝集の直接の尺度であシまた
はこれはアナライトにより生ぜしめられた凝集阻害の間
接的尺度である。凝集の間に生ずる濁シ変化を至適化さ
せるためには、注意して粒子サイズを選択することが重
要である。

凝集反応の間、有効粒子サイズは上昇１−る。

従って感度測定のためにはある与えられた粒子サイズ変
化に対するシグナル変化が至適となるように波長を進ぶ
ことか重要である。

凝集反応の濁度分析での検出のだめの屈折率の重要性の
故に、コア物質はＱｉ望のアッセイ感度のために許容し
うるシグナル変化を生成させるものに限定される。高娘
度（μｇ／ｍｅの範囲）２５− のアナライトに対してはその選択は臨界的ではない。し
かしナノグラム１ｄ範囲のアナライトに対しては、高い
屈折率を有する粒子が必要である。すなわち高い芳香化
度および原子量置換基を有するコア重合体が、脂肪族重
合体よシも好ましく、そして一般に高い屈折率の重合体
が低い屈折率の重合体よりも好ましい。

重合体粒子の内側コアは高い屈折率を有する大なる物質
群から選ぶことができる。好ましいものは最終粒子サイ
ズが制御可能でありかつ実質的に均一となるような方法
での乳化重合により製造しうる物質である。重合体粒子
の内側コアに使用される典型的重合体は１．５４以上の
屈折率（ＮａＤ線、５６９ｎｍにおいて）を有しておシ
そしてこれらは表１に列記されている。屈折率は波長の
画数なのであるから、散乱性は測定波長に依存する。一
般に屈折率はよシ知い波長２６− においてよシ大である。

表　　１ 重合体の屈折率 セルレース　　　　　　　　　　　１．５４ポリ（塩化
ビニル）　　　　　　　１．５４〜１，５５尿累−ホル
ムアルデヒド樹脂　　　１．５４〜１．５６ポリ（第２
級ブチルα−ソロモアクリレート）１．５４２ポリ（シ
クロヘキシルα−ブロモアクリレ−））１．５４２ポリ
（２−ブロモメチルメタクリレート）　　　　１．５４
２６ポリ（ジヒドロアビエチン＊）　　　　　　　　　
１．５４４ポリ（アビエチン酸）　　　　　　　　　　
　　１．５４６ポリ（エチルメルカプチルメタクリレ−
））　　　　１．５４７ポリ（Ｎ−アリルメタクリルア
ミド）　　　　　１．５４７６ポリ（１−フェニルエチ
ルメタクリレート）　　１．５４８７ポリ（ビニルフラ
ン）　　　　　　　　　　　　　ｔ　５５ポリ（２−ビ
ニルテトラヒドロフラン）　　　　１．５５エポキシ樹
脂　　　　　　　　　　１．５５〜１．６０ポリ（ｐ−
メトキシベンジルメタクリレート）１．５５２ポリ（イ
ソプロピルメタクリレート）　　　　　　ｔ　５５２ポ
リ（ｐ−イソゾロビルスチレン）　　　　　　　１．５
５４ポリ（クロロブレン）１．５５４〜１．５５ポリ（
ｐ＋Ｔ”−キシリレニルジメタクリレート）１．５５５
９ポリ（１−フェニルアリルメタクリレート）　　１．
５５７３ポリ（２−フェニルエチルメタクリレート）１
゜５５９２ポリ（スチレン−共−マレイン酸無水物）　
　　１．５６４ポリ（メチルα−ブロモアクリレート）
　　　　１．５６７２ポリ（ベンジルメタクリレート＞
　　　　　　　　１．５６８０ポリ（ｍ−クレジルメタ
クリレート）　　　　　　１．５６８３ポリ（０−メト
キシフェニルメタクリレート）　　　１．５７０５ポリ
（フェニルメタクリレート）　　　　　　　１．５７０
６ボリ（０−クレジルメタクリレート）　　　　　１．
５７０７ポリ（ジアリルフタレート）　　　　　　　　
　　１．５７２ポリ（オキシ−２，６−シメチルフエニ
レン）　　　１．５７５ポリ（オキシエチレンオキシテ
レフタレート）　　　１．５７５ポリ（ビニルベンゾエ
ート）　　　　　　　　　　１．５７７５２９− ０　　　　　　　　　′　　　　　　　　　キ各害キ等
ポリ（０−クロロベンジルメタクリレート）　　　　１
．５８２３ポリ（ｍ−ニトロベンジルメタクリレート）
　　　１．５８４５ポリ（４−メトキシ−２−メチルス
チレン）　　１．５８６８ポリ（０−メチルスチレン）
　　　　　　　　　　１．５８７４ポリ（スチレ／）　
　　　　　　　　　　　　　１．５９〜１．５９２ポリ
（０−メトキシスチレン）　　　　　　　　　１．５９
３２ポリ（ジフェニルメチルメタクリレート）　　　１
．５９３３３０− ポリ（Ｎ−ベンジルメタクリルアミド）　　　　１．５
９６５ポリ（ｐ−メトキシスチレン）　　　　　　　　
１．５９６７硬質ゴム（３２％Ｅｌ）　　　　　　　　
　　　　　１．６ポリ（ビニリゾ／クロリド）　　　　
　　　　　　１．６０〜１．６３ポリ（サルファイド）
１．６〜１．７ ポリ（ペンタクロロフェニルメタクリレート）１．６０
８ポリ（０−クロロスチレン）　　　　　　　　　１．
６０９８ポリ（フェニルα−ブロモアクリレート）　　
　１．６１２ポリ（ｐ−ジビニルベンゼン）　　　　　
　　　１゜６１５０ポリ（Ｎ−ビニルフタルイばド）　
　　　　　　　１．６２００ポリ（２，６−ジクロロス
チレン）　　　　　　　　１．６２４８ポリ（β−ナフ
チルメタクリレート’）　　　　　　１．６２９８ポリ
（α−ナフチルカルビニルメタクリレ　　１．６６−ト
） ポリ（スルホン）　　　　　　　　　　　　　　　１．
６３３ポリ（２−ビニルチオフェン）　　　　　　　　
１．６３７６ポリ（α−ナフチルメタクリレート”）　
　　　　　１．６４１０ポリ（ビニルフェニルサルファ
イド）　　　　　　１．６５６８ブチルフェノール−ホ
ルムアルデヒド樹脂１．６６尿素−チオ尿素−ホルムア
ルデヒド樹脂　　　１．６６０ポリ（ビニルナフタレン
）　　　　　　　　　　　１．６８１８ポリ（ビニルカ
ルバゾール＞　　　　　　　　　　１．６８３ナフタレ
ン−ホルムアルデヒド樹脂１．６９６フエノールーホル
ムアルデヒド樹脂　　　　　１．７０ホリ（ペンタブロ
モフェニルメタクリレート）１．７１前記の重合体のす
べてを本発明の粒子試薬用内側コアとして使用できるわ
けではない。その理由はコア単量体物質の選択に適用さ
れるべきその他の基準が存在するからである。例えばセ
ルロースは均一粒子サイズ球体として容易には製造され
ない。縮合重合体もまた有用ではない。

その理由はその重合工程は乳化重合により得ることので
きるタイプの球形粒子を生じないからである。いくつか
の熱可辿性重合体例えばポリ（オキシエチレン−オキシ
テレフタレート）およびいくつかの尿素−ホルムアルデ
ヒドタイプの熱硬化性樹脂は適当ではない。

関心ある単量体は高い屈折性を付与する置換基例えばハ
ライド、芳香族、複素環、不飽和または炭素環基の他に
ビニルまたはアリル基を含有するものである。

本発明の粒子試薬の製造のために有用な重合体粒子は優
先的に乳化重合によシ製造することができる。段階的乳
化重合はｎｌ）−１，５４以下ではない所望の屈折率に
近いコア／シェル重合体を導きうる。所望の屈折率の重
合体を得るためには、シェル重合体が重合体粒子の約１
０重量部を越えないことが好ましい。

３３− 重合体粒子の粒子サイズ制御のための便利な方法は第一
に種乳剤を製造することであるがそのサイズは使用され
る表面活性剤の量によって制御することができる。種乳
剤の製造の後、制御された速度で追加の単量体および表
面活性剤を加えて種乳剤中の粒子サイズを増大させるこ
とができる。

重合体粒子の外側のシェル重合体は、生物学的関心ある
化合物と反応しうる官能基を有する広範囲のエチレン性
不飽和単量体から製造することができる。場合により外
側シェルにはまたその他のエチレン性不飽和単を体を官
有させることができる。コアに対するシェル重合体の結
合は、コア重合体中の残存エチレン性不飽和基への官能
性単量体のグラフト重合により達成することができるし
または官能性単量体をコアのまわシに重合させて隣接シ
ェルを生成させるこ３４− とができる。好ましい単量体としてはエポキシ基含有の
もの例えばグリシジルメタクリレート、グリシジルアク
リレート、ビニルグリシジルエーテルおよびメタアリル
グリシジルエーテルがあげられる。その他の官能基とし
てはカルボキシル、ヒドロキシル、アミンおよびアルデ
ヒドがあげられる。

