JPS59162455A - 免疫学的検査試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的検査試薬に関するものである。

最近において、ヒトまたは動物の疾病の診断のために、
いわゆる免疫学的検査が行なわれるようになってきてい
る。この免疫学的検査は、患者等の体液中に抗原または
抗体が存在するか否かを抗原抗体反応を利用して調べる
ものでアシ、当該反応が極めて特異的に生ずるものであ
るために抗原または抗体が微量であってもその存在の正
確な判定を行なうことができる点に最大の特長がある。

抗原抗体反応においては、患者等の血清、尿、その他の
体液に、検出すべき抗原または抗体に対応する抗体また
は抗原を混合することにより、不溶性の抗原・抗体複合
体が形成されるので、これを検出することによ）目的と
する検査が行なわれる。しかしながら、抗原・抗体複合
体は極めて小さな粒子であってその検出に困難を伴い、
このため、実用化を目指して多くの研究がなされている
。

現在において最も広く行なわれている方法は、動物の赤
血球、各種のクレー、ポリスチレンラテックス等よシ成
る微粒子を担体としてこれに抗原まｆｃは抗体を感作さ
せておき−１これによフ、抗原抗体反応の発生の判定を
容易なものとする方法である。そして特にこの方法に属
するものとして、ヒツジ、ニワトリ等の動物の赤血球を
担体として用いる、いわゆる血球凝集法が古くから行な
われている。

血球凝集法は、対象とされ得る抗原及び抗体の範囲が広
く、例えばマイクロタイター法を利用して０．５〜１時
間という短時間のうちに判定を行なうことができる点で
は優れたものであるが、動物の血球はそれ自体が抗原性
を有するのでそのために非特異凝集を生じ易い欠点があ
る。しかも血球は生きている動物等から採取されるもの
であるため、個体間、季節間、その他による特性のバラ
ツキが大きく、そのため必ずしも正確な判定を行なうこ
とができない。

一方、ポリスチレンラテックス等の合成高分子物質の０
．１〜１μｍ程度の粒径を有する粒子も担体として有用
であシ、特にそれ自体が抗原性を有しない点及び均質の
ものを大量に安定して入手し得る点で優れている。しか
しながら、従来の合成高分子物質の粒子よシ成る担体は
、高い感度を得ると共に定量的な判定を行なうためにマ
イクロタイター法を利用すると、血球を担体として用い
る場合に比して、沈降に長時間を必要とし、迅速な判定
を行なうことができない問題がある。

このような点を緩和するため、沈降速度の小さい理由が
粒径の小さいこと及び比重が例えば１．０５と水に近い
ことにあることから、比重の大きい合成高分子物質の粒
子を用いることが提案されているが、これは限られた抗
原または抗体以外のものについては十分な感作を達成す
ることができず、従って利用範囲が狭り、シかも判定ま
でになお１０時間程度の長時間を要するもので、この点
においても利用範囲が限られる欠点がある。

本発明は以上の如き事情に基いてなされたものであって
、その目的とするところは、十分な感作を行なうことの
可能な抗原または抗体の範囲が広くてしかも高い感度の
ものが容易に得られ、しかも短時間のうちに判定を行な
うことのできる免疫学的検査試薬を提供することを目的
とする。

以上の目的は、下記一般式（１）で表わされる単量体に
よる重合体若しくは共重合体の粒子よシ成る担体に免疫
学的活性物質を感作せしめて成ることを特徴とする免疫
学的検査試薬によって達成される。

一般式（Ｉ） （式中Ｒ１およびＲ２は同−又は異なシ、水素原子又は
アルキル基、Ｒ３は炭素数２または３の直鎖又は分枝鎖
のアルキレン基であシ、ヒドロキシル基で置換されてい
てもよく、Ｘは同−又は異なるハロゲン原子であり、ｍ
は０または１〜１０の整数であシ、ｎは１〜５の整数を
示す。） 以下本発明について具体的に説明する。

本発明においては、前記一般式（１）で表わされる単量
体の１種若しくは複数種を重合せしめ或いは共重合せし
めて得られる重合体若しくは共重合体の粒子、または一
般式（Ｉ）で表わされる単量体とこれと共重合可能な他
の単量体と全共重合せしめて得られる共重合体の粒子を
担体とし、との担体の表面に、検出すべき抗原または抗
体等と抗原抗体反応を起す対応する抗体または抗原等の
免疫学的、活性物質を感作せしめて免疫学的検査試薬と
する。

