RU2657834C1 - Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы - Google Patents
Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2657834C1 RU2657834C1 RU2017113715A RU2017113715A RU2657834C1 RU 2657834 C1 RU2657834 C1 RU 2657834C1 RU 2017113715 A RU2017113715 A RU 2017113715A RU 2017113715 A RU2017113715 A RU 2017113715A RU 2657834 C1 RU2657834 C1 RU 2657834C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thyroglobulin
- microspheres
- test system
- polymer
- solution
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 title 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 71
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 62
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000047688 human TG Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims abstract description 11
- VJOWMORERYNYON-UHFFFAOYSA-N 5-ethenyl-2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=C(C=C)C=N1 VJOWMORERYNYON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- CLWRFNUKIFTVHQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CC=NC=C1 Chemical group [N].C1=CC=NC=C1 CLWRFNUKIFTVHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 13
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 9
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 abstract 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 21
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 20
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 4
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- -1 10-carboxydecyl Chemical group 0.000 description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 208000010928 autoimmune thyroid disease Diseases 0.000 description 2
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- HCDGVLDPFQMKDK-UHFFFAOYSA-N hexafluoropropylene Chemical compound FC(F)=C(F)C(F)(F)F HCDGVLDPFQMKDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- JRIDTVOTHRSTJZ-UHFFFAOYSA-N n'-cyclohexyl-n-(2-morpholin-4-ylethyl)methanediimine;4-methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1.C1CCCCC1N=C=NCCN1CCOCC1 JRIDTVOTHRSTJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 2
- BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N tetrafluoroethene Chemical group FC(F)=C(F)F BFKJFAAPBSQJPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- BQCIDUSAKPWEOX-UHFFFAOYSA-N 1,1-Difluoroethene Chemical compound FC(F)=C BQCIDUSAKPWEOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical group C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBZBISQOWJYWCC-UHFFFAOYSA-N 2-(2-carboxypropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(O)=O VBZBISQOWJYWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROGIWVXWXZRRMZ-UHFFFAOYSA-N 2-methylbuta-1,3-diene;styrene Chemical compound CC(=C)C=C.C=CC1=CC=CC=C1 ROGIWVXWXZRRMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 229920001744 Polyaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002174 Styrene-butadiene Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- WRVRNZNDLRUXSW-UHFFFAOYSA-N acetic acid;prop-2-enoic acid Chemical compound CC(O)=O.OC(=O)C=C WRVRNZNDLRUXSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N butadiene-styrene rubber Chemical compound C=CC=C.C=CC1=CC=CC=C1 MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- SQNNHEYXAJPPKH-UHFFFAOYSA-N chloroethene;prop-2-enoic acid Chemical compound ClC=C.OC(=O)C=C SQNNHEYXAJPPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Chemical group OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007870 radical polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011115 styrene butadiene Substances 0.000 description 1
- 229920003048 styrene butadiene rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины, а также к аналитической и органической химии. Тест-система для экспрессного определения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека содержит фосфатный буфер и суспензионную композицию полимерных микросфер со средним размером от 1,0 до 5,0 мкм из поли(2-метил-5-винилпиридина), у которых к карбоксиметильным группам, связанным с поверхностью микросфер через атом азота пиридина, ковалентно присоединены молекулы тиреоглобулина. Также заявлен способ получения данной тест-системы и диагностический набор, включающий указанную тест-систему. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала средств аналогичного назначения и сокращение времени анализа без ухудшения качества определения в интервале содержаний аутоиммунных антител к тиреоглобулину от 10 до 2000 МЕ/мл. 3 н.п. ф-лы, 2 табл., 9 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а также к аналитической и органической химии. Более конкретно, изобретение представляет собой тест-систему с ковалентно иммобилизованным тиреоглобулином, предназначенную для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, на основе полимерных микросфер из поли(2-метил-5 винилпиридина), модифицированных тиреоглобулином, и способ ее получения.
В настоящее время для диагностики различных заболеваний, в том числе - аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, таких как тиреоидит Хасимото, базедова болезнь и др., широко распространены методы иммуноферментного анализа (ИФА), основанные на реакциях «антиген-антитело». [Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. - N.-Y: Elsevier. - 1985. - 502 p.; Егоров A.M, Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая школа. - 1991. - 288 с]. Такие методы сравнительно редко дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, однако существенными недостатками являются сложность постановки и длительность проведения иммуноферментной реакции. Кроме того, многие реагенты ИФА недостаточно стабильны при хранении и применении, что ухудшает межлабораторную воспроизводимость, а также внутрилабораторную воспроизводимость на разных партиях. Также, зачастую, возникает проблема недостаточной специфичности и чувствительности метода.
