DE2457845C3 - Immunologisches Absorptionsmittel und Verfahre n zu dessen Herstellung - Google Patents
Immunologisches Absorptionsmittel und Verfahre n zu dessen HerstellungInfo
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Description
Antigene können aus wäßrigen Flüssigkeiten wie ^0
Körperflüssigkeiten mit Hilfe eines einfachen leicht herstellbar und handhabbaren sowie lagerfähigen
immunologischen Absorptionsmittel entfernt werden. Das immunologische Absorptionsmittel wird hergestellt,
indem man das immunologische Gegenstück zu 4j
dem Antigen in einer im wesentlichen nicht hydrophilen polymeren Matrix einschließt, die in der zu behandelnden
wäßrigen Flüssigkeit unlöslich und im wesentlichen nicht quellfähig ist. Eine immunologisch aktive Stelle in
dem eingeschlossenen Gegenstück ist für immunologisehe Reaktionen mit Antigenen in wäßrigen Flüssigkeiten
frei verfügbar. Die polymere Matrix besteht vorzugsweise aus einem Polymer oder Gemisch von
Polymeren aus der Gruppe linearer und vernetzter polymerer Substanzen, die im wesentlichen in wäßrigen
Flüssigkeiten nicht quellen. Dieses neue immunologische Absorptionsmittel ist eine feste Nichtgel-Phase
bezüglich der wäßrigen Flüssigkeiten und ist sehr geeignet für immunologische Bestimmungsverfahren,
indem es die Entfernung des zu bestimmenden Antigens ^0
aus der Probe erleichtert.
Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Behandlung von wäßrigen Flüssigkeiten, um daraus ein
Antigen zu entfernen. Sie betrifft besonders immunologische Absorptionsmittel und ihre Anwendung für
immunologische Bestimmungen in biologischen Flüssigkeiten.
Der Ausdruck »immunologisches Absorptionsmittel«
bezeichnet allgemein Gegenstänae bzw. Formkörper, die ein unlösliches immunologisch reaktionsfähiges
Substrat darstellen, das mit Antigenen in Flüssigkeiten
reagieren kann und immunologisch an diese gebunden wird. Indem es immunologisch an das unlösliche
Substrat gebunden wird, wird das Antigen unbeweglich gemacht bzw. immobilisiert und kann dadurch von der
Flüssigkeit durch geeignete Handhabung des Substrats entfernt werden.
Immunologische Absorptionsmittel finden in sehr vielen Bereichen Anwendung, besonders zur Reinigung
und Isolierung von Antigenen und für immunologische Untersuchungen in biologischen Flüssigkeiten. Gerade
in letzter Zeit hat es sich gezeigt, daß immunologische
Absorptionsmittel besonders geeignet sind für immunologische Bestimmungen von Isoenzymen und bei
radioimmunologischen Untersuchungsverfahren. Die zu untersuchende Flüssigkeit wird mit einem immunologischen
Absorptionsmittel, in dem ein immunologisches Gegenstück zu dem zu bestimmenden Enzym enthalten
ist, in Berührung gebracht und die Radioaktivität oder Enzymaktivität, die mit der zu bestimmenden Substan2
verbunden ist, wird berechnet entweder auf Grund der Aktivitätsänderung in der Flüssigkeit oder der Aktivität,
die das immunologische Absorptionsmittel durch Berührung mit der Flüssigkeit und anschließenden
Entfernung daraus gewonnen hat.
Die wesentlichen Unterschiede zwischen bekannter immunologischen Absorptionsmitteln sind die Zusammensetzung
und die Art der Matrix oder des, Substratmaterials und die Art in der das immunologische Gegenstück darin eingebaut ist. Während die
Wirksamkeit irgendeines speziellen immunologischen Absorptionsmittels in erster Linie von der spezifischen
Bindungsaffinität zwischen dem Antigen und seinem in der Matrix eingebauten immunologischen Gegenstück
abhängt, sind die besonders günstigen immunologischen Absorptionsmittel solche, die leichter gehandhabi
werden können und die das immunologische Gegenstück sicherer immobilisieren, während sie die immunologische
Reaktivität dieses Gegenstücks in Beziehung auf das in der zu behandelnden Flüssigkeit vorhandene
Antigen möglichst wenig beeinflussen.
