DE2102514A1 - Verfahren zur chemischen Kupplung biologisch aktiver Stoffe an oxiran haltige Polymere - Google Patents

Verfahren zur chemischen Kupplung biologisch aktiver Stoffe an oxiran haltige Polymere

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DE2102514A1 DE19712102514 DE2102514A DE2102514A1 DE 2102514 A1 DE2102514 A1 DE 2102514A1 DE 19712102514 DE19712102514 DE 19712102514 DE 2102514 A DE2102514 A DE 2102514A DE 2102514 A1 DE2102514 A1 DE 2102514A1
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Description

patentanwXltb
Dipl.-lng. EIDENEIER Dlpl.-Chem.Dr.RUFF Dipl.-lng. J. BEIER
T.B.F.
Uppsala, Schweden
A 15 556
Verfahren zur chemischen Kupplung biologisch aktiver Stoffe an oxiranhqitige Polymere
Proteine, Nucleine und deren Hydrolyseprodukte, Aminosäuren, Peptide und Nucleotide sowohl als eine Anzahl anderer in lebenden Zellen, Gewebeflüssigkeiten oder Pflanzensaften vorkommender Stoffe können als amphotere Elektrolyten klassifiziert werden, sie enthalten also sowohl basische als saure, funktioneile Gruppen. Zu diesen biologisch wirksamen Stoffen gehören Enzyme, Hormone und andere biologische Regulatoren und Metaboliten.
In lebenden Zellen katalysieren Enzyme die Depolymerisierung biologischer Makromoleküls, die Ester- und Amidhydrolyse, biochemische Oxydationen und Reduktionen, die Anlagerung und Abspaltung von Wasser usw. Diese Reaktionen können in gewissen Fällen nur schwer, oder oftmals überhaupt nicht, mit den üblichen organisch- -chemischen Methoden ausgeführt werden, und deshalb ist es von ausserordentlicher Bedeutung, dass die Eigenschaften der Enzyme auch technisch in rationeller Weise ausgenutzt werden können.
Enzyme sind sehr wertvoll und unstabil, und deshalb ist es besonders wichtig, dass man das Enzym an ein unlösliches Trägerpolymer binden kann und swar auf eine Art, die eine leichte Wiedergewinnung desselben ermöglichte Dadurch dürfte sogar möglich werden, ein derart unlöslich gemachtes, granuliertes Enzympolymer in Reaktorbetten zu verwenden. Xn diesen Betten kann danach ein Substrat ohne Nebenreaktionan in ein gewisses Produkt konvertiert werden, allein indem man eine Snostratlösiing durch das Bett passieren lässt.
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Enzyme und andere Proteine, die an eine chemisch resistente, in Wasser jedoch quellende Polymersubstanz fixiert sind, können ebenfalls angewendet werden um Stoffe, die zusammen mit dem fixierten Protein reversible Komplexe bilden, spezifisch zu adsorbieren. Dieses Prinzip ist gegebenenfalls auch bei anderen Systemen verwendbar, z.B. bei Peptiden, Nucleinsäuren und anderen Stoffen, die fähig sind, reversible Komplexe zu bilden. Indem man das Molekülgewicht, den Querbindungsgrad usw. des Polymeren variiert, kann man für verschiedene Zwecke unterschiedliche Härtegrade, Quellungseigenschaften u.dgl.m. erhalten, und folglich verschiedene Abstände zwischen den aktiven Gruppen. Man kann allerdings auch zum äussersten Grenzfall greifen und die Enzyme oder andere biologisch wirksame Stoffe an lösliche Polymere fixieren und dadurch die Gelegenheit zu stufenweisen oder kontinuierlichen Reaktionen mit verschiedenen Zirkulationswegen erhalten. Die Polymerlösung kann beispielsweise kontinuierlich zwischen der Adsorbierungsstufe und der Eluierungsstufe in einem Dialyseapparat mit mehreren Zellen zirkulieren.