実質的完了までコア単葉体の変換を実施してその結果シ
ェル重合体が未知の組成の共重合体でなくてむしろ既知
組成のホモ重合体または共重合体であるようにすること
が好ましい。重合の終シにコア乳剤の温度を約９５℃ま
で上昇させることによって９８％以上の変換を達成する
ことができる。その表面が未知の組成の共重合体である
粒子を生成させる可能性を更に低下させるために、シェ
ル単量体をバッチ的ではなく徐々に加えることができる
。そのような方法においては、シェル重合体形成の初期
の段階の間に残存コア単量体は消費さ扛うる。使用され
る単量体がエポキシ基含有のものである場合には、シェ
ル重合体はホモ重合体であることが好ましいが、しかし
実際問題として外側シェルの１０重量部までの内側コア
単量体を存在させることができる。

ヒドロキシル、了ミノ、アルデヒド徒たはカルボン酸基
を含有するシェル単蓋体の場合には、水溶性重合体の形
成を除外するように性悪が払われなくてはならない。す
なわち例えばアクロレインまたはメタクリル酸を単独で
使用してホモ重合体シェル構造を生成させることはでき
ない。しかしながらこれらはその他の単量体と共重合さ
せて水不溶性重合体粒子を生成させることはできる。

また後でそれに代る化学技術にょ９処理して外側シェル
重合体を変性して共有結合しうる表面を生成させること
もまた可能である。例えばエポキシ基を加水分解して蛋
白質中のアミン基に対してカップリング剤として作用し
うるシアノゲンプｐミドと反応しうるジオール化合物を
生成させることができる。

アルデヒドを直接アミンと反応させてシック塩基を生成
させこれを次いで還元させて共有結合を生成させること
ができる。あるいはまた、アルデヒドを酸化させて酸を
生成させ、そしてカルボシイばドを以後のアミンとの反
応に使用してアミド結合を生成させることができる。

外側シェルは好ましくはホモ重合体である。

しかしこれは外側シェルの重量基準で１０部以下、好ま
しくは５部以下そして更によル好ましくは２部以下の内
側コアの単量体を含有しうる。

これら単量体は内側コア重合からの残存単量体３７− であシうる。

本発明の粒子試薬は数種の異った機能的シェル物質を含
有しうる。好ましいものは、生物学的関心ある化合物例
えばハプテン、抗体、蛋白質またはハプテン−蛋白コン
ジュゲートと共有結合形成するために便利に使用しうる
エポキシ基を含有する。そのような反応は本発明の粒子
試薬を生成させる結果となる。

粒子試薬の製造は次のようにして実施することができる
。ハプテンまたは蛋白性物質を例えば重合体粒子表面に
吸着させ、次いで官能基例えばエポキシド基を、適当な
ｐＨ条件下にハプテンまたは蛋白物質の補合的官能基と
反応させることができる。次いですべての未反応物質を
粒子試薬から分離させる。反応条件は粒子の実質的交叉
結合が生じない筈のものである。実質的な交叉結合は不
均一試薬粒子および以後のイム、３８− ノアツセーの間に予期せざるにとシ変化を生成させる結
果となる。

蛋白質物質を介して共有結合的に結合された生物学的関
心ある化合物を含有する粒子試薬の製法には２釉の方法
が存在しうる。生物学的関心のある化合物例えはハブテ
ンを第一に担体蛋白に結合させそして次いで重合体粒子
に結合させる。あるいはまた蛋白質をまず重合体粒子に
結合させそして次いでハブテンをこの蛋白に結合させる
ことができる。第２のアプローチは生物学的関心のある
柚々の化合物をそれらに結合させた粒子試薬の合成に対
して同一の蛋白−粒子試薬を使用するという利点を有し
ている。

ハブテンまたは蛋白質物質による重合体粒子の表面被覆
すなわち生物学的関心のある化合物に対する重合体粒子
の比は反応時間、生物学的関心ある化合物の不活性希釈
剤による希釈、または粒子分散を助ける添加剤によシ変
化させることができる。完全な被覆は最も迅速な凝集速
度を生成させうるけれども、より少ない表面被接はアツ
セー感度を上昇させるにあたって重要でありうる。

得られる粒子試薬を更にバッファー、血清成分および表
面活性剤を含有しうる実質的に水性の媒体中に懸濁させ
て光散乱イムノアツセーにおいて便用するだめの単分散
粒子試薬を生成させることができる。

本発明は更に生物学的関心ある化合物の測定のために感
度の高い光散乱イムノアツセーにおいて使用するための
免疫学的に活性な安定な粒子試薬に関する。アツセーの
対象は生物学的流体、細胞および組織抽出液中のそれに
対する免疫学的対応反応成分が産生されたものであシう
る広範囲な種々の物質を包含する。生物学的関心ある化
合物としては血清、血漿、唾液、尿または乳蛋白、薬物
、ビタミン、ホルモン、酵素、抗体、多糖体、細菌、プ
ロトシア、真菌、ビールス、細胞および組織抗原および
その他の血液細胞または血液流体物質があげられる。特
に興味のあるのは、疾患の状態および種々の薬物の評価
のためにその定量的測定の要求されている物質である。

このイムノアツセーはアナライトのタイプおよび要求さ
れる感度によって種々の方法で実施することができる。

比較的高濃度のアナライト例えばある種の血清蛋白に対
しては適当な抗体粒子試薬を直接粒子強化濁度計イムノ
沈降アッセイにおいて便用することができる。本発明の
方法は通常のイムノ沈降技術に比べて上昇した検出度、
試薬コストの相当する節約を与え、そしてこれはより少
４１− 量の患者試料体積の使用を可能ならしめる。逆に関心あ
る循環性抗体の検出のためには対応反応性抗原または抗
体粒子試薬を直接アッセイにおいて使用することができ
る。

本発明の阻害イムノアクセ−法はまた、粒子試薬の他に
二官能性または多官能性の薬剤を要求する。これらは以
後本明細書中では粒子試薬の凝集を生せしめるだめの凝
集剤として参照される。生物学的関心ある化合物によっ
て阻害されうるものはこの凝集である。この凝集剤は生
物学的関心ある化合物に対する抗体または前述したよう
に生物学的関心ある化付物の抗体に共有結合的に結合さ
れた重合体粒子に基く粒子試薬であシうる。これら凝集
剤はこの方法において便用される粒子試薬が生物学的関
心ある共有結合的に結合された化合物を含有しているよ
うな場合に使用される。

４２− 凝集剤はまた生物学的関心ある化合物と蛋白との多価コ
ンジュゲートであシうる。そのようなコンジュゲートは
、本発明の方法に使用される粒子試薬が生物学的関心あ
る化合物の共有結合的に結合した抗体を含有している場
合に使用される。

ハプテンの測定のためには、いくつかの異ったアツセー
構成を使用することができる。一つのそのような構成に
おいては、抗原性粒子試薬（ハプテン−粒子またはハブ
テン−蛋白−粒子試薬）を製造することができ、そして
生物学的関心ある化合物によるこれら粒子の抗体との反
応の阻害が測定される。との反応は粒子と患者ハプテン
との間の抗体に対する直接拮抗反応によるか％またはハ
ブテンと抗体との一連の反応およびそれに続く抗原粒子
試薬の添加によシ行われうる。

ハプテンに対するその他の丁ツセー構成は可溶性多ハプ
テンー蛋白コンジュゲートとの抗体粒子試薬の凝集はア
ナライトにより阻害される抗体粒子試薬を利用するもの
である。そのようなアツセーもまた拮抗的または順次的
様式で実施することができる。更にその他のアツセーに
おいては同一または異ったサイズの抗体および抗原粒子
試薬の両方を存在させることができ、そしてハブテンに
よる阻害を拮抗的または順次的（一連）様式で実施する
ことができる。

本発明の方法で起る凝集反応は凝集促進剤の存在によっ
て促進させることができる。そのような促進剤はポリエ
チレングリコールまたは表面活性剤例えばドデシル硫酸
ナトリウムであシうる。この後者はジゴキシン−ＨＢｋ
−粒子試薬ヲ使用するジゴキシンアツセーにおいて特に
有用である。

