DE2457845B2 - Immunologisches absorptionsmittel und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

Antigene können aus wäßrigen Flüssigkeiten wie ^₀ Körperflüssigkeiten mit Hilfe eines einfachen leicht herstellbar und handhabbaren sowie lagerfähigen immunologischen Absorptionsmittel entfernt werden. Das immunologische Absorptionsmittel wird hergestellt, indem man das immunologische Gegenstück zu ^₅ dem Antigen in einer im wesentlichen nicht hydrophilen polymeren Matrix einschließt, die in der zu behandelnden wäßrigen Flüssigkeit unlöslich und im wesentlichen nicht quellfähig ist. Eine immunologisch aktive Stelle in dem eingeschlossenen Gegenstück ist für immunologisehe Reaktionen mit Antigenen in wäßrigen Flüssigkeiten frei verfügbar. Die polymere Matrix besteht vorzugsweise aus einem Polymer oder Gemisch von Polymeren aus der Gruppe linearer und vernetzter polymerer Substanzen, die im wesentlichen in wäßrigen Flüssigkeiten nicht quellen. Dieses neue immunologische Absorptionsmittel ist eine feste Nichtgel-Phase bezüglich der wäßrigen Flüssigkeiten und ist sehr geeignet für immunologische Bestimmungsverfahren, indem es die Entfernung des zu bestimmenden Antigens &> aus der Probe erleichtert.

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Behandlung von wäßrigen Flüssigkeiten, um daraus ein Antigen zu entfernen. Sie betrifft besonders immunologische Absorptionsmittel und ihre Anwendung für immunologische Bestimmungen in biologischen Flüssigkeiten.

Der Ausdruck »immunologisches Absorptionsmittel« bezeichnet allgemein Gegenstände özw. Formkörper, die ein unlösliches immunologisch reaktionsfähiges Substrat darstelj£nf^jasi mit Antigenen in Flüssigkeiten reagieren kann und-immunologisch an diese gebunden wird. Indem es immunologisch an das unlösliche Substrat gebunden wird, wird das Antigen unbeweglich gemacht bzw. immobilisiert und kann dadurch von der Flüssigkeit durch geeignete Handhabung des Substrats entfernt werden.

Immunologische Absorptionsmittel finden in sehr vielen Bereichen Anwendung, besonders zur Reinigung und Isolierung von Antigenen und für immunologische Untersuchungen in biologischen Flüssigkeiten Gerade in letzter Zeit hat es sich gezeigt, daß immunologische Absorptionsmittel besonders geeignet sind für immunologische Bestimmungen von Isoenzymen und bei radioimmunologischen Untersuchungsverfahren. Die zu untersuchende Flüssigkeit wird mit einem immunologischen Absorptionsmittel, in dem ein immunologisches Gegenstück zu dem zu bestimmenden Enzym enthalten ist, in Berührung gebracht und die Radioaktivität oder Enzymaktivität, die mit der zu bestimmenden Substanz verbunden ist, wird berechnet entweder auf Grund der Aktivitätsänderung in der Flüssigkeit oder der Aktivität die das immunologische Absorptionsmittel durch Berührung mit der Flüssigkeit und anschließenden Entfernung daraus gewonnen hat.

Die wesentlichen Unterschiede zwischen bekannten immunologischen Absorptionsmitteln sind die Zusammensetzung und die Art der Matrix oder des Substratmaterials und die Art in der das immunologische Gegenstück darin eingebaut ist. Während die Wirksamkeit irgendeines speziellen immunologischen Absorptionsmittels in erster Linie von der spezifischen Bindungsaffinität zwischen dem Antigen und seinem ir der Matrix, eingebauten immunologischen Gegenstück abhängt sind die besonders günstigen immunologischen Absorptionsmittel solche, die leichter gehandhabt werden können und die das immunologische Gegenstück sicherer immobilisieren, während sie die immunologische Reaktivität dieses Gegenstücks in Beziehung auf das in der zu behandelnden Flüssigkeit vorhandene Antigen möglichst wenig beeinflussen.

