DE2552510C3

DE2552510C3 - Biologisch aktive Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2552510C3
Application number: DE2552510A
Authority: DE
Inventors: Heinrich Dr. 6231 Schwalbach Huemer; Rudolf Schmidtberger; Tibor Dipl.- Chem. Dr. Toth
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1975-11-22
Filing date: 1975-11-22
Publication date: 1981-02-19
Also published as: IL50940A; LU76243A1; DK522976A; SE430066B; AU1981776A; AT358275B; SE7612998L; JPS6048524B2; CH636628A5; BE848601A; CA1069070A; ZA766942B; GB1571182A; ES453362A1; ATA863176A; NO763975L; FR2332287A1; DE2552510B2; NL7612771A; IT1121742B

Description

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung vorzugsweise bei der Affinitätschromatographie.

In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchgesetzt, deren primäres Merkmal darin besteht, die Affinität von trägergebundenen, biologisch aktiven Substanzen zu selektiv durchzuführenden Reaktionen einzusetzen.

Ober eine spezifische Komplexbildung der trägergebundenen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch en'fernt und gewünschtenfalls anschließend durch Desorption isoliert werden.

Trägergebundene Enzyme bieten den Vorteil, Stoffumwandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durchzuführen und die Reaktionsprodukte enzymfrei zu erhalten.

In der biochemisenen, enzymatischen Analytik stehen trägergebundene wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwendbare Reagenzien zur Verfügung.

Auf Grund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht nur gegenüber den Substraten, sondern auch gegenüber den spezifischen Inhibitoren aufzuweisen, hat sich die Gewinnung von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Affinitätschromatographie an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserunlösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechenden Enzyme.

Als sogenannte ImmunadsorbentH"i werden Antigene oder Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlauben danach die isolierung der korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene.

Als biologisch aktive Substanzen werden entsprechend den vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im weitesten Sinne als Enzyme. Aktivatoren. Inhibitoren, Antigene oder Antikörper. Vitamine und Hormone bezeichnet werden können. Für diese biologisch aktiven Substanzen hat sich, da sie die Wirkprinzipien der wasserunlöslichen Systeme darstellen, die Bezeichnung Effektoren eingeführt.

Die meisten der bisher beschriebenen träger gebundenen Effektoren sind wesentlich stabiler als die entsprechenden biologisch aktiven Substanzen in Lösung.

Als Trägermaterialien, sogenannte Matrizen, sind vorteilhaft solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in wäßrigen Systemen eine möglichst niedrige unspezifische Adsorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reaktion* partner des Effektors weitgehend unterbunden werden. Mit Substanzen, deren Bindung an den Effektor unerwünscht ist. z. B. solchen, die keine spezifischen Reaktionspartner des Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein.

Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu gehören beispielsweise Polystyrol, Aktivkohle und Glasperlen und diejenigen, die mit den Effektoren über eine kovalente Bindung miteinander verknüpft sind. Die Letztgenannten schließen Vinylpolymere als Homo- und Copolymerisate, ζ. Β.

Polyacrylsäuren, Polyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder Sulfonyl-substttuiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Abkömmlinge und schließlich natürliche und synthetische Polypeptide und Proteine ein. Wegen der ausgeglichenen Wechselwirkung zwischen Matrize und Effektor hat die Verwendung von Kohlenhydraten, insbesondere der Zellulose, des Dextrans, der Stärke, des Agars bzw. deren Abkömmlingen, als Matrize in wäßrigen Systemen die höchste

ίο Verbreitung gefunden, wenn auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxylgruppen wegen ihren unspezifischen Affinitäten als störend empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ geringe thermische und chemische Stabilität auf.

is Viele dieser Nachteile konnten durch Verwendung von Polyvinylenglykol, einem synthetischen Polymeren, als Matrize weitgehend beseitigt werden (DE-OS 24 21 789). Polyvinylglykol, auch Polyhydroximethylen genannt, wird durch saure oder basische Hydrolyse aus

μ Polyvinylencarbonat hergestellt Jedes Kohlenstoffatom trägt eine Hydroxylgruppe und ein Wasserstoffatom. Die durchgehende -C-C-Bindung verleiht dem Träger eine besonders hohe Stabilität

Polyvinylencarbonat und Copolymere der Vinylen-

carbonate sind ebenfalls bereits als Träger für verschiedene Effektoren, insbesondere Proteine, verwendet worden (DE-OS 24 07 340). Diese bekannten Verbindungen besitzen aber — sofern überhaupt aktive Gruppen der Vinylencarbonat-Mono.nereneinheiten

jo nicht an den Effektor gebunden sind — intakte Carbonat-Gruppen, die dem System Träger-Effektor keine hydrophilen Eigenschaften verleihen.