以下の実施例は本発明を説明する。

例　　１ ポリスチレン／ポリグリシジルメタクリレートシェル−
コア重合体粒子の製造 （ａｌ　　攪拌機およびサーモスタットつき加熱マント
ルを付した３を丸底フラスコが重合に使用される。その
重合は窒素雰囲気下で７０℃で実施される。６ｆの「ガ
フアク（Ｇａｆａｃ）Ｊ　ＲＥ！６１０（ＧＡＦ’社よ
シ入手可能な陰イオン表面活性剤）および２ｆの過硫酸
カリウムを含有する２ｔの水に５０ｄのスチレンを加え
ることによって種乳剤が製造される。半時間の後、４０
０ｄのスチレン、４ゴのアリルメタクリレートおよび１
．５ｔのエアロゾル０Ｔ−１００（ジオクチルナトリウ
ムスルホサクシネート、アメリカン・シアナばド社よシ
入手可能）、ｌニジ成る単歓体供給物の添加を４ｍ／／
分の速度で開始する。供給の完了後、乳４５− 剤を７０℃に１時間保持してスチレンの完全な変換を確
実ならしめる。最終固体分合量は１５．９％であり、コ
アポリスチレン乳剤の粒子サイズ（５４６ｎｍにおける
濁度測定により決定）は０．０６７μｍであり、そして
表面張力〔ド・ノイ（ｄｕ　Ｎｏｕｙ）リング法を使用
してテンジオメーターにより測定〕は６５ダイン／ｃｍ
２である。

（’ｂｌ　　シェル−コア重合体の製造のためには３０
０ゴ丸底フラスコが使用される。重合は８０℃で窒素雰
囲気下で実施される。２００ｄのコアポリスチレン乳剤
（例１ａ）を０．２ｆの過硫酸カリウムおよび０．２ｆ
の無水炭酸カリウムを含有する水５０ｍ１Ｋ加え、次い
で０．１ｍ／／分の速度で３．９−のグリシジルメタク
リレートを加える。

４５分後この混合物を冷却させる。最終シェル−コア重
合体は０．０６９μｍの粒子サイズを有している。

４６− 例　　２ ポリスチレン／ポリグリシジルメタクリレートシェル−
コア重合体粒子の製造 （ａｌ　　攪拌機およびサーモスタットつき加熱マント
ルを付した６を丸底フラスコが重合に使用される。塩基
性アルばすを充填されたカラムに通すことによって重合
前にスチレンを精製する。

重合は緩徐な窒素流れ下に７０℃で実施される。

４５ｄのスチレン、５ゴのエチレングリコールジメタク
リレート％５０ｍ／の３０％ナトリウムドデシルサルフ
ェート水溶液および２ｆの過硫酸カリウムを２ｔの脱イ
オン水に加えることによって重合を開始させる。この混
合物を７０℃で２０分重合せしめる。この時点において
、粒子サイズは０．０２１μｍであシそしてその表面張
力は３ａ８ダイン／ｃＴｎ２である。このことは実質的
にすべての表面活性剤が粒子の安定化に便用されている
ことを意味する。

次いで徐々に４ｍ／分の速度で４００　ｍｌのスチレン
および１０ｆの「エアロゾルＪＯ’Ｉ’−１００を加え
ることによって粒子を０．０４３μｍの最終サイズまで
生長させる。その最終サイズは初期粒子サイズおよび添
加スチレンの体積に基づいて０．０４４μｍ　であると
予測される。

前記で製造された５９０＃＋ｅの種乳剤（エマルジョン
）を１．５ｆの過硫酸カリウムを含有する脱イオン水１
５１０ｄＫ加えそして７０℃に加熱する。この混合物が
７０℃に達したら３４０　ｍｌのスチレンおよび３，４
ｔの「エアロゾルＪ　０Ｔ−１００を４１ｎｔ／分の速
度で加える。供給が完了した時点で温度を９５℃に０．
５時間の間上昇させて単量体の高い変換を確実からしめ
る。乳剤のエーテル抽出物のガスクロ−ｒ）グラフィー
によシ測定した場合その変換は９ゴ４％完了している。

最終コアサイズは０．０７０μｍである（初期サイズお
よび添加スチレンの体積から計算される予測値は０．０
６９μｍである）。

１’ｌ：＋）２ｒの炭酸カリウムおよび２ｆの過硫酸カ
リウムを官有する２００＃＋７！の水を前記（ａｌで製
造されたコア重合体に加え、そして反応温度を８０℃に
調整する。５０＃＋７！のグリシジルメタクリレートを
次いで１．５ｍ／分の速度で加える。

シェル重合に対して合計で４５分を与える。最終粒子サ
イズは０．７１μｍであり、そしてグリシジルメタクリ
レート変換率は９７．３％である（スチレンと同様にガ
スクロマトグラフィー測定を使用）。最終的にスチレン
変換は完全と考えられる。その理由はクロマトグラフィ
ーによシスチレンは検出可能ではないからである。

例　　３ ポリビニルカルバゾール／ポリグリシジルメタ４９− クリレートシェル−コア重合体粒子の製造蒸留ヘッドお
よび機械的攪拌機を付した３０〇−丸底フラスコが使用
される。０，５ｆの過硫酸カリウム、０．５Ｆの燐酸ト
リナトリウムに水加物および１．５２のナトリウムドデ
シルサルフェートを含有する水２００　ｍｇを窒素雰囲
気中で７０℃に加熱する。４．５　ｍｅのスチレ／およ
び０，５−のエチレンゾ１）コールジメタクリレートの
添加によって種乳剤を生成させる。３０分後、この種乳
剤は０．０２１μｍの粒子サイズおよびａ５のｐＨを有
している。１０Ｆｎｌのジクロロメタン中２０１のビニ
ルカルバゾールおよび１ｆの「エアロゾルＪＯＴ−１０
０の溶液を次いで０．１ｍ／分の速度で加える。それを
加えた後直ちにジクロロメタンを蒸留によシ除去する。

コア乳剤の完了後、１０−の水中の０．１ｔの過硫酸カ
リウムを加え次いで２．５−のグリシジルメタクリレ６
０− −トをＱ、１ｎ４７分の供給速度で加える。４５分を重
合に対して与える。最終粒子サイズは０．０４１μｍで
ある。最終固体分合量は１０．５％である。

例　　４ ポリスチレン／ポリグリシジルメタクリレートシェル−
コア重合体粒子の製造 （ａｔ　　例１（ａ）の方法を次のように使用する。２
１のアゾビスイソブチルアばジン塩酸塩を含有する水２
ｔに、５０艷のスチレンおよび２１のセチルトリメチル
アンモニウムプロミドを加えそして６０分間重合させる
。次いで２００νｎｅのスチレンと２　ｎｒｌのアリル
メタクリレ−１・との混合物を４１９７分の速度で加え
る。１００＋＋＋ｌ！の添加後そして再ひ添加完了した
後％Ｄ、７５ｔのセチルトリメチルアンモニウムプロば
ドを加える。

最終固体分合量は１０．５％であシそして粒子サイズは
０．１０６μｍである。

（ｔ）ｌ　　前記例４（ａ）でＭ造された２　００　ｍ
ｌのコア乳剤、Ｏ，ｌｒのアゾビスイソブチルアミジン
塩酸塩および０゜２ｖの酢酸ナトリウム（１！１ｍ水）
を１０−の水に溶解させたものの混合物を窒素雰囲気下
に７０℃に加熱する。温度を安定化させた後ｓ５＃１７
！のグリシジルメタクリレートを０，１−７分の速度で
加える。４５分を重合に対して与える。最終乳剤は４．
８５ダイン／ａｍ２の表面張力を有している。

例　　５ ゲンタマイシン粒子試薬の製造およびその便用５ｒｎｔ
の水中の５０Ｒｇのゲンタマイシンサルフェートを、そ
れ以上の沈殿が生成しなくなるまで水酸化バリウムを加
えることによシ中和する。

この硫酸バリウムの沈殿を遠心によシ除去する。

この上澄み液を５１Ｌｌのポリスチレン／ポリグリシジ
ルメタクリレート重合体粒子（例４で製造）および５−
のα１％「シェルコシリン（Ｓｃｈｅｒｃｏｚｏｌｌｎ
ｅ）１８（シェル・ケばカル社から入手可能なステアリ
ン酸からの置換イばダブリン）懸濁液の水酸化カリウム
でｐＨａ　５に調整した混合物に加える。

この混合物を７５℃に約３０分加温し、２００ｄの水で
希釈しそして混合イオン交換樹脂床を使用して脱イオン
化させる。得られる粒子試薬０．４−を２０−の０．１
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）に加え、次いで
０．３　Ｍ　ＮａＯ４および０．１％８ＤＳを含有する
０、０２０Ｍホスフェートバッファー（ｐＨ７，４３）
　０．２−を加える。

別々に人血清、ゲンタマイシン、抗ゲンタマイシン（兎
抗抽清、カレスタツド・ラボラトリーズ社製品）を、そ
して抗ゲンタマイシンとゲンタマイシ／との混合物を加
えることによシそしてその濁度を測定することによって
この混合物１．５−の免疫学的反応性を試験する。

