JPH0318875B2 - - Google Patents

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JPH0318875B2
JPH0318875B2 JP57089707A JP8970782A JPH0318875B2 JP H0318875 B2 JPH0318875 B2 JP H0318875B2 JP 57089707 A JP57089707 A JP 57089707A JP 8970782 A JP8970782 A JP 8970782A JP H0318875 B2 JPH0318875 B2 JP H0318875B2
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meth
acrylate
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particles
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Seiji Aotani
Hisanori Kanayama
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Japan Synthetic Rubber Co Ltd
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は免疫学的反応性物質、酵素、細胞、細
胞識別性物質などの生物学的物質を担持するに好
適な担体に関する。 抗体または抗原などの免疫学的反応性物質を担
体に担持し、免疫学的反応によつて反応する抗原
または抗体などの免疫学的反応性物質を検出測定
することは、臨床検査の重要な手段となつてい
る。また、特定の細胞と選択的に結合する物質、
すなわち細胞識別性物質を粒子状担体に担持し
て、それに対応する細胞を識別、分離をすること
もしばしば行なわれている。さらに酵素を粒子状
担体に担持して酵素反応を行なつたり、細胞を粒
子状担体に担持して、粒子状担体表面を細胞培養
床として細胞を培養することもよく行なわれてい
る技術である。このような目的に使用される粒子
状担体としては、従来、人、羊、ニワトリ、ワニ
などの赤血球や、ポリスチレン、スチレン−（メ
タ）アクリル酸共重合体などの重合体の微粒子が
用いられてきた。例えば免疫学的反応性物質を担
持した担体の液体媒体分散液（以下このものを感
作試薬という）を用いて免疫学的反応を行ない感
作試薬の状態変化、すなわち感作試薬の凝集状
態、沈降状態あるいは分散状態などを観測するこ
とにより、対応する免疫学的反応性物質の存在を
測定することができる。 また、エンザイムイムノアツセイ、ラジオイム
ノアツセイなどのように標識化被検出物質を検液
に加えておけば粒子を分離することにより粒子と
反応した被検出物質の量を測定することができ
る。さらに細胞に抗原性基または抗体性基がある
場合、担体にこの抗原性基または抗体性基に対応
する抗体または抗原を担持しておけばその細胞の
みを選択的に捕集することができる。 これらの方法において生物学的物質などを担持
する粒子状担体に要求されるのは非特異的反応、
非特異的凝集などを起こさず安定なこと、粒子状
担体を液体媒体から容易に分離できること、また
感作試薬として被検出物質と反応することによる
感作ラテツクスの状態変化を簡便に検出測定でき
ることなどである。 赤血球からなる担体を用いた感作ラテツクスは
被検出物質と反応することによつては比較的短時
間で感作ラテツクスの状態変化を観測しやすいた
め、スライド法、マイクロタイター法などの簡便
な検出測定方法における感作ラテツクスとして使
用されてきたが赤血球を用いるために感作ラテツ
クスの品質のバラツキが大きいこと、非特異的凝
集が起こり易いこと、保存が困難であることなど
の理由により、安定な担体への変換が求められて
いる。このためにポリスチレンなどの重合体の微
粒子が、安定性、品質の一定性が優れているとの
理由によつて赤血球からなる担体の代りに担体と
して免疫学的反応性物質などを物理的に吸着させ
て、あるいは科学的に結合させて担持し、使用さ
れてる。 しかしポリスチレンなどの重合体からなる担体
は、感作試薬として被検出物質を沈降状態の観察
により、検出測定しようとすると数時間から数十
時間と長時間を要するという欠点がある。 本発明の目的は赤血球からなる担体を用いた感
作試薬のように被検出物質との反応による状態変
化が観測しやすく、ポリスチレンなどの重合体か
らなる担体のように安定性及び品質の一定性を兼
ね備えた特定の重合体粒子よりなる生物学的物質
などを担持するに好適な担体を提供することにあ
る。 一般式（） （式中R1およびR2は同一又は異なり、水素原子
又は低級アルキル基、R3は炭素数２または３の
直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、ヒドロキ
シル基で置換されていてもよく、Ｘは同一又は異
なるハロゲン原子であり、ｍは０または１〜10の
整数であり、ｎは１〜５の整数を示す） で表わされる単量体又はこれらの単量体と共重合
可能な他の単量体とを（共）重合して得られる重
合体粒子よりなる担体が提供される。 本発明に用いられる一般式(I)で表わされる単量
体のR1およびR2としては水素原子またはメチル
基が、R3としてはエチレン基またはプロピレン
基が好ましく、またＸとしては塩素原子または臭
素原子が、ｍとしては０または１が、ｎとしては
３〜５が好ましい。一般式(I)で表わされる単量体
の具体例としては（メタ）アクリル酸モノフルオ