Es gibt drei grundlegende Verfahren, das immunologische Gegenstück in eine unlösliche Matrix einzubauen, nämlich durch chemische Bindung des Gegenstücks an das Matrixmaterial, entweder direkt oder über ein Kupplungsmittel, durch Adsorption des Gegenstücks auf dem Matrixmaterial und durch Einschluß des Gegenstücks in dem Matrixmaterial. Während eine chemische Bindung zwischen dem Gegenstück und dem Matrixmaterial das Gegenstück sicher immobilisiert, ist es sehr schwer, die Lage der chemischen Bindung zu steuern, und daher ist die aktive Stelle oder sind die aktiven Stellen in dem immobilisierten Gegenstück häufig sterisch gehindert durch eine Kupplung, die an oder nahe an der aktiven Stelle stattfindet. Außerdem wird das entstehende immobilisierte Gegenstück durch die Reaktionsbedingungen, die erforderlich sind, um die Bildung von chemischen Bindungen zwischen dom Gegenstück und dem Matrixmateria! herbeizuführen, häufig verändert oder auf andere Weise nachteilig beeinflußt. Gegenstücke, die an die Matrixmaterialien adsorbiert sind, unterliegen leicht der Desorption. Solche Verfahren sind daher im allgemeinen nicht geeignet als Mittel zur Herstellung von immunologischen Absorptionsmitteln.

In letzter Zeit wurden einige Versuche unternommen.

geeignete immunologische Absorptionsmittel herzustellen, indem man das immunologische Gegenstück in das Matrixmaterial einfügt (Immuno-chemistry 8:39-48 [1971] und Science 142 :678-9 [1963]). Bei allen diesen Versuchen, ein Gegenstück in einem Matrixmaterial einzuschließen, wurden stark vernetzte polymere Substanzen im allgemeinen ein hochvernetztes Polyacrylamid angewandt

Die entstehenden vernetzten Polymere waren alle stark quellbar in wäßrigen Flüssigkeiten und damit in dem halbfesten Zustand eines Gels. Es ist offensichtlich angenommen worden, daß, um wirksame immunologische Absorptionsmittel durch den Einschluß des immunologischen Gegenstücks herzustellen, nur stark vernetzte hydrophile polymere Gels angewandt werden könnten zur Herstellung der das Gegenstück einschließenden Matrix. Offensichtlich wurde angenommen, daß eine vernetzte Struktur eine erforderliche dreidimensionale käfigartige Struktur ergibi zum Einschluß des Gegenstücks und daß eine hydrophile Gelstruktur für das eingeschlossene Gegenstück eine nicht feindliche wäßrige Umgebung darstellt sowohl während des Verfahrens des Einschließen als auch bei der entstehenden Matrix. Die Quellbarkeit und die makromolekulare Porengröße dieser hydrophilen Gele führten jedoch zu einem Auslaugen des immunologischen Gegenstücks aus der umschließenden Matrix. Um diese immunologischen Absorptionsmittel-Gele von den Testflüssigkeiten abzutrennen, waren auch ausgiebige Filtrations- und Zentrifugationsschritte erforderlich, und in vielen Fällen war die prozentuale Rückgewinnung nicht befriedigend.

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß immunologische Gegenstücke mechanisch in polymere Matrices eingeschlossen werden können, die in wäßrigen Flüssigkeiten im wesentlichen nicht quellbar sind, wodurch man einfache, leicht handhabbare und lagerfähige immunologische Absorptionsmittel erhält. Der erfindungsgemäße Gegensiand betrifft eine feste im wesentlichen nicht hydrophile Matrix, umfassend ein polymeres Material, wobei die Matrix in der zu untersuchenden wäßrigen Flüssigkeit unlöslich und im wesentlichen nicht quelibar ist und in der ein immunologisches Gegenstück zu dem Antigen im wesentlichen mechanisch eingeschlossen ist. Eine immunologisch aktive Stelle in dem Gegenstück ist für die immunologische Reaktion mit dem Antigen in der wäßrigen Flüssigkeit verfügbar.

Derartige Polymere, die in linearer Form in Wasser löslich sind und die daher, wenn sie vernetzt werden, bis zu einem gewissen Grad in Wasser quellen, können in der Matrix enthalten sein, solange sie ausreichend vernetzt sind, um eine wasserunlösliche polymere Matrix zu erhalten. Die bevorzugten polymeren Materialien, aus denen die Matrix besteht, umfassen die linearen, verzweigten und vernetzten Formen solcher polymeren Substanzen, die in ihrer linearen Form wasserunlöslich sind und die daher in ihrer verzweigten und vernetzten Form in Wasser im wesentlichen nicht quellen.