В качестве альтернативы методам ИФА интерес представляют методы иммунодиагностики, основанные на реакции латексной агглютинации (РЛА) [Кедик С.А., Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Станишевский Я.М., Панов А.В., Суслов В.В., Петрова Е.А. Высокочувствительные тест-системы на основе конъюгатов «полимерная микросфера - биолиганд» для экспресс-диагностики протеинопатий // Тонкие химические технологии. - 2013. - Т. 8, №4. - С.3-10. и Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Быков В.А. Полимерные микросферы в диагностике. - М.: Научно-исследовательский и учебно-методический Центр БМТ ВИЛАР. - 2005. - 137 с], которые сравнительно недороги и экспрессны, характеризуются высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью. Простота таких тестов и возможность их осуществления практически в любых условиях позволяют проводить диагностику заболеваний, как при одиночных, так и при скрининговых исследованиях.
Тест-системы для проведения РЛА представляют собой суспензию полимерных микросфер, на поверхности которых иммобилизованы специфические биолиганды, способные аффинно связываться с детектируемым компонентом объекта исследования. В результате такого взаимодействия образуются пространственные агломераты, видимые невооруженным глазом.
Тест-системы, основанные на РЛА, могут быть реализованы, например, в пробирках, на пластинах, 96-луночных микропланшетах, на фильтрах, а также как различные твердофазные иммуноферментные «сэндвич-тесты», что является их преимуществом. В качестве объектов исследования могут использоваться любые доступные биологические жидкости и объекты, содержащие антитела или антигены (сыворотка крови, слезная жидкость, слюна, моча, цереброспинальная жидкость).
Аналитические характеристики тест-систем в большой мере зависят от способа иммобилизации специфических биолигандов на их поверхности. Иммобилизацию биолигандов на поверхности полимерных микросфер можно осуществлять за счет физической адсорбции или формирования ковалентных связей между реакционноспособными функциональными группами, связанными с поверхностью микросферы, и реакционноспособными группами биолиганда. Но, безотносительно к способу иммобилизации биолиганда, полимерные микросферы по своим физико-химическим свойствам должны удовлетворять определенным жестким требованиям. В частности, средний диаметр микросфер должен составлять 0,2-5,0 мкм и иметь малый коэффициент вариации (1-3%), воспроизводимые от партии к партии. Кроме того, в материале микросфер должны отсутствовать остаточные мономеры, а сами микросферы должны сохранять устойчивость и индивидуальность в буферных системах электролитов, а также стабильность при хранении в течение не менее полугода. В поверхностном слое микросфер не должна наблюдаться неспецифическая адсорбция ПАВ из исследуемой биологической среды.
Физическая адсорбция биолигандов на поверхности полимерных микросфер зависит от температуры, рН [Грицкова И.А., Нусс П.В., Дорохова Е.А., Гусев С.А., Крашенинникова И.Г., Аль-Хаварин Д.И. Адсорбция белков на полистирольных микросферах и постановка реакции латекс-агглютинации // Коллоидный журнал. - 1994. - Т. 56, №4. - С.491-495; Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г., Дорохова Е.А., Нусс П.В., Гусев С.А., Аль-Хаварин Д.И. Адсорбция белков на поверхности частиц полистиролметакрилатных суспензий // Коллоидный журнал. - 1994. - Т. 56, №4. - С.487-490], ионной силы среды, а также многих других факторов. Стабильность и чувствительность тест-систем на основе полимерных микросфер с физически адсорбированными биолигандами существенно зависит от концентрации адсорбированных биолигандов, количества активных центров на поверхности частиц и биолигандов и гидрофобности поверхности микросферы. Поэтому присутствие в исследуемой биологической среде поверхностно-активных веществ, способных избирательно сорбироваться на поверхности микросфер и мешать сорбции биолигандов, негативно влияет на чувствительность и специфичность таких тест-систем. Кроме того, в определенных условиях наблюдается десорбция биолиганда, что также снижает чувствительность и ухудшает воспроизводимость результатов анализа.
Более предпочтительны тест-системы на основе ковалентно конъюгированных биолигандов. Образование ковалентных связей между биолигандом и поверхностью полимерной микросферы возможно при наличии в поверхностном слое полимера активных или активируемых функциональных групп, способных химически взаимодействовать с аминными, карбоксильными или сульфгидрильными функциональными группами биолигандов. Непосредственно с ними могут реагировать локализованные на поверхности полимерной микросферы активные функциональные группы, такие как хлорметильные [Margel S., Nov Е., Fisher I. Polychloromethylstyrene microspheres - synthesis and characterization // J. Polymer Sc. - Polymer Chemistry Edition. - 1991. - Vol.29, Iss. 3. - P. 347-355; Okubo M, Ikegami K, Yamamoto Y. Preparation of micron-size monodisperse polymer microspheres having chloromethyl group // Colloid and Polymer Sc. - 1989. - Vol.267. - P. 193-200], альдегидные [Changhong Y, Zhang X, Sun Z, Kitano H., Ise N. Poly(styrene-co-acrolein) latex particles: copolymerization and characteristics // J. Appl. Polymer Sc. - 1990. - Vol.40. - P. 89-98; Margel S. Characterization and chemistry of polyaldehyde microspheres // J. Polymer Sc. - Polymer Chemistry Edition. - 1984. - V.22. - P.3521-3533], эпоксидные [Schlund В., Pith Т., Lambla M. Syntheses et caracteristiques structurelles de latex reactifs // Macromol. Chem. Suppl. - 1985. - No. 10/11. - P. 419-433.] и сульфгидрильные [Rembaum A., Chang M., Richards J., Li M. Synthesis and characterization hydrophilic microspheres // J. Polymer Sc. - Polymer Chemistry Edition. - 1984. - Vol.22. - P. 609-619].