Es gibt drei grundlegende Verfahren, das immunologische Gegenstück in eine unlösliche Matrix einzubauen,
nämlich durch chemische Bindung des Gegenstücks an das Matrixmaterial, entweder direkt oder über ein
Kupplungsmittel, durch Adsorption des Gegenstücks auf dem Matrixmaterial und durch Einschluß des
Gegenstücks in dem Matrixmaterial. Während eine chemische Bindung zwischen dem Gegenstück und dem
Matrixmaterial das Gegenstück sicher immobilisiert, is« es sehr schwer, die Lage der chemischen Bindung zu
steuern, und daher ist die aktive Stelle oder sind die aktiven Stellen in dem immobilisierten Gegenstück
häufig sterisch gehindert durch eine Kupplung, die an oder nahe an der aktiven Stelle stattfindet. Außerdem
wird das entstehende immobilisierte Gegenstück durch die Reaktionsbedingungen, die erforderlich sind, um die
Bildung vor. chemischen Bindungen zwischen dem Gegenstück und dem Matrixmaterial herbeizuführen,
häufig verändert oder auf andere Weise nachteilig beeinflußt. Gegenstücke, die an die Matrixmaterialien
adsorbiert sind, unterliegen leicht der Desorption. Solche Verfahren sind daher im allgemeinen nicht
geeignet als Miitel zur Herstellung von immunologischen Absorptionsmitteln.
In letzter Zeit wurden einige Versuche unternommen,
b7 845
geeignete immunologische Absorptionsmittel herzustellen,
indem man das immunologische Gegenstück in das Matrixmaterial einfügt (Immuno-chemistry 8 · 39-48
[1971] und Science 142 :678-9 [1963]). Bei allen diesen
Versuchen, ein Gegenstück in einem Matrixmaterial einzuschließen, wurden stark vernetzte polymere
Substanzen im allgemeinen ein hochvernetztes Polyacrylamid angewandt
Die entstehenden vernetzten Polymere waren alle stark quellbar in wäßrigen Flüssigkeiten und damit in
dem halbfesten Zustand eines Gels. Es ist offensichtlich angenommen worden, daß. um wirksame immunologische
Absorptionsmittel durch den Einschluß des immunologischen Gegenstücks herzustellen, nur stark
vernetzte hydrophile polymere Gels angewandt werden könnten zur Herstellung der das Gegenstück einschließenden
Matrix. Offensichtlich wurde angenommen, daß eine vernetzte Struktur eine erforderliche dreidimensionale
käfigartige Struktur ergibt zum Einschluß des Gegenstücxs und daß eine hydrophile Gelstruktur für
das eingeschlossene Gegenstück eine nicht feindliche wäßrige Umgebung darstellt sowohl während des
Verfahrens des Einschließens als auch bei der entstehenden Matrix. Die Quellbarkeit und die makromolekulare
Porengröße dieser hydrophilen Gele führten jedoch zu einem Auslaugen des immunologischen
Gegenstücks aus der umschließenden Matrix. Um diese immunologischen Absorptionsmittel-Gele von den
Testflüssigkeiten abzutrennen, waren auch ausgiebige Filtrations- und Zentrifugationsschritte erforderlich,
und in vielen Fällen war die prozentuale Rückgewinnung nicht befriedigend.
Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß immunologische Gegenstücke mechanisch in polymere
Matrices eingeschlossen werden können, die in wäßrigen Flüssigkeiten im wesentlichen nicht quellbar sind,
wodurch man einfache, leicht handhabbare und lagerfähige immunologische Absorptionsmittel erhält.
Der erfindungsgemäße Gegenstand betrifft eine feste im wesentlichen nicht hydrophile Matrix, umfassend ein
polymeres Material, wobei die Matrix in der zu untersuchenden wäßrigen Flüssigkeit unlöslich und im
wesentlichen nicht quellbar ist und in der ein immunologisches Gegenstück zu dem Antigen im
wesentlichen mechanisch eingeschlossen ist. Eine immunologisch aktive Stelle in dem Gegenstück ist für
die immunologische Reaktion mit dem Antigen in der wäßrigen Flüssigkeit verfügbar.
Derartige Polymere, die in linearer Form in Wasser löslich sind und die daher, wenn sie vernetzt werden, bis
zu einem gewissen Grad in Wasser quellen, können in der Matrix enthalten sein, solange sie ausreichend
vernetzt sind, um eine wasserunlösliche polymere Matrix zu erhalten. Die bevorzugten polymeren
Materialien, aus denen die Matrix besteht, umfassen die linearen, verzweigten und vernetzten Formen solcher
polymeren Substanzen, die in ihrer linearen Form wasserunlöslich sind und die daher in ihrer verzweigten
und vernetzten Form in Wasser im wesentlichen nicht quellen.