Allgemein besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des immunologischen Absorptionsmittels darin, daß man, vorzugsweise über eine Kondensationsreaktion, eine feste Matrix bildet, umfassend eine polymere Substanz in Gegenwart eines immunologisehen Gegenstücks zu dem Antigen. Vorzugsweise wird die Matrix hergestellt durch Grenzschicht-Polymerisation, umfassend mindestens ein Lösungsmittelsystem,

das das immunologische Gegenstück enthält, wobei das Lösungsmittelsystem im wesentlichen inert ist gegenüber der immunologischen Aktivität des immunologischen Gegenstücks. Es ist ferner bevorzugt, daß die Matrix durch Grenzschicht-Polymerisation zwischen einer wäßrigen Lösung, umfassend ein aliphatisches biamin und das immunologische Gegenstück, und einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, umfassend ' ein aliphatisches Dicarbonsäurehalogenid, durchgeführt wird.

Das immunologische Absorptionsmittel kann angewandt werden für Reinigungs- und Bestimmungsverfahren, besonders bei immunologischen Verfahren, die die Entfernung eines Antigens aus einer Testflüssigkeit umfassen. Ein solcher Schritt wird nach dem angegebenen Verfahren erreicht indem man die Flüssigkeit mit dem erfindungsgemäßen Absorptionsmittel in Berührung bringt und anschließend die Matrix aus der Flüssigkeit entfernt Bei Bestimmungsverfahren, wo die Zeit ein wichtiger Parameter ist, werden diese Stufen vorzugsweise in einem vorher bestimmten Zeitabstand durchgeführt

Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, daß immunologische Gegenstücke in Matrices eingeschlossen werden können und die entstehende Struktur als immunologisches Absorptionsmittel verwendet werden kann, wobei die Matrix kein hydrophiles Ge! ist. Polymere Substanzen können eingeteilt werden auf Grund der Funktionaiitätszahl des Monomers oder der Monomeren, aus denen das Polymer besteht.

Diese Zahl gibt die Anzahl von polymerbildenden reaktionsfähigen Gruppen in dem Monomer an. Monomere mit einer Funktionalität von 2 bilden lineare Polymere, während solche mit einer Funktionalität von 3 oder mehr vernetzte Polymere bilden, die als verzweigte, verbrückte oder vernetzte Polymere bekannt sind. Ein Gemisch von Polymeren mit Funktionalitäten von 2 bilden lineare Copolymere und Gemische von Monomeren mit Funktionalitäten von 3 oder darüber und Gemische von Monomeren mit Funktionalitäten von 2 mit Monomeren mit Funktionalitäten von 3 oder darüber bilden alle vernetzte Copolymere. Lineare Polymere können durch chemische oder physikalische Maßnahmen verändert werden, so daß sie vernetzte Polymere über die Bildung von Vernetzungen bilden. Wenn ein lineares Polymer, das wasserlöslich ist, in einem ausreichenden Maße vernetzt wird, erhält man ein hydrophiles Gel, das ein verneiztes Polymer ist und das in Wasser stark quellfähig ist. Ähnlich werden hydrophile Gele während der Polymerisations-Reaktion gebildet, wenn das entstehende Polymer zunächst wasserlöslich war und die Vernetzung bis zum Gelpunkt fortschreitet, d. h. dem Punkt, an dem das entstehende Polymer ausreichend vernetzt ist, daß es zur Gelbildung der Netzstruktur führt. Eine weitere Vernetzung in einem der beiden angegebenen Fälle kann zur Bildung eines hochvernetzten wasserunlöslichen und im wesentlichen nicht quellfähigen Nichtgel-Polymers führen. Die Vernetzung von linearen Polymeren, die in Wasser unlöslich sind, führt zu wasserunlöslichen vernetzten Polymeren, unabhängig vom Grad der Vernetzung. In diesem Zusammenhang wird auf grundlegende Handbücher der Polymer-Chemie verwiesen wie The Structure of Polymers von M. L Miller, Reinhold Publishing Corp. (New York 1966), Principles of Polymer Chemistry von P. J. Flory, Cornell University Press (Ithaca, New York 1953), und Fundamental Principles of Polymerization von G. F. D' AI e I i ο, John Wiley &

Sons, Inc.(New York 1952).