５３− 濁度変化速度として表２に表わされている結果は、その
粒子試薬が免疫学的に活性であることそしてこれをゲン
タマイシンの測定に使用しうろことを示している。

表　　２ ゲンタマイシンによる濁度活性の阻害 １５μを人血清　　　　　　　　　　　　　　。

０．２μｇゲンタマイシン　　　　　　　　　　　２１
５μを抗ゲンタマイシン　　　　　　　　７４例　　６ テオフィリンの測定 （ａ）８−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジメ
チルキサンチンの製造 ８−置換テオフィリン誘導体である８−（３−カルボキ
シゾロビル）−１，３−ジメチルキサ５４− ンチンは「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　＆
　ＰｈａｒｍａａｏｌｏｇｙＪ第１３巻第４９７〜５０
５頁（１９７６）の発表された方法によって、次のよう
にして合成される。グルタル酸無水物（６，８２）およ
び４．５−ジアミノ−１，３−ジメチルピリミジン−２
，６−ジオン（６，２９″）を悩素下に１５−のＮ、Ｎ
−ジメチルアニリン中で６時間ディーンスタークトラッ
プを使用して還流させる。この混合物を冷却させ、濾過
しそして固体生成物（３，６ｆ　）を水から２回再結晶
させる。精製された誘導体は２５４〜２５５℃の融点お
よび質量スペクトルにおいてＶθ−２６６に予想される
親イオンビークを有している。

（ｂｌ　　重合体粒子へのテオフィリン誘導体の結合前
記（ａ）で製造された８−置換テオフィリン誘導体を次
のようにして例１で製造さ′ｎ′＃：、ポリスチレン／
ポリグリシジルメタクリレート重合体粒子に直接結合さ
せる。８−（６−カルボキシプロピル）　−１，３−ジ
メチルキサンチン（５０ｍｇ）および０．６　ｍｌのラ
テックス（１７％固体分）を０．０１５　Ｍ燐酸ナトリ
ウムバッファー（ｐＨ７，３，５０Ｉｎｔ）中で１時間
加熱させる。混合物のｐＨを５．４に調整しそして更に
１時間加熱する。

次いでｐＨを２．６に調整しそして最後の１時間加熱す
る。次いでこの混合物を遠心（８０分、４０、ＯＯＯｘ
ｇ）Ｌ、等容量の０．１％ドデシル硫酸す）　ＩＪウム
中に再懸濁させ、再遠心し、そして再び０．１％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ　）６０００を含有する０、
０１５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７８）に懸濁させる。次
いで試系を同一のバッファーに対して透析する◎ （Ｑ）　　テオフィリンの測定 この測定は６７℃で「ａｃａ■」装置６（デュポン社製
品）上で実施される。０．０２０ｄの未知量のテオフィ
リンを含有する試料を２．５％（ｗ／ｖ）ＰＩｎＧ６０
ＤＯを含有する０、１５Ｍホスフェートバッファー（ｐ
Ｈ７，８）　４．９　’８　＃＋７！に加える。０．０
０４＃１７＋の兎抗テオフィリン抗血清（カレスタツド
・ラボラトリーズ社製品）を加え、そして３．５分の培
養（インキュベーション）期間の後、３％固体分を含有
する前記（ｂｌで製造された粒子試系ｏ、１ｓｏｉを添
加することにより反応を開始させる。粒子凝集による濁
度上昇は粒子の添加後２９秒と４６秒との間の３４０ｎ
ｍの吸光度差（変化速度）として測定される。表６は血
清テオフィリンアッセイ用の標準曲線のだめのデータを
示す。未知試料について得られた結果をこの曲線に比べ
ることによシ存在するテオフィリン盆を与える（テオフ
ィリン標準は人血清を使用して水中の既知濃度のテオフ
ィリン溶液を適当に希釈することにより調製され、標準
からのアラ５７− セイ結果は標準曲線用データを与える）。

表　　６ １９２ ０．５　　　　１７０ １．０　　　　１４９ ３．３　　　　１１４ ５．０　　　　１０６ ２０．０　　　　５５ ４０．０　　　　３２ 例　　７ 人血清アルブミンの重合体粒子への結合ここに記載と同
様の方法を工ｇＧ％（゛粛々の薬物および薬物コンジュ
ゲート例えばジゴキシン−Ｈ８Ａ　、テオフィリン−Ｈ
８Ａ％”’ンタマイシンーＨ８Ａ％　　）プロマイシン
−Ｈ８Ａおよびサイロキシ５８− ンーカタラーゼコンジュゲートの重合体粒子への結合に
使用することができる。

１１Ｉｇ／−のＨ８Ａを含有する溶液（０，３Ｍ　Ｎａ
０４％０．０２Ｍホスフェート、ｐＨ９，７）　１．２
１に、攪拌および超音波処理を行いつつ例１で製造され
た６ｄのラテックス重合体粒子（１０％Ｗ／Ｖ　）を流
加する。この懸濁液を攪拌し、超音波処理しそして加熱
する（５０℃、１時間）。次いでこの懸濁液を７時間１
２，５００　ｒｐｍでデュポン社「ンーパル（５ｏｒｖ
ａｌｌ　）９型式Ｒｅ−５Ｂ遠心機およびＧ８Ａロータ
ーを使用して遠心してすべての非結合Ｈ８Ａを除去する
。粒子ペレットを前記バッファー中の０．１％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤ８）５０〇−中に再懸濁させ、５
０℃に１時間加熱し、そして同一条件を使用して再び遠
心させる。

粒子ペレットを２５０艷の０．１％８ＤＳ　ｉｃ再び再
懸濁させ、超音波処理しそして８８３４０−ターを使用
して１９．５０Ｏｒｐｍで２時間遠心する。粒子ペレッ
トをα１％Ｈ８Ａを含有する０、　１５　Ｍ　Ｎａ０ｔ
含有の０．１Ｍグリシンバッファー（ＧＢＳバッファー
）　（ｐＨ７，６）　６　ｏｔｎｔ中に再懸濁させそり
、テ次いで５Ｍ２４＋：ｌ−ターを使用して１９．５０
Ｏｒｐｍで８０分遠心する。粒子ベレツｌ最終的にグリ
シンバッファー化食塩水／　Ｈ８Ａ溶液６０ゴに再懸濁
させて、可能性ある以後の生物学的関心ある化合物の共
有結合のためにその表面に結合させた蛋白質を有する粒
子試系の１％（ｗ／ｖ　）懸濁液を生成させる。それは
４℃で保存される。

例　　８ 牛血清アルブミンの測定 （ａ）　　ＢＳＡの重合体粒子への結合２０翼９のＢＳ
Ａ　（シグマ・ケミカル社製品、フラクション■）を、
１０−の２０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ９，７）を伴な
う０．６Ｍ　Ｎａ０ｔに溶解させることによって２．０
１１９　／−の牛面清アルブばン（ＢＳＡ　）溶液を製
造する。次いで０．０６０ｍ１区分量のラテックス重合
体粒子（例１）（１４％Ｗ／Ｖ懸濁液、０．０６９μｍ
直径）をとのＥＳＡ溶液に加え、そして５０℃で１時間
超音波にかける。以後の遠心および超音波処理の条件は
使用される体積に応じて適当に減少させて例７に与えら
れている通９である。

（ｂ）　　ＢＳＡのアッセイ アッセイは２、ローのバッファー（０，１５Ｍ燐酸ナト
リウム、ｐＨ７，８，４，５％（ｗ／ｖ　）ポリエチレ
ングリ：Ｉ−ルＰＦｉＧ　６０００含有〕を含有する３
、０ゴキユベツトを１更用して６７℃でキャリー（Ｏａ
ｒｙ）２１９分光光度計で実施される。異った水準のＢ
ＳＡ含有試料０．０５０ｍｇおよび０．０５０ｍ１の抗
血清（マイルズ・バイオケミカルズ社製品ｓ　抗ＢＳＡ
　％非希釈）をこのキュベツトに加えそして５分間６１
− 培養させ、その後で０．０５０ｄのＢＳＡコーティング
した粒子を包含させる。前記（ａ）で製造されたＢＯＡ
粒子試薬を加えた時のその凝集程度を５４０ｎｍの吸光
度変化を追跡することによシモーターする。表４は試料
中のＢＳＡ水準の上昇によって凝集速度が阻害されるこ
とを示す。