Es ist wichtig, dass der biologisch interessante Stoff, ein Enzym oder dergleichen, unter möglichst milden Bedingungen an den Polymer verankert wird, und zwar so, dass die ursprünglichen Aktivitätseigenschaften maximal beibehalten oder möglicherweise sogar verbessert werden. Weil die in diesem Zusammenhang aktuellen Stoffe eine so verschiedene Stabilität und Reaktivität besitzen, ist es notwendig, Zugang zu und Wahlmöglichkeit zwischen verschiedenen Fixierungsmethoden zu haben. So kann man dann für jeden speziellen aktiven Stoff die günstigste Fixierungsmethode wählen.
Die Erfindung bezieht sich auf eine Methode, biologisch wirksame Stoffe chemisch an ein oxiranhaltiges Polymer zu fixieren, insbesondere solche, die Amino-, Imino-, Amido-, Imido- und Carboxylgruppen enthalten. Die chemische Kupplungsreaktion wird in einem derartigen Milieu ausgeführt, wo der biologisch wirksame Stoff seine charakteristischen Eigenschaften nicht verliert, z.B. die Enzymaktivität, die Fähigkeit, andere Substanzen spezifisch zu
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3 21025H
binden oder zu hemmen. Die Reaktion wird geeignetermassen in einer gepufferten Wasserlösung durchgeführt. Unter biologisch wirksamen Stoffen versteht man hier Aminosäuren, Hormonen, physiologische Transportsubstanzen für Enzyme und Hormone, Antigene, Antikörper und andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen, Antibiotici und biologisch aktive Derivate aller dieser Stoffe.
Das oxiranhaltige Polymer kann dargestellt werden, indem man ein hydroxylhaltiges Polymer mit nicht ionenbildenden Epoxiden (Oxiranen), die mindestens zwei stark reaktive Gruppen enthalten, beispielsweise Epihalohydrin oder Bisepoxid, behandelt, und zwar so, dass das Epoxid auf das Polymer unter Bedingungen reagiert, die im grossen Ausmasse zu einer "einseitigen" Substitution führt. Hierbei werden reaktive Gruppen auf den Polymer eingeführt und danach kann das chemisch reaktive Produkt in ein Milieu überführt werden, das sich für eine weitere Reaktion mit biologisch aktiven Stoffen eignet. Der Reaktionsverlauf für ein Kohlehydrat wie Agarose, Cellulose usw. mit Epichlorhydrin und einer Aminoverbindung in alkalischem Milieu wird durch die folgende Formel veranschaulicht :
ROH + Cl-CH0-CH-CH0 * R-O-CH0-CH-CH0 + HCl
2 V2 2 V2
wo R Kohlehydrat, Cellulose, Agarose, Dextran usw. repräsentiert.
Das oxiranhaltige Polymer kann ebenfalls durch eine Reaktion zwischen einem amidhaltigen Polymer, z.B. Polyacrylamid oder quergebundenem Polyacrylamid oder eines Derivats derselben und einem bifunktionellen Epoxid, z.B. einem Bisepoxid, dargestellt werden.
Ist das aktivierte Polymer ein unlösliches, granuliertes Gel, wird das Gel vorzugsweise auf Filter gewaschen. Gleicherweise befreit man ein lösliches Polymer vom Ueberschuss an Epichlorhydrin durch Dialyse.
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k 21025H
Der biologisch aktive Stoff wird chemisch fixiert indem man in einem geeigneten Puffermilieu die folgende Reaktion durchgeführt;
R-O-CH0-CH-CH0 + H0NB * R-O-CH0-CH-CH0-NH-B
θ' OH
wo B den biologisch aktiven Stoff, ein Protein oder ähnliches, repräsentiert.
Bei der Kupplung an eine Carboxylgruppe sieht der Reaktionsverlauf beim Fixieren so aus σ
R-O-CH0-CH-CH0 + B-COOH ) R-O-CH0-CH-CH0-OCO B
2 \ / 2 2 1 2
0 OH
und mit einem Diepoxid mit langer Kette und Aminkupplung erhält man als Endprodukt:
R-O-CH2-CH- CH-CH2-NH B
OH OH
Für ein Polyamid ist der Re aktionsv erlauf beim Kuppeln an ein lösliches Amin wie folgt ι
R-CONH2^-X-CH2-CH-CH2 > R-CO-NH-CH2-CH-CH2
R-CO-NH-CH2-CH-CH2 + H2NB > R-CO-NH-CHg-CH-CHg-NH B
\/ OH
wo X z.B. ein Halogen oder eine Oxirangruppe und R das Polymer ist.