Активируемые группы, такие как карбоксильные, аминные, амидные или гликолевые способны образовывать ковалентные связи с биолигандами только после переведения их в форму подходящих активных производных [US 3857931, МПК G01N 33/543, G01N 33/571, опубл. 31.12.1974; US 4046723, МПК C08G 81/02; G01N 33/545, опубл. 06.09. 1977], гидроксильные [FR 2378094, МПК G01N 33/543, опубл. 18.08.1978; Pichot С. Latex structures et functionalizes // Bull. Soc. Chim. Fr. - 1987. - No. 4. - P. 725-733; US 4045384, МПК A61K 39/44; C08G 81/02; G01N 33/76, опубл. 30.08.1977].
Чувствительность тест-систем на основе полимерных микросфер, ковалентно связанных с биолигандами, зависит от многих факторов, главными из которых являются природа и концентрация функциональных групп на поверхности полимерных микросфер и доступность активных центров (детерминант) биолигандов после их иммобилизации.
Налагаемые требования обусловливают многочисленные технические проблемы, которые следует решить при создании новых тест-систем с улучшенными характеристиками чувствительности, селективности, воспроизводимости и стабильности.
В патенте RU 2164919 (МПК C08F 2/22; C08F 112/08; C08F 118/08; C08F 120/10, заявка опубл. 10.11.1999) раскрыт способ получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц путем безэмульгаторной эмульсионной полимеризации винильного мономера в водно-щелочной среде в присутствии карбоксилсодержащего инициатора при нагревании, отличающийся тем, что в качестве винильного мономера используют один или смесь мономеров из ряда стирол, винилацетат, (мет)акрилаты и в исходную реакционную смесь дополнительно вводят соль со способностью создавать буферные растворы в области щелочных значений рН или смесь таких солей при концентрации соли в расчете на водную фазу 0,005-0,150 М. Примерами подтверждена возможность получения микросфер функционализированного латекса с размером 0,52- 2,50 мкм, коэффициентом дисперсности 1,002-1,019 и поверхностной концентрацией карбоксильных групп 1,0-5,7 мг-экв/м2. Активацию карбоксильных групп проводят раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида, сенсибилизацию выполняют раствором поликлональных антител к Neisseria meningitidis А при соотношении объемов растворов 1:1. Конечная концентрация латекса в диагностикумах составляет 0,25%.
В патенте RU 2459834 (МПК C08F 2/18; C08F 2/20; C08F 4/04; C08F 4/30; C08F 4/34; C08F 112/08; C08F 118/08; C08F 120/14; C08F 120/18; C08F 136/18, опубл. 27.08.2012) раскрыт способ получения монодисперсных карбоксилированных полимерных микросфер в виде водной суспензии, характеризующийся тем, что раствор в винильном мономере поверхностно-активного вещества - α,ω-бис-(10-карбоксидецил)полидиметилсилоксана, содержащего от 6 до 60 силоксановых звеньев и взятого в количестве 0,5-1,9%, интенсивно перемешивают в бидистиллированной воде в атмосфере инертного газа при нагревании смеси до 50-75°С и объемном соотношении мономер:вода в пределах 1:(2-9), с предварительным добавлением в реакционную массу 0,8-1,3% (от массы мономера) радикальных инициаторов полимеризации - смеси персульфата калия с динитрилом азо-бис-изомасляной кислоты или перекисью бензоила, для образования прямой эмульсии с последующей полимеризацией в течение 2-5 ч под действием инициатора капель мономера в полимерные частицы, при повышении температуры на 10°С за час до окончания процесса. Примеры подтверждают возможность получения микросфер функционализированного латекса с размером 0,13-0,65 мкм, коэффициентом дисперсности 1,009-1,020 и поверхностной концентрацией карбоксильных групп 17,2×10-3-138,1×10-3 мг-экв/м2, суспензия которых устойчива в солевых растворах с концентрацией 0,15-0,25 М. В описании обоих известных технических решений не содержится указаний или предположений о применимости предлагаемых латексов для целей настоящего изобретения.