本発明免疫学的検査試薬は以上のようなものであるので
、検査すべき体液と接触せしめることによシ検育が行な
われ、その体液中に検出対象である抗原または抗体等が
存在するときは、これが、担体としての粒子の表面に担
持された対応する免疫学的活性物質と抗原抗体反応し、
その結果当該粒子が凝集し、当該粒子の沈降性が変化す
るので、これによシ抗原抗体反応の有無、即ち検出対象
である抗原または抗体等の検出を行なうことができる。

またマイクロタイター法によれば、上述の操作がＶ字型
またはＵ字型の底壁を有する容器（マイクロタイタープ
レート）を用いて行なわれ、抗原抗体反応が生じた体液
と検査試薬の混合液から診断薬の粒子が広がシを持った
まま沈降するため、容器をその上方から観察して沈降部
分の大きさを評価することにより、定量的な判定を行な
うことができる。

而して本発明においては、検出対象に対応する免疫学的
活性物質を、既述の一般式（１）で表わされる単量体に
よって得られる特定の重合体若しくは共重合体の粒子よ
シ成る担体に感作せしめるため、感作せしめる免疫学的
活性物質を広い範囲から選んでしかも十分に感作せしめ
ることができると共に高い感度が得られ、また担体粒子
として比重の大きいものが容易に得られるので大きな沈
降速度が得られ、その結果例えば数時間以内の極めて短
時間のうちに目的とする検出操作の結果の判定を行なう
ことができる。

本発明における担体を得るための単量体に係る前記一般
式（１）におけるＲ１およびＲ２としては水素原子また
はメチル基が好ましく、Ｒ３としてはエチレン基または
プロピレン基が好ましく、又としては塩素原子または臭
素原子が好ましく、ｍとしては０または１が好ましく、
ｎとしては３〜５が好ましい。

一般式（１）で表わされる単量体の具体例としてハ、（
メタ）アクリル酸モノフルオロフェニル、（メタ）アク
リル酸千ノクロロフェニル、（メタ）アクリル酸トリク
ロロフェニル、（メタ）アクリル酸ペンタクロロフェニ
ル、（メタ）７りＩ））Ｌ４モノブロモフェニル、（メ
タ）アクリルｉ　）　ＩＪ　フロモフェニル、（メタ）
アクリル酸モノイオトフェニル、（メタ）アクリル酸ペ
ンタブロモフェニル、（メタ）アクリル酸−２−（トリ
ブロモフェノキシ）エチル、（メタ）アクリル酸−２−
（）リフロモフエノキシエトキシ）エチル、（メタ）ア
クリル酸−２−（ペンタクロロフェノキシ）プロピル、
（メタ）アクリル酸−１−（トリブロモフェノキシ）−
２−ヒドロキシプロピル等を挙ケることができる。

これらの単量体と他の単量体との共重合体を用いる場合
には、各々の種類、割合、共重合反応の条件等を選定す
ることによシ、得られる重合体粒子表面の親水度、疎水
度、官能度、電荷の程度々どの担体としての特性を変化
させ、また得られる重合体粒子の比重を調整するうえで
大きな自由度が得られる。

上記他の単量体としては例えばスチレン、クロルスチレ
ン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、スチレン
スルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸、（メタ）
アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ
）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリ
ル酸グリシジル、エチレングリコール−ジー（メタ）ア
クリル酸エステル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ
）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロ
ール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）
アクリルアミド、ブタジェン、イソプレン、酢酸ビニル
、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル
、塩化ビニリデン、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合物
、α、β−不飽和カルボン酸またはそのエステル類若し
くはアミド類、α、β−不飽和二トリル化合物、ノ・ロ
ゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物、低級脂肪酸ビ
ニルエステル類等を挙げることができる。

以上のような単量体により重合体若しくは共重合体を得
るための重合方法ζしては例えばラジカル重合法、具体
的には乳化重合法、乳化剤を使用しない乳化重合法（ソ
ープフリー重合法）、懸濁重合法、溶液重合法、溶液沈
殿重合法等を挙げることができるが、得られる重合体若
しくは共重合体が、はじめから微粒子の形で得られるこ
と、夾雑物の除去が容易であることなどから、ソープフ
リー重合法または溶液沈殿重合法が有利である。