Hier ist der biologisch interessante Stoff, B, an das Polymer R mit einem langen, hydrophilen, flexibeln Gelänk fixiert, das den biologisch wichtigen Stoff nicht daran hindert, seine normalen Reaktionen gegenüber anderen biologisch wichtigen Substanzen auszuüben, wie Enzymbindungen, falls B ein Inhibitor ist und das Enzym zusammen mit B einen Molekülkomplex in freier Lösung bildet. Falls B ein Enzym ist, ist es umso wahrscheinlicher, dass es auch
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5 21025H
im fixierten Zustand seine starke Katalysatorwirkung behält, -wenn das vereinigende Segment lang ist und hydrophilen Character hat.
Das oxiranhaltige Polymer kann auch vom Polymer dargestellt werden, das Hydroxylgruppen in 1, 2-Stellung enthält, z.B. über Tosylester und der darauf folgenden Behandlung mit Natriumäthylat.
?H ? Q,~- Tosylchlorid^C 1 H ß^~-
c—c ^ c c
H OH OH
NaOCH3 -^c f f
■wonach die Kupplung durchgeführt wird:
C-C
^O H OH
COR
+ HOOC-R > —-τ <
it
H OH
Man kann auch einen ungesättigten Alkyläther oxydieren, z.B.
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6 21025U
HH HH
—7 C - C - C C-- organisches Peroxid -^^-C -C-C-
0 OH oder Persäure ^ * ^
t ] 2
CH2 > ■ CH-.
CH CH^
Il
CH2
wonach die Kupplung wie oben durchgeführt wird.
Um die Erfindung weitgehend zu verdeutlichen und leichter verständlich zu machen, folgen eine Anzahl von Beispielen sowie Fällen praktischer Anwendung.
Beispiel 1 Aktivierung von Sepharose 6B mit Epichlorhydrin
Sepharose 6B wurde auf Glasfilter in destilliertem Wasser gewaschen. Das abgesaugte Gel wurde danach in einen Rundkolben überführt unter Zusetzung von 1-N NaOH sowie Epichlorhydrin. Nach der 'Aktivierungsreaktion, die beim kräftigen Rühren während 1 Stunde bei 60°C erfolgte, wurde der Epichlorhydrinüberschuss in destilliertem Wasser zu neutralen pH verwaschen. Das aktivierte Gel konnte in diesem Milieu bei 5°C gelagert werden.
Beispiel 2 Kupplung des Soyabotoen-Trypsin-Inhibitors (STI) an erfindungs-
gemäss aktivierte Sepharose 6B
Aktivierte Sepharose 6B, mit Bicarbonat pH 9,5 gepuffert, wurde mit einem Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI), der im gleichen Puffer gelöst worden war, umgesetzt. Die Kupplung wurde bei Zimmertemperatur unter langsamen Rühren und einer Reaktionszeit von 20 Stunden vollzogen. Das erhaltene Produkt wurde gründlich gewaschen und zwar im Kupplungspuff er, im Azetat puff er pH 3,0 mit einem Halt von 1-M NaCl und schliesslich im TRIS-Puffer pH 7,8.
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■\ — w
η 21025Η
Beispiel 3 Kupplung von Trypsin an erfindungsgemäss aktivierte Sepharose 6B
Im Bicarbonatpuffer pH 9,0 gelöstes Trypsin -wurde mit aktivierter Sepharose 6B umgesetzt. Kupplung und Waschen des erhaltenen Produkts erfolgte auf gleichermassen wie in Beispiel 2.
