DE