В патенте RU 2054009 (МПК C08F 112/08; C08F 2/24; C08F 257/02, опубл. 10.02.1996) раскрыт способ получения монодисперсного латекса с частицами типа ядро-оболочка путем эмульсионной полимеризации стирола в водной среде в присутствии радикального инициатора и диспергатора при нагревании, добавления изопрена к полученному полистирольному латексу, выдерживания реакционной системы в присутствии радикального инициатора с последующей полимеризацией изопрена, отличающийся тем, что полимеризацию изопрена ведут в присутствии 2,4-4,8 мас.ч. на 100 мас.ч. полистирола окислительно-восстановительной инициирующей системы при массовом соотношении изопрен: полистирол (0,1-0,5):1 с последующей модификацией при 30-60°C полученного изопрен-стирольного латекса водным раствором серосодержащей аминокислоты при массовом соотношении полимер : аминокислота 1:(0,5-0,15) при рН 10-11. Экспериментально доказана возможность получения модифицированных микросфер с размером 0,05-1,5 мкм, относительной дисперсией 3,2-7,7% и концентрацией аминокислотных остатков на поверхности 60-250 мкмоль/г.
В патенте US 4045384 (МПК C08L 89/00, опубл. 30.08.1977) раскрыт способ сочетания карбоксилированного латекса с белком посредством образования амидной связи, включающий реакцию латекса с водорастворимым карбодиимидом и солюбилизированным в воде N-гидроксипроизводным с образованием активированного сложного эфира латекса, удаление непрореагировавших веществ из активированного сложного эфира латекса и сочетание очищенного активированного сложного эфира латекса с белком.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения латекс выбран из полимеров и сополимеров акриловой, метакриловой кислоты и стирола в виде монодисперсии однородных по размеру частиц, карбодиимид применяют в количестве, эквивалентном содержанию карбоксильных групп в латексе, N-гидроксипроизводным является N-гидроксибензотриазол, в качестве водорастворимого карбодиимида используют п-толуолсульфонат 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимида, а белок представляет собой хориогонадотропин человека.
В патенте US 3857931 (G01N 31/06; G01N 33/16, опубл. 31.12.1974) заявлен водонерастворимый иммунологический диагностический реагент, имеющий удельный вес, близкий к удельному весу воды, включающий дискретные частицы серологически инертного латексного полимера, выбранного из группы, состоящей из карбоксилированного стиролбутадиена, карбоксилированного полистирола, карбоксилированного полистирола с аминогруппами, полимеров акриловой кислоты, полимеров метакриловой кислоты, сополимера акрилонитрила, бутадиена и стирола, поливинилацетатакрилата, поливинилпиридина и винилхлоридакрилата, с которыми действием водорастворимого карбодиимидного агента сочетания через амидную связь конденсировано приблизительно от 0,01 до 15,0 масс. % известного серологического аналитического агента, выбранного из хориогонадотропина человека или гамма-глобулина человека. В предпочтительных вариантах осуществления размер частиц составляет приблизительно от 0,01 до 0,9 мкм, а серологический аналитический агент является денатурированным гамма-глобулином человека.
В примерах 1-3 раскрыты наборы и методики проведения экспресс- анализов для определения пороговых уровней биоаналита в сыворотке.
Наборы включают два флакона по 1-2 мл, в одном из которых содержится водная суспензия 1,8 мг/мл аналитического реагента, иммобилизованного на носителе, а во втором находится должным образом разведенная антисыворотка. Аналитическим сигналом, наблюдаемым при уровне аналита (хориогонадотропина, альбумина или ревматоидного фактора), равном или превышающем пороговое значение, соответствующее болезненному состоянию, является визуально наблюдаемая агглютинация. Отсутствие агглютинации означает, что содержание аналита находится в пределах физиологической нормы.
Описания изобретений к обоим патентам не содержат прямых указаний на возможность его модификации с целью определения уровней тиреоглобулина или антител к нему, а также не предоставляют раскрытия общих подходов к такой модификации.
В заявке ЕР 0199367 (МПК G01N 33/545; G01N 33/546; G01N 33/76; G01N 33/78, опубл. 29.10.1986) раскрыт реагент для обнаружения реакции «антиген-антитело» латексной агглютинацией, в котором дисперсной фазой является фторсодержащий полимер с показателем преломления до 1,42, содержащий адсорбированный белок.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения белок представлен тиреоглобулином, показателем преломления не превышает 1,38, а фторсодержащий полимер является продуктом сополимеризации тетрафторэтилена с гексафторпропеном или перфторалкилвиниловым эфиром или винилиденфторида с гексафторпропеном или тетрафторэтиленом. Аналитический сигнал (светопоглощение А ~ 0,01-0,1), коррелирующий с концентрацией антител к тиреоглобулину, определяют турбидиметрически, что существенно снижает точность и воспроизводимость метода. Иммобилизация белкового реагента адсорбцией является недостатком, поскольку также ухудшает точность определения.