Allgemein besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des immunologischen Absorptionsmittels
darin, daß man, vorzugsweise über eine Kondensationsreaktion,
eine feste Matrix bildet, umfassend eine polymere Substanz in Gegenwart eines immunologischen
Gegenstücks zu dem Antigen. Vorzugsweise wird die Matrix hergestellt durch Grenzschicht-Polymerisation,
umfassend mindestens ein Lösungsmittelsystem,
das das immunologische Gegenstück enthält, wobei das Lösungsmittelsystem im wesentlichen inert ist gegenüber
der immunologischen Aktivität des immunologischen Gegenstücks. Es ist ferner bevorzugt, daß die
Matrix durch Grenzschicht-Polymerisation zwischen einer wäßrigen Lösung, umfassend ein aliphatisches
Diamin und das immunologische Gegenstück, und einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, umfassend
ein aliphaiisches Dicarbonsäurehalogenid, durchgeführt wird.
Das immunologische Absorptionsmittel kann angewandt werden für Reinigungs- und Bestimmungsverfahren,
besonders bei immunologischen Verfahren, die die Entfernung eines Antigens aus einer Testflüssigkeit
umfassen. Ein solcher Schritt wird nach dem angegebenen Verfahren erreicht, indem man die Flüssigkeit mit
dem erfindungsgemäßen Absorptionsmittel in Berührung bringt und anschließend die Matrix aus der
Flüssigkeit entfernt Bei Bestimmungsverfahren, wo die Zeit ein wichtiger Parameter ist, werden diese Stufen
vorzugsweise in einem vorher bestimmten Zeitabstand durchgeführt.
Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, daß immunologische Gegenstücke in Matrices eingeschlossen werden
können und die entstehende Struktur als immunologisches Absorptionsmittel verwendet werden kann, wobei
die Matrix kein hydrophiles Gel isi. Polymere Substanzen können eingeteilt werden auf Grund der
Funktionalhätszahl des Monomers oder der Monomeren, aus denen das Polymer besteht.
Diese Zahl gibt die Anzahl von polymerbildenden reaktionsfähigen Gruppen in dem Monomer an.
Monomere mit einer Funktionalität von 2 bilden lineare Polymere, während solche mil einer Funktionalität von
3 oder mehr vernetzte Polymere bilden, die als verzweigte, verbrückte oder vernetzte Polymere bekannt
sind. Ein Gemisch von Polymeren mit Funktionalitäten von 2 bilden lineare Copolymere und Gemische
von Monomeren mit Funktionalitäten von 3 oder darüber und Gemische von Monomeren mit Funktionalitäten
von 2 mit Monomeren mit Funktionalitäten von 3 oder darüber bilden alle vernetzte Copolymere. Lineare
Polymere können durch chemische oder physikalische Maßnahmen verändert werden, so daß sie vernetzte
Polymere über die Bildung von Vernetzungen bilden. Wenn ein lineares Polymer, das wasserlöslich ist, in
einem ausreichenden Maße vernetzt wird, erhält man ein hydrophiles Gel, das ein vernetztes Polymer ist und
das in Wasser stark quellfähig ist. Ähnlich werden hydrophile Gele während der Polymerisations-Reaktion
gebildet, wenn das entstehende Polymer zunächst wasserlöslich war und die Vernetzung bis zum Gelpunkt
fortschreitet, d. h. dem Punkt, an dem das entstehende Polymer ausreichend vernetzt ist, daß es zur Gelbildung
der Netzstruktur führt Eine weitere Vernetzung in einem der beiden angegebenen Fälle kann zur Bildung
eines hochvernetzten wasserunlöslichen und im wesentlichen nicht quellfähigen Nichtgel-Polymers führen. Die
Vernetzung von linearen Polymeren, die in Wasser unlöslich sind, führt zu wasserunlöslichen vernetzten
Polymeren, unabhängig vom Grad der Vernetzung. In diesem Zusammenhang wird auf grundlegende Handbücher
der Polymer-Chemie verwiesen wie The Structure of Polymers von M. 1. Miller, Reinhold Publishing
Corp. (New York 1966), Principles of Polymer Chemistry von P. J. Flory, Cornell University Press
(Ithaca, New York 1953), und Fundamental Principles of
Polymerization von G. F. D A1 e I i ο, John Wiley &
Sons, lnc.(New York 1952).