Polymere Materialien, die wasserunlösliche im wesentlichen nicht quellbare Matrices bilden, können im allgemeinen zum Einschluß des immunologischen Gegenstücks angewandt werden. Solche Polymere, die in wäßrigen Flüssigkeiten sowohl unlöslich als auch im wesentlichen nicht quellfähig sind und die dadurch feste im wesentlichen nicht hydrophile polymere Matrices ergeben, umfassen 1. wasserunlösliche lineare Polymere, 2. alle verzweigten oder vernetzten Formen von Polymeren, die in ihren linearen Formen wasserunlöslich sir<l, und 3. die vernetzten Formen von Polymeren, die in ihrer linearen Form wasserlöslich sind, wobei die Polymeren ausreichend vernetzt sind, um im wesentlichen in Wasser nicht quellbar zu sein. So können im wesentlichen alle nicht hydrophilen polymeren Substanzen in der erfindungsgemäßen Matrix enthalten sein. Während vernetzte Polymere, die im wesentlichen in Wasser nicht quellbar sind, angewandt werden können, ist es besonders bevorzugt, im wesentlichen oder vollständig lineare polymere Substanzen zur Bildung der polymeren Matrix zu verwenden. Im wesentlichen lineare polymere Substanzen sind im allgemeinen definiert als solche, die wasserunlösliche Polymere umfassen, die nicht ausreichend vernetzt sind, um in wäßrigen Lösungen zur Gelbildung zu führen, selbst wenn zusätzliche organische Quellmittel vorhanden sein können. So kann gemäß der Definition von im wesentlichen linearen polymeren Substanzen ein gewisses Maß an Vernetzung möglich sein, so wie es durch Verunreinigungen oder Nebenreaktionen auftritt. Im allgemeinen sind jedoch hohe Vernetzungen nur dann bevorzugt, wenn die lineare Form des Polymers in der wäßrigen Lösung löslich ist, während eine ausreichend vernetzte Form in der wäßrigen Lösung sowohl unlöslich als auch im wesentlichen nicht quellbar ist. Ein Beispiel für ein solches Polymer ist Polyvinylalkohol. Beispiele für Polymere, die in wäßrigen Flüssigkeiten in ihrer linearen Form unlöslich sind, sind Polyäthylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyamide und die Polyurethane. Ein Quellmittel kann definiert werden als eine Flüssigkeit, die zu einer Quellung oder Gelbildung der polymeren Netzstruktur führt, wenn diese Netzstruktur in einem ausreichenden Maße vernetzt ist, d. h. bis zu einem Punkt an oder über dem Gelpunkt der Netzstruktur. Ein Nichtquellmittel führt nicht zur Gelbildung unabhängig von dem Grad der Vernetzung in der polymeren Netzstruktur. In den bekannten Druckschriften ist der Einschluß von immunologischen Gegenstücken nur in hochvernetzten hydrophilen Gels angegeben. Es ist daher überraschend, daß es sich gezeigt hat, daß im wesentlichen lineare polymere Materialien, die im wesentlichen nichthydrophile polymere Matrices ergeben, zu besonders günstigen immunologischen Absorptionsmitteln führen.

Es hat sich gezeigt, daß die Reaktion zwischen dem Antigen und dem in der Matrix eingeschlossenen Gegenstück ein Oberflächenphänomen ist So muß das Antigen nicht in die Matrix eindringen, um immunologisch mit dem Gegenstück zu reagieren. In jedem Falle muß eine immunologisch aktive Stelle in dem eingeschlossenen Gegenstück für die immunologische Reaktion mit dem in der Flüssigkeit enthaltenen Antigen zur Verfügung stehen.

Das immunologische Gegenstück ist im wesentlichen mechanisch oder physikalisch in der Matrix eingeschlossen. Der Ausdruck »im wesentlichen« ist so zu verstehen, daß ein gewisser Anteil unüblicher chemischer Bindungen zwischen dem Gegenstück und dem polymeren Matrixmaterial bei der Bildung der Matrix entsteht. Solche ungewöhnlichen Bindungen dienen nicht dazu, das Gegenstück sicherer zu immobilisieren, sondern stören eher die Linearität des Polymers, wenn es sich bildet, da die chemische Natur des Gegenstücks im allgemeinen dazu führt, eine entstehende Polymerkette abzubrechen, wenn sie mit dem Gegenstück reagiert. Zum Beispiel sollte beim Einschluß eines proteinartigen Gegenstücks in eine Polyamid-Matrix, die durch Reaktion zwischen einem aliphatischen Diamin und einem aliphatischen Dicarbonsäurehalogenid gebildet worden ist, die Aminogruppen in dem proteinartigen Gegenstück mit dem aliphatischen

■5 Dicarbonsäureholgenid reagieren, wodurch die entstehende Polymerkette abgebrochen wird.