В международной заявке WO 96/025668 (МПК G01N 33/543; G01N 33/564, опубл. 22.08.1996) раскрыты два варианта способа определения аутоиммунного антитела против тиреоглубулина человека в жидкой пробе. Первый вариант способа включает: (а) объединение указанной пробы с первым реагентом, включающим поликлональные аутоиммунные антитела человека, и вторым реагентом, включающим препарат тиреоглобулина человека, где один из указанных первого и второго реагентов является меченым, а другой из указанных первого и второго реагентов иммобилизован связыванием с твердой фазой, в таких условиях, чтобы аутоиммунное антитело в пробе, если оно присутствует, связывалось с тиреоглобулином препарата, тем самым, снижая степень связывания антител первого реагента с тиреоглобулином препарата; (b) определение количества указанного меченого реагента, иммобилизованного на указанной твердой фазе с помощью указанного иммобилизованного реагента; (с) построение корреляции указанного меченого реагента, иммобилизованного на указанной твердой фазе с помощью указанного иммобилизованного реагента, если наблюдается, в присутствии указанной пробы с количеством указанного меченого реагента, иммобилизованного на указанной твердой фазе с помощью указанного иммобилизованного реагента, в тех же условиях, но в отсутствии указанной пробы, чем достигается определение аутоиммунного антитела к тиреоглобулину в указанной пробе, если оно присутствует.
Второй вариант на стадии (с) предусматривает построение корреляции в присутствии жидкого стандарта, содержащего известное количество указанного препарата тиреоглобулина человека, чем достигается определение аутоиммунного антитела к тиреоглобулину в указанной пробе, если оно присутствует.
Также раскрыт набор для определения аутоиммунных тел к тиреоглобулину человека, который включает первый реагент, включающий поликлональные аутоиммунные антитела человека, и второй реагент, включающий препарат тиреоглобулина человека, где один из указанных первого и второго реагентов является меченым, а другой из указанных первого и второго реагентов иммобилизован связыванием с твердой фазой.
Как следует из примеров, приведенных в описании изобретения, выполнение определения с помощью набора HENNINGtest® anti-Tg, принятого в качестве стандарта качества определения, требует достаточно длительного времени, включая 22 часа на подготовку пробирок с пробами, взятыми у пациентов, 4 часа на инкубирование после добавления в пробирки афинно-очищенньгх аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека и 2 часа на инкубирование перед определением радиоактивности образцов.
Способ в соответствии с известным изобретением позволяет на порядок сократить продолжительность определения при незначительно худшей вероятности получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Однако в примерах, приведенных в описании изобретения, указано, что иммобилизация второго реагента, содержащего тиреоглобулин человека, происходит за счет сорбции на модифицированных стенках пробирок, а метка является радиоактивной меткой, что обусловливает низкую специфичность и высокие пределы обнаружения и определения метода. Необходимость введения и определения радиоактивной метки также является недостатком.
Поэтому существует потребность в разработке усовершенствованных способов определения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека и тест-систем для их осуществления.
В результате обширных исследований авторы изобретения установили, что недостатки известного уровня техники могут быть в существенной мере преодолены созданием тест-системы для экспрессного определения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека на основе полимерных микросфер со средним размером от 1,0 до 5,0 мкм с молекулами тиреоглобулина, ковалентно конъюгированными вблизи поверхности микросфер, указанная тест-система содержит фосфатный буфер и суспензионную композицию полимерных микросфер из поли(2-метил-5-винилпиридина), у которых к карбоксиметильным группам, связанным с поверхностью микросфер через атом азота пиридина(-N+Н-СН2-COOH):
ковалентно присоединены молекулы тиреоглобулина:
Для целей настоящего изобретения природа полимера, образующего микросферы, имеет принципиальное значения и должна обеспечивать возможность введения на поверхность карбоксильных групп, способных к активации под действием активирующих агентов из класса карбодиимидов. Примером подходящего для этого полимера является 2-метил-5-винилпиридин. Примерами подходящих карбодиимидов являются 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида 4-толуолсульфонат и (N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид.
Тест-система может быть получена в соответствии соспособом получения, включающим следующие стадии:
а) на поверхность микросфер вводят карбоксиметильные группы посредством их обработки раствором калиевой или натриевой соли галогенуксусной кислоты, в присутствии карбоната натрия или калия, с последующей обработкой раствором кислоты.
б) свободные карбоксильные группы, связанные с поверхностью полимерных микросфер:
активируют водорастворимым карбодиимидом с получением модифицированных полимерных микросфер:
в) тиреоглобулин иммобилизуют на модифицированных полимерных микросферах с образованием ковалентного конъюгата:
г) полученный конъюгат выделяют из реакционной массы, очищают и объединяют с фосфатным буфером. Далее изобретение обеспечивает набор для определения уровней аутоантител к тиреоглобулину, в состав которого входят:
- планшет 96-луночный полистирольный;
- тест-система;
- буферный раствор;
- отрицательная контрольная сыворотка;
- положительная контрольная сыворотка;
- инструкция по применению;
- упаковка, обеспечивающую его идентификацию и способствующую его сохранности в течение срока годности, при этом входящая в набор тест-система представляет тест-систему для экспрессного определения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека на основе полимерных микросфер со средним размером от 1,0 до 5,0 мкм с молекулами тиреоглобулина, ковалентно конъюгированными вблизи поверхности микросфер, которая является содержащей фосфатный буфер суспензионной композицией полимерных микросфер из поли(2-метил-5-винилпиридина), у которых карбоксиметильным группам, связанным с поверхностью микросфер через атом пиридина азота:
ковалентно присоединены молекулы тиреоглобулина:
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств аналогичного назначения сокращение времени определения приблизительно в 2 раза без ухудшения качества определения в интервале содержаний аутоиммунных антител к тиреоглобулину от 10 до 2000 МЕ/мл.