Polymere Materialien, die wasserunlösliche im wesentlichen nicht quellbare Matrices bilden, können im
allgemeinen zum "Einschluß des immunologischen Gegenstücks angewandt werden. Solche Polymere, die
in wäßrigen Flüssigkeiten sowohl unlöslich als auch im wesentlichen nicht quellfphig sind und die dadurch leste
im wesentlichen nicht hydrophile polymere Matrices ergeben,umfassen !.wasserunlöslichelineare Polymere,
2. alle verzweigten oder vernetzUn Formen von
Polymeren, die in ihren linearen Formen wasserunlöslich sind, und 3. die vernetzten Formen von Polymeren,
die in ihrer linearen Form wasserlöslich sind, wobei die Polymeren ausreichend vernetzt sind, um im wesentlichen
in Wasser nicht quellbar zu sein. So können im '5 wesentlichen alle nicht hydrophilen polymeren Substanzen
in der erfindungsgemäßen Matrix enthalten sein. Während vernetzte Polymere, die im wesentlichen in
Wasser nicht quellbar sind, angewandt werden können, ist es besonders bevorzugt, im wesentlichen oder
vollständig lineare polymere Substanzen zur Bildung der polymeren Matrix zu verwenden. Im wesentlichen
lineare polymere Substanzen sind im allgemeinen definiert als solche, die wasserunlösliche Polymere
umfassen, die nicht ausreichend vernetzt sind, um in wäßrigen Lösungen zur Gelbildung zu führen, selbst
wenn zusätzliche organische Quellmittel vorhanden sein können. So kann gemäß der Definition von im
wesentlichen linearen polymeren Substanzen ein gewisses Maß an Vernetzung möglich sein, so wie es durch
Verunreinigungen oder Nebenreaktio/ien auftritt. Im
allgemeinen sind jedoch hohe Vernetzungen nur dann bevorzugt, wenn die lineare Form des Polymers in der
wäßrigen Lösung löslich ist, während eine ausreichend vernetzte Form in der wäßrigen Lösung sowohl
unlöslich als auch im wesentlichen nicht quellbar ist. Ein Beispiel für ein solches Polymer ist Polyvinylalkohol.
Beispiele für Polymere, die in wäßrigen Flüssigkeiten in ihrer linearen Form unlöslich sind, sind Polyäthylen,
Polypropylen, Polystyrol, Polyamide und die Polyurethane. Ein Quellmittel kann definiert werden als eine
Flüssigkeit, die zu einer Quellung oder Gelbildung der polymeren Netzstruktur führt, wenn diese Netzstruktur
in einem ausreichenden Maße vernetzt ist, d. h. bis zu einem Punkt an oder übet· dem Gelpunkt der
Netzstruktur. Ein Nichtquellmittel führt nicht zur Gelb'ldung unabhängig von dein Grad der Vernetzung
in der polymeren Netzstruktur. In den bekannten Druckschriften ist der Einschluß von immunologischen
Gegenstücken nur in hochvernetzten hydrophilen Gels angegeben. Es ist daher überraschend, daß es sich
gezeigt hat, daß im wesentlichen lineare polymere Materialien, die im wesentlichen nichthydrophile polymere
Matrices ergeben, zu besonders günstigen immunologischen Absorptionsmitteln führen.
Es hat sich gezeigt, daß die Reaktion zwischen dem Antigen und dem in der Matrix eingeschlossenen
Gegenstück ein Oberflächenphänomen ist. So muß das Antigen nicht in die Matrix eindringen, um immunologisch
mit dem Gegenstück zu reagieren. In jedem Falle muß eine immunologisch aktive Stelle in dem
eingeschlossenen Gegenstück für die immunologische Reaktion mit dem in der Flüssigkeit enthaltenen
Antigen zur Verfügung stehen.
Das immunologische Gegenstück ist im wesentlichen mechanisch oder physikalisch in der Matrix eingeschlossen.
Der Ausdruck »im wesentlichen« ist so zu verstehen, daß ein gewisser Anteil unüblicher chemischer
Bindungen zwischen dem Gegenstuck und dem Dolvmeren Matrixmaterial be. der Bildung der Matrix
entsteht Solche ungewöhnlichen Bindungen dienen nicht dazu, das Gegenstück sicherer zu immobilisieren,
sondern stören eher die Lineantat des Polymers, wenn es sich bildet, da die chemische Natur des Gegenstücks
im allgemeinen dazu führt, eine entstehende Polymerkette abzubrechen, wenn sie mit dem Gegenstück
reagiert Zum Beispiel sollte beim Einschluß eines nroteinartigen Gegenstücks in eine Polyamid-Matrix,
die durch Reaktion zwischen einem aliphatischen Diamin und einem aliphatischen Dicarbonsäurehalogenid
gebildet worden ist, die Aminogruppen in dem proteinartigen Gegenstück mit dem aliphatischen
Dicarbonsäureholgenid reagieren, wodurch die entstehende Polymerkette abgebrochen wird.
