DE69423522T2

DE69423522T2 - Membran aus einem acrylnitrilpolymer

Info

Publication number: DE69423522T2
Application number: DE69423522T
Authority: DE
Inventors: Frank Gentile; Milton Harris; Molly Shoichet
Original assignee: Cytotherapeutics Inc
Current assignee: Microbot Medical Inc
Priority date: 1993-04-27
Filing date: 1994-04-26
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2014-04-27
Also published as: CA2157915A1; ATE190633T1; WO1994025503A1; DK0746582T3; DE69423522D1; FI954774A; AU6904194A; EP0746582A4; NO954266L; NO954266D0; AU689477B2; US5720969A; FI954774A0; EP0746582B1; JPH08510274A; KR960701923A; EP0746582A1; ES2145137T3; US6180007B1

Description

Gebiet der Erfindung

Das technische Gebiet betrifft Propfpolymere und Propfpolymermembrane, die zur Verkapselung lebender Zellen, die biologisch aktive Faktoren erzeugen, brauchbar sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Propfhomopolymere und -copolymere von Polyalkylnitril und Polyalkylenoxid. Die Propfpolymer-Membranen sind permselektiv und ermöglichen es durch die eingekapselten Zellen gebildeten Proteinen leicht durch die Membran hindurchzudiffundieren.

Hintergrund der Erfindung

Selektiv permeable Membranen wurden zur Verkapselung von Zellen verwendet, die biologisch aktive Faktoren, die zur Behandlung verschiedener Erkrankungen und Beschwerden nützlich sind, ausscheiden. Typischerweise werden die Zellen in Membranen eingebracht, die in Form von Hohlfasern vorliegen, oder zwischen zwei flache Schichten in Sandwichform. Die Fasern werden dann an den Enden unter Bildung von "Makrokapseln" versiegelt. Die eingekapselten Zellen werden dem Patienten, der die durch die Zellen erzeugten biologisch aktiven Faktoren benötigt, implantiert. Makrokapseln besitzen den Vorteil einer leichten Wiedergewinnbarkeit, was bei therapeutischen Implantaten ein wichtiger Faktor ist.
Ein Beispiel von Makrokapseln findet sich im US-Patent 4892538, das die Verkapselung von Neurotransmitterabsondernden Zellen beschreibt, die einem Patienten mit einer Neurotransmitter-Mangelkrankheit implantiert werden.
Das US-Patent 5158881 beschreibt ebenfalls Verfahren und Systeme zur Verkapselung von Zellen, die biologisch aktive Faktoren bilden. Die Zellen werden mit einer semipermeablen polymeren Membran durch Koextrudieren einer wässerigen Zellsuspension und einer Polymerlösung durch eine gemeinsame Öffnung unter Bildung eines rohrförmigen Extrudats mit einer polymeren Außenbeschichtung, die die Zellsuspension einkapselt, verkapselt. Die Zellen können auch in vorgebildeten Hohlfasermembranen eingebracht werden.
Die zur Einkapselung von Zellen verwendeten semipermeablen Membranen werden typischerweise aus polymeren Materialien gebildet, wie z. B. Acrylpolymeren, Polyvinylidenfluorid, Polyurethanisocyanaten, Polyalginat, Celluloseacetat, Polysulfon, Polyvinylalkoholen, Polyacrylnitril und Mischungen oder Derivaten davon. Poly(acrylnitril-co- vinylchlorid) (PAN/PVC) ist eines der Polymere, die zur Verwendung implantierbarer Membranen verwendet werden, weil es leicht in permselektive Membranen überführt werden kann, die einen leichten Transport von Nährstoffen ermöglichen und den Transport von Immun-Molekülen stark reduzieren. Diese Membranen können in einer Vielzahl von Wandstärken und Morphologien hergestellt werden. PAN/PVC ist mäßig hydrophil und gegenüber Zellen nicht toxisch.
Sowohl JP-A-63068620 und Zhu et al. ("Development of PAN-PVC- Ultrafiltration Membranes", Suichuli Jishu, Band 14, Seiten 208-212) beschreiben die Verwendung von Acrylnitril-Homo- und Copolymeren als selektiv permeable Membranen für biologische Fluide, die lebende Zellen und/oder biologisch aktive Verbindungen, wie z. B. Proteine oder Enzyme, enthalten. Insbesondere die JP-A-6306%20 beschreibt das Propfen von Polymeren von thioamidisiertem Polyacrylnitril (PA) mit (Meth)acryloylpolyoxyethylen. Die Umsetzung verläuft im wesentlichen, indem man zunächst Polyacrylnitril in DMF mit H&sub2;S behandelt, was zum thioamidisierten Polyacrylnitril führt. Das resultierende Polymer wird in DMSO gelöst und mit Methoxypoly(ethylenglykol)monomethylacrylat behandelt. Dieses Polymer wird in DMSO gelöst und in die Form einer Polyoxyethylen/Polyacrylnitril-Membran gegossen.
JP-A-59142242 beschreibt die Herstellung einer Formmasse durch Umsetzen von Polyalkylenoxid mit einem Carboxyfunktionellen Polyolefin. Das Polyalkylenoxid ist durch einen Gehalt an Hydroxy (-OH), Epoxy (-O-) oder Amino (-NH2)- funktionellen Gruppen charakterisiert, die mit den Carboxyl (-COOH)-Gruppen des modifizierten Polyolefins reagieren. Die Carboxylgruppen werden außerdem in das Polyolefin durch Copolymerisieren mit einem Carboxyfunktionellen Monomer (z. B. Methacrylsäure, Maleinsäure, Phthalsäure) oder durch Verseifung von Alkyl(meth)acrylat eingeführt.
Obwohl diese Materialien die Fähigkeit besitzen, in permselesktive, biokompatible Membranen überführt zu werden, besteht die Notwendigkeit für eine weitere Verbesserung der Eigenschaften der Membranen, um ihre Verwendbarkeit für Makroverkapselungszwecke zu verbessern. Ein Nachteil einiger polymerer Membranen ist der, daß Proteine, die aus den verkapselten Zellen abgesondert werden, und Proteine von Patienten die Tendenz zeigen, an ihnen adsorbiert zu werden, wodurch die Diffusionsrate des Proteins zum Patienten und damit die Effizienz des Implantats verringert werden.
An polymeren Materialien wurden verschiedene Modifikationen vorgenommen, um ihre Eigenschaften zu verändern, und um ihre Verwendbarkeit für bestimmte therapeutische Applikationen zu verbessern. Das US-Patent 4871785 (Froix et al.) beschreibt z. B. Hydrogel-Kontaktlinsen-Zusammensetzungen, die so modifiziert sind, daß sie beträchtliche Mengen an vernetzendem Material, wie z. B. Polyethylenoxid, enthalten. Durch diese Modifikation wird eine Linse mit einer verringerten Proteinadsorption erhalten. Allmer et al. haben Polyethylenglykol (PEG) und Heparin auf Polymeroberflächen aufgepropft, um die Proteinadsorption zu inhibieren und um eine durch die Oberfläche aktivierte Blutgerinnung zu verhindern (J. of Polymer Sci. Band 28: 176-183 (1990)). Miyama et al. beschreiben Propfcopolymere mit verbesserten antithrombogenen Eigenschaften, nachdem sie heparinisiert wurden (J. Biomed. Mater. Res. Band 11: 251-265 (1977)). Das US-Patent 4424311 (Nagaoka et al.) beschreibt ein antithrombogenes biomedizinisches Material, das ein Polymer mit einer Polyethylenoxideinheit enthält. Das US-Patent 4965112 (Brinkman et al.) beschreibt ein Verfahren zur Applikation einer Polyethylenoxid-Beschichtung auf Polyether- Urethan-Formkörpern, wie z. B. Kathetern, um die Blutkompatibilität zu verbessern. Die veröffentlichte PCT- Anmeldung PCT/US91/07051 beschreibt das Aufpropfen von Polyethylenoxid auf Mikrokapseln, die aus polykationischen Polymeren, wie z. B. Poly(1-lysin), hergestellt wurden. Fane et al. beschreiben, daß die Behandlung verschiedener Ultrafiltrationsmembranen mit nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln den Durchfluß von Proteinlösungen erhöhen kann (Desalination, Band 53: 37-55 (1985)).