Возможность достижения технических результатов изобретения будет подтверждена примерами его предпочтительных осуществлений.
Примеры 1-9. Иммобилизация тиреоглобулина человека на микросферах.
Пример 1. Приготовление поли(2-метил-5-винилпиридина) и микросфер на его основе:
В раствор 0,4 г поливинилового спирта (ММ 40 кДа) в 40 мл дистиллированной воды добавляют 0,096 г персульфата калия и растворяют при перемешивании на магнитной мешалке. Полученный раствор фильтруют и переносят в реактор, снабженный термостатируемой рубашкой и верхнеприводной мешалкой. В реактор добавляют 10 мл мономера 2-метил-5-винилпиридина и перемешивают в течение 30 минут. Затем включают нагрев до 67°С и проводят полимеризацию в течение 24 часов. Получают продукт с среднечисловой молекулярной массой 65 кДа. Полученный полимер отделяют фильтрованием, растворяют в хлористом метилене и готовят 18% раствор, который порциями смешивают с 10 объемами диэтилового эфира. Выпавший осадок полимера отфильтровывают, промывают эфиром, высушивают и используют для приготовления микросфер.
Раствор поли(2-метил-5-винилпиридина) в 5,0 мл хлористого метилена порциями при постоянном перемешивании (6500 об/мин) вводят в раствор поливинилового спирта с молекулярной массой 40 кДа в 250 мл дистиллированной воды. Дальнейшую обработку полученной эмульсии проводят на ультразвуковом диспергаторе в течение 10 минут. Затем эмульсию перемешивают в течение 15 часов при комнатной температуре на магнитной мешалке (200 об/мин) до получения суспензии микросфер.
Полученную суспензию концентрируют центрифугированием при 15000 об/мин в течение 10 минут, затем смешивают с дистиллированной водой и выдерживают при перемешивании (200 об/мин) в течение 1 часа.
Процесс центрифугирования полученной суспензии полимерных микросфер осуществляют при 15000 об/мин в течение 10 минут.
Пример 2. Приготовление полимерных микросфер осуществляют, как описано в примере 2, при условиях проведения процесса согласно таблице 1.
Пример 3. Введение карбоксиметильных групп на поверхность микросфер (вариант 7):
К раствору 1,38 г (0,1 моль) карбоната калия в 2,5 мл дистиллированной воды при перемешивании прибавляют предварительно охлажденный раствор 1,89 г (0,2 моль) хлоруксусной кислоты в 2,0 мл дистиллированной воды.
К 5 мл полимерной суспензии с концентрация 0,56% масс/об. (вариант 6) добавляют 0,048 мл полученного раствора и перемешивают с помощью шейкера в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем смесь нагревают до 70°C в течение 4 часов, охлаждают до 15-20°C, разбавляют дистиллированной водой, суспензию центрифугируют, фугат промывают избытком воды, полимерные микросферы отделяют центрифугированием и подвергают лиофильной сушке.
Пример 4. Введение карбоксиметильных групп на поверхность микросфер (вариант 8):
К раствору 1,38 г (0,1 моль) карбоната калия в 2,5 мл дистиллированной воды при перемешивании прибавляют предварительно охлажденный раствор 1,89 г (0,2 моль) хлоруксусной кислоты в 2,0 мл дистиллированной воды.
К 5 мл полимерной суспензии с концентрация 0,94% масс/об. (вариант 5) добавляют 0,08 мл полученного раствора и перемешивают с помощью шейкера в течение 48 ч при комнатной температуре. Затем смесь нагревают до 70°C в течение 4 часов, охлаждают до 15-20°C, разбавляют дистиллированной водой, суспензию центрифугируют, фугат промывают избытком воды, полимерные микросферы отделяют центрифугированием и подвергают лиофильной сушке.
Пример 5. Введение карбоксиметильных групп на поверхность микросфер (вариант 9):
К раствору 1,38 г (0,1 моль) карбоната калия в 2,5 мл дистиллированной воды при перемешивании прибавляют предварительно охлажденный раствор 1,89 г (0,2 моль) хлоруксусной кислоты в 2,0 мл дистиллированной воды.
К 5 мл полимерной суспензии с концентрация 0,18% масс/об. (вариант 2) добавляют 0,046 мл полученного раствора карбоната калия и перемешивают с помощью шейкера в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем смесь нагревают до 70°C в течение 4 часов, охлаждают до 15-20°C, разбавляют дистиллированной водой, суспензию центрифугируют, фугат промывают избытком воды, полимерные микросферы отделяют центрифугированием и сушат под вакуумом.