Beispiel ^ Reinigung von Trypsin
Eine Lösung aus partiell gereinigtem Trypsin wurde durch ein aus Inhibitor-AgarosQ (STI gekuppelt an Sepharose 6B) "bestehendes Kolonnenbett gepumpt. Danach wurde die Kolonne in einem schwach alkalischen Puffer gewaschen, bis kein UV-adsorbierendes Material " im "Eluat mehr vorgefunden wurde. Durch Eluierung der Kolonne mit einem Puffer mit saurem pH erhielt man einen UV Gipfel ( esorptionsgipfel), der mit Hinsicht auf die Trypsinaktivität untersucht wurde. Diese bestimmte man, mit Benzoylarginin-p-Nitroanilid (BAPA) als Substrat, durch Messen der Ext inkt ions ν er änderung bei ko5 mm.
Die spezifische Trypsinaktivität des Desorptionsgipfels war 177 % des Ausgangsmaterials.
Die Kapazität der Inhibitor-Agarose in Bezug auf die Fähigkeit das Trypsin zu binden, wurde auf ca 1 mg Trypsin pro ml Inhibitorgel berechnet.
Aus dem Versuch geht hervor, dass STI erfindungsgemäss mit Epoxiden an Sepharose gekuppelt, nach der Kupplung die Aktivität behält, d.h. das Inhibitorgel ist fähig mit aktivem Trypsin Komplexe zu bilden, wonach der Komplex gespalten werden kann und das dabei erhaltene freie Enzym seine volle Aktivität behält.
Beispiel 5 Reinigung des Soyabohnentrypsin-Inhibitors
Eine Lösung aus partiell gereinigtem Trypsin-Inhibitor Hess man ein Kolonnenbett passieren, das aus an Sepharose 6B gekuppeltem
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Trypsin bestand. Nach Waschen des Gels wurde der gebundene Inhibitor in einem Puffer mit saurem pH eluiert. Der erhaltene Desorptionsgipfel wurde auf die Trypsin-Inhibitoraktivität hin untersucht .
Diese bestimmte man, indem man die Testlösung und das Trypsin inkubierte, und danach die resultierende Trypsinaktivität nach Beispiel h bestimmte.
Dabei wies der erhaltene Desorptionsgipfel eine hohe Trypsin-Inhibitoraktivität auf. Die Kapazität des Trypsingels berechnete man auf 1 mg STI pro 3 ml Trypsingel.
Das erfindungsgemäss gebundene Trypsin behielt ebenfalls seine Aktivität bezüglich der Fähigkeit mit dem aktiven Soyabohnentrypsin-Inhibitor Komplexe zu bilden. Der nach Spaltung des Enzyminhibitor-Komplexes erhaltene Trypsin-Inhibitor besass eine hohe Aktivität.
Beispiel 6
I. Aktivierung von Cellulose. II. Kupplung des Inhibitors an aktivierte Cellulose. III. Adsorption von Trypsin an Inhibitorcellulose
I. Tosylester aus Cellulose wurde mit Na-Methylat (1 % Na in Methanol) bei ca -2O0C (Eis-Kochsalzgemisch) während einer Stunde und dreissig Minuten behandelt. Man wusch das Produkt in Methanol, Wasser und Bicarbonat-Puffer, pH 8,8.
II. Ein Soyabohnentrypsin-Inhibitor wurde mit Cellulose während
2h Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt. Den InhibitorUberschuss wusch man in einem Bicarbonat-Puffer pH 8,8, Azetat-Puffer pH 3,0 und schliesslich in einem Bicarbonat-Puffer pH 7,8 aus.
III. Ein Trypsinpräparat wurde der Inhibitor-Cellulose bei pH 7,8 zugesetzt. Nach dem Waschen wurde das Enzym von Adsorptionsmittel desorbiert in einem Puffer mit saurem Milieu. Das erhaltene Enzym wies hohe spezifische Aktivität auf.
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9 21025U.
Beispiel 7
I. Aktivierung von Agarose (Sepharose mit Epibromhydrin).
II. Kupplung des Trypsininhibitors an ., die aktiyi_erte Agarose.
III. Adsorption des Trypsins in Inhibitor-Ag.arose.
I. Agarose wurde in 1 N NaOH aufgeschlämmt und Epibromhydrin bei 60°C unter Rühren zugesetzt. Die Reaktionszeit: 1 Stunde. Das erhaltene Produkt wurde in Wasser und Kupplungspuffer gewaschen.