Von der chemischen Struktur aus gesehen, sind Antigene im allgemeinen entweder Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Glycoproteine oder Steroide und können im allgemeinen als irgendeine Substanz definiert werden, die spezifisch mit einem immunologischen Gegenstück reagiert, wodurch zwischen beiden eine immunologische Bindung entsteht. Eine immunologische Bindung ist in erster Linie eine physikalische

*5 Bindung, kann aber als physikochemische Bindung oder sogar als chemische Bindung bezeichnet werden. Substanzen, von denen gesagt werden kann, daß sie antigene Eigenschaften besitzen, können auch bezeichnet werden durch eine ihrer alternativen Funktionen,

d. h. einige Antigene können Enzyme, Hormone, Vitamine, Therapeutika oder sogar Antikörper sein. Im Zusammenhang der vorliegenden Beschreibung ist ein immunologisches Gegenstück irgendeine Substanz, die mit dem zu bestimmenden Antigen immunologisch reagieren kann und die auch mechanisch in eine Matrix der angegebenen Art eingeschlossen werden kann. So kann das immunologische Gegenstück ein Antikörper, ein Antikörper-Polymer, ein Konjugat von Antikörpern usw. sein. Antikörper sind biologisch entstehende Substanzen, die im Serum auftreten und die Fähigkeit besitzen, mit einem Antigen eine Bindung einzugehen. Ein Antikörper-Polymer ist eine Substanz, die chemisch aus Antikörpern besteht, die direkt aneinander gebunden sind, während ein Konjugat von Antikörpern eine Substanz ist, die chemisch aus Antikörpern besteht, die über Zwischensubstanzen wie niedermolekulare Kupplungsmittel oder hochmolekulare Trägersubstanzen miteinander verbunden sind. Beispiele für Kupplungsmittel sind Cyanohalogenide, wie Cyanobromid, die organischen und anorganischen Cyanate, wie die Alkalicyanate, die Bis-diazonium-Verbindungen, wie Bis-diazobenzidin und die Epihalogenhydrine wie Epichlorhydrin. Beispiele für Trägersubstanzen sind Latex, Methacrylat und Bakterienzellen.

Wenn Antikörper isoliert werden müssen, um das erfindungsgemäße Absorptionsmittel herzustellen, kann irgendein Verfahren zur Erzeugung von Antigen-spezifischen Antikörpern angewandt werden. Verfahren bei denen die Bildung von spezifischen Antikörpern

6d angeregt wird, können als bekannt wenn auch nicht wissenschaftlich angesehen werden. Das ist der Fall auf Grund der Tatsache, daß der Mechanismus, über den die Antikörper gebildet werden, weitgehend unbekannt ist. Die Technik mit Hilfe derer die Bildung spezifischer Antikörper angeregt werden kann, umfaßt Variationen bezüglich solcher Faktoren wie Immunogenzusammensetzung, Zusatz, Arten des Gasttiers und Schemas der Injektion von Immunogen und Abnahme des Serums.

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Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein spezielles Verfahren oder auf verschiedene Verfahren zur Isolierung von Antikörpern beschränkt.

Die erfindungsgemäß angewandte Matrix kann nach vielen verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Das immunologische Gegenstück wird in der Matrix dadurch eingeschlossen, daß es während der Bildung der Matrix vorhanden ist. Irgendein übliches Verfahren zur Herstellung polymerer Matrices kann angewandt werden, solange der erhaltene Formkörper die erfindungsgemäßen neuen Eigenschaften besitzt. Während Additions-Polymerisations-Reaktionen zur Bildung der Matrix angewandt werden können, sind Kondensations-Polymerisations-Reaktionen bevorzugt und besonders Grenzschicht-Kondensations-Polymerisations-Reaktionen. Die Anwendung von Grenzschicht-Kondensations-PoIymerisations-Reaktionen, bei denen mindestens ein Lösungsmittelsystem, das das immunologische Gegenstück enthält, gegenüber der immunologischen Aktivität des Gegenstückes inert ist, sind besonders bevorzugt. Die Anwendung wäßriger Lösungsmittel ergibt eine nichtfeindliche, die Stabilität erhöhende Umgebung für das Gegenstück während der Bildung des erfindungsgemäßen Absorptionsmittels.