ソープフリー重合法では単量体の添加方法、単量体の種
類、量、重合開始剤の量などを変えることによυ、例え
ば０．０５〜２μｍ程度の範囲の粒径の調整された粒径
分布の狭い球形の形状が一定な粒子を得ることができる
。また、溶液沈殿重合法では溶媒の種類、量などを変え
ることによシ、例えば０．１〜１０μｍの範囲の粒径の
重合体粒子を得ることができる。この場合に使用する溶
媒は、低級アルコール、エーテル、ケトン、エステル、
炭化水素、ハロゲン化炭化水素等から、単量体は溶解す
るが、重合体若しくは共重合体は溶解しない溶媒が選ば
れるが、単量体の溶解性は厳密なものでなく、熱時溶解
すればよいし、また、スチレン−スルホン酸ナトリウム
等イオン性単量体は溶媒に溶解しないまま重合させる場
合がある。

特に好ましい重合方法は、上記ソープフリー重合法であ
シ、得られる重合体若しくは共重合体粒子の粒径分布が
狭いこと、得られる粒子の形状が一定であるなどの利点
を有する。

一般式（１）で表わされる単量体とこれと共重合可能な
他の単量体とを共重合する場合、一般式（Ｉ）で表わさ
れる単量体は１０モルチ以上、特に１５モルチ以上共重
合することが好ましい。一般式（Ｉ）で表わされる単量
体の共重合割合が少ない場合は担体としての担持能力が
低下し、また担体としての比重を顕著に高めることがで
きない。

本発明において担体とされる粒子の好ましい粒径は０．
１〜１０μｍ１特に好ましくは０．３〜２μｍであシ、
好ましい比重は１．２〜２　ｆ　７ｃｍ３、特に好まし
くは１．３〜１．８ｔ／ｃｍ３である。担体の粒径また
は比重が小さすぎたシ、大きすぎたシすると免疫学的検
査試薬として使用する場合に被検出物質との反応による
状態変化を観測しにくくなる。