Zusammenfassung der Erfindung

Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer biokompatiblen permselektiven Hohlfasernmembran, die eine sehr gute Molekulardiffusion mit minimaler Proteinadsorption aufweist.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabenstellung ist die Bereitstellung von Propfpolymer- und -copolymermembranen mit funktionellen Oberflächengruppen, durch die zusätzliche Modifikationen erreicht werden können, um die Brauchbarkeit und die Biokompatibilität der Membranen weiter zu verbessern.
Diese Aufgabenstellungen werden durch das erfindungsgemäße Propfpolymer und die permselektiven Propfpolymerbranen gelöst. Das Propfpolymer wird gebildet, indem man einen Teil der C N (Cyano)-Gruppen eines Polymergrundgerüstes, das
Einheiten enthält, in intermediäre reaktive Stellen überführt.
Über die reaktiven Stellen können dann Polyalkylenoxid- Polymerketten auf das Copolymergrundgerüst aufgepropft werden.
In einer Ausführungsform wird das Propfpolymer ausgebildet durch Copolymerisieren von Acrylnitrilmonomer und Vinylchloridmonomer unter Bildung eines Copolymergerüstes. Das Copolymergerüst umfaßt in der Copolymerkette die folgenden Gruppen:
und
worin ein Teil der -C N (Cyano)-Gruppen in intermediäre reaktive Stellen überführt wurden.
Über die reaktiven Stellen können dann Polyalkylenoxid- Polymerketten auf das Copolymergrundgerüst aufgepropft werden.
In einer Ausführungsform werden die Polyalkylenoxid- Polymerketten verwendet, um das Polymergrundgerüst einer permselektiven Polymermembran zu modifizieren, um eine permselektive Propfpolymermembran auszubilden. In einer anderen Ausführungsform werden die Polyalkylenoxid- Polymerketten verwendet, um das Polymergrundgerüst eines Polymerharzes zu modifizieren, um ein Propfpolymerharz auszubilden. Das Harz wird dann in eine permselektive Propfpolymermembran unter Verwendung von auf diesem Gebiet bekannten Verfahren überführt.
Die Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Ausbildung eines Propfpolymers, worin ein Acrylnitrilmonomer und Vinylchloridmonomer unter Bildung eines Copolymergrundgerüstes copolymersiert werden, das die folgenden Gruppen umfaßt:
und
Ein Teil der Cyangruppen wird dann in intermediäre aktive Stellen überführt, und über die reaktiven Stellen werden Polyalkylenoxidpolymerketten auf das Copolymergrundgerüst aufgepropft.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung ist aus der nachfolgenden Beschreibung zusammen mit den anliegenden Zeichnungen besser verständlich, worin bedeuten:
Fig. 1 zeigt die saure Hydrolyse eine Poly(acrylnitril-covinylchlorid) (PAN/PVC)-Grundgerüstes, worin x und y den Anteil an Acrylnitril bzw. Vinylchlorid bedeuten. Das hydrolysierte PAN/PVC-Copolymer wird dann mit Polyethylenglykolamin derivatisiert.
Fig. 2 zeigt die Natriumborhydrid-Reduktion eines PAN/PVC- Grundgerüstes, worin x und y den Anteil an Acrylnitril bzw. Vinylchlorid bedeuten. Das reduzierte PAN/PVC-Copolymer wird dann mit Polyethylenglykolsuccinimid derivatisiert.
Fig. 3 zeigt das ¹H NMR-Spektrum von PAN/PVC-Copolymer.
Fig. 4 zeigt das ¹H NMR-Spektrum für reduziertes PAN/PVC- Copolymer.
Fig. 5 zeigt das ¹H NMR-Spektrum für SC-PEG-8000, an reduziertes Polymer gekoppelt.
Fig. 6 zeigt das ¹H NMR-Spektrum für hydrolysiertes PAN/PVC- Copolymer.
Fig. 7 zeigt das ¹H NMR-Spektrum für das an M-PEG-NH&sub2; gekoppelte hydrolysierte Polymer.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben festgestellt, daß eine Modifizierung von Hohlfasern auf der Basis von Polyacrylnitril (PAN) mit einem aktivierten Polyalkylenoxid (PAO) eine permselektive biokompatible Membran ergibt, die eine verringerte Proteinadsorption besitzt. Die erfindungsgemäße Membran ist ein Propfpolymer, das wesentlich weniger Proteinadsorption als das Copolymer von Polyvinylchlorid und Polyacrylnitril (PAN/PVC) zeigt: Ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, wird angenommen, daß PAO einen Raum auf der Oberfläche ausschließt, wodurch die Proteine daran gehindert werden, an der Membran "anzukommen" oder an ihr adsorbiert zu werden. Die unmodifizierte Membran ist in wässeriger Lösung unlöslich; während PAO, wie Proteine, in wässeriger Lösung löslich ist. Es wird angenommen, daß die PAO-Kette sich von der unlöslichen Oberfläche in die wässerige Lösung erstreckt, wodurch die Proteinadsorption inhibiert wird.