Besonders günstige immunologische Absorptionsmittel (lmmunosorbentien) werden hergestellt durch Grenzschicht-Polymerisation von Polyamiden. PoIyamid-Matrices können hergestellt werden durch Grenzschicht-Polymerisation zwischen einer wäßrigen Lösung, umfassend ein aliphatisches Diamin und das immunologische Gegenstück und einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, umfassend ein aliphctisches Dicarbonsäurehalogenid. Bevorzugte aliphatische Diamine enthalten 2 bis 10 Methylengruppen und bevorzugte aliphatische Dicarbonsäurehalogenide enthalten nicht mehr als 8 Methylengruppen.

Es ist auch bevorzugt, ein Aufbau- oder Dickungsmittel zu der wäßrigen Lösung zuzusetzen. Ein solches Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es im Stande ist, die Viskosität der wäßrigen Lösung zu erhöhen und die nahe Lage des Gegenstücks zu verbessern. So ist das Aufbau- oder Dickungsmittel in der wäßrigen Lösung innig verbunden mit dem Gegenstück und unterstützt damit die Bildung einer einschließenden Matrix. Beispiele für geeignete Aufbaumittel sind die Albumine (bzw. Proteine), besonders Serumalbumine und synthetische Polymere wie die mittel- und hochmolekularen Polyvinylpyrrolidone.

Wenn die Grenzschicht zwischen der wäßrigen Lösung und der Lösung in dem organischen Lösungsmittel nicht gestört ist, entsteht an der Grenzschicht eine Membran- oder Folienform der Matrix. Wenn man die Grenzschicht stört, z. B. durch Rühren oder Zugabe geeigneter Detergentien, entsteht das erfindungsgemäße Absorptionsmittel in Teilchenform. Es ist bevorzugt, wenn auch nicht erforderlich, daß das erfindungsgemäße Mittel vollständig fest ist Bei der Bildung kann jedoch auch eine kleine Menge flüssiger Substanzen wie Lösungsmittel, polymerbildender Materialien und immunologischer Gegenstücke usw. eingeschlossen werden. Das Vorhandensein solcher zusätzlicher Substanzen kann jedoch solange toleriert werden wie es die Oberflächenreaktion zwischen dem eingeschlossenen Gegenstück und dem Antigen nicht stört

Das erfindungsgemäße immunologische Absorptionsmittel besitzt zahlreiche Vorteile gegenüber den bekannten. Es ist im wesentlichen in wäßrigen Flüssigkeiten nicht quellbar, während alle bekannten immunologischen Absorptionsmittel, in denen das Gegenstück durch mechanischen Einschluß unbeweglich gemacht worden ist, in wäßrigen Lösungen stark quellfähige Gele sind. Das erfindungsgemäße Mittel wird als im wesentlichen nicht quellbar oder nicht hydrophil in dem Sinne bezeichnet, daß auf Grund des osmotischen Druckes oder der Molekülstruktur der in der Matrix enthaltenen polymeren Materialien eine geringe Quellung in wäßrigen Lösungen beobachtet werden kann. Eine solche Quellung ist jedoch vollständig unbedeutend im Vergleich mit der Stärke der Quellung, die bei einem Gel auftritt. Da das erfindungsgemäße Mittel im wesentlichen nicht quellbar ist, wird das Auslaugproblem, das bei gelartigen immunologischen Absorptionsmitteln auftritt, im wesentlichen überwunden.

Das erfindungsgemäße Mittel ist auch stabiler als Gel-lmmunoabsorptionsmittel. Da Gel-Netzstrukturen keine vollständig elastische Rückgewinnung (reversible ■ Hydratisierung) zeigen, ist eine solche Netzstruktur, wenn sie einmal entwässert ist, nicht mehr brauchbar. Auch ist die Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels wesentlich einfacher als die Verfahren, die zur Herstellung der bekannten immunologischen Absorptionsmittel angegeben sind. Gelteilchen sind wesentlich schwieriger zu handhaben, sowohl bei der Herstellung und Isolierung des immunologischen Absorptionsmittels als auch bei der Anwendung. Das erfindungsgemäße Absorptionsmittel kann leicht in Form einer Membran 1 oder eines Films bzw. einer Folie in Form fester Teilchen hergestellt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines erfindungsgemäßen Absorptionsmittels in Form einer Membran durch Grenzschicht-Polymerisation in 'Gegenwart eines spezifischen Antiserums, wodurch spezifische Antikörper mechanisch in einer Polyamid-Matrix eingeschlossen werden.