表　　４ 試料ＢＡＡによる濁度活性の阻害 ０　　　　　　　　　　３５０ １　　　　　　　　　　６００ ２　　　　　　　　　　２４０ １０　　　　　　　　　　　６６ 例　　９ ハプトグロビンの測定 Ｃａ）　　ハプトグロビンの重合体粒子への結合０．０
３０−区分量のポリスチレン／ポリグリシ６２− ジルメタクリレートＭ合体粒子ラテックス（１７％ｗ／
ｖ懸濁液、０．０７６μｍ＠径、例１と同様の方法で製
造）を２０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ９，７）中に１．
０　Ｉｌ！？　／−の人ハプトグロビン（カルビオケム
ーベーリング社）全含有する溶液５ｍｅＫ加える。５０
℃で１時間［プランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）＠Ｊ型式Ｂ
−２２−４水浴ソニケーター中で超音波処理した後、こ
の懸濁液をデュポン社「ソーパル■」型式Ｒｅ−８Ｂ遠
心機中で１９．００Ｏｒｐｍで遠心分離させる。２時間
後に得られた粒子にレットを５ゴの０．１％（Ｗ／Ｖ　
）ドデシル硫酸ナトリウム中に再懸濁させる。更に４０
分遠心させた後に生ずるペレットを５ｄの０．２Ｍグリ
シン（ｐＨ７，４）中に再懸濁させそして角び遠心する
。完全に粒子を分散させるために［ヒートシステムズ・
ウルトラソニックス（Ｈθａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌ
ｔｒａｓｏｎｉｃｓ）■」型式Ｗ−１８５−Ｆノ二ケー
ターを使用して５分間超音波処理することによって最終
ベレットを０．２Ｍグリシン１ゴ中に再懸濁させる。

（ｂ）　　ハプトグロビンアッセイ アッセイは６７℃で２．０　ｍｌの０．１５０Ｍ燐酸ナ
トリウムバッファー（ｐＨ７，８）を含有する５、０−
石英キュベツトを使用してキャリー２１９分光光度計上
で実施さ扛る。０．０５０１ｎｔの抗人ハプトグロビン
抗血清（カルビオケムーベーリング社製品）を、前記バ
ッファー中に遊離ハプトグロビンを含有する試料０．０
４Ｍと共に３７℃で３分間培養する。その培養期間の後
、０．０５０ｍの前記（ａ）で製造されたハプトグロビ
ン粒子試薬（０，１０％ｗ／ｖ粒子）を加えセして３４
０ｎｍの吸光度変化の初期速度を追跡する。表５はハプ
トグロビン濃度の１数としての測定された速度を示す。

表　　５ 試料ハプトグロビンによる濁度活性阻害０　　　　　　
　　　　　　　　２１８０・１　　　　　　　　　　　
　　１２５０．２　　　　　　　　　　　　　　　７５
０．４　　　　　　　　　　　　　　　２８１．００ 例　　１０ ゲンタマイシンの測定 （ａ）　　重合体粒子へのゲンタマイシン−人血清ア′
ルプインコンジュゲートの結合 ５０−の蒸留水中の１．５ｔのゲンタマイシンサルフェ
ート（シグマ・ケずカル社製品）および１．５ｔ人血清
アルプンン（グロブリンなし、シグマ・ケくカル社製品
）の溶液に６．２５　ｆのＮ−エチル−Ｎ’−（５−ジ
メテルアイノブロピー６　δ− ル）カルボシイミド塩酸塩を攪拌しつつ加える。

溶液のｐＨを０．１Ｎ塩酸の添加によって６．　ＯＫ　
調整する。この混合物を室温に１８時間保持し、次いで
１５ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，８）に対
して４℃で透析させる。

次いでこのゲンタマイシン−ＩＳＡコンジュゲートをカ
ルボキシメチル化して粒子の非特異的沈降を阻止する。

前記で製造されたバッファー化コンジュゲートを希釈し
て６Ｍグアニジン塩酸塩および０．　Ｉ　Ｍ　）リス（
ヒドロキシメチル）アぐツメタン（ｐＨａ２）を含有す
る溶液５００−を生成させる。２．５−のβ−メルカプ
トエタノールを攪拌しつつ徐々に加える。この混合物を
３７℃に２時間保持し、次いで攪拌しつつ除徐に１２．
！Ｍのヨード酢酸す）　ＩＪウム塩を加える。１Ｎ水酸
化ナトリウムの添加によってそのｐＨをａ２に再調整す
る。６７℃に２時装置いた６６− 後、この生成物を０．３０Ｍ塩化ナトリウムおよび２０
ｍＭホスフェートバッファー（ｐＨ７，８）に対して透
析する。すべての沈殿した蛋白は１２．５０Ｏｒｐｍで
２０分遠心することによって除去できる。

ケンタマイシンーＨ８Ａコンジュゲートを使用するゲン
タマイシン−ＩＳＡ−粒子試薬の製造は例７に記載の方
法によシ実施される。

（ｂ）　　ゲンタマイシンに対するアッセイこのアッセ
イは「ａｃａ　Ｊ装置を使用して６７℃で実施される。

ゲンタマイシン含有試料ｏ、ｏ　ｉ　。

−を２．５％（ｗ／ｖ　）ポリエチレングリコ−／ｌ／
（ＰＥＧ）６０００を含有する０、１５Ｍホスフェート
バッファー（ｐＨ７，８）４．９９ゴに加える。兎から
の抗血清すなわち抗ゲンタマイシン−ＢＳＡ　（カレス
タツド・ラボラトリーズ社製品）　０．０１５ｄ（１／
２５０〜１１５００最終希釈）を加える。６５分間６７
℃で培養した後、前記（ａ）で製造さ扛た粒子懸濁液（
１％ｗ／ｖ、０．０５０ｍ／）を加えて反応を開始させ
る。粒子添加後の２９秒と４６秒との吸光度の差によっ
て濁度上昇を３４０ｎｎｎＴ測定する０表６はこのアッ
セイに対する標準曲線用データを示す。一方、標準ラジ
オイムノアッセイ法に対する比較は表７に与えられてい
る（ゲンタマイシンの標準は人正常血清中にゲンタマイ
シンプルフェートを溶解させ、そして適当な希釈液をつ
くることによって調製される）。

表　　６ 血清ゲンタマイシンによる濁度活性の阻害０　　　　　
　　　　１８２ １　　　　　　　　　　　　　１５７ ２　　　　　　　　　　　　　１３４ ４　　　　　　　　　　　　　　８９ ８　　　　　　　　　　　　　　４７ １２　　　　　　　　　　２２ １６　　　　　　　　　　　　　　１４表　　７ ＲＩＡに対する粒子ゲンタマイシンアッセイのＩＩＪ試
料数　　　　　　７１ 傾斜　　　１．０６５ Ｙ−切点１）　　　　−０，０６ 相関係数　　　　　０．９８５ （注）１）Ｙ軸は本発明の方法を表わす。

例　　１１ トブロマイシ／の測定 トブロマイシンーＨＥＩＡ−粒子試楽の製造およびトブ
ロマイシ／（ｔｏｂｒａｍｙａｉｎ）用アッセイはゲン
タマイシンに対して与えられている方法（例１０）に従
って実施される。表８は血清トブロマイシンによシ生ぜ
しめられた凝集（アグルチネーション）の阻害を示す。

６９− 表　　８ 崩清トブロマイシンによる濁度活性の阻害０　　　　　
　　　　　２１３ ２　　　　　　　　　　１９７ ６　　　　　　　　　　１０６ １２　　　　　　　　　　　３２ １６　　　　　　　　　　　２０ 例　　１２ テオフィリンの測定 （ａｊ　　テオフィリン−Ｈ８Ａコンジュゲートの製造
蛋白質とのカップリングに対して必要な８−置換テオフ
イリン銹導体は例６（ａ）の方法により合成される。

１、６　ｄのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２５１
ｇの８−（３−カルボキシプロピル）−１，３−ジメチ
ルキサンチン（例６で製造）のｌｆ［ｌｃＯ℃で１１１
１？のＮ−ヒドロキシサクシンイミド−）〇− および２１　ＱのＮ−エチル−Ｎ／−（ｙ、−ジメチル
アミノプロピル）カルボシイイド塩酸塩を加える。次い
でこの混合物全１８時間４℃で攪拌しそして次いで０℃
で０．０５Ｍ重炭酸塩バッファー　（６Ｆｎｌ、　Ｉ）
Ｈ９，０）中の人血清アルブｉ　ン（Ｈ８Ａ　。

１２０ＩＩｇ）の溶液に加える。得られた混合物を０、
５　Ｎ　ＮａＯＨの添加によってｐＨ９，０に保ちそし
てこの混合物を４℃に１８時間保存する。得られたコン
ジュゲートを脱イオン水に対して透析し、次いで凍結乾
燥させる。最終物質の分析は約２０：１のテオフイリ／
のＨ８Ａに対するモル比を示す。

（ｂ）　　テオフィリン−Ｈ８Ａ−粒子試薬の製造テオ
フィリン−Ｈ８Ａの溶液（３００ｍｅｓ　２Ｍｇ／ｌｒ
ｉ’）を０．０２Ｍ重炭原塩バッファー（ｐＨ９，７）
、中で調製する。次いで例１で製造さ′ｔ１．た重合体
粒子ラテックス１．８１ｎｔ（１５％固体分）を徐々に
攪拌しつつ加える。この混合物を１時間７０’Ｃに加熱
し、次いで遠心（８０分、４０，０００Ｘｒ）Ｋすべて
の非結合コンジュゲートを除去する。