Пример 6. Введение карбоксиметильных групп на поверхность микросфер (вариант 10):
К раствору 1,38 г (0,1 моль) карбоната калия в 2,5 мл дистиллированной воды при перемешивании прибавляют предварительно охлажденный раствор 1,89 г (0,2 моль) хлоруксусной кислоты в 2,0 мл дистиллированной воды.
К 5 мл полимерной суспензии с концентрация 0,47% масс/об. (вариант 3) добавляют 0,12 мл полученного раствора и перемешивают с помощью шейкера в течение 48 ч при комнатной температуре. Затем смесь нагревают до 70°C в течение 4 часов, охлаждают до 15-20°C, разбавляют дистиллированной водой, суспензию центрифугируют, фугат промывают избытком воды, полимерные микросферы отделяют центрифугированием и подвергают лиофильной сушке.
Пример 7. Методика определения содержания карбоксиметильных групп на поверхности микросфер:
К 4 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия добавляют 0,05 г полимерных микросфер и выдерживают в течение 14 часов. Смесь фильтруют. Полученный фильтрат оттитровывают 0,1 Н раствором серной кислоты.
Количество карбоксильных групп на 1 г полимерных микросфер рассчитывают по формуле:
V0 - объем титранта, израсходованный на титрование контрольного опыта, мл;
V1 - объем гидроксида натрия, добавленный к полимерным микро;
V2 - объем титранта, израсходованный на титрование анализируемого раствора, мл;
CNaOH - концентрация раствора щелочи, моль/мл;
NА - число Авогадро, моль-1;
m - масса полимерных микросфер, г.
Пример 8. Методика иммобилизации тиреоглобулина:
Карбоксильные группы полимерных микросфер активируют с помощью (N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (КДИ), для чего суспензию микросфер, полученных по примеру 8 в фосфатном буферном растворе, центрифугируют 15 мин при 8000 об/мин, отделяют надосадочную жидкость, а фугат смешивают с фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2-7,4) с получением полимерной суспензии с концентрации 0,5% масс/об.
Затем 1 мл полученной суспензии смешивают с 1 мл раствора карбодиимида (КДИ) с концентрацией 0,1 масс. %, полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, трижды промывают фосфатным буферным раствором с последующим центрифугированием для удаления непрореагировавшего КДИ.
Полученную активированную суспензию смешивают с равным объемом раствора тиреоглобулина с концентрацией 0,005% масс/об. После инкубации в течение времени tи, равного 3-6 часам, при температуре +37°C несвязанный биолиганд удаляют трехкратным центрифугированием. Концентрацию суспензии устанавливают равной 0,3% масс/об. добавлением фосфатного буфера.
Эффективность иммобилизации составляет 8-13% по данным определения содержания тиреогобулина в объединенных промывных водах методом Лоури.
Получают тест-системы со следующими характеристиками (табл. 2)
Аликвоты полученной тест-системы помещают в герметично укупориваемые флаконы вместимостью 10 мл и хранят в холодильнике при температуре 2-4°C, защитив от воздействия света.
Пример 9. Оценка чувствительности тест-системы обнаружения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека:
В 96-луночном планшете готовят разведения сывороток с отрицательным и положительным контролями, для чего в лунку А1 вносят 50 мкл сыворотки с отрицательным контролем (ОК), в лунку А2 вносят 50 мкл сыворотки с положительным контролем (ПК). Концентрация аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы в ПК составляет 640 МЕ/мл. Затем в оставшиеся свободные лунки рядов 1 и 2 вносят по 25 мкм фосфатного буферного раствора и затем готовят серии последовательных 2-х-кратных разведений от 1:20 до 1:1280 контрольных сывороток.
При положительной РЛА на дне лунки формируется агглютинат в виде перевернутого зонтика, при отрицательной - точечный преципитат. Показано, что чувствительность тест-системы соответствует 10 МЕ/мл.
Claims (7)
1. Тест-система для экспрессного определения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека на основе полимерных микросфер со средним размером от 1,0 до 5,0 мкм с молекулами тиреоглобулина, ковалентно конъюгированными вблизи поверхности микросфер, характеризующаяся тем, что она содержит фосфатный буфер и суспензионную композицию полимерных микросфер из поли(2-метил-5-винилпиридина), у которых к карбоксиметильным группам, связанным с поверхностью микросфер через атом азота пиридина, ковалентно присоединены молекулы тиреоглобулина.
2. Способ получения тест-системы для экспрессного определения аутоиммунных антител к тиреоглобулину человека на основе полимерных микросфер по п. 1, характеризующийся тем, что включает стадии:
а) на поверхность микросфер из поли(2-метил-5-винилпиридина) вводят карбоксиметильные группы посредством их обработки раствором калиевой или натриевой соли галогенуксусной кислоты, с последующей обработкой раствором кислоты;
б) свободные карбоксильние группы карбоксиметильных групп активируют водорастворимым карбодиимидом с получением модифицированных полимерных микросфер;
в) тиреоглобулин иммобилизуют на модифицированных полимерных микросферах с образованием ковалентного конъюгата;
г) полученный конъюгат выделяют из реакционной массы, очищают и объединяют с фосфатным буфером.