Es wurde eine wäßrige Lösung hergestellt durch Zusammengeben von 80 μΐ, 1,8 m 1,6-Hexamethylendiamin in 0,15 m NazCCb-O.Ol m NaHCCb Puffer (pH 9,8) und 0,2 ml 50%igem Rinderserumalbumin in spezifischem Antiserum. Eine Drahtschleife mit einem Durchmesser von ungefähr 5,5 mm wurde kurz in diese wäßrige Lösung getaucht, wobei sich ein Film bildete, und dann in eine Lösung gegeben, enthaltend 0,02 m Sebacoylchlorid in einem 1 :4-Gemisch aus Chloroform und Cyclohexan, und zwar 40 s bis I¹/2 min lang. Die in der Schlaufe entstehende Membran wurde mit einer 5%igen Lösung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (Tween 20 der Atlas Powder Co, Wilmington, Delaware) gewaschen. Das restliche Tween 20 wurde durch Eintauchen der Membran nacheinander in vier 0,85%igem Natriumchlorid- oder Phosphat-Pufferlösungen ausgewaschen. Die Membran wurde dann in der Schleife in Salz- oder Pufferlösung aufbewahrt

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung des erfindungsgemäßen Absorptionsmittels in Teilchenform durch Grenzflächen-Polymerisation in Gegenwart von spezifischem Antiserum, wobei die spezifische Antikörper mechanisch in einer Polyamid-Matrix eingeschlossen sind.

509584/486

Es wurde eine wäßrige Lösung hergestellt durch Zusammengeben von 0,5 ml 0,47 m-1,6-Hexamethylendiamin in 0,45 m-Na2CO3-NaHCO3-Puifer (pH 9,8), " 0,9 ml 50%igem Rinderserumalbumin und 0,2 ml spezifischem Antiserum. Diese wäßrige Lösung wurde zusammengegeben mit 15 ml eines 1 :4-Gemisches von Chloroform und Cyclohexan enthaltend 10% eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels (Span 85 der Atlas Powder Co., Wilmington, Delaware). Dieses Gemisch wurde 2 min gerührt und 10 ml 0,09%iges Sebacoylchlorid in einem 1 :4-Gemisch von Chloroform und Cyclohexan unter gelegentlichem Rühren innerhalb 1 min zugegeben. Das Gemisch, das dann Polyamidteilchen enthielt, wurde weitere 3 min gerührt, nachdem 30 ml eines 1 :4-Gemisches aus Chloroform und Cyclohexan zugegeben worden waren. Alle angegebenen Stufen dieses Beispiels wurden im Eisbad durchgeführt. Das entstehende Gemisch wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit: abgegossen und die Polyamidteilchen in 20 ml einer 45°/oigen Tween-20-Lösung dispergiert. Restliches Tween 20 wurde durch weiteres Waschen mit einer 0,9%igen Natriumchlorid-Lösung entfernt. Die Teilchen wurden in Salzlösung aufbewahrt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft die Anwendung der nach Beispiel 1 hergestellten Membran zur Isolierung von Isoenzymen.

a) Isolation von M4 Isoenzym von Milchsäure-dehydrogenase (LDH)

Die AntiM4-LDH-Membran wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wobei 0,2 ml Serum, enthaltend Anti-M4-LDH, zur Herstellung der ersten wäßrigen Lösung verwendet wurden. Die Membran wurde 60 min bei Raumtemperatur in einem Gemisch von 0,1 ml Serum oder einer wäßrigen Lösung, enthaltend MvLDH-lsoenzym und 1,5 ml 0,05 m-Natrium- pyrophosphat-Puffer (pH 8,8) inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Membran entfernt und 1,0 ml 0,16 m-Natriumlactat (pH 7,0) und 0,3 ml 0,05 m-Diphosphopyridin-nucleotid (pH 7,5) zu dem Behandlungsgemisch für die Membran zugegeben. Die auftretende Enzymreaktion wurde bei 340 nm gegenüber einer Blindprobe, enthaltend destilliertes Wasser, an Stelle des Serums oder der wäßrigen M4-LDH-LÖ-sung verfolgt, wobei die Blindprobe vorher mit einer Schleife behandelt worden war, die eine Membran enthielt, die kein Antiserum enthielt, und auf die gleiche Weise hergestellt und behandelt worden war wie das mit der Anti-M4-LDH-Membran behandelte Serum oder die wäßrige M4-LDH-Lösung.