Von der chemischen Struktur aus gesehen, sind Antigene im allgemeinen entweder Peptide, Proteine,
Kohlenhydrate, Glycoproteine oder Steroide und können im allgemeinen als irgendeine Substanz
definiert werden, die spezifisch mit einem immunologischen Gegenstück reagiert, wodurch zwischen beiden
eine immunologische Bindung entsteht. Eine immunologische Bindung ist in erster Linie eine physikalische
Bindung, kann aber als physikochemische Bindung oder sogar als chemische Bindung bezeichnet werden.
Substanzen, von denen gesagt werden kann, daß sie antigene Eigenschaften besitzen, können auch bezeichnet
werden durch eine ihrer alternativen Funktionen, d h einige Antigene können Enzyme, Hormone,
Vitamine, Therapeutika oder sogar Antikörper sein. Im Zusammenhang der vorliegenden Beschreibung ist ein
immunologisches Gegenstück irgendeine Substanz, die mit dem zu bestimmenden Antigen immunologisch
reagieren kann und die auch mechanisch in eine Matrix der angegebenen Art eingeschlossen werden kann. So
kann das immunologische Gegenstück ein Antikörper, ein Antikörper-Polymer, ein Konjugat von Antikörpern
usw. sein. Antikörper sind biologisch entstehende Substanzen, die im Serum auftreten und die Fähigkeit
besitzen, mit einem Antigen eine Bindung einzugehen. Ein Antikörper-Polymer ist eine Substanz, die chemisch
aus Antikörpern besteht, die direkt aneinander gebunden sind, während ein Konjugat von Antikörpern eine
Substanz ist, die chemisch aus Antikörpern besteht, die über Zwischensubstanzen wie niedermolekulare Kupplungsmittel
oder hochmolekulare Trägersubstanzen miteinander verbunden sind. Beispiele für Kupplungsmittel
sind Cyanohalogenide, wie Cyanobromid, die organischen und anorganischen Cyanate, wie die
Alkalicyanate, die Bis-diazonium-Verbindungen, wie Bis-diazobenzidin und die Epihalogenhydrine wie
Epichlorhydrin. Beispiele für Trägersubstanzen sind Latex, Methacrylat und Bakterienzellen.
Wenn Antikörper isoliert werden müssen, um das erfindungsgemäße Absorptionsmittel herzustellen, kann
irgendein Verfahren zur Erzeugung von Antigen-spezifischen Antikörpern angewandt werden. Verfahren bei
denen die Bildung von spezifischen Antikörpern angeregt wird, können als bekannt wenn auch nicht
wissenschaftlich angesehen werden. Das ist der Fall auf Grund der Tatsache, daß der Mechanismus, über den die
Antikörper gebildet werden, weitgehend unbekannt ist. Die Technik mit Hilfe derer die Bildung spezifischer
Antikörper angeregt werden kann, umfaßt Variationen bezüglich solcher Faktoren wie Immunogenzusammensetzung,
Zusatz, Arten des Gasttiers und Schemas der Injektion von Immunogen und Abnahme des Serums.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezielles Verfahren oder auf verschiedene Verfahren zur
Isolierung von Antikörpern beschränkt.
Die erfindungsgemäß angewandte Matrix kann nach vielen verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Das
immunologische Gegenstück wird in der Matrix dadurch eingeschlossen, daß es während der Bildung der
Matrix vorhanden ist. Irgendein übliches Verfahren zur Herstellung polymerer Matrices kann angewandt
werden, solange der erhaltene Formkörper die erfindungsgemäßen neuen Eigenschaften besitzt. Während
Additions-Polymerisations-Reaktionen zur Bildung der Matrix angewandt werden können, sind Kondensations-Polymerisations-Reaktionen
bevorzugt und besonders Grenzschicht-Kondensations-Polymerisations-Reaktionen.
Die Anwendung von Grenzschicht-Kondensations-Polymerisations-Reaktionen,
bei denen mindestens ein Lösungsmittelsystem, das das immunologische Gegenstück enthält, gegenüber der immunologischen Aktivität
des Gegenstückes inert ist, sind besonders bevorzugt. Die Anwendung wäßriger Lösungsmittel ergibt eine
nichtfeindliche, die Stabilität erhöhende Umgebung für das Gegenstück während der Bildung des erfindungsgemäßen
Absorptionsmittels.