3. Набор для определения уровней аутоантител к тиреоглобулину, содержащий тест-систему по п. 1 и характеризующийся тем, что он дополнительно содержит планшет 96-луночный полистирольный, буферный раствор, отрицательную и положительную контрольные сыворотки.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017113715A RU2657834C1 (ru) | 2017-04-20 | 2017-04-20 | Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017113715A RU2657834C1 (ru) | 2017-04-20 | 2017-04-20 | Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2657834C1 true RU2657834C1 (ru) | 2018-06-15 |
Family
ID=62620212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017113715A RU2657834C1 (ru) | 2017-04-20 | 2017-04-20 | Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2657834C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2817258C2 (ru) * | 2022-07-25 | 2024-04-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способы латекс-агглютинации и торможения латекс-агглютинации, применимые для всех подтипов вирусов гриппа А и В, и тест-система для их осуществления |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4150232A (en) * | 1977-07-15 | 1979-04-17 | Cilag-Chemie A.G. | 1-Carboxymethyl-3-sulfoloweralkyl pyridinium betaine inner salts |
| WO1996025668A1 (de) * | 1995-02-16 | 1996-08-22 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Verwendung von polyklonalen humanen anti-htg-autoantikörpern als reagenz für die klinische diagnostik von schilddrüsen-autoimmunerkrankungen sowie reagenziensatz für eine bestimmung von anti-htg-autoantikörpern in patientenseren |
| US5871722A (en) * | 1988-11-16 | 1999-02-16 | Advanced Polymer Systems, Inc. | Ionic beads useful for controlled release and adsorption |
| RU2164919C2 (ru) * | 1998-02-04 | 2001-04-10 | Институт высокомолекулярных соединений РАН | Способ получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц |
-
2017
- 2017-04-20 RU RU2017113715A patent/RU2657834C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4150232A (en) * | 1977-07-15 | 1979-04-17 | Cilag-Chemie A.G. | 1-Carboxymethyl-3-sulfoloweralkyl pyridinium betaine inner salts |
| US5871722A (en) * | 1988-11-16 | 1999-02-16 | Advanced Polymer Systems, Inc. | Ionic beads useful for controlled release and adsorption |
| WO1996025668A1 (de) * | 1995-02-16 | 1996-08-22 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Verwendung von polyklonalen humanen anti-htg-autoantikörpern als reagenz für die klinische diagnostik von schilddrüsen-autoimmunerkrankungen sowie reagenziensatz für eine bestimmung von anti-htg-autoantikörpern in patientenseren |
| RU2164919C2 (ru) * | 1998-02-04 | 2001-04-10 | Институт высокомолекулярных соединений РАН | Способ получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STANISHEVSKIY YA. M. et al. Technology for test-systems for diagnosis of modified proteins (proteopathy) underlying social diseases (Report 2)/ Вестник МИТХТ, 2013, Т.8, стр.77-82. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2817258C2 (ru) * | 2022-07-25 | 2024-04-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способы латекс-агглютинации и торможения латекс-агглютинации, применимые для всех подтипов вирусов гриппа А и В, и тест-система для их осуществления |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4415700A (en) | Hydrophilic latex particles and use thereof | |
| US4656144A (en) | Immunoparticles and process for preparing same | |
| EP0038960B1 (en) | Diagnostic reagents for immunological tests and a process for preparing the same | |
| JPH0361143B2 (ru) | ||
| CN108593641B (zh) | 一种定量检测全血样品中待测物质的试剂盒及方法 | |
| WO2003005031A1 (fr) | Latex a particules supports pour reactif d'essai, et reactif d'essai | |
| EP0070527A1 (en) | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor | |
| JPH0810224B2 (ja) | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 | |
| JPH11287802A (ja) | 表面保護剤 | |
| RU2657834C1 (ru) | Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы | |
| US4792527A (en) | Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor | |
| JPH0810223B2 (ja) | 診断薬用ラテツクス、その製法および該ラテツクスを用いてなる診断薬 | |
| JP2947600B2 (ja) | 免疫測定法 | |
| JP2003344410A (ja) | 免疫測定試薬及び免疫測定法 | |
| JP2000046828A (ja) | 免疫学的測定試薬及び免疫学的測定試薬の製造方法 | |
| JP3954900B2 (ja) | 免疫測定試薬及び免疫測定法 | |
| JPS6343412B2 (ru) | ||
| JPH09304386A (ja) | 免疫診断薬の製造方法および得られた免疫診断薬 | |
| JPH0743383B2 (ja) | 診断試薬用担体ラテツクス | |
| JPS61159166A (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| JPH0564744B2 (ru) | ||
| JPH07270423A (ja) | 免疫診断薬の製造方法 | |
| JPS62231169A (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| JPH0564743B2 (ru) | ||
| JP2001289854A (ja) | 高分子球状体、免疫学的測定試薬及び免疫測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190421 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210204 |