Es wurde nun gefunden, daß man statt Polyvinylenglykol vorteilhaft Vinylenglykol-Copolymere als

α Trägermatrix verwenden kann. Durch Einpolymerisieren von geeigneten Comonomeren in Polyvinylencarbonat können die physikalischen und chemischen Eigenschaften des daraus hergestellten Polyvinylglykois weitgehend variiert werden.

So kann z. B. die »Hydrophilie«. bzw. »Quellung« des Polyvinylenglykols durch Einpolymensieren von hydrophoben Monomeren, wie Äthylen. Vinylchlorid oder Styrol in das Polyvinylencarbonat verändert werden. Durch die Copolymerisation von Vinylacetat wird im verseiften Endprodukt eine Vinylenglykolgruppe durch eine Vinylalkoholgruppe ersetzt, was eine erhöhte Quellbarkeit in wäßrigem Medium zur Folge hat.

Es ist möglich, mit Hilfe von Comonomeren, wie z. B. Diäthylenglykoldivinyläther und Divinylbenzol eine

V) Vernetzung und damit eine Verbesserung der mecham sehen Eigenschaften des Trägers zu erhalten Durch Einpolymerisieren von elektrophilen Funktionen. / B Oxira-gruppen (Epoxigruppen) aus Vinylglycidyl ätherComonomeren. ist eine direkte Umsetzung der

« Matrix mit nucleophilen Funktionen (-NHj. -OH usw.) möglich. Carboxylgruppen können durch Acryl säureester-Comonomere eingeführt werden. Nach er folgter Copolymerisation werden die Estergruppen ^u Carboxylgruppen verseift. Die Einführung von -NH?

oder -COOH-G<-jppen erlaubt die Aktivierung mit Hilfe VQn Carbgdiimjden, IsQsasoliumsateen, Gluiar aldehyd usw. Copolymerisate-Vinylenglykol/Vinylalkohol haben eine höhere spezifische Oberfläche und damii eim höhere Bindungskapazität für z. B. Proteine an der

to Oberfläche des Polymerpulvers im Vergleich zu Vinylenglykol-Homopolymerisat

Gegenstand der Erfindung sind demnach Verbindungen aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und

einer daran unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz, worin nur ein Teil der aktiven Giuppen der VinylenglykoI-Einheiten des Polymeren an die biologisch aktive Substanz gebunden ist und der Rest als freie Hydroxylgruppen vorliegt

In diesen Verbindungen ist die Trägermatrix ein Polyvinylenglykol-Copolymerisat enthaltend bis zu 45%, vorzugsweise 5-20%, eines Comonomeren. Die biologisch aktiven Substanzen sind Stoffe wie Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen, Phytämagglutinine, Antibiotika, Vitamine oder Hormone, Peptide oder Aminosäuren oder synthetisch hergestellte Effektoren.

Der polymere Träger und die biologisch aktive Substanz sind entweder direkt oder über eine Seitenkette (Spacer) kovalent miteinander verknüpft

Die biologisch aktiven Verbindungen über eine Seitenkette (Spacer) zu binden ist von Vorteil, wenn die Molekulargewichte ihrer affinen Psatner sehr unterschiedlich sind, oder wenn bei der Verwendurg in eisern biospezifischen Prozeß sehr hochmolekulare oder aus mehreren Untereinheiten aufgebaute Proteine teilnehmen. Spacer sind an der polymeren Matrix verankerte Seitenketten bestimmter Länge, die durch Einpolymerisiereti durch An- oder Einbau (Bindung von bi- oder polyfunktionellen Verbindungen — z. B. einem Tripeptid — an die Matrix) oder durch Einbau von funktioneilen Gruppen und schrittweise Verlängerung jo an diesen erhalten werden können.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur kovalenten Verbindung der biologisch aktiven Substanzen mit dem Träger.

Hierzu steht eine Reihe von allgemein bekannten Reaktionen zur Verfügung.

Sie betreffen zunächst die Verfahren zur Herstellung des Polyvinylenglykol-Copolymeren. Sie sind dadurch gekennzeichnet daß Vinylencarbonat mit Comonomeren, insbesondere solchen der der allgemeinen Formeln:

HjC = C

COOR, R.

Ο —CO —CH, R,

50

H,C =

Cl

H₂C =

CH=CH₂

H₂C = C

(OCH₂-CHi)_n-O-CH =

H₂C = C CH₂

N (CH₂),

OC CH₂

R.