粒子を等容量の０．１％ＳＤＳ中に再懸濁させそして再
遠心する。

この粒子試薬を２回遠心および再懸濁させることによっ
て０．０１５Ｍホスフェートバッフγ−（ｐＨ７，８）
で洗う。最終懸濁液は１請９／１ｒｔｌのＨ８Ａ　’ｉ
　含有する０、０１５Ｍホスフェートバッファー　（ｐ
Ｈ７，８）の形である。この容量を調整して１％（Ｗ／
Ｖ　）固体分粒子濃度を生成させる。

（０）　　テオフィリンアッセイ このアッセイは６７℃でｒ　ａｃａ　Ｊ装置上で実施さ
れる。テオフィリン含有試料０．０１０ｄを０、０５０
−の０．１５Ｍホスフェートバッファー（ｐＨ７、８）
で希釈しそしてこれを２．０％（ｗ／ｖ）　ＰＢＧ６０
００ヲも含有する４、９６＋ｄの同一ホスフェートバッ
ファーに加える。０．１％Ｈ８Ａを含有する０、１５Ｍ
ホスフェートバッファー（ｐＨ７，８）　０．０４０−
で希釈した０、０１０ｍｅ兎抗テオ７イリン抗血清（カ
レスタツド・ラボラトリーズ製品）を加えそして五５分
の培養期間の後前８ｆ（ｂ）製造の粒子試薬０．０５０
＋ｎｅを使用して反応を開始させる。テオフィリン標準
の作製および濁度測定は例６の記載のようにして実施さ
れる。表９は薬物−コンジュゲートー粒子試薬を使用す
る血清テオフィリン測定用の標準曲線のためのデータを
示す。

表　　９ 崩清テオフィリンによる濁度活性のＩＬＡ４害２．５　
　　　　　　　　　　　２２４５、０　　　　　　　　
　　　　　　　　　２０８１０．０　　　　　　　　　
　　　１５８２０．０　　　　　　　　　　　　　８６
４０．０　　　　　　　　　　　　　４６−’／３− 例　　１３ サイロキシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ　）の測定ブイロキ
シンー力タラーゼコンジュゲートの製造５ｖのＬ−サイ
ロキシンナトリウム塩（６，６ミリモル）を２０　ｍｅ
の５０％水性ジオキサンに懸濁させる。１８．９ミリモ
ル（２，６４ｍ１）のトリエチルアミンを攪拌しつつこ
の懸濁液に加え、次いで１．７１ｔｃ６．９５ξリモル
）のＮ−第３級ブトキシカルボニル−２−フェニルアセ
トニトリルを加える。室温で２時間攪拌した後、２５　
ｍｌのＨ２Ｏおよび３３艷の酢酸エチルを加え、そして
水性相および有機相を分離する。５５ｍ１の酢酸エチル
でこの水性相を抽出する。固体状クエン酸す）　ＩＪウ
ムをこの水性相に加えて溶液のｐＨを４．０に低下させ
る。得られた沈殿の’Ｎ−（第３級ブトキシ）−Ｌ−サ
イロキシンを集め、真空下に乾燥させそして一２０℃に
保存する。

７４− １．２３ｆ（１，４ミリモル）のＮ−第５級ブトキシ）
−Ｌ−サイロキシンおよび（ｌＬ１６Ｆ（１，４ばリモ
ル）のＮ−ヒドロキシサクシンイミドを２０−のジメチ
ルホルムアミドに溶解させる。

０．３１１１．５　＃リモル）のジシクロへキシルカル
ボシイばドをこの溶液に加え、次いでこれを室温で１８
時間攪拌する。反応の間に沈殿した尿素を濾過によシ除
去しそして活性エステルを官有するｐ液を一２０℃で保
存する。

１５１Ｒｔの０．１５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨａｌ）
中に４５ｍ９０カタラーゼを溶解させる。０．６０献の
活性エステル溶液（１５０ｍＭ）を加え、そして得られ
る懸濁液を４℃で１時間攪拌する。

すべての未反応エステルを１５，０００　ｒｐｍテ３０
分遠心することによシ除去し、そして次いでその上澄を
１０ｍＭ燐酸カリウムバッファー（ｐＨ７）に対して透
析させる。Ｎ−（第３級ブトキシ）−Ｌ−サイロキシン
−カタラーゼコンジュゲートを凍結乾燥させ、そして次
いで一２０℃で保存する。

（１）ｌ　　サイロキシン−カタラーゼ−粒子試薬の製
造 反応をＮａ０６不存在下に４０℃で実施する以外は例７
の方法に従って６０嘘のＮ−（第３級ブトキシ）−Ｌ−
サイロキシン−カタラーゼコンジュゲート（１０ｍＭの
燐酸カリウムバッファー（ｐＨ７）中！ｈ、０肩ｙ／ｍ
ｌの溶液１０Ｗｄ！、〕を例１で製造された０、　０６
９μｍ粒子サイズのラテックス重合体粒子に結合させる
。

（０）　　サイロキシンアッセイ サイロキシンに対する濁度アッセイは「ａｃａＪ装置上
で実施される。０．１５Ｍホスフェートバッファー（ｐ
Ｈ７，８）　、２．５％（ｗ／ｖ）　ＰＥＧ　６　Ｄ　
００．０．０１％１−アニリノ−８−ナフタレンスルホ
ン酸（Ａｌ１）および０．２％サリチル酸ナトリウムヲ
含有するバッファー４．８−区分量に、０．１０ｍ１の
種々の濃度のサイロキシンｔｃ料（０，ＺＭ　ｘｏａ中
にＬ−サイロキシンナトリウム塩を溶解させそして０．
１％Ｈ８Ａを含有する０、１５Ｍホスフェートバッファ
ー（ｐＨ７，８）中で希釈させることによシ製造〕を加
える。０．０５０ｍ１の竿尻サイロキシン抗血清〔アボ
ット・ラボラトリーズ社製品、０．１％Ｈ８Ａ含有ホス
フェートバッファー（ｐＨ７）で１７５に希釈〕を各区
分量に加え、そして６７℃での３５分の培養期間の後、
そのｌ　ａｃａ　Ｊテストノぞツクに０．０５０ｍ７！
の１％サイロキシン−カタラーゼ粒子試薬を加えること
によって、濁度計的反応を開始させる。！＋４０ｎｍに
おける濁度の上昇速度を２９秒および４６秒後に測定す
る０表１０はこのアッセイに対する標準曲線用のデータ
を示す＠ −７ツー 表　　１０ サイロキシンによる濁度活性の阻害 ０　　　　　　　　　　５２ １　　　　　　　　　　４６ ５　　　　　　　　　　３７ １０　　　　　　　　　　２８ 例　　１４ ジゴキシンの測定 （ａ）　　ジゴキシン−ＵＳＡコンジュゲートの製造２
、４０　ｆのジゴキシンを１４４−の無水アルコールに
溶解させる。１４４ゴの０．１Ｍ過沃素酸ナトリウムを
攪拌しつつ滴加し、そして反応を６０℃で２５分継続さ
せる。この時点で３．２６４祠の０．１Ｍグリセロール
を加えて反応を停止させる。５分後、この反応混合物を
１４４−の脱イオン水中６．６ｔのＨ８Ａ　（５％（ｗ
／ｖ　）炭酸カリウムでｐＨを９，２に調整〕に滴加す
る。反応の経７８− 過の間（３０分、２５℃）５％（ｗ／ｖ　）炭酸カリウ
ムを使用してそのｐＨを９０〜９．５に保持する。

１．２７２ｆの硼水素化ナトリウムを加えそして３時間
後にそのｐＨを３．６５ＭＨ（３ｔで６．５に調整する
。

この溶液を次いで脱イオン水に対して透析する。

透析の後、溶液をＰＭ　１Ｑフイルターを使用したアず
コン（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮装置で１３０ｍｅまで濃縮す
る。次いでこの溶液を凍結乾燥させてジゴキシン−Ｈ８
Ａコンジュゲートを生成させる。硫酸炭化法によるジゴ
キシン含量分析および２８０ｎｍの吸光度による蛋白含
量の分析は蛋白分子当ｊｌ）　１３．５のジゴキシ／分
子の比を示す。

（ｂ）　　ジゴキシン−Ｈ８Ａ粒子試薬の製造ジゴキシ
ｙ−ＵＳＡコンジュゲートを例７に与えられている方法
によって０．０６９μｍおよび０．１０９μｍ（例１の
方法により製造された）の２釉の異ったサイズのラテッ
クス重合体粒子に結合させる。