Zusätzlich zur Verringerung der Proteinadsorption der Membran stellt das aufgepropfte PAO Hydroxygruppen bereit, auf denen zusätzliche Moleküle angebracht werden können. Es kann z. B. wünschenswert sein, verschiedene Proteine oder zelluläre Adhäsionsmoleküle, antizelluläre Adhäsionsmoleküle, usw., anzubringen. Auch Enzyme könnten angebracht werden, die Viren oder IgG binden oder inaktivieren, wodurch die Biokompatibilität der permselektiven Membran verbessert wird.
Der hier verwendete Ausdruck "permselektiv" wird verwendet, um eine biokompatible Membran zu beschreiben, die den Durchtritt von Substanzen bis zu einer bestimmten Größe ermöglicht, den Durchtritt größerer Substanzen aber verhindert. Spezifischer ausgedrückt wird die Membran auf eine solche Weise hergestellt, daß sie Poren oder Vakuolen einer bestimmten Größenordnung aufweist; dadurch ist die Membran permselektiv. Die Molekulargewichtausschlußgrenze (MWCO), die für eine bestimmte Membran gewählt wird, wird teilweise durch die Art und das Ausmaß der immunologischen Abstoßung bestimmt, die nach Implantation der Membran auftreten wird, und teilweise durch die Molekülgröße der größten Substanz, die in und/oder aus dem Träger ein/austreten können soll. Es können z. B. Membranen gebildet werden, die den Durchgang von Molekülen bis zu einer Größe von Clq, einer Komponente eines Komplements (ca. 400 kD), ein Protein, das zur Anordnung des Cytolytic Complement Attack Complex erforderlich ist, zulassen. In diesem Fall können Substanzen, die kleiner als Clq sind, frei hindurchtreten. Es ist auch möglich, permselektive Membranen auszubilden, die den Durchtritt von Molekülen bis zur Größe von Immunglobulin G (ca. 150 kD) ermöglichen, und größere Moleküle ausschließen. Außerdem können auch permselektive Membranen oder Hydrogele verwendet werden, die den Durchtritt von Molekülen bis zur Größe von Immunglobulin M (ca. 1000 kD) ermöglichen, verwendet werden; nur sehr große Substanzen, wie z. B. Zellen, werden in dieser Ausführungsform ausgeschlossen.
Die permselektiven Membranen können als Hohlfasern oder flache Schichten ausgebildet werden. Die Hohlfasermembran besitzt einen ringförmigen Querschnitt und besteht aus einer inneren zylindrischen Oberfläche, einer Wandstruktur als Stütze, und einer äußeren zylindrischen Oberfläche. Eine oder beide der Oberflächen können für Moleküle verschiedenen Molekulargewichts selektiv sein. Eine flache Schicht besteht aus einer planaren Hohlfaserzusammensetzung.
In einer Ausführungsform wird eine Membran erhalten, die durch Copolymerisieren von Acrylnitrilmonomer und Vinylchloridmonomer unter Bildung eines Copolymergrundgerüstes aus PAN/PVC erhalten wird. Es können jedoch auch andere Copolymermembranen auf Basis von PAN verwendet werden, einschließlich von, ohne aber darauf beschränkt zu sein, PAN-co-Vinylidenchlorid, PAN-co- Acrylsäure, PAN-co-Butadien-Styrol, PAN-co-Butadien, PAN-co- Vinylacetat, PAN-co-4-Vinylpyridin, PAN-co-Butadien-co- Acrylsäure und PAN-co-Maleinsäureanhydrid. Auch PAN- Homopolymer und Membranen auf der Basis von PAN- Blockcopolymeren können verwendet werden. Der hier verwendete Ausdruck "Copolymer" umfaßt Terpolymere. Er umfaßt auch statistische Copolymere und Blockcopolymere. Zur Ausbildung von PAN-Copolymermembranen können auf diesem Gebiet bekannte Verfahren verwendet werden, einschließlich solcher, wie sie bekannt sind aus US-Patent 2763631 (Coover et al.), US-Patent Nr. 2420330 (Shriver et al.) und US-Patent 4334046 (König et al.), die PAN/PVC beschreiben.
Nachdem eine Polymermembran auf PAN-Basis erhalten wurde, wird ein Teil der -C N (Cyano)-Gruppen des Grundgerüstes in intermediäre reaktive Stellen überführt. Dann werden Polyalkylenoxidpolymerketten (z. B. Polethylenglykol oder Polypropylenglykol, vorzugsweise das erstere) auf das Copolymergrundgerüst über die reaktiven Stellen aufgepropft. Die erfindungsgemäß verwendeten Polyalkylenoxid-Polymerketten sind im wesentlichen in Wasser löslich. Die reaktiven Stellen sind Gruppen, mit denen die PAO-Endgruppen in einer einzigen Reaktionsstufe reagieren können.