以上の如き担体に担持せしめる免疫学的活性物質として
は、広い範囲から選ぶことができる。次に免疫学的活性
物質の具体例を挙げる。

■、微生物 １）バクテリア 連鎖法菌属（化膿、大便、緑色）、ブドウ球菌属（黄色
、白色）、肺炎球菌（肺炎双球菌）等のグラム陽性球菌 ナイセリア属（淋菌、髄膜炎菌）等のダラム陰性球菌 炭痕菌、ジフテリア菌、エリシベロトリックス属、単球
症リステリア等のグラム陽性好気性桿菌 クロストリジウム属（ボツリヌス菌、ウエルチ菌Ａ型、
ウエルチ菌、破傷風菌）等のグラム陽性嫌気性桿菌 バクテロイド属等のダラム陰性嫌気性桿菌エシェリヒア
属、クレブシェラ属、腸内歯科、プロテウス属、プソイ
ドモナス八、サルモネラ属、赤痢菌属等のグラム陰性腸
内桿菌 パスツレラ属（ベスト菌、針先病菌）、インフルエンザ
菌、プルセラ属（マルタ熱菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌
）、百日咳菌、マレオミヶス属等のダラム陰性非腸内桿
菌 梅毒トレボネーマ、レプトスピラ属、ボレリア属等のス
ピロヘータ属 ミコプラズマ属 ミコバクテリウム属 ビブリオ属 放線菌属 ２）原虫類 アメーバ等の腸内原虫 トリコモナス属、レーシュマニア属、トリパノゾーマ属
、トキソプラズマ属等の鞭毛虫類プラスモジウム属（三
日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱原虫、
卵形マラリア原虫）等の胞子虫類 線虫、鉤虫、鞭虫等の腸内線虫類 トリキネラ属、糸状虫（バンクロフト糸状虫）、ドラク
ンクルス属等の組織線虫類 住血吸虫属、腸内吸虫類、組織吸虫類等の吸虫類；真田
虫等の条虫類 トキソプラズマ（トキソプラズマ・ボンブイ）３）カビ
類 スポロトリカム属 クリプトコックス属 発芽菌属 ヒストプラズマ属 コクシジオイデス属 カンジダ属 ４）ウィルスおよびリケッチア属 リケッチア属 イヌウィルス性肝炎、ショープ乳頭腫、インフルエンザ
ＡおよびＢ、烏禽ベスト、単純庖疹、アデノウィルス、
ポリオーマ、ラウス家禽肉腫、ワクシニア、ポリオウィ
ルス、麻疹、犬ジステンパー、白血病、おたふくがぜ、
ニューキャッスル病、センダイ、ＢＣＨＯ，口蹄疫、オ
ウム病、狂犬病、エキストロメリア、高木ウィルス等の
ウィルス ■、器官特異的抗原を包含する組織抗原多糖類、ヒアル
ウロン酸分解酵素、破傷Ｍ［、卵アルブミン、羊血清ア
ルブミン、腎１５１ｉ、肝臓、皮膚、心臓、胃腸管、前
立腺、胎児抗原（アルファ１胎児蛋白質）、肺癌抗原（
癌性胎児抗原）、筋肉、コラーゲン、類殿粉 ■、ホルモン 下垂体ホルモン、インクニリン、グルカゴン、甲状腺ホ
ルモン、絨毛膜ゴナトロピン、絨毛膜生長ホルモン−プ
ロラクチン、ヒト胎盤ラクトゲン ■、酵　素 スイｊ類キモトリプシノゲン、プロカルボキシペブチタ
ーゼ、デオキシリボ核酸分解酵素、リボ核酸分解酵素、
グリセルアルデヒド−３一般酸脱水素酵素、カタラーゼ
、過酸化酵素 ■、血球抗原、血液群物質およびその他の同種抗原類血
小板、巨核球、白血球、赤血球、血液群物質、フォルス
マン抗原、組織適合性抗原 ■、血漿蛋白質 フィブリンおよびフィブリノーゲン、プラスミノゲンお
よびプラスミン、アルブミン、イムノグロブリン、α−
１−抗キモトリプシン、α−１−抗トリプシン、補体因
子、セル゛ロブラスミン、Ｇｃ　−ｆロフリン、ハプト
グロビン、α−２＝マクログロブリン、β−２−ミクロ
グロブリン、オロソムコイド、グレアルプミン、トラン
スフェリン 〜１乳蛋白質 ラクトフェリン、リゾチーム、分易ＩｇＡ、分秘ＩｇＭ
、分利成分 ■、唾液蛋白質 分易ＩｇＡ、分秘ＩｇＭ、分秘成分 ■、尿蛋白質 Ｘ、病変蛋白質 骨髄腫蛋白質、高分子グロブリン血症蛋白質、グロブリ
ン異常症蛋白質、ペンスージョーンス１、ＩＦ蛋白質、
Ｃ−反応性蛋白質、寒性グロプリ　ン Ｘ、自家抗体を包含する抗体 抗咳因子、甲状腺自家抗体、抗タムーホースフォール蛋
白質、冷凝集素、類リウマチ因子、副腎自家抗体、悪性
貧血における胃壁細胞に対する自家抗体、抗血腸、抗肝
臓、抗腎臓、ｊ１青子に対する自家抗体、抗心臓、筋無
力症における筋肉自家抗体、神経組織に対する自家抗体
、線維組織および脈管成分に対する自家抗体、血小板お
よび巨核球に対する自家抗体、栄養胚芽に対する抗体、
微生物に対する抗体、動物抗原に対する抗体、薬剤に対
する抗体 以下本発明の実施例について説明する。

〔担体用粒子の製造〕

攪拌棒、冷却器および温度コントローラーを備えた反応
器を用い、第１表に示したところに従い、水を入れて８
０℃に昇温し、次いで過硫酸カリウム（ＫＰＳ）ｉ加え
、攪拌しながらアクリル酸トリブロモフェニル（ＴＢＰ
Ａ）　、スチレン（ＳＴ）およびメタクリル酸（ＭＡＡ
）よシ成る単量体混合液を連続的に注入して重合しくソ
ープフリー重合法）、合計４種の乳濁液を得た。それら
の重合体粒子をそれぞれ重合体粒子Ａ−Ｄとし、その特
性を第１表に示す。