Besonders günstige immunologische Absorptionsmittel (Immunosorbentien) werden hergestellt durch
Grenzschicht-Polymerisation von Polyamiden. PoIyamid-Matrices
können hergestellt werden durch Grenzschicht-Polymerisation zwischen einer wäßrigen Lösung,
umfassend ein aliphatisches Diamin und das immunologische Gegenstück und einer Lösung in einem
organischen Lösungsmittel, umfassend ein aliphatisches Dicarbonsäurehalogenid. Bevorzugte aliphatische Diamine
enthalten 2 bis 10 Methylengruppen und bevorzugte aliphatische Dicarbonsäurehalogenide enthalten
nicht mehr als 8 Methylengruppen.
Es ist auch bevorzugt, ein Aufbau- oder Dickungsmittel
zu der wäßrigen Lösung zuzusetzen. Ein solches Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es im Stande ist,
die Viskosität der wäßrigen Lösung zu erhöhen und die nahe Lage des Gegenstücks zu verbessern. So ist das
Aufbau- oder Dickungsmittel in der wäßrigen Lösung innig verbunden mit dem Gegenstück und unterstützt
damit die Bildung einer einschließenden Matrix. Beispiele für geeignete Aufbaumittel sind die Albumine
(bzw. Proteine), besonders Serumalbumine und synthetische Polymere wie die mittel- und hochmolekularen
Polyvinylpyrrolidone.
Wenn die Grenzschicht zwischen der wäßrigen Lösung und der Lösung in dem organischen Lösungsmittel
nicht gestört ist, entsteht an der Grenzschicht eine Membran- oder Folienform der Matrix. Wenn man
die Grenzschicht stört, z. B. durch Rühren oder Zugabe
geeigneter Detergentien, entsteht das erfindungsgemäße Absorptionsmittel in Teilchenform. Es ist bevorzugt,
wenn auch nicht erforderlich, daß das erfindungsgemäße Mittel vollständig fest ist. Bei der Bildung kann
jedoch auch eine kleine Menge flüssiger Substanzen wie Lösungsmittel, polymerbildender Materialien und immunologischer
Gegenstücke usw. eingeschlossen werden. Das Vorhandensein solcher zusätzlicher Substanzen
kann jedoch solange toleriert werden wie es die Oberflächenreaktion zwischen dem eingeschlossenen
Gegenstück und dem Antigen nicht stört
Das erfindungsgemäße immunologische Absorptionsmittel besitzt zahlreiche Vorteile gegenüber den
bekannten. Es ist im wesentlichen in wäßrigen Flüssigkeiten nicht quellbar, während alle bekannten
immunologischen Absorptionsmittel, in denen das Gegenstück durch mechanischen Einschluß unbeweglich
gemacht worden ist, in wäßrigen Lösungen stark quellfähige Gele sind. Das erfindungsgemäße Mittel
■ wird als im wesentlichen nicht quellbar oder nicht
hydrophil ir; dem Sinne bezeichnet, daß auf Grund des osmotischen Druckes oder der Molekülstruktur der in
der Matrix enthaltenen polymeren Materialien eine geringe Quellung in wäßrigen Lösungen beobachtet
ίο werden kann. Eine solche Quellung ist jedoch
vollständig unbedeutend im Vergleich mit der Stärke der Quellung, die bei einem Gel auftritt. Da das
erfindungsgemäße Mittel im wesentlichen nicht qucl'bar
ist, wird das Auslaugproblem, das bei gelartigen immunologischen Absorptionsmitteln auftritt, im wesentlichen
überwunden.
Das erfindungsgemäße Mittel ist auch stabiler als Gel-Immunoabsorptionsmittel. Da Gel-Netzstrukturen
keine vollständig elastische Rückgewinnung (reversible
20' Hydratisierung) zeigen, ist eine solche Netzstruktur,
wenn sie einmal entwässert ist, nicht mehr brauchbar. Auch ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels
wesentlich einfacher als die Verfahren, die zur Herstellung der bekannten immunologischen Absorptionsmittel
angegeben sind Gelteilchen sind wesentlich schwieriger zu handhaben, sowohl bei der Herstellung
und Isolierung des immunologischen Absorptionsmittels als auch bei der Anwendung. Das erfindungsgemäße
Absorptionsmittel kann leicht in Form einer Membran oder eines Films bzw. einer Folie in Form fester
Teilchen hergestellt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden nichteinschränUenden
Beispiele näher erläutert
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines erfindungsgemäßen Absorptionsmittels in Form einer
Membran durch Grenzschicht-Polymerisation in Gegenwart eines spezifischen Antiserums, wodurch spezifische
Antikörper mechanisch in einer Polyamid-Matrix eingeschlossen werden.