In einem Verfahren werden die reaktiven Stellen der PAN/PVC- Grundgerüstmembran durch Hydrolyse der Cyangruppen in eine chemisch verfügbare Carboxylgruppe gebildet. Die Carboxylgruppen werden mit einer endständigen Aminogruppe einer Vorläufer-Polyalkylenoxid (PAO)-Polymerkette unter Bildung des Propfpolymers umgesetzt. In Fig. 1 werden z. B. die Carboxylgruppen des PAN/PVC-Grundgerüstes durch saure Hydrolyse gebildet. Sie werden dann mit Polyethylenglykolamin unter Bildung des Propfcopolymers umgesetzt. Fig. 1 zeigt die saure Hydrolyse des PAN/PVC-Copolymers, in dem das Verhältnis von Acrylnitril zu Vinylchlorid 45 : 55 beträgt. Andere Verhältnisse von Acrylnitril zu Vinylchlorid können jedoch ebenfalls verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Propfcopolymeren können auch durch Reduktion von PAN/PVC gebildet werden. Die reaktiven Stellen werden durch Reduktion der Cyangruppen in Aminogruppen gebildet. Die Anmelderin hat gefunden, daß eine Natriumborhydrid-Reduktion des Copolymers Aminogruppen bildet, die verwendet werden können, um ein aktiviertes PAO, wie z. B. ein Succinimidylcarbonat-derivatisiertes PAO, zu binden. Dies wird in Fig. 2 gezeigt, wo die Aminogruppen dann mit Polyethylenglykolsuccinimid umgesetzt werden. Die aktivierten PAOs können z. B. von Polysciences, Inc., Warrington, PA, und Shearwater Polymers, Huntsville, AL, im Handel erhalten werden.
Die Protonen-Kernresonanz (Protonen-NMR) ist ein geeignetes analytisches Verfahren zur Quantifizierung der Menge des an PAN/PVC angebundenen PAO. Das Propfcopolymer kann auch durch andere spektroskopische Methoden charakterisiert werden, wie z. B. durch attenuierte Totalreflektions-Fourier- Transformations-Infrarotspektroskopie (ATR FTIR) und röntgenstrahlenangeregte Photoelektronenspektroskopie (XPS) Durch ATR FTIR wird es ersichtlich, daß die PAN-Nitrilgruppe über eine Amidgruppe hydrolysiert wird. Obwohl nicht alle Nitrilgruppen vollständig hydrolysiert werden, können sie mit PEG-Amin reagieren. Wie durch ATR FTIR gezeigt, erhöht sich die Fläche des Amidpeaks, während sich die des Carboxylsäurepeaks verringert. Im IR-Spektrum ist zusätzlich die Gegenwart eines (C-O)-Peaks bei 1100 cm&supmin;¹ ersichtlich, die PEG anzeigt. Die Reduktion der Nitrilgruppe von PAN/PVC ergibt außerdem auch einen Anstieg eines Amidpeaks unbekannter Ursprungs. Nach dem Kuppeln mit dem PEG- Succinimid ist jedoch ein (C-O)-Peak bei 1100 cm&supmin;¹ vorhanden, und eine Verringerung des (N-H)-Peaks und eine Erhöhung des Amidpeaks sind ersichtlich. Durch Protonen-NMR wird die Reduktion von PAN/PVC und das Aufpropfen von PEG durch die chemischen Verschiebungen ersichtlich.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann zuerst ein Polymerharz selbst modifiziert werden, und dann aus dem modifizierten Harz unter Verwendung von auf diesem Gebiet bekannten Verfahren eine Membran ausgebildet werden, wie z. B. durch Methoden, beschrieben von H. Strathmann in Material Science of Synthetic Membranes, "Production of Microporous Media by Phase Inversion Processes", Seiten 165- 195; American Chemical Society (1985). Grundsätzlich wird das Harz unter Verwendung der gleichen Chemie, wie sie vorstehend für die PAO-Modifizierung der Oberfläche einer Polymermembran beschrieben wurde, modifiziert. Der hier verwendete Ausdruck "Harz" bezieht sich auf die Massenform eines Polymers und umfaßt Harze in Form von Pulvern, Flüssigkeiten oder Pellets.
Die Proteinadsorption umfaßt die Wechselwirkung von Proteinen in Lösung mit einer festen (unlöslichen) Oberfläche. Die Wechselwirkung kann entweder als Chemisorption (z. B. ionisch) oder Physiosorption (z. B. hydrophob) beschrieben werden. Die PAO-Modifizierung der Oberfläche verhindert die Proteinadsorption, die eine Oberflächenerscheinung ist. Obwohl die Oberfläche eines nicht-porösen Films gut definiert ist, ist es die einer Phaseninversionsmembran nicht. Für die letztere gilt, daß die Oberfläche, die dem Protein ausgesetzt wird, die Oberfläche der Poren umfaßt, die durch die Membran hindurchlaufen. Eine Modifizierung eines Polymerharzes vor der Membranausbildung ist ein Verfahren, das sogar eine noch größere Modifizierung der Zwischenräume der Poren ermöglichen kann als Verfahren, die die Oberflächenmodifikation der Membran betreffen.