II. Soyabohnentrypsin-Inhibitor wurde mit der aktivierten Agarose 2h Stunden bei Zimmertemperatur und pH 9,5 umgesetzt. Der ungekuppelte Inhibitor wurde in Bicarbonat-Puffer pH 9,5, Azetat-Puffer pH 3,0 und Tris-Puffer pH 7,8 ausgewaschen.
III. Partiell gereinigtes Trypsin (kommerzielles Trypsin) wurde der Inhibitor-Agarose bei pH 7,8 zugestezt. Nicht adsorbiertes Protein wurde ausgewaschen und das adsorbierte Enzym mit saurem pH desorbiert. Das desorbierte Enzym enthielt eine spez. Trypsinaktivltät die ungefähr der eines doppelten Ausgangsmaterials entsprach.
1 ml Inhibitor-Agarose adsorbierte 1 mg Trypsin, das mit beibehaltener Aktivität wiedergewonnen werden konnte.
Beispiel 8
I. Aktivierung von quergebundenem Polyakrylamid mit Bisepoxid.
II. Kupplung des Trypsin-Inhibitors zum aktivierten Gel. |
III. Adsorption von Trypsin in Inhibitor-Gel.
I. Quergebundenes Polyakrylamid, das mit einem Bicarbonat-Puffer pH 9,5 ausgeglichen worden war, liess man bei Zimmertemperatur während 20 Stunden und Rühren mit Bisepoxid reagieren. Das Produkt wurde in Wasser und Kupplungspuffer pH 9,5 gewaschen.
II. Der Soyabohnentrypsin-Inhibitor wurde mit dem aktivierten Gel pH 9,5 während 2k Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt. Der un- gekuppelte Inhibitor wurde in Bicarbonatpuffer pH 9,5, Azetatpuffer pH 3,0 und Tris-Puffer pH 7,8 ausgewaschen.
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III. Trypsin wurde dem Inhibitor-Gel bei pH 7?8 zugesetzt. Nicht adsorbiertes Enzym wurde ausgewaschen und adsorbiertes Enzym mit saurem pH desorbiert. Das erhaltene Enzym war völlig aktiv,
10 ml Inhibitor-Gel adsorbierte ^00 mg Enzym, das mit völlig beibehaltener Aktivität wiedergewonnen werden konnte.
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Claims (1)

  1. ii 21025U
    Uppsala, Schweden
    P at ent anspräche
    Verfahren zur chemischen Kupplung an Polymere von amphoteren Elektrolyten und biologisch wirksamen Stoffen wie Aminosäuren, Nucleotiden, Enzymen, Enzyminhibitoren und Enzymaktivatoren lind anderen, mit Enzymen spezifisch komplexbildenden Stoffen, Hormonen, physiologischen Transportsubstanzen für Hormonen, Antikörpern und Λ anderen Plasmaproteinen, Blutgruppensubstanzen, Phytemagglutininen, Antibiotic! und biologisch -wirksamen Derivaten dieser Stoffe, die mindestens eine der Amino- und Imino-Gruppen enthalten; einschliesslich beispielsweise Amido-, Imido-, Amidino-, Guanidino-, Hydroxylamino- und Hydrazino-Gruppen5 Hydroxyl oder Carboxyl sowie biologisch wirksame Derivate derselben, dadurch gekennzeichnet, dass man in ein hydrophiles Polymer zunächst Oxirangruppen (Epoxigruppen) einführt, wonach die Kupplung in einem Milieu vollzogen wird, wo der biologisch wirksame Stoff völlig oder teilweise seine Aktivität behält.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chnet, dass ein Polymer, das eine oder mehrere der folgenden Gruppen ent- " hält: Hydroxyl, Carboxyl, Amino, Iminoj einschliesslich beispielsweise Amido, Imido, Guanidino, Hydroxylamino und Hydrazino-gruppen5 mit Epihalohydrin oder einem Bisepoxid, Tris- oder höherem PoIyepoxid in Kontakt und so zum reagieren gebracht wird, dass Oxirangruppen in das Polymer eingeführt werden, wonach das nicht reagierte, niedermolekulare Epoxid vom oxiranhältigen Polymer entfernt und die Kupplung hergestellt wird, indem man das Polymer in Kontakt mit dem biologisch virksamen Stoff bringt.