以上のようにして得られた重合体粒子を用い、以下の実
施例を行なった。

実施例１ 本発明の条件を満たす重合体粒子Ａ−Ｃの各々を、塩化
ナトリウム０．１５モルを含むｐＨ７，２，１／６０Ｍ
のリン酸塩緩衝食塩水（以下ｒ、ＰＢｓＪと記す。）に
固形分濃度が０．２５重量％となる割合で懸濁させ、こ
れにＰＢＳに濃度５　Ｑ　ｍｃｇ、／−となるよう溶解
した抗原熱会合ヒトＩｇＧ　（以下「ａｇｒ−ＩｇＧ　
Ｊと記す。）を等容量加え、室温（２０℃）で２時間緩
かに攪拌して抗原の感作処理を行ない、ＰＢＳで洗浄し
て未吸着抗原を除去し、３種の本発明試薬Ａｌ、Ｂｌ、
ＣＩを得た。ここに用いたａｇｒ−ＩｇＧは、ヒトＩｇ
Ｑを濃度が１０歌−となるようＰＢＳに溶解し、温度６
３℃に１５分間加熱して得られるものである。

また対照のために、上記ａｇｒ−ＩｇＧのＰＢＳ溶液の
代シにＰＢＳのみを用いたほかは上述と全く同様にして
、重合体粒子Ａ−Ｃによる対照用試薬Ａｌ’、Ｂｌ’、
Ｃｒを得た。

各試薬を、ＰＢＳにウサギ血清を濃度１重量係となるよ
う加えた希釈液によシ希釈して固形分濃度を０．２５重
量％として反応試薬とし、一方反応術式としてリウマチ
因子陽性の患者血清（以下「陽性血清」という。）と同
陰性の患者血清（以下「陰性血清」という。）に対して
前記希釈液によシ、マイクロタイター法に従い、■型マ
イクロプレート（豊島製作所製）上で液−ｉｏ、０２５
ｍの連続倍数希釈を行ない、これに上述の反応試薬０．
０２５１ｎｔを滴下して加え、十分に混合した後室温で
静置し、判定可能になった時に管底凝集像を肉眼で判定
し、凝集を示す血清の最大希釈倍数の逆数をリウマチ因
子の抗体価として求めた。

また市販の検査試薬用担体（比重：１．２）よシ成る比
較用重合体粒子を用いて上記と全く同様にして試薬Ｒ１
及びＲ１’　　を得、これを用いて同様の実験および判
定を行なった。

以上の結果を第２表に示す。

第２表 以上の結果から明かなように、本発明試薬によれば、十
分な感度を有すると共に、判定時間即ち判定が可能とな
るまでの時間が非常に短い。

実施例２ 本”発明の条件を満たす重合体粒子Ａ、Ｂ及びＤの各々
をＰＢＳに固形分濃度が０．５重量％となる（２３） 割合で懸濁させ、これにメチル化ウシ血清アルブミン（
以下ｒＭＢｓＭ」という。）の１ｏ　ｍｅ、ｇ／ｍｇ溶
液を等容量加え、室温で６０分間放置してＭＢＳＡを吸
着させ、その後ＰＢＳで洗浄した上、尿量のＰＢＳに懸
濁させてＭＢＳＡ処理担体を得、これに抗原としてウシ
胸腺ＤＮＡ　（シグマ社製）１００ｍｃｇ／ｇｄｌ溶液
を等容量加え、室温で６０分間緩かに攪拌して抗原′（
ｉｌ−感作させ、ＰＢＳで洗浄して合計３種の本発明試
薬Ａ２．Ｂ２及びＤ２を得た。

また実施例１におけると同様の操作によシ、重合体粒子
Ａ、Ｂ及びＤによる対照用試薬Ａ２’、Ｂ２’及びＤ２
’を得た。

各試薬について、全身性エリテマトーデス（ＳＬＢ）お
よび正常ヒト血清を用いたほかは実施例１におけると同
様の操作によシ抗体価を求めた。

また、実施例１で説明した比較用重合体粒子を用いて比
較用試薬Ｒ２及びＲ２’を得、これについても同様にし
て判定を行なった。

以上の結果を第３表に示す。

第３表 この結果から、本発明試薬が十分な感度を有し、しかも
極めて短時間のうちに判定が可能であることが明かであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記一般式ＣＩ）で表わされる単量体による重合体
   若しくは共重合体の粒子より成る担体に免疫学的活性物
   質を感作せしめて成ることを特徴とする免疫学的活性物
   質。 一般式（１，） （式中Ｒ１およびＲ２は同−又は異なシ、水素原子又は
   アルキル基、Ｒ３は炭素数２または３の直鎖又は分枝鎖
   のアルキレン基であシ、ヒドロキシル基で置換されてい
   てもよく、又は同−又は異なるハロゲン原子であシ、ｍ
   は０または１〜１０の整数であシ、ｎは１〜５の整数を
   示す。）