H₂C =

CH₂

Ri

H₂C = C

O —CH CH₂

H₂C = C

CH-CH₂

I I ο ο

Il ο

in denen Ri Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R₃ Methyl, Äth;,i Propyl und η eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten, polymerisiert wird.

Die Polymerisation des Polyvinylencarbonats erfolgt mit bis zu 45% Comonomeren, vorzugsweise mix 5-20%. Die Bindung des Effektors an den polymeren Träger

M) kann — unter berücksichtigung der Fähigkeit des Polyvinyleiicarbonats zur Hydrolyse und dem Bestreben, einen Teil der im Polymeren verbundenen Hydroxylgruppen zu erhalten — auf verschiedene Weise erfolgen.

h) So kann man:

(A) ein Copolymeres des Vinylcarbonats mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzen und danach

die noch vorhandenen Cyclocarbonatgruppen in Hydroxygruppen überführen oder
(B) die Cyclocarbonatgruppen eines Copolymeren des Vinylencarbonats in Hydroxygruppen überführen und

(a) im Copolymerisat vorhandene oder in dieses eingeführte elektrophile Gruppen mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzen oder

(b) diese Hydroxygruppen

(1) entweder zuerst mit einer elektrophile Gruppen enthaltenden Verbindung und sodann mit einer biologisch aktiven Substanz

(2) oder unmittelbar mit einer elektrophilen Gruppen tragenden biologisch aktiven Substanz umsetzen.

Die Herstellung der an den Träger gebundenen

dadurch möglich, daß eine elektrophile Gruppe entweder in die biologisch aktive Substanz oder in das Polyvinylenglykolcopolymer eingeführt wird und über diese die biologisch aktive Substanz mit den Polyvinylenglykolcopolymeren umgesetzt wird.

Die Einführung der elektrophilen Gruppen in die Trägermatrix erfolgt entweder durch Copolymerisieren von Vinylencarbonat mit elektrophile Gruppen enthaltenden Comonomeren oder durch Umsetzung der Trägermatrix mit aktivierenden, elektrophile Gruppen tragenden niedermolekularen Verbindungen.

Allgemein ist die chemische Kupplung eines Reaktionspartners an die Trägermatrix einfach, wenn auf der einen Seite nucleophile und auf der anderen elektrophile Funktionen vorhanden sind. Als reaktive nucleophile Funktionen kommen vor allem Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen in Betracht, die gewöhnlich entweder in der Matrix oder im Reaktionspartner bereits enthalten sind. Elektrophile Funktionen müssen erst eingeführt werden. Dazu können Carboxylgruppen in Säurehalogenide, Säureazide, Säureanhydride, Imidazolide übergeführt oder direkt mit Carbodiimiden aktiviert werden. Als reaktive elektrophile Gruppen werden auch Isocyanat-, Isothiocyanat-, Diazonium-Gruppen oder cyclische Imidocarbonatester benutzt. Besonders günstig ist die Einführung reaktiver Gruppen mit Hilfe der Copolymerisation.

Durch Einpolymerisieren von Monomeren mit Epoxy-Gruppen, z. B. mit Epoxyalkylvinyläthern in das > Polyvinylencarbonat und durch die sehr großen Unterschiede in der Verseifungsgeschwindigkeit zwischen cyclischen Carbonat- und Epoxy-Gruppen. erhält man leicht eine Polyvinylenglykol-Matrix mit reaktiven Epoxy-Gruppen, die mit nucleophilen Funktionen ι·) umgesetzt werden können. So ist die direkte Bindung einer biologisch aktiven Substanz und/oder die Einführung (Verlängerung) einer Seitenkette (Spacer) möglich.

Ein weiterer Vorteil ist demnach bei der Verwendung

von Copolymeren auch die Möglichkeit der direkten

Ii Einführung (Einpolymerisieren) von elektrophilen Funktionen, die eine Umsetzung nach bekannten Methoden erlauben.

Durch Copolymerisieren von Vinylencarbonat mit

JL |U**1. Λ sif>wla*l i*·^ r!SChfc!'^v0n^^or Λ/ArcjktfitnfT A&r PnIw.

meren erhält man eine Matrix mit -OH- und — COOH-Funktionen. Die Carboxylgruppen können mit Hilfe von Carbodiimiden aktiviert werden und sodann eine Amidbindung mit Aminogruppen des Effektors eingehen. Carboxylgruppen lassen ferner die

λ> Ausbildung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward eingeführten (soxazoliumsalze zu.

Eine weitete Methode zur Kupplung von biologisch aktiven Verbindungen an Carboxylgruppen-haltigen Polymeren wird mit Hilfe von N-äthoxycarbonyl-2-äth-

so oxy-i^-dihydrochinolin (EEDQ) ausgeführt.