    3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Epihalohydrin ein Epichlorhydrin ist.
    109831/7750
    12 21025U-
    k. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Epihalohydrin ein Epibromhydrin ist.
    5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bisepoxid folgendermassen zusammengesetzt ist;
    CH2 CH-X -CH CH2, wo X [-0-(CH2Vl p"° °der Θ±ηβ
    Kohlenwasserstoffkette ist, beispielsweise (CHp) , wobei η vorzugsweise Werte zwischen 0 und 5 annimmt, m zwischen 2 und k und ρ zwischen 1 und 3·
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf ein Polymer, das naheliegende Hydroxylgruppen enthält, Oxirangruppen über Tosylester und der darauffolgenden Behandlung mit Alkalialkoholat, eingeführt werden.
    7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chnet, dass die Oxirangruppen durch Oxydation bei Doppelbindungen eingeführt werden.
    8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer unlöslich ist.
    9. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff eine Aminosäure oder ein Derivat derselben ist.
    10. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff ein Mononucleotid, Oligonucleotid, Nucleinsäure oder ein Derivat derselben ist.
    11. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff ein Enzym oder ein Enzymderivat ist.
    109831/7250
    21025U
    12. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch -wirksame Stoff eine mit Enzym spezifisch komplexbildende Substanz oder ein Derivat derselben ist, so dass man ein spezifisches Adsorptionsmittel für Enzym erhält.
    13. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff ein Hormon oder ein Hormonderivat ist, wobei man ein spezifisches Adsorptionsmittel für HormontransportSubstanzen und andere mit Hormonen spezifisch komplexbildende Stoffe erhält.
    Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff eine mit Hormonen spezifisch komplexbildende Substanz ist, wobei man ein spezifisches " Adsorptionsmittel für Hormone erhält.
    15. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff ein Antikörper ist, wobei man ein spezifisches Adsorptionsmittel für das entsprechende Antigen erhält.
    16. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff ein Antigen ist, wobei man ein spezifisches Adsorptionsmittel für den entsprechenden Antikörper erhält.
    17. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein Polysaccharid oder ein PoIysaccharidderivat ist.
    18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid ein Agaro, besonders Agarose und deren Derivate ist.
    19· Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid Cellulose oder ein Derivat derselben ist.
    109831/2250
    lk 21025U
    20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid Dextran oder ein Dextranderivat, z.B. quergebundenes Dextran ist.
    21. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein quergebundener polyhydrischer Alkohol oder ein Derivat desselben ist, -wobei der polyhydrische Alkohol z.B. Sorbitol oder Polyvinylalkohol ist.
    22. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer ein quergebundenes hydrolysiertes Copolymerisat eines Polyvinylazetats oder einer anderen ungesättigten Verbindung, z.B. Styren, ist.
    23. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer eventuell eine quergebundene Polyakrylsäure oder ein Polyakrylsäurederivat ist, das Molekülsegmente folgender Zusammensetzung enthält;
    R1 Π
    -C-C-R2 COX
    wo R-,, R„ und R-. H oder ein Alkyl oder Arylgruppe ist, und X eine Hydrophilgruppe, z.B. 0 R1^ NHR^, 0-R^-OH, 0-R1+NH2, NHR^OH, NHR^NH2, wo R]+ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist, und eventuell OH, NH2 und/oder Ätherbrücken enthält
    2k. -Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyakrylsäurederivat ein unlösliches, quergebundenes Polyakrylamid ist.
    25. Verfahren nach Anspruch 23 und 21+, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyakrylsäurederivat ein unlöslicher, quergebundener, hydroxylhaltiger Polyacrylsäureester ist.
    109831/^250
    15 21025U
    26. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplung in einem Milieu vollzogen wird, vjo der Wasserhalt auf mindestens 70 % ansteigt.
    101831/7250 ORlGfNAL INSPECTED
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