Es wurde eine wäßrige Lösung hergestellt durch Zusammengeben von 80 μΐ i,8m 1,6-Hexamethylendiamin
in 0,15 m NazCOs-O.Ol m NaHCOa Puffer (pH 9,8)
und 0,2 ml 50%igem Rinderserumalbumin in spezifischem Antiserum. Eine Drahtschleife mit einem
Durchmesser von ungefähr 5,5 mm wurde kurz in diese wäßrige Lösung getaucht, wobei sich ein Film bildete
und dann in eine Lösung gegeben, enthaltend 0,02 m
so Sebacoylchlorid in einem 1 :4-Gemisch aus Chloroform
und Cyclohexan, und zwar 40 s bis V/2 min lang. Die ir der Schlaufe entstehende Membran wurde mit einei
5%igen Lösung eines nichtionischen oberflächenakti ven Mittels (Tween 20 der Atlas Powder Co.
Wilmington, Delaware) gewaschen. Das restliche Tween 20 wurde durch Eintauchen der Membrar
nacheinander in -u\er 0,85%igem Natriumchlorid- odei
Phosphat-Pufferlösungen ausgewaschen. Die Membrai wurde dann in der Schleife in Salz- oder Pufferlösung
aufbewahrt
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung des erfin dungsgemäßen Absorptionsmittels in Teilchenforn
durch Grenzflächen-Polymerisation in Gegenwart voi spezifischem Antiserum, wobei die spezifische Antikör
per mechanisch in einer Polyamid-Matrix eingcsclilos sen sind.
609 63d/32
Es wurde eine wäßrige Lösung hergestellt durch Zusammengeben von 0,5 ml 0,47 m-1,6-Hexamethylendiamin
in 0,45 m-Na^Oa-NaHCCb-Puffer (pH 9,8),
0,9 ml 50%igem Rinderserumalbumin und 0,2 ml spezifischem Antiserum. Diese wäßrige Lösung wurde
zusammengegeben mit 15 ml eines 1 :4-Gemisches von Chloroform und Cyclohexan enthaltend 10% eines
nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (Span 85 der Atlas Powder Co, Wilmington, Delaware). Dieses
Gemisch wurde 2 min gerührt und 10 ml 0,09%iges Sebacoylchlorid in einem 1 :4-Gemisch von Chloroform
und Cyclohexan unter gelegentlichem Rühren innerhalb 1 min zugegeben. Das Gemisch, das dann Polyamidteilchen
enthielt, wurde weitere 3 min gerührt, nachdem 30 ml eines 1 :4-Gemisches aus Chloroform und
Cyclohexan zugegeben werden waren. Alle angegebenen Stufen dieses Beispiels wurden im Eisbad
durchgeführt. Das entstehende Gemisch wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit abgegossen und die
Polyamidteilchen in 20 ml einer 45%igen Tween-20-Lösung dispergierL Restliches Tween 20 wurde durch
weiteres Waschen mit einer 0,9%igen Natriumchlorid-Lösung entfernt. Die Teilchen wurden in Salzlösung
aufbewahrt.
Dieses Beispiel betrifft die Anwendung der nach Beispiel 1 hergestellten Membran zur Isolierung von
Isoenzymen.
a) Isolation von M4 Isoenzym von Milchsäure-dehydrogenase
(LDH)
Die AntiM4-LDH-Membran wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wobei 0,2 ml Serum, enthaltend
Anti-M4-LDH, zur Herstellung der ersten wäßrigen Lösung verwendet wurden. Die Membran wurde 60 min
bei Raumtemperatur in einem Gemisch von 0,1 ml Serum oder einer wäßrigen Lösung, enthaltend
M4-LDH-Isoenzym und 1,5 ml 0,05 m-Natriumpyrophosphat-Puffer (pH 8,8) inkubiert. Nach
der Inkubationszeit wurde die Membran entfernt und 1,0 ml 0,16 m-Natriumlactat (pH 7,0) und 0,3 ml
0,05 m-Diphosphopyridin-nucleotid (pH 7,5) zu dem Behandlungsgemisch für die Membran zugegeben. Die
auftretende Enzymreaktion wurde bei 340 nm gegenüber einer Blindprobe, enthaltend destilliertes Wasser,
an Stelle des Serums oder der wäßrigen M4-LDH-L0-sung verfolgt, wobei die Blindprobe vorher mit einer
Schleife behandelt worden war, die eine Membran enthielt, die kein Antiserum enthielt, und auf die gleiche
Weise hergestellt und behandelt worden war wie das mit der Anti-M4-LDH-Membran behandelte Serum
oder die wäßrige Mt-LDH-Lösung.