（０１ジゴキシンのアッセイ このアッセイけ３７℃でｒ　ａｃａ　Ｊ装置上で実施さ
れる。標準（人血清中、および０．１Ｍグリシン、１％
ＮａＯ２，０，０１％ナトリウムアジドを含有スるバッ
ファー（ｐＨ７，５）すなわちＧＢＳ　バッファー中の
両方）を、ＤＭＳＯ中に１１１９／ｄジゴキシン区分量
を加えそして適当な希釈を行うことにより製造する。１
００μを標準試料を、０．０２Ｍホスフェート、０．３
　Ｍ　Ｎａ、Ｏ６，０，１％８１）ｓ　、０．０１％ナ
トリウムアジドを含有するｐＨ７，５のバッファー４．
９　ｍｌに加え、次いで５０μｔの抗血清（カペル・ラ
ボラトリーズ社の７抗ジゴキシン、１ｍｇ　／　ｍｌの
Ｈ８Ａを含有するＧＢＳバッファー中に１７５０に希釈
、１１５０００最終希釈）を加える。３７℃で３１．５
分の培養期間の後、２種の異ったジゴキシン−ＵＳＡ粒
子試薬の各々０．０５０−を加えて反応を開始させる。

速度（開始後２９秒および４６秒後の吸光度差）として
、または開始後種種の時間での終点として３４０ｎｍで
濁υを測定する。表１１は０．１０９μｍの粒子を使用
して６４０ｎｍで得られたミＩＪ吸光度単位での終点値
を示す。

一方、表１２は［１，０６９μｍの粒子を使用した速度
データを示す。データ比較は０〜５０ｎｇ濃度範囲に対
して与えられたｍＡを達成するために必要な時間はよシ
小さい出発粒子の使用の場合には１５分から１０分に短
縮されることを示す０表１３は粒子試薬（０，０ｂμｍ
の重合体粒子ベース）で開始させた後２９秒と４６秒と
の間の吸光度変化速度を測定した標準曲線のためのデー
タを示す。

比較において、表１４はよシ低い抗体濃度においてさえ
も、より大なる０、１０９μｍ重合体粒子をベースとし
た粒子試薬に対しては感度の若干８１− の損失があることを示す。０．０６９μｍ粒子をに−ス
としたよシ小さい粒子試薬の場合には％　１／１２５０
抗体希釈において％５００　ｎｇ／４試料は４２％の阻
害を招来するが、一方よυ大なる粒子試薬は１／１６６
７抗体希釈において初速度の２２％阻害を招来する。こ
の例はよシ小さい粒子を使用した場合のジゴキシンに対
するアッセイ感度の改善を例示する。

表　　１１ ジゴキシンによる濁度活性阻害の終点測定（０，１１０
９ＩＩ粒子、抗体希釈１１５０００　）０　　　　　　
　　　７５０ ５（１７００ １００６６０ ２５０６２０ ５００５７５ １０００５２５ ８２− 表　　１２ ジゴキシンによる濁度活性の円害の終漬測定（０，０６
９ＩＩｍ粒子、抗体希釈１１５０００）０　　　１９０
　　　２５０　　３３０　　　３７’ｌ］１０　　　　
１７５　　　２３０　　３００　　　３４５５０　　　
　１６５　　　２００　　２５０　　　２７５１００　
　　　　１６０　　　　１９０　２５０　　　２５０５
００　　　　１４０　　　１４５　　１５０　　　１６
０１０００　　　　１３０　　　１３０　　１３０　　
　１３０表　　１５ ジゴキシンによる濁反活性１泪害の速度測定（抗体希釈
　１／１２５０） ジゴキシン濃度（ｎｖ匂）　　　速度（ｍＡ１０．３４
０ｎｍ）０　　　　　　　　　８１ ５００　　　　　　　　　　４６ １０００　　　　　　　　　　７ ｓｏｏｏ　　　　　　　　　　　。

１００００　　　　　　　　　　０ 表　　１４ ジゴキシンによる濁度活性阻害の速度測定（抗体希釈、
１／１６６７＞ ０　　　　　　　　　　　１１２ １２５　　　　　　　　　　　１０５ ２５０　　　　　　　　　　　　９７ ５００　　　　　　　　　　　　８７ １０００　　　　　　　　　　　　４４２０００　　　
　　　　　　　　　２６例　　１５ ジゴキシンの測定 （ａｌ　　重合体粒子への抗体の結合 ジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲートに対する特異的兎抗
血清の免疫グロブリンＧ分画（工ｇＧ）（カペル・ラボ
ラトリーズ社製品）をＱ、３　Ｍ　Ｎａ０６゜０．０２
０Ｍ燐酸ナトリウムおよび１．０肩ｇ／−のＨ８Ａを含
有する２５ｍ／バッファー中に１．０Ｑ／−の最終工ｇ
Ｇ濃度に溶解させる。Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを使用して溶液
のｐＨを９゜７に調整した後、例１と同様の方法で製造
された０、０６９μｍ直径の１４％（ｗ／ｖ　）重合体
粒子懸濁液０．１５〇−区分量を徐々に加える。得られ
た懸濁ｔｉを５０℃に加熱しそして［ブランソン（Ｅｒ
ａｎｓｏｐＪ型式Ｂ−２２−４水浴ソニケーターを使用
して１時間しずかに超音波処理する。超音波処理の後、
＠濁液を２時間遠心させ、その後で得られたベレットを
０．１％（Ｗ／Ｖ　）ドデシル硫酸ナトＩＪウムに再懸
濁させ、そして再び４０分間遠心させる。第２の遠心か
らのベレットをグリシンバッファーさ扛た食塩水（ＧＢ
ＥＩ、０．１Ｍグリシ：’　、０．１５　Ｍ　Ｎａｏｔ
％ｐＨ７、６）に再懸濁させ、そして史に４０分遠心さ
せる。第３の遠心段階はＩｇＧ−重合体粒子試薬（＃果
剤）のにレットを生成させる。これを１、０１ｇ／　ｍ
ｅ　Ｈ８Ａおよび０．１％（ｗ／ｖ）ナトリウム８５− アジドを含有するＧＢ８５ｍｌ中に再懸濁させる。

使用前に粒子を分散させるためにはこの最終懸濁液を２
０分間ヒートシステムズ・ウルトラソニクス■型式Ｗ−
１８５−Ｆソーケータ−で超音波処理する。すべての遠
心段階はデュポンソーパル型式ＲＯ−５Ｅ遠心装置を使
用して５Ｍ−２４０−ターを１９，０００ｒｐｍで使用
して実施される。

（１））　　ジゴキシン−Ｈ８Ａの重合体粒子への結合
ジゴキシン−Ｈ８Ａコンジュゲートは１０ｍＭジゴキシ
ンを３０℃で３０分間５０％エタノール中で５０ｍＭ過
沃素酸ナトリウムと反応させることによシ製造される。

７０ｎ＋Ｍグリセロールを加えて反応を停止させた後、
２容量のこの溶液を炭酸カリウムでｐｎｌｏ、１に調整
した１容量の２１．３１１Ｆ／ｍＨ８Ａに加える。この
ジゴキシン−ＵＳＡコンジュゲート溶液を室温で１時間
培養させ、その後で５０ｍＭ水準まで硼水素化す）　Ｉ
Ｊウ８６− ムを加える。更に２時間後そのｐＨを３Ｎ　ＨＯ１Ｃ６
，５に調整する。得られたコンジュゲート浴液をｐＨ１
８の５ｍＭ燐酸す）　ＩＪウムに対して透析する。

このジゴキシン−Ｈ８Ａコンジュゲート溶液を２０ｍＭ
＃酸ナトリウム、０．３ＭＮａ０ｔバツフアー（ｐＨ９
，７）で希釈して２ｊ１ｇ／ｍｌの最終蛋白濃度とする
。例１と同様の方法で製造された直径０．０６９μｍの
１４％（ｗ／ｖ　）懸濁液の重合体粒子ラテックス０．
５４０ｍＭ区分量を９０ｆｆ！７！のコンジュゲート溶
液に加え、そして５０℃で１時間超音波処理する。超音
波処理および以後の遠心の条件は前記（ａｌに与えられ
ているものと同一であシそしてこれはジゴキシン−Ｈ８
Ａ−粒子試薬を生成させる。

（ｃ＋　　ジゴキシンのアッセイ このアッセイは２．０　ｒｔｒｌのバッファー〔４，５
％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール６０００を含有す
るｐＨ７，８の０．１５０Ｍ燐酸ナトリウムバッファー
〕を含有する３、　０　Ｉｎｌの石英キュベツトを使用
して３７℃でキャリー■２１９分光光度計中で実施され
る。（抗ジゴキシン）　工ｇＧ−粒子試薬区分量ヲこの
バッファーおよび１．０　Ｑ／ｍｌ　Ｈ８Ａ　ｋ含有す
るＧＢＳ中の遊離ジゴキシン官有試料４０μｔと共に５
分間培養する。培養後、ジゴキシン−ＵＳＡ粒子試薬の
区分量を加えそして３４０ｎｍにおいて初期吸光度変化
速度をモニターする。表１５は吸光度変化速度の濃度依
存性を示し、そして表１６はジゴキシン（４０μｔの粒
子試薬および５０μｔの凝集剤）によるこれら速度の阻
害を示す。