Die Carboxylgruppen können nach bekannten Methode verestert, danach der Ester in das Hydrazid überführt und schließlich das in der Folge resultierende Azid mit der Aminogruppe des Effektorproteins mit der

r. Polyvinylglykol-Matrix verknüpft werden.

Besitzt das in die Matrix einpolymerisierte Comonomere durch nachfolgende Umsetzungen frei verfügbare Aminogruppen, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder Schwefelsäureestern von

jo 0-Hydroxyäthylsulfonen die Einführung von Arylaminogruppen möglich, wobei die Arylaminogruppen sodann nach bekannten Methoden diazotiert und anschließend mit entsprechend reaktiven Gruppen eines Effektors verbunden werden können, z. B.

H H
-C —C —
OH OH

HHHH

-C — C — C — C

OH H O H

CH₂
HO-CH

CH₂ — NH—(CH₂),,—-NH —CH₂-

-NH₂

Auf diese Weise kann auch eine »Verlängerung« eines Spacers vorgenommen werden.

Ein anderer Weg zur Bindung von Proteinen über die Aminogruppen erfolgt mit Hilfe von Glutardialdehyd.

Einfach ist die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung der Hydroxyl- oder Aminogruppen des Polyvinyiengiykol-Copolymeren mittels Cyanhalogeniden, vorteilhaft mit Bromcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Aminogruppen

enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über diese aktivierten Gruppen.

Eine weitere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyvinylenglykol- oder Polyviny-Ienglykol-Copolymerisat-Matrix besteht in der Acylierung der Hydroxylgruppen mit Bromacetyibromid, gefolgt von der Alkylierung der Aminogruppen des Effektors.

Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch

Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Triazinen zu erreichen, wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazine mit der Polyvinylenglykol-Verbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt.

Diazolierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, ertauben auf der anderen Seite die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin- oder Histidinresten der Proteineffektors.

Arylaminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von /f-Hydroxyäthylsulfonen können mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Sie ermöglichen die Bindung des Effektors nach der vorbeschriebenen Diazotierungsreaktion.

Besonders stabile Ätherverbindungen entstehen bei der Umsetzung der Hydroxylgruppen des Polyvinylenglykol-Copolymerisats mit nicht ionenbildenden Epoxiden, die mindestens 2 reaktive Gruppen enthalten, wie die Epihalohydrine oder die Polyepoxide, beispielsweise Epichlorhydrin oder Bisepoxide.

Eine weitere Art der Modifizierung ist die Einpolymerisation von Comonomeren in die Polyvinylencarbonat-Kette (wie z. B. von Vinylpyrrolidon) mit anschlie-

ι« Bender partieller Umsetzung der Zyklocarbonatringe des Polyvinylencarbonats mit einem Amin, z. B. mit Hexamethylendiamin, zu einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder Effektor substituierten Polyvinylencarbonat-Copolymerisat. Die restlichen

Ii Zyklocarbonatgruppen werden dann zu Hydroxylgruppen verseift:

-CH
ι

-CH₂-

γ/

"CH- CH"
ι ι

^J

+ P

ft

-NH₂

H₂

-CH

-CH₂-

γ/

"CH-
I

^L

CH
I

-

-CH
j

— (

I
N

O

I I
O O

N

O

I
O

I
OH

:h —

H₂

/ \

H₂

\ /

H₂

/ \

H₂

\ /

/

O

L

C

L

C

H:

Il

carbonat

O

C = O

n- I

Pol

vvinvler

NH

R

-CH-CH₂-

Verseifung

CH-CH"

I I

OH OH

CH I	-CH
I OH	O
	NH I
	I R

Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix und dem Proteineffektor oder v, anderen Effektoren, existieren noch weitere Methoden, die zur Reaktion der Hydroxylgruppen oder bestimmter Gruppen des Copolymeren mit einem Effektor führen und dadurch die kovalente Verbindung zwischen beiden herstellen; so die bekannte Umsetzung mit komplexbil- v> denden Metallverbindungen, z. B. Titanverbindungen. Alle diese Methoden sind dem Fachmann bekannt. Bei der Bindung niedermolekularer biologisch aktiver Verbindungen ist es oft von Vorteil, nicht den Träger, sondern den Effektor zu aktivieren. ■>■>

Im Prinzip können alle Verfahren verwendet werden, die in der makromolekularen Chemie bei der Modifizierung von synthetischen oder natürlichen makromolekularen Verbindungen bekannt sind.