Der durch das immunologische Absorptionsmittel entfernte Prozentsatz an Milchsäure-dehydrogenase
wurde berechnet durch einen Vergleich der restlichen LDH-Aktivität nach der Behandlung mit der Anti-rvU-LDH-Membran
und der anfänglichen LDH-Aktivität nach Verfahren, wie sie beschrieben sind in »New
Englang Journal of Medicine 261:25 (1969)«. Die Anti-M4-LDH-Membranen entfernten das Mi-LDH-Isoenzym
in einer Menge von 7 bis 70%, selbst bei Enzym-Konzentrationen über 200 Einheiten/ml.
b) Isolation von Placenta-Isoenzym von alkalischer
Phosphatase
Die Antiplacenta-alkalische-Phosphatase-Membran
wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wobei 0.2 ml Serum, enthaltend Antiplacenta-alkalische-Phosplhate
zur Herstellung der wäßrigen Anfangslösung verwendel wurden. Die Membran wurde 60 min bei Raumtemperatur
in einem Gemisch von 0,5 ml einer wäßrigen Lösung enthaltend Placenta-alkalisches-Phosphatase-lsoenzym
und 0,5 ml 0,01 m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (pH 7,0) inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die
Membran entfernt nnd 1,5 ml 0,84 m-2-Amino-2-melhyl·
1-propanol-Puffer (pH 10,17), enthaltend 100 mg p-Nitrophenylphosphat/70
ml Puffer zu dem Behandlungsgemisch für die Membran zugegeben. Die auftretende Enzymreaktion wurde bei 400 nm gegenüber einer
Blindprobe, enthaltend destilliertes Wasser an Stelle der wäßrigen Lösung, enthaltend Placenta-alkalisches-Phosphatase-Isoenzym,
verfolgt, wobei die Blindprobe vorher mit einer Schleife behandelt worden war. enthaltend eine Membran, die kein Antiserum enthielt
und wobei die Blindprobe auf die gleiche Weise behandelt wurde wie das mit der Antiplacenta-alkalische-Phosphatase-Membran
behandelte wäßrige PIacenta-aikaiische-Phosphatase-Isoenzym.
Der Prozentsatz der alkalischen Phosphatase, die durch das immunologische Absorptionsmittel entfernt worden
war, wurde berechnet durch einen Vergleich der restlichen alkalischen Phosphatase-Aktivität nach Behandlung
mit der Antiplacenta-alkalischen-Phosphaiase-Membran mit der Anfangs-Aktivität der alkalischen-Phosphatase,
wie sie bestimmt worden war nach dem Verfahren, das beschrieben worden ist in Clinical
Chemistry 2:2 (1966). Die Antiplacenta-alkalischen Phosphatase-Membranen entfernten das alkalische
Placenta-Phosphatase-Isoenzym in einer Menge von 20 bis 96%.
Claims (4)
1. Immunologisches Absorptionsmittel zur Entfernung eines Antigens aus einer wäßrigen Flüssigkeit,
bestehend aus einer Membran aus einem polymeren Material, in welchem ein Gegenstück zu dem
Antigen im wesentlichen mechanisch eingeschlossen ist, dadurch gekennzeichnet, daß das
polymere Material eine feste im wesentlichen nicht-hydrophile Matrix ist, die in der wäßrigen
Flüssigkeit unlöslich und im wesentlichen nicht quellbar ist und die immunologisch aktiven Stellen in
dem immunologischen Gegenstück für die immunologische Reaktion mit dem Antigen in der wäßrigen
Flüssigkeit frei verfügbar sind.
2. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
feste im wesentlichen nichthydrophile Matrix, umfassend ein polymeres Material, in Gegenwart
eines immunologischen Gegenstücks zu dem Antigen herstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die feste Matrix durch Grenzschicht-Polymerisation
herstellt, umfassend mindestens ein Lösungsmittelsystem, das das immunologische
Gegenstück enthält und das in Beziehung auf die immunologische Aktivität des immunologischen
Gegenstückes im wesentlichen inert ist.
4. Anwendung des Mittels nach Anspruch 1 zur Entfernung eines Antigens aus einer wäßrigen
Flüssigkeit, vorzugsweise einer Körperflüssigkeit, wobei man die wäßrige Flüssigkeit mit dem Mittel
zusammenbringt und das Mittel nach einer vorher bestimmten Zeit wieder aus der Lösung entfernt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US42278473A | 1973-12-07 | 1973-12-07 | |
US42278473 | 1973-12-07 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2457845A1 DE2457845A1 (de) | 1975-06-19 |
DE2457845B2 DE2457845B2 (de) | 1976-01-22 |
DE2457845C3 true DE2457845C3 (de) | 1976-09-02 |
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