Beispiele 1 bis 4: Bildung von Propfcopolymer-Membranen

Zur beispielhaften Veranschaulichung der Erfindung, aber ohne ihren Rahmen darauf zu beschränken, werden die folgenden Beispiele angegeben, die verschiedene Verfahren zeigen, die zum Anbringen von PAO an ein PAN/PVC-Copolymer brauchbar sind.

Beispiel 1

Reduktion von Polymer mit NaBH&sub4;

Copolymer (Schichten oder Röhren) wurden in einer 10%-igen wässerigen Lösung von NaBH&sub4; (0,7 g in 7 ml Wasser) während 48 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert, dann mit Wasser und 95% Ethanol gewaschen.

Beispiel 2

Kuppeln von SC-PEG mit reduziertem Polymer

Das reduzierte Copolymer wurde mit 7 ml Natriumphosphatpuffer, pH = 8,0, gerührt. SC-PEG 20000 (0,7 g) wurde zugefügt und das Rühren bei 40ºC 2 Stunden lang fortgesetzt. Das umgesetzte Polymer wurde dann mit Wasser und 95%-igem Ethanol gewaschen und bei 40ºC 48 Stunden lang in 95% Ethanol belassen. Die Probe wurde dann mit Wasser gewaschen. Ein ähnliches Experiment wurde mit SC- PEG 8000 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Umsetzung bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, und alle Waschungen mit Wasser.

Beispiel 3

Hydrolyse von Polymer mit HCl-NaOH

Das Copolymer wurde 48 Stunden in 10 ml konzentrierter HCl gerührt, dann mit Wasser gewaschen. Das Polymer wurde dann zu 10 ml 10 M NaOH-Lösung zugegeben und 48 Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und dann 10 Minuten lang mit 5% Oxalsäure behandelt, und dann wieder mit Wasser und 95%-igem Methanol gewaschen.

Beispiel 4

Kuppeln von MPEG-NH&sub2; (5000) an hydrolysiertes Polymer

M-PEG-NH&sub2; (0,7 g), N-(3-Dimethylaminopropyl)-ethylcarbodiimid (0,28 g) und hydrolysiertes Polymer wurden in Wasser (7 ml) gerührt. Der pH-Wert der Mischung wurde mit verdünnter HCl auf 4,5 eingestellt. Die Mischung wurde 5 Stunden lang auf 40ºC erwärmt, dann mit Wasser und 95% Ethanol gewaschen, und bei 40ºC 48 Stunden in 95% Ethanol belassen. Es wurde eine Endwaschung mit Wasser durchgeführt. Es wurde auch ein begleitendes Experiment ohne Ethanolwaschen durchgeführt.
Die in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Produkte wurden mittels ¹H NMR untersucht. Die NMR-Spektren wurden erhalten durch Lösen von 4 bis 5 mg der Polymerproben in 0,5 ml d&sub6;- Aceton. Die Spektren wurden mit einem 200 MHz-Bruker-Gerät erhalten. Alle Peaks waren relativ zu Aceton.
Das NMR-Spektrum für das Ausgangs-PAN/PVC-Copolymer ist in Fig. 3 angegeben. Festzustellen ist der H-C-C&sub1;-Peak bei 4,43 ppm (Peak A), H-C-CN-Peak bei 3,39 ppm (Peak B), Wasser bei 2,87 ppm, -CH&sub2;- bei 2,44 ppm und Aceton bei 2,06 ppm. Das
Verhältnis von Peak A zu Peak B beträgt 55/45, was anzeigt, daß das Polymer 55% Vinylchlorid und 45% Acrylnitril enthält.
Das Spektrum für das im Beispiel 1 hergestellte reduzierte Polymer ist in Fig. 4 dargestellt. Das A/B-Verhältnis erhöht sich auf 62/38 (wie für die Borhydrid-Reduktion der -CN- Gruppe und dem dadurch erfolgenden Abfall der Größe des H-C- CN-Peaks erwartet).
Das Spektrum für das an das reduzierte Polymer gekuppelte SC- PEG-8000, wie im Beispiel 2 hergestellt, ist in Fig. 5 dargestellt. Es zeigt klar den Einbau von PEG, das einen Peak bei 3,60 ppm besitzt. Die Addition aller Flächen und Abschnitte für die PEG-Fläche (120) zeigt 1,8% PEG.
Das Spektrum für das hydrolysierte Polymer, wie im Beispiel 3 dargestellt, wird in Fig. 6 gezeigt. Es zeigt ein A/B- Verhältnis, das dem des Ausgangsmaterials sehr ähnlich ist. Dies zeigt an, daß die neuen -CH-CO&sub2;- und -CH-CONH&sub2;-Peaks nahe dem -CH-CN-Peak sind.
Fig. 7 zeigt das Spektrum für das an M-PEG-NH&sub2; gekuppelte hydrolysierte Polymer, wie im Beispiel 4 hergestellt. Es liegt ein kleiner PEG-Peak bei 3,61 ppm vor. Dieses Spektrum zeigt, daß der hydrolytische Weg weniger wirksam ist, um PEG in PAN/PVC einzubauen, als der Weg über die Reduktion; die Hydrolysebedingungen könnten jedoch optimiert werden, um, wenn erwünscht, einen größeren Einbau von PEG zu liefern.

Beispiele 5-9: Messung der Proteinadsorption, Diffusion, und nMWCO

Beispiel 5

Schicht-Adsorptionsuntersuchung

Durch Lösen von 9,23 g FTA und 0,5 g Natriumazid in 1 l Wasser wurde eine FTA-Lösung hergestellt. Durch Lösen von 5 g B5A in 100 ml FTA-Lösung unter Rühren wurde eine 5%-ige BSA- Lösung hergestellt. Bei Raumtemperatur wurden 3 Schichten in 3 Kammern angeordnet, mit BSA-Lösungen auf einer Seite und FTA auf der anderen Seite. Die permselektive Schicht war gegen die FTA-Lösung gerichtet. Die Lösung auf der anderen Seite wurde durch UV-Absorption auf BSA untersucht. Wenn das BSA durch die Membran bis zu einem Gleichgewichtswert hindurchdiffundiert war, wurden die Schichten entfernt, und fünfmal mit FTA gewaschen, und durch den BCA-Test für Proteinadsorption untersucht. Die dem BCA-Test unterworfenen Schichten besaßen einen Durchmesser von 1 cm. Die Menge an adsorbiertem Protein wurde aus einer Eichkurve (ug/ml) bestimmt, und dann durch Dividieren durch die ungefähre Oberfläche der Schicht in ug/cm² überführt.