ロフエニル、（メタ）アクリル酸モノクロロフエ
ニル、（メタ）アクリル酸トリクロロフエニル、
（メタ）アクリル酸ペンタクロロフエニル、（メ
タ）アクリル酸モノブロモフエニル、（メタ）ア
クリル酸トリブロモフエニル、（メタ）アクリル
酸モノイオドフエニル、（メタ）アクリル酸ペン
タブロモフエニル、（メタ）アクリル酸−２−（ト
リブロモフエノキシ）エチル、（メタ）アクリル
酸−２−（トリブロモフエノキシエトキシ）エチ
ル、（メタ）アクリル酸−２−（ペンタクロロフエ
ノキシ）プロピル、（メタ）アクリル酸−１−（ト
リブロモフエノキシ）−２−ヒドロキシプロピル
などを挙げることができる。 これらの単量体は他の単量体と共に共重合する
ことにより得られる重合体粒子表面の親水度、疎
水度、官能度、電荷の程度などの担体としての特
性を変化させ、また得られる重合体粒子の比重を
調整することができる。 上記他の単量体としては例えばスチレン、クロ
ルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベン
ゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）
アクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）
アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒ
ドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、
エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エ
ステル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アク
ロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロ
ール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス
（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレ
ン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピ
ロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビ
ニルなどの芳香族ビニル化合物、α，β−不飽和
カルボン酸またはそのエステル類もしくはアミド
類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化
ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビ
ニルエステル化合物などを挙げることができる。 本発明の重合体を得るための重合方法としては
例えばラジカル重合法、具体的には乳化重合法、
乳化剤を使用しない乳化重合法（ソープフリー重
合法）、懸濁重合法、溶液重合法、溶液沈澱重合
法などをあげることができるが、得られる重合体
が、はじめから微粒子の形で得られること、きよ
う雑物の除去が容易であることなどから、ソープ
フリー重合法または溶液沈澱重合法が有利であ
る。 ソープフリー重合法では単量体の添加方法、単
量体の種類、量、重合開始剤の量などを変えるこ
とにより、例えば0.05〜1μｍの範囲で粒径の調整
された粒径分布の狭い球形の形状が一定な重合体
粒子を得ることができる。また、溶液沈澱重合法
では溶媒の種類、量などを変えることにより、例
えば0.1〜10μｍの範囲の粒径の重合体粒子を得る
ことができる。この場合に使用する溶媒は、低級
アルコール、エーテル、ケトン、ハロゲン化炭化
水素などから、単量体は溶解するが、重合体は溶
解しない溶媒が選ばれるが、単量体の溶解性は厳
密なものでなく、熱時溶解すればよいし、また、
スチレン−スルホン酸ナトリウムなどイオン性単
量体は溶媒に溶解しないまま重合させる場合があ
る。 特に好ましい重合方法は、上記ソープフリー重
合法であり、得られる重合体粒子の粒径分布が狭
いこと、得られる重合体粒子の形状が一定である
などの利点を有する。 一般式（）で表わされる単量体とこれと共重
合可能な単量体とを共重合する場合、一般式
（）で表わされる単量体は10モル％以上、特に
15モル％以上共重合することが好ましい。一般式
（）で表わされる単量体の共重合が少ない場合
は担体としての担持能力が低下し、また担体とし
ての比重を顕著に高めることができない。また得
られる重合体を本発明の担体として使用するうえ
において好ましい粒径は0.1〜10μｍ、特に好まし
くは0.3〜1μｍであり、好ましい比重は1.2〜２
ｇ／cm3、特に好ましくは1.3〜1.8ｇ／cm3である。
担体の粒径または比重が小さすぎたり、大きすぎ
たりすると感作試薬として使用する場合に被検出
物質との反応による状態変化を観測しにくくな
る。 本発明の担持は感作試薬として使用するにさい
し、被検出物質との反応による状態変化を観測し
やすく、また安定性及び品質の一定性にすぐれ、
かつ共重合する単量体の種類によつて担体の表面
特性を変化させることも容易である。 特に本発明の担体は生物学的物質などを担持す
る場合、単位面積当りの担持量が優れており、し
かも生物学的物質などを担持しても非特異的凝集
を起こしにくくかつ分散安定性が優れたものであ
る。 また本発明の担体は、比重が大きいので水など
の液体媒体からの分離が容易であり、感作試薬な
どとして被検出物の検出、測定において沈降が伴