Die Polyvinylenglykol-Polymerisate zeichnen sich w) neben der chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führen damit zu einer Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefundenen Trägermatrizen auf der Basis von natürlichen Kohlenhydraten. Sie sind z. B. in t>5 Form von Fasern, Fäden, Folien oder sphärischen Partikeln herstellbar, so daß je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form eewählt werden kann. Vorzugsweise werden diese Copolymerisate in Form von feinteiligen Pulvern mit hoher spezifischer Oberfläche angewendet.

Durch die produktionstechnisch lenkbare Größe der für die Bindung der Effektoren bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug der Polyvinylenglykol-Copolymerisate gegenüber den bekannten Trägermaterialien.

Die erfindungsgemäßen biologisch aktiven Verbindungen eignen sich für die meisten Anwendungsverfahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als sogenannte Enzymelektroden verwendet Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen.

Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbentien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbesondere zur Gewinnung

i|

natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrakten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von anderen Serumbestandteilen und frei von anderen Antigenen erhalten werden. Affinitätschromatographisch können auch nicht präzipitierbaren Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden.

Beispiele Herstellung von Vinylencarbonat-Copolymeren

Das bei der ''erstellung der Copolymeren (CP) eingesetzte Vinylencarbonat wurde vor dem Einsatz eine Stunde über Natriumborhydrid (100 Gewichtsteile Vinylencarbonat auf 2 Gewichtsteile NaBH*) bei einem Druck von 33 mm am Rückfluß gekocht, dann bei

iigc, mil rvascmg-vjias-

2.) C'opolymcrisat-Vinylenglykol/ Yinylglycidyläther

Ein Gemisch von 7 Gewichtsteilen Vinylencarbonat, 3 Gewichtsteilen Vinylglycidyläther und 0,1 Gewichtsteil Azobisisobutyronitril wird wie unter I.) a) beschrieben in flachen Aluminiumtuben unter N2 3 Tage auf 50° erwärmt. Die erhaltenen Kunststoffplatten werden wie unter 1.) a) beschrieben zerkleinert, entmonomerisiert. auf eine Korngröße <0,l mm gemahlen, in 500 Gewichtsteilen eiskalter, 0,5 η NaOH mit einem schnellaufenden Rührer 30 Minuten suspendiert, an schließend das verseifte Polymere sofort abzentrifugiert, in Eiswasser aufgeschlämmt, unter Eiskühlung mit 2 η H2SO4 auf pH 7 neutralisiert, abgesaugt, mit Eiswasser ausgewaschen und gefriergetrocknet. Ausbeute: 3,9 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol (Vinylglycidyläther enthaltend 1,3 Milliäquivalenten Oxirangruppen/g (bestimmt nach: »Praktikum der makro-

ClIlC JVLII VGfi υΓαίϊΠ,

ringen gefüllte Silbermantel-Kolonne destilliert und möglichst umgehend für die Copolymerisation eingesetzt. Ebenso wurden die eingesetzten Comonomeren zuvor noch durch Destillation gereinigt.

1.) Copolymerisat-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus verseiftem Copolymerisat-Vinylencarbonat/Vinylacetat

a) In 9 Gewichtsteilen Vinylencarbonat und 1 Gewichtsteil Vinylacetat werden 0,05 Gewichtsteile Azobisisobutyronitril unter Stickstoff gelöst. Das Monomerengemisch wird unter Stickstoff in eine flachgedrückte (4 mm dicke, 60 mm breite, 150 mm lange) Aluminiumtube mit Schraubverschluß eingefüllt (Gesamtfüllvolumen etwa 35 ml), unter N2 verschlossen und 48 h in ein 50° warmes Wasserbad eingehängt. Es werden harte, spröde Kunststoffplatten erhalten, die in einer Schlagmühle vorzerkleinert werden. Anschließend wird das Granulat bei 1 -2 mm Druck 5 h lang auf 120° erwärmt, um das nicht polymerisierte Rest-Monomere abzutrennen. Das entmonomerisierte Granulat wird in einer Mühle -weiter auf eine Korngröße <0,l mm gemahlen, in 500 Gewichtsteilen 0,5 N Natronlauge eingetragen, bei 20° mit einem schnellaufenden Rührer eine Stunde lang gemischt, wobei die Carbonat- und Acetyl-Gruppen verseift werden. Das wasserunlösliche CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol wird abgesaugt, gut mit Wasser von anorganische Salzen freigewaschen und gefriergetrocknet

Ausbeute: 4,7 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol mit einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 34 m² g-'.

b) Wie unter 1.) a) beschrieben, nur daß auf 7 Gewichtsteile Vinylencarbonat 3 Gewichtsteile Vinylacetat eingesetzt werden.