Beispiel 6

Faser-Adsorptionsuntersuchung

Drei 1 cm lange Fasern jedes Typs wurden in 5% BSA in Lochplatten mit 6 Vertiefungen eingetaucht und bei 37ºC 3 Tage lang inkubiert. Die Fasern wurden entfernt und während einer Stunde fünfmal mit FTA gewaschen, und dann dem BCA-Test auf Proteinadsorption unterworfen. Die Menge an adsorbiertem Protein wurde durch Vergleich mit einer Eichkurve für BSA (ug/ml) bestimmt, und dann durch Multiplizieren mit 0,1 ml und nachfolgendem Dividieren durch die ungefähre Oberfläche der Fasern (πdl) in ug/cm² überführt.

Beispiel 7

BCA-Test

Ein Standard-BCA-Testverfahren war das folgende. Eine Faser oder eine Schicht, die keiner Proteinlösung ausgesetzt war, wurde als Vergleich verwendet, und die Blindlösung bestand nur aus FTA. Drei Fasern oder Schichten wurden den BCA- Reagentien während 2 Stunden bei Raumtemperatur ausgesetzt, und dann die UV-Absorption an einem Mikrotiterplatten- Anzeigegerät unter Verwendung von Softmax-Hardware bestimmt.

Beispiel 8

Diffusionstest

Fasern einer Länge von 2,5 cm wurden glycerinisiert und dann mit 0,5 cm Tecoflex unter Verwendung von Polyurethan-Leim ausgerüstet. Die Fasern wurden dann durch Eintauchen in FTA während mindestens zwei Tagen deglycerinisiert. Die Fasern wurden rasch getrocknet und dann 40 ul von 3 mg/ml α- Chymotrypsinogen mit einer Pipette in das Lumen einer Faser eingeführt. Die Faser wurde durch Erhitzen des Tecoflex-Endes verschlossen und dann in FTA während ca. 2 Minuten gespült, bevor die Faser (vertikal) in 6 ml FTA in einem konischen 15 ml-Zentrifugenrohr eingeführt wurde. Die Diffusion wurde durch UV-Absorption bei 281 nm während 24 Stunden verfolgt.

Beispiel 9

Bestimmung des nominellen Molekulargewichtausschlusses (nMWCO)

Die nMWCOs von Fasern einer Länge von 2 cm wurden durch den MWCO-Test charakterisiert, um zu bestimmen, welche Molekülgrößen durch die Membranen hindurchgehen. Das Ausmaß, in dem ein Molekül mit bestimmtem Molekulargewicht eine Membran durchläuft, wird durch den Zurückweisungskoeffizient (rejection coefficient) R bestimmt, wobei R = 1 - cp/cr, worin cp die Konzentration in einer Lösung des Moleküls mit einem bestimmten Molekulargewicht, das eine Membran durchläuft, ist, und cr die Konzentration des Moleküls, das durch die Membran ausgeschlossen wird. Ein nMWCO einer Membran ist das Molekulargewicht eines Moleküls mit R ≥ 90%. MWCO wird unter konvektiven (mit Druck beaufschlagten) Bedingungen, 34473.8 ± 6894.76 N/m² (5+1 psig) und Raumtemperatur (18-28ºC) gemessen. Normalerweise werden 10 bis 20 Fasern gleichzeitig gemessen (Patronentest), es können aber auch einzelne Fasern gemessen werden, indem man eine einzige Faserspule (Spulentest) herstellt.
Die aus den Beispielen 5 bis 9 erhaltenen Daten sind in Tabelle I angegeben. Tabelle I
Aus Tabelle 1 ist es ersichtlich, daß das Aufpropfen von PEG- NH&sub2; auf PAN/PVC die Menge an adsorbiertem Protein im Vergleich zu nicht gepropftem PAN/PVC verringerte. Der Molekulargewicht-Ausschluß änderte sich jedoch nach einer Oberflächenbehandlungsreaktion mit PEO nicht nennenswert. Es ist wahrscheinlich, daß Polyethylenoxid-funktionalisiertes PAN/PVC die offensichtliche Diffusion erhöht, indem es die Menge an Protein, die während der Diffusion adsorbiert wird, verringert. Die Molekulargewicht-Ausschlußdaten zeigen, daß die Porenstruktur durch die beim Aufpropfen von Polyethylenoxid verwendete Chemie nicht nachteilig beeinträchtigt wird.

Beispiel 10: Insulin-passivierte Fasern

Die Fasern wurden wie in den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 hergestellt. Dann wurde nach dem Verfahren von Beispiel 8 gearbeitet, nach der Deglycerinisierung wurden die Fasern jedoch in einen Insulin-enthaltenden Puffer bei 37ºC während 16 Stunden eingetaucht. Die Ergebnisse des Diffusionstests sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben. Tabelle 1I
Typischerweise bewirkt die Insulinpassivierung einen Anstieg im Diffusionskoeffizienten (Dmc) von PAN/PVC. Die Insulin- Passivierung besitzt jedoch nur einen geringen Einfluß auf den Diffusionskoeffizienten von PEO-gepropften PAN/PVC. Unter der Voraussetzung, daß Insulin die PAN/PVC-Membran durch Adsorption passiviert, ist es wahrscheinlich, daß nür eine unbedeutende Menge an Insulin an PEO-PAN/PVC adsorbiert wird. PEO inhibiert deshalb die Proteinadsorption wirksam, und die Insulin-Passivierung beeinträchtigt den Diffusionskoeffizienten von PEO-PAN/PVC nicht.