表　　１５ ！１０　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　
２４６３０　　　　　　　　　　６０　　　　　　　　
　　　２００３０　　　　　　　　　　５０　　　　　
　　　　　　１７４４０　　　　　　　　　　　５０　
　　　　　　　　　　１７０２０　　　　　　　　　　
５０　　　　　　　　　　　１２５１５　　　　　　　
　　　３０　　　　　　　　　　　　６０表　　１６ ジゴキシンによる初速度の阻害 ０　　　　　　　　　１６５ １　　　　　　　　　１２０ ５　　　　　　　　　１０５ ０９５ ０８５ ０５４ １００　　　　　　　　　　　３５ ８９− 第１頁の続き 優先権主張　０１９８１年１０月２８日［相］米国（Ｕ
Ｓ）■３１５９２２ ０発　明　者　キャサリン・エリザベス・ルーニイ アメリカ合衆国プラウエア用（１ ９８０７）ウイルミントン・センタ ービル・バリーウェイ５９０９ ０発　明　者　マイクル・アンドリュー・ギヤレット・
ルディ アメリカ合衆国ペンシルバニア 州（１９３８０）ウェストチェスター ・アンダーソンアベニュー３０２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）本質的に （（転）　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
   コアがナトリウムＤ線の波長で測定して１．５４以下で
   ない屈折率をＭしそして外側シェルが （１）　　エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシ
   およびアルデヒドよシ成る群から選ばれた生物学的に関
   心ある化合物と反応しうる官能基を有するエチレン性不
   飽和単量体、 （２）場合によシその他のエチレン性不飽和単量体、お
   よび （３）外側シェルの１０重量部を越えない内側コアの単
   量体 の重合体であシ且つこの外部シェルは前記内側コアの存
   在下での重合によって製造されるものである０、０５〜
   ０．１μｍの大約の直径範囲を有する重合体粒子と、 （Ｂ）　　前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
   いる生物学的に関心のある化合物またはその抗体 とからなる、高屈折率を有する粒子試薬。 ２）前記外側シェルが前記重合体粒子の５重量部を越え
   ない童である前記特許請求の範囲第１項記載の粒子試薬
   。 ３）本質的に （Ａ）　　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
   コアがす）　ＩＪウムＤ線の波長で測定して１．５４以
   下でない屈折率を有しそして外側シェルが （４）　エポキシ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシお
   よびアルデヒドよシ成る群から選ばれた生物学的に関心
   ある化合物と反応しうる官能基を有するエチレン性不飽
   和単量体、 （２）場合によシその他のエチレン性不飽和単量体、お
   よび （３）外側シェルの１０重量部を越えない内側コアの単
   量体 の重合体であシ且つこの外部シェルは前記内側コアの存
   在下での重合によって製造されるものである０、０３〜
   ０．１μｍの大約の直径範囲を有する重合体粒子と、 （Ｂ）　　前記重合体粒子が蛋白性物質を介して共有的
   に結合せしめられている生物学的に関心のある化合物 とからなる、高屈折率を有する粒子試薬。 ４）生物学的に関心ある化合物を測定するにあたυ、下
   記すなわち （→（１）本質的に （ａ）　　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
   コアがす）　ＩＪウムＤ線の波長で測定して１．５４以
   下でない屈折率を有しそして外側シェルが （１）　　エポキシ、カルボキシ、アばノ、ヒドロキシ
   およびアルデヒドよシ成 る群から選ばれた生物学的に関心あ る化合物と反応しうる官能基を有す るエチレン性不飽和単量体、 （１１）場合によシその他のエチレン性不飽和単量体、
   および （曲　外側シェルの１０重を部を越えない内側コアの単
   量体 の重合体であり且つこの外部シェルは 前記内側コアの存在下での重合によっ て製造されるものである０、０６〜０．１μｍの大約の
   直径範囲を有する重合体粒子と、 （ｂｌ　　前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
   いる生物学的に関心のある化 合物またはその抗体 とからなる高屈折率を有する粒子試薬、（２）生物学的
   に関心のある化合物を含有していると推足される液体、
   および （５）　　凝集剤 を培養すること、そして （Ｂ）　　凝集から生じた増大した粒子サイズを分光分
   析的にＩ１１定すること の各段階を包含する、方法。 ５）重合体粒子が生物学的に関心のある化合物に共有結
   合的に結合されている％　ｉ’ｔｔ記特許請　５− 求の範囲第４項記載の方法。 ６）凝集剤が （Ａ）　　生物学的に関心のある化合物に対する抗体、 （Ｂ）　　本質的に （１）　　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
   コアがす）　ＩＪウムＤ線の波ｉ　テ測定して１．５４
   以下でない屈折率を有しそして外側シェルが （ａ）　　エポキシ、カルボキシ、アばノ、ヒドロキシ
   およびアルデヒドよシ成る群 から選ばれた生物学的に関心ある化合 物と反応しつる官能基を有するエチレ ン性不飽和単量体、 （ｂ）　　場合によシその他のエチレン性不飽和単量体
   、および （０）　　外側シェルの１０重量部を越えない　６− 内側コアの単量体 の重合体であシ且つこの外部シェルは前記内側コアの存
   在下での重合によって製造されるものである０、０３〜
   ０．１μｍの大組の直径範囲を有する重合体粒子と、 （２）前記重合体粒子が共有的に結合せしめられている
   生物学的に関心のある化合物に対する抗体 とからなる、高屈折率を有する粒子試薬よシ成る群から
   選ばれる前記特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７）重合体粒子が生物学的に関心ある化合物の抗体に共
   有結合的に結合されている前記特許請求の範囲第４項記
   載の方法。 ８）凝集剤が生物学的に関心ある化合物と蛋白との多価
   コンジュゲートである前記特許請求の範囲第７項記載の
   方法。 ９）培養段階（ａＪＯ間に凝集促進剤をも存在せしめる
   前記特許請求の範囲第４項記載の方法。 １０）凝集促進剤がポリエチレングリコールおよびナト
   リウムドデシル硫酸ナトリウムより成る群から選ばれる
   前記特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１）重合体粒子を蛋白物質を介して生物学的に関心の
   ある化合物に共有結合的に結合させる前記特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 １２）本質的に ＋ＡＪ　　内側コアと外側シェルとを有し、その際内側
   コアがす）　ＩＪウムＤ線の波長でｆｆｆｌＪ　定して
   １．５４以下でない屈折率を有しそして外側シェルが （１）　　エポキシ、カルボキシ、ヒドロキシおよびア
   ルデヒドより成る群から選ばれた生物学的に関心ある化
   ＆物と反応しりる官能基を有するエチレン性不飽和単量
   体、（２）場合によシその他のエチレン性不飽和単量体
   、および （６）　　外側シェルの１０重量部を越えない内側コア
   の単量体 の重合体であシ且つこの外部シェルは前記内側コアの存
   在下でのＴｆｉ合によって製造されるものである０、０
   ３〜０．１μｍの大組の直径範囲を有する重合体粒子と
   、 （Ｂｌ　　前記重合体粒子が共Ｍ的に結合せしめられて
   いる生物学的に関心のある化合物の抗原 とからなる高屈折率を有する粒子試薬。 １６）前記外側シェルが前記重合体粒子の５重量部を越
   えない量である前記特許請求の範囲第１２項記載の粒子
   試薬。 １４）生物学的関心ある化θ物の抗原が蛋白物質　９− を介して前記重合体に結合されている前記特許請求の範
   囲第１２項記載の粒子試薬。 １５）蛋白質を測定するにあた９、下記すなわち（Ａ）
   （１１本質的に ｔａｌ　　内引ＩＩコアと外１則シェルとを有し−その
   際内側コアがナトリウムＤ線の波長 で測定して１．５４以下でない屈折率を廟しそして外１
   則シェルが （１）　　エポキシ、カルボキシ、アミン、ヒドロキシ
   およびアルデヒドよシ成 る群から選ばれた生物学的に関心あ る化合物と反応しうる官能基を有す るエチレン性不飽和単量体、 （１１）場合によシその他のエチレン性不飽和単量体、
   および （曲　外側シェルの１０重量部を越えない内側コアの単
   量体 １０− の重合体であり且つこの外部シェルは 前記内τ（１］コアの存在下での重付によって製造され
   るものである０、０６〜０，１μｍの大組の直径範囲を
   有する重合体粒子と、 （ｂ）　　前記重合体粒子が共有的に結合せしめられて
   いる蛋白質の抗体 とからなる高屈折率を有する粒子試薬、（２）　　生物
   学的に関心のある化合物を含有していると推定される液
   体 を培養すること、そして （Ｂ）　　凝集から生じた増大した粒子サイズを分光分
   析的に測定すること の各段階を包含する、方法。 １６）前記蛋白が抗体であシそして前記重合体粒子が前
   記蛋白の抗体または抗原に結合されている、前記特許請
   求の範囲第１５項記載の万１１− 注口