なう場合極めて有利である。例えば本発明の担体
を感作試薬としてマイクロタイター法に用いれば
従来、数時間から数十時間、測定に要していたの
が、数分から360分程度で終了し、遠心分離など
による粒子の分離もきわめて短時間ですむ。 なお本発明の担体に担持される生物学的物質の
例としては、Ｂ型肝炎表面抗原（HBs抗原）、抗
HBs抗体、人じゆう毛性ゴナドトロピン（HCG
抗原）、抗HCG抗体、イムノグロブリンＧ、マイ
コプラズマ抗原、核酸、核タン白、エストロゲ
ン、抗エストロゲン抗体などの免疫学的反応性物
質、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、α−アミラーゼ、パパイン、アミノアシ
ラーゼなどの酵素、胎児肺細胞、腎細胞、繊維芽
細胞などの生育に固定表面を必要とする細胞など
が挙げられるが、目的に応じて適宜選択すること
ができる。 次に本発明を実施例によつて説明する。 実施例 １〔重合例〕 (1) ソープフリー重合 アクリル酸ペンタクロロフエニル 64ｇ スチレン 32ｇ メタクリル酸 ３ｇ ｔ−ドデシルメルカプタン １ｇ の混合液を過硫酸カリウム１ｇを含む80℃の水
600ml中に４時間かけてかきまぜながら連続的
に滴下する。 滴下終了後さらに２時間かきまぜを続け、重
合率98％で平均粒子径0.4μｍの重合体粒子をラ
テツクス状で得る。得られた重合体粒子を洗浄
および濾過によつて精製し、濃度を調整して、
担体として使用する。なお、この担体の上記単
量体の共重合比はアクリル酸ペンタクロロフエ
ニル／スチレン／メタクリル酸＝0.37／0.55／
0.8（モル比）であつた。 (2) 沈澱重合 アクリル酸トリブロモフエニル 72ｇ スチレン 26ｇ ジビニルベンゼン ２ｇ をエタノール２に溶解し、アゾビスイソブチ
ロニトリル２ｇを加え、かきまぜながら、75℃
で重合すると、重合体が微粒子状に析出する。
４時間かきまぜを続けると、重合率93％で平均
粒子径1.0μｍの重合体粒子を分散液として得
る。得られた重合体粒子は直ちに沈降するの
で、傾斜法でエタノールから分離し、精製後水
分散液の形で担体として使用する。なお、この
担体の上記単量体の共重合比はアクリル酸トリ
ブロモフエニル／スチレン／ジビニルベンゼン
＝0.41／0.55／0.03（モル比）であつた。 実施例 ２ 〔担体の特性〕 実施例１で得た担体の特性を以下のようにして
調べる。同時に比較のためにカルボキシル変性ポ
リスチレン粒子からなる担体の特性を調べる。 (1) 沈降時間 担体濃度0.1重量％の水分散液を、Ｕ型マイ
クロタイター用セルに入れ、丸いスポツトが鮮
明に観察できるまでの時間を測定する。 (2) タン白質吸着量 担体濃度0.5重量％の水分散液２mlを500μ
ｇ／mlの牛血清γ−グロブリンのリン酸塩緩衝
溶液２mlを加え、１時間混合する。次いで上澄
液中のγ−グロブリン濃度を分光光度計を用い
280nｍの波長で出測定し、ブランクとの吸光
度の差から担体の単位面積当りのγ−グロブリ
ン吸着量を求める。 (3) 平均粒子径 電子顕微鏡により観察して求める。 (4) 比重 密度勾配管法により求める。 結果を表１に示す。
【表】 実施例 ３ 〔免疫反応性物質の測定〕 実施例１で得た担体および比較のためのカルボ
キシル変性ポリスチレン粒子からなる担体を用い
た担体濃度0.25重量％の水分散液１mlに熱変性イ
ムノグロブリンG0.025mgを含むリン酸塩緩衝溶
液１mlを加え室温で１時間混合し、熱変性イムノ
グロブリンＧを担持する。これにリウマチ因子ポ
ジテイブの血清釈液を加え、かきまぜて、マイク
ロタイター用セルに入れる。 表２に示すように、本発明の担体を用いると、
測定に要する時間がいちぢるしく短縮され、感度
も良好であることがわかる。
【表】 備考：、、＋、±、−は粒子の沈降
状態を示し、程面積が広く、
−程小さなスポツトとなることを示す
。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （式中R1およびR2は同一又は異なり、水素原子
    又は低級アルキル基、R3は炭素数２または３の
    直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、ヒドロキ
    シル基で置換されていてもよく、Ｘは同一又は異
    なるハロゲン原子であり、ｍは０または１〜10の
    整数であり、ｎは１〜５の整数を示す） で表わされる単量体又はこれらの単量体と共重合
    可能な他の単量体とを（共）重合して得られる重
    合体粒子よりなる担体。
JP57089707A 1982-05-28 1982-05-28 粒子状重合体よりなる担体 Granted JPS58209984A (ja)

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US06/496,502 US4559303A (en) 1982-05-28 1983-05-20 Carrier composed of particulate polymer
DE8383303121T DE3365121D1 (en) 1982-05-28 1983-05-31 The use of a particulate polymer as a carrier for biological substances and the like and such substances supported on the carrier
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