Beispiel 11: Biokompatibilität von PEO-PAN/PVC

Die in vivo-Biokompatibilität von PEG-gepropftem PAN/PVC wurde beurteilt, indem man Fasern in das Hirn und subkutane Stellen von Lewis-Ratten (ca. 250 g) implantierte. Fasern mit und ohne PEG wurden implantiert. Die Fasern wurden durch Eintauchen in 70% Ethanol über Nacht und dann in steriles Hanks-Medium während 2 Tagen sterilisiert. Die Fasern besaßen eine Länge von ca. 6 mm und eine Breite von ca. 0,8 mm. Sie wurden dann als primäre Versiegelung wärmeversiegelt. Eine sekundäre Versiegelung wurde durchgeführt, indem man die wärmeversiegelten Enden in Polyacrylat-Leim eintauchte, der dann durch UV-Bestrahlung vernetzt wurde, wodurch eine zweite Versiegelung ausgebildet wurde. Die versiegelten Fasern wurden bei 37ºC in HL-1-Medium während 2 Tagen belassen und dann vor der Implantation zweimal in sterilem Hanks-Medium gespült. Die Fasern wurden einseitig in das Striatum des Gehirns der Ratten während 4 Wochen implantiert, und danach das Gehirn histologisch seziert.
Die Gesamt-Biokompatibilität wurde im Hinblick auf die Wechselwirkung der Fasern mit dem Hirngewebe bewertet. Die Fasern wurden, wie in Tabelle III angegeben, im Hinblick auf die Reaktion der implantierten Hohlfasernmembranen gegenüber
Makrophagen (MACs), Fremdkörper-Riesenzellen (FBGCs), polymorphonuklearen Leukocyten (PMNs), Eosinophilen (EOs), und reaktiven Astrocyten verglichen. Die p-Werte wurden relativ zu unmodifiziertem PAN/PVC unter Verwendung des Mann- Whitney-U-Tests berechnet, wobei die Signifikanz mit p ≤ 0,05 angenommen wird. Tabelle III
Auf der Basis der Reaktion reaktiver Zellen gegenüber der implantierten Hohlfasermembran im Zentralnervensystem und im Vergleich zu Sham-chirurgischen Kontrollen mit einer Punktbewertung von 1, zeigte PAN/PVC eine durchschnittliche Biokompatibilität mit einem Gesamtrating von 1,8 (n = 4), während PEO-gepropftes PAN/PVC (PAN/PVC-PEO-NH&sub2; (5k und 20k)) eine verbesserte Biokompatibilität mit einem Gesamtrating von 1,2 (n = 8) zeigte. Unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests bestand ein statistischer Unterschied (p-Werte) zwischen PAN/PVC und PEG-gepropftem PAN/PVC für die Reaktion von FBGCs, aber nicht für die von MACs (EOs oder PMNs). Das in vivo-Experiment zeigt, daß die Biokompatibilität im Vergleich zu PAN/PVC für PAN/PVC-PEO qualitativ höher ist. Die Reaktion von PMNs gegenüber den implantierten Fasern war annehmbar (d. h. 1), was anzeigt, daß alle Implantate steril waren und daß während des chirurgischen Eingriffs keine Kontamination erfolgte. Zusätzlich wurden an der Stelle des Implantats keine Eosinophile gefunden, was anzeigt, daß durch die Membran keine allergische Reaktion hervorgerufen wurde. Die Reaktion der immunoreaktiven GFAP-Astrocyten gegenüber den verschiedenen Fasertypen zeigten die gleichen Trends wie vorstehend beschrieben.

Beispiel 12: PEO-Modifikation von PAN/PVC-Harz

Ein PAN/PVC-Harz wird in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), n-Methylpyrrolidon (NMP) oder Aceton, gelöst. Das Harz wird dann mit Natriumborhydrid, das im gleichen Lösungsmittel gelöst ist, umgesetzt. Die Reaktion ergibt eine Modifizierung des PAN/PVC-Harzes durch Reduktion der Nitrilgruppen zu einer Aminogruppe. Das reduzierte PAN/PVC-NH&sub2; wird dann wiederholt in Wasser ausgefällt, im Vakuum getrocknet und charakterisiert.
Methoxy-terminiertes Poly(ethylenoxid)succinimidylcarbonat (PEO-SC - entweder 5000 g/mol oder 20000 g/mol) wird, wie das PAN/PVC-NH&sub2;, in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Das PEO-SC und PAN/PVC-NH&sub2; werden zusammen umgesetzt, um bis zu ca. 2,0% der -NH&sub2;-Gruppen weiter zu modifizieren, was zur Bildung von PAN/PVC-PEO führt. Eine größere Modifikation als eine 2,0%-Modifikation kann die Eigenschaften der Membranformulierung des PAN/PVC-Harzes ändern. Das derivatisierte Polymer wird wiederholt in Wasser ausgefällt, getrocknet und dann charakterisiert. Das modifizierte PAN/PVC, PAN/PVC-NH&sub2; und PAN/PVC-PEO werden durch mindestens drei der folgenden Methoden charakterisiert: ¹HNMR, Fluorescamin-Titration, Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, und FTIR.
Die Parameter, die zur Polymermodifikation von Bedeutung sind, sind das Molekulargewicht des Polymers und das Verhältnis der Monomerarten im Polymer. Das Molekulargewicht des Polymers kann nach einer Anzahl von für einen Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannten Verfahren bestimmt werden, einschließlich der Gelpermeationschromatographie, Lichtstreuung, und Viskosität einer verdünnten Lösung. Das Verhältnis der Monomerarten im Copolymer kann durch Elementaranalyse bestimmt werden, wenn die Monomere verschiedene Elemente aufweisen (z. B. weist PAN/PVC Stickstoff und Chlor auf, was jedes Monomer unterscheidet), oder durch protonenkernmagnetisches Resonanz (¹H NMR).
Der Anteil der in den vorstehend beschriebenen Umsetzungen verwendeten Reagentien hängt von dem Prozentsatz der Überführung ab. Das nachstehend beschriebene Beispiel geht von einer 100%-igen Überführung von PAN/PVC zu PAN/PVC-NH&sub2; und von PAN/PVC-NH&sub2; zu PAN/PVC-PEO aus. Unter der Annahme, daß das Molekulargewicht von PAN/PVC ca. 140000 g/mol beträgt, und das PAN/PVC ca. 45% Acrylnitril (53 g/mol) und 55% Vinylchlorid (62 g/mol) aufweist, sind ca. 63000 g/mol Acrylnitril oder 1188 sich wiederholende Acrylnitrileinheiten und 77000 g/mol Vinylchlorid oder 1242 sich wiederholende Vinylchlorideinheiten Vorhanden. Für eine 2,0%-ige Modifikation mit PEO werden 4,4% oder 53 sich wiederholende Einheiten von Acrylnitrilgruppen modifiziert. Unter der Annahme, daß der Prozentsatz der Umwandlung von Nitril zu Amin 100% beträgt, und der von Amin zu Succinimid 100%, kann das Verhältnis von Natriumborhydrid zu PAN/PVC und das von PEO/SC zu PAN/PVC-NH&sub2; auf molarer Basis bestimmt werden. Unter der Annahme, daß der gewünschte Prozentsatz an Umwandlung 2,0% beträgt, sind 2809 g/mol PAN/PVC erforderlich. D. h. wenn 200 g (0,071 mol) PAN/PVC modifiziert werden sollen, müssen 0,071 mol (2,71 g) Natriumborhydrid damit umgesetzt werden. Ähnlich ist für 200 g (~ 0,071 mol) PAN/PVC-NH&sub2; eine gleiche molare Menge an PEO-SC erforderlich. Für eine 0,5%-ige Modifikation werden 1,1% der Nitrilgruppen modifiziert. Dies trifft für PEO 5000 und PEO 20000 zu. Wenn der Prozentsatz an Überführung von PAN/PVC zu PAN/PVC-NH&sub2; oder PAN/PVC-NH&sub2; zu PAN/PVC-PEO nicht 100% beträgt, dann müssen die vorstehend angegebenen Molverhältnisse entsprechend modifiziert werden.