Der durch das immunologische Absorptionsmittel entfernte Prozentsatz an Milchsäure-dehydrogenase wurde berechnet durch einen Vergleich der restlichen LDH-Aktivität nach der Behandlung mit der Anti-M4-LDH-Membran und der anfänglichen LDH-Aktivität nach Verfahren, wie sie beschrieben sind in »New Englang Journal of Medicine 261 :25 (1969)«. Die Anti-M4-LDH-Membranen entfernten das M4-LDH-Isoenzym in einer Menge von 7 bis 70%, selbst bei Enzym-Konzentrationen über 200 Einheiten/ml.

b) Isolation von Placenta-Isoenzym von alkalischer Phosphatase

Die Antiplacenta-alkalische-Phosphatase-Membran wurde entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wobei 0,2 ml Serum, enthaltend Antiplacenta-alkalische-Phosphate, zur Herstellung der wäßrigen Anfangslösung verwendet wurden. Die Membran wurde 60 min bei Raumtemperatur in einem Gemisch von 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend Placenta-alkalisches-Phosphatase-Isoenzym und 0,5 ml 0,01 m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (pH 7,0) inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Membran entfernt Hnd 1,5 ml 0,84 m-2-Amino-2-methyl-1-propanol-Puffer (pH 10,17), enthaltend 100 mg p-Nitrophenylphosphat/70 ml Puffer zu dem Behandlungsgemisch für die Membran zugegeben. Die auftretende Enzymreaktion wurde bei 400 nm gegenüber einer Blindprobe, enthaltend destilliertes Wasser an Stelle der wäßrigen Lösung, enthaltend Placenta-alkalisches-Phosphatase-Isoenzym, verfolgt, wobei die Blindprobe vorher mit einer Schleife behandelt worden war, enthaltend eine Membran, die kein Antiserum enthielt, und wobei die Blindprobe auf die gleiche Weise behandelt wurde wie das mit der Antiplacenta-alkalische-Phosphatase-Membran behandelte wäßrige PIacenta-alkalische-Phosphatase-Isoenzym. Der Prozentsatz der alkalischen Phosphatase, die durch das immunologische Absorptionsmittel entfernt worden war, wurde berechnet durch einen Vergleich der restlichen alkalischen Phosphatase-Aktivität nach Behandlung mit der Antiplacenta-alkalischen-Phosphatase-Membran mit der Anfangs-Aktivität der alkalischen-Phosphatase, wie sie bestimmt worden war nach dem Verfahren, das beschrieben worden ist in Clinical Chemistry 2:2 (1966). Die Antiplacenta-alkalischen Phosphatase-Membranen entfernten das alkalische Placenta-Phosphatase-Isoenzym in einer Menge von 20 bis 96%.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Immunologisches Absorptionsmittel zur Entfernung eines Antigens aus einer wäßrigen Flüssigkeit. bestehend aus einer Membran aus einem polymeren Material in weichem ein Gegenstück zu dem Antigen im wesentlichen mechanisch eingeschlossen ist, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Material eine feste im wesentlichen nicht-hydrophile Matrix ist, die in der wäßrigen Flüssigkeit unlöslich und im wesentlichen nicht quellbar ist und die immunologisch aktiven Stellen in dem immunologischen Gegenstück für die immunologische Reaktion mit dem Antigen in der wäßrigen Flüssigkeit frei verfügbar sind.

2. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man eine feste im wesentlichen nichthydrophile Matrix, umfassend ein polymeres Material, in Gegenwart _Α eines immunologischen Gegenstücks zu dem Antigen herstellt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die feste Matrix durch Grenzschicht-Polymerisation herstellt, umfassend mindestens ein Lösungsmittelsystem, das das immunologische Gegenstück enthält und das in Beziehung auf die immunologische Aktivität des immunologischen Gegenstückes im wesentlichen inert ist.

4. Anwendung des Mittels nach Anspruch 1 zur Entfernung eines Antigens aus einer wäßrigen Flüssigkeit, vorzugsweise einer Körperflüssigkeit, wobei man die wäßrige Flüssigkeit mit dem Mittel zusammenbringt und das Mittel nach einer vorher bestimmten Zeit wieder aus der Lösung entfernt.