Ausbeute: 4,1 Gewichtsteile CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol mit einer spezifischen Oberfläche des gefriergetrockneten Polymerpulvers von

c) Vergleichsversuch wie unter I.) a) beschrieben, nur daß 10 Gewichtsteile Vinylencarbonat und kein Comonomer eingesetzt werden. Ausbeute: 4,7 Gewichtsteile Homopolymerisat-Vinylenglykol mit einer spezifischen Oberfläche des gefriergetrockneten Polymerpulvers von 20,5

MiOiciCüiSrCn CrgämSCitcM ^iiCiiiiC«, >j.

D. Cherdron, H., Kern, W, Müthig Verlag. Heidelberg 1966).

3.) Aminosubstituierte Copolymerisat-,. Trägermaterial

3.9 Gewichtsteile CP-Vinylglykol/Vinylgiycidyläther (aus Beispiel 2.)) werden mit einem Ultra-Turrax-P.ührer in 100 Gewichtsteilen H2O suspendiert und mit 10 ml 30%igem Ammoniak versetzt. Mit einem kleinen

in Magnetrührer wird anschließend noch 10 h bei 50° gerührt, schließlich abgesaugt und gut mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet. Ausbeute: 3,5 Gewichtsteile Copolymerisat-Trägermaterial enthaltend 0,9 m äquivalente Aminogruppen

ji pro Gramm, in Form von 3-Amino-2-hydroxy-propyl-Gruppen (aus der Umsetzung von Ammoniak mit Glycidylgruppen entstanden).

4.) CP-Vinylenglykol/Arylsäure

jo 9 Gewichtsteile Vinylencarbonat, 1 Gewichtsteil Acrylsäureäthylester und 0,05 Gewichtsteile Azobisisobutyronitril werden unter N2 wie bei BeispiM 1.) a) Dolvmerisiert zerkleinert, entmonomerisiert und auf eine Korngröße <0,l mm gemahlen, verseift, abge- > saugt, ausgewaschen und gefriergetrocknet.

Ausbeute: 5,0 Gewichtsteile hydrophiles Polymerpulver, enthaltend 4,1 Mtlliäquivalente Carboxylgruppen pro Gramm Träger mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 27,2 m²g-'.

5.)ü)-Aminohexyl-Gruppen-substituiertes Poly-Vinylglykol

5 Gewichtsteile CP-VinylenglykoI/Acrylsäure aus Beispiel 4.) werden mit dem Ultra-Tuirax in 100 ml H₂O suspendiert auf 5° gekühlt, mit 2,5 g N-Cyclo hexyl-N'-iN-methylmorpholinoJ-äthyiycarbodiimido-

p-toluol-sulfonat versetzt, 30 Minuten bei pH 5 und 5° gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen.

Der aktivierte Träger wird anschließend sofort in eine

bo mit 2 η HCl auf pH 7,5 gestellte und auf 5° gekühlte Lösung von 5 g Hexamethylendiamin in 100 ml Wasser suspendiert und noch weitere 24 Stunden unter diesen Bedingungen mit einem Magnetrührer gerührt, abgesaugt, gut mit Wasser ausgewaschen und gefrierge- trocknet

Ausbeute: 4,5 Gewichtsteile ω-Aminohexyl-Gruppen-substituiertes Poly-Vinylenglykol mit 0.7 Milliäquivalenten Aminogruppen pro Gramm Träger.

6.) Umsetzung von CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus Beispiel 1.) a) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 34 m² g -'

») mit Epichlorhydrin

50 g eines CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol, hergestellt nach Beispiel 1.) a) werden in 1 Liter 2 η NaOH suspendiert, mit 250 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55-60° gerührt. Der pH-Wert der Suspension sinkt nach kurzer Zeit auf 10—11. Durch Zugabe von NaOH wird noch 1 Stunde dieser pH-Wert gehalten. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird der Feststoff abgesaugt, mit Wasser, Aceton und zum Schluß wieder mit Wasser gewaschen.

b) mit Hexamethylendiamin

50 g Hexamethylendiamin werden in 1,51 Wasser gelöst und mit HCl bis pH 10 versetzt. Zu der Losung wird das nach 6.) a) aktivierte CP-Vinyienglykol/Vinylalkohol gegeben und bei 50-55° 6 Stunden gerührt. Danach wird das Produkt abgesaugt und mit Wasser frei von Hexamethylendiamin gewaschen.

c) mit i-Aminobenzol^-^-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester

Das unter Beispie! 6.) b) erhaltene Produkt wird mit 50 g i-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester bei 55" -ind pH 10 eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird der Feststoff abfiltriert, mit Wasser, Aceton und wieder mit Wasser gewaschen.

d) Diazotierung

10 g des unter Beispiel 6.) c) erhaltenen Produktes werden auf einer Nutsche mit 200 ml η HCl gewaschen und danach in 300 ml 0,5 η HCI suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren mit 0,1 η NaNO₂-Lösung bei 0 — 4° versetzt, bis bei der Diazotierung mit KJ-Stärkepapier ein geringer Nitrit-Überschuß festzustellen ist. Nach 10 Min. wirrt ühpr eine Nutsche ahfiltriert und der Rückstand mit Eiswasser und anschließend mit 0,15 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,5 von 0-4° gewaschen.

e) Kovalente Bindung mit Protein

0,8 g Albumin werden in 350 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst, auf 4° abgekühlt und das unter 6.) d) hergestellte Produkt zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4° gerührt danach abfiltriert und der Feststoff mit 1 M NaCl und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (wäßrige 03%ige NaCl-Lösung mit einem Gehalt an 1/15MoI Na₂HPO₄-KH₂PO₄-Puffer von pH 7,2) gewaschen.

Filtrat und Waschlauge werden nach der Methode der radialen Immundiffusion auf Albumin untersucht Es werden 60 mg Albumin an 1 g des so hergestellten Trägers gebunden.

7.) Umsetzung von CP-Vinylenglykol/Vinylalkohol aus Beispiel 1.) b) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 62^ m² g-'

Nach analogen Umsetzungen wie unter 6.) a) bis e) beschrieben können 1 g aktivierten Träger 80 mg Albumin quantitativ gebunden werden.

8.) Umsetzung von Homopolymerisat-Vinylenglykol aus Beispiel 1.) c) mit einer spezifischen Oberfläche nach BET von 20,5 m² g-¹

■'> Nach analogen Umsetzungen wie unter 6.) a) bis e) beschrieben können an 1 g aktivierten Trüger 45 mg Albumin quantitativ gebunden werden.

9.)w-Aminohexylgruppen-substituiertes , _n VinylenglykoKVinylpyrrolidon-Copolymerisat

In 9 Gewichtsteilen Vinylencarbonat und 1 Gewichtsteil Vinylpyrrolidon werden 0,05 Gewichtsteilen Azobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst und analog Beispiel 1.) a) polymerisiert und aufgearbeitet.

ι") Nach dem Entmonomerisieren wird das Granulat zu einer 12gewichtsprozentigen Dimethylform-

amid-Lösung gelöst, und mit einem Druck von 15Atü wird diese Lösung in ein Methanol-Fallbad hineingedüst. Man erhält einen feinfaserigen Niederschlag

-'Ii Vinyiencarbonat/Vinyipyrroiidon-Copoiymerisat, der abgesaugt, mit Methanol nachgewaschen und in 200 Gewichtsteifen Methanol resuspendiert wird. Es werden 6 Gewichtsteile Hexamethylendiamin, gelöst in 50 Gewichtsteilen Methanol, zugegeben, die Suspension 2

2ϊ Tage bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt und mit Methanol ausgewaschen. Der gewaschene Filterrückstand wird jetzt in einer Lösung von 10 Gewichtsteilen Natriummethylat in 300 Gewichtsteilen 96°/oigem Methanol 4 Tage bei Raumtemperatur suspendiert, mit

in Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen und gefriergetrocknet

Ausbeute: 5,0 Gewichtsteile eines über Urethan-Bindungen mit ω-Aminohexyl-Gruppen substituierten Vinylglykol/Vinylpyrrolidon-Copolymerisats enthal-

r> tend 1,6mÄquivalentNH₂-Grippen/g Träger.

10.) Bindung von IgG an ω-Aminohexyl-Gruppensubstituiertes Copolymerisat aus Beispiel 9.) mit Hilfe von Bernsteinsäureanhydrid und _4n wasserlöslichen Carbodiimid

5 Gewichtsteile von nach Beispiel 9.) hergestelltem ω-Aminohexylsubstituierten Träger werden bei 10° und nH fi mi» ? S Opwirhtstpilpn Rprns»pin«änrpanhyrlriH Hip in 200 Gewichtsteilen Wasser suspendiert sind, 4

4i Stunden succinyliert. Der pH-Wert wird mit 2 η NaOH einreguliert. Nach der Waschung des Feststoffes mit Wasser wird das Produkt mit 1,25 Gewichtsteilen N-Cyclohexyi-N'-tN-methymorpholinoJ-äthylJ-carbodiimid-p-toluol-sulfonat bei pH 5 und 5° 30 Min. gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen.

0,5 Gewichtsteile IgG werden in 150 Gewichtsteilen Phosphat-Puffer pH 7,5 gelöst und mit dem aktivierten Träger 24 Stunden bei 4° gerührt Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen. An 1 g des Trägers werden 75 mg IgG kovalent gebunden.

11.) Copolymerisat-Vinylenglykol Diäthylenglykoldivinyläther

In 9 Gewichtsteilen Vinylencarbonat und 1 Gewichtsteil Diäthylenglykoldivinyläther wird 0,1 Gewichtsteil Azobisisobutyrolnitril unter Stickstoff gelöst und wie unter 1.) a) beschrieben in flachen Aluminiumtuben unter N₂ 3 Tage auf 50° erwärmt und polymerisiert Nach Aufarbeitung und Verseifung wie unter 1.) a) beschrieben werden 3,5 Gewichtsteilen CP-Vinylenglykol/DiäthylenglykoIdivinyläther erhalten.

ί5

1 2.) Copolymerisat-Vinylenglykol/N-AcryloylaminoacetaldehyddimethylacetaJ

a) In 9 Gewichtsteilen Vinylencarbonat und 1 Gewichtsteil N-Acyloylaminoacetaldehyddimethylacetal werden 0,05 Gewichtsteile Azolisisobutyronjtril unter Stickstoff gelöst Das Monomerengemisch wird wie unter 1.) a) beschrieben polymerisiert, aufgearbeitet und verseift zu 4,1 Gewichtsteilen N-Acryloylaminoacetaldehyddimethylacetal/Vinylenglykol-CopoIymer.
10 Gewichtsteilen N-Acryloylaminoacetaldehyddi-

methylacetal/VinylenglykoI-Copolymere wurden in 100 Gewichtsteilen IN HCl 4-5 Stunden geröhrt Der aktivierte Träger wurde mit Wasser und Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen,
b) 0,5 g Albumin wurden in 200 ml PBS gelöst und mit dem unter a) hergestellten Produkt 14 Stunden bei 4° gerührt Nach Filtration wurde das trägergebundene Protein mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.

1 g des so hergestellten Trägers bindet 40 mg Albumin.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verbindung aus einem Copolymeren des Vinylenglykols und einer daran chemisch gebundenen biologisch aktiven Substanz, worin nur ein Teil der aktiven Gruppen der Vinylenglykol-Einheiten des Polymeren an die biologisch aktive Substanz gebunden ist und der Rest als freie Hydroxylgruppen vorliegt

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymere mindestens 55% Monomereneinheiten des Vinylenglycols enthält und höchstens 45% Monomereneinheiten mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formeln:

R,

10

15

H₂C = C

20

COORj

H₂C =

Ο —CO —CHj R₁

Cl R.

JO

J5

H₂C = C

HjC =

H₁C = C

(OCH,-CHj)₁₁-O-CH = CH₃

N (CW₁),.

i !

(K CH,

H₂C = C

(CHj),- CH CH₂

Ri

H₂C = C

O —CH CH₂

H₂C = C

CH-CH₂

I I ο ο

in denen Ri Wasserstoff, Methyl, Äthyl, R₃ Methyl, Äthyl, Propyl und η eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten.

3. Verbindung gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein Enzym, Aktivator, Inhibitor, Antigen oder Antikörper, ein Plasmaprotein, eine Blutgruppensubstanz, ein Phythämagglutinin, ein Antibiotikum, Vitamin oder Hormon, ein Peptid oder eine Aminosäure, ein natürlicher oder synthetisch hergestellter Effektor ist

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man

(A) ein Copolymeres des Vinylcarbonats mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt und danach die noch vorhandenen Cyclocarbonatgruppen in Hydroxygruppen OberfOhrt oder

(B) die Cyclocarbonatgruppen eines Copolymeren des Vinylencarbonats in Hydroxygruppen überführt und

(a) im Copolymensat vorhandene oder in dieses eingeführte elektrophile Gruppen mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt oder

(b) diese Hydroxygruppen

(1) entweder zuerst mit einer elektrophile Gruppen enthaltenden Verbindung und sodann mit einer biologisch aktiven Substanz

(2) oder unmittelbar mit einer elektrophilen Gruppen (ragenden biologisch aktiven Substanz umsetzt.

5. Verwendung einer Verbindung gemäü Anspruch 1 zur Affinitätschromatographie, zur Durchführung von Immunreaktionen oder zur Durchführung von Enzymreaktionen.