Claims

1. Propfpolymer, ausgebildet durch Überführen eines Teiles der -C=N (Cyan)-Gruppen eines Polymergerüstes, das die Einheiten

enthält, worin ein Teil der -C=N (Cyan)-Gruppen in intermedläre reaktive Stellen durch Hydrolyse oder Reduktion der Cyangruppen überführt wurden, und Aufpropfen von Polyalkylenoxidpolymerketten an das Polymergerüst über die reaktiven Stellen unter Bildung einer Amidbindung.

2. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein Polyacrylnitril-Homopolymer ist.

3. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein Copolymer aus Acrylnitril und einem Monomer umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acrylsäure, Butadien-Styrol, Butadien, Vinylacetat, Vinylpyridin, Butadien-co-acrylsäure, Maleinsäureanhydrid und Mischungen davon.

4. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das POlymergerüst ein Copolymer aus Acrylnitril und Vinylchlorid umfaßt.

5. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Stellen durch Hydrolyse der Cyangruppen gebildet werden.

6. Propfpolymer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Stellen -CO&sub2;H-Gruppen umfassen, die mit einer Amin-Endgruppe an Vorläufer- Polyalkylenoxidpolymerketten unter Bildung des Pfropfpolymers reagieren.

7. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Stellen durch Reduktion der Cyangruppen gebildet werden.

8. Propfpolymer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Stellen -CH&sub2;NH&sub2;-Gruppen umfassen, die an die Polyalkylenoxidpolymerkette durch Reaktion über eine auf ihr enthaltene endständige reaktive Gruppe binden.

9. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyalkylenoxid Polyethylenoxid umfaßt.

10. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein polymeres Harz ist, und das Propfpolymer ein polymeres Harz ist.

11. Propfpolymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst in Form einer permselektiven Membran vorliegt, und das Propfpolymer in Form einer permselektiven Propfpolymer-Membran vorliegt.

12. Hohlfaser oder flache bahnförmige Umhüllung, die unter Verwendung einer aus einem Propfpolymer nach Anspruch 1 gebildeten permselektiven Propfpolymer-Membran ausgebildet ist.

13. Hohlfaser oder flache bahnförmige Umhüllung nach Anspruch 12, die außerdem lebende Zellen enthält.

14. Verfahren zur Ausbildung eines Propfpolymers aus einem Polymergerüst, das ausgebildet ist durch Überführen eines Teiles der -C=N (Cyan)-Gruppen eines Polymergerüsts, das

Einheiten enthält, in intermediäre reaktive Stellen, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Überführen eines Teiles der -C=N (Cyan)-Gruppen in intermediäre reaktive Stellen durch Hydrolyse oder Reduktion der Cyangruppen, und

(b) Aufpropfen von Polyalkylenoxidpolymerketten an das Polymergerüst über die reaktiven Stellen unter Bildung einer Amidbindung.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein Polyacrylnitrilhomopolymer ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein Copolymer aus Acrylnitril und einem Monomer umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acrylsäure, Butadien-Styrol, Butadien, Vinylacetat, Vinylpyridin, Butadien-co-acrylsäure, Maleinsäureanhydrid und Mischungen davon.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein Copolymer aus Acrylnitril und Vinylchlorid umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe (a) das Hydrolysieren der Cyangruppen zu den reaktiven Stellen umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrolysierten reaktiven Stellen -CO&sub2;H-Gruppen umfassen und Stufe (b) durchgeführt wird durch Umsetzen von -CO&sub2;H mit einer endständigen Aminogruppe an einer Vorläufer Polyalkylenoxidpolymerkette.

20. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Stellen durch Reduktion der Cyangruppen gebildet werden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die reduzierte reaktive Stelle -CH&sub2;NH&sub2; ist.

22. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst ein polymeres Harz und das Propfpolymer ein polymeres Harz ist.

23. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymergerüst in Form einer permselektiven Membran vorliegt und das Propfpolymer in Form einer permselektiven Propfpolymer-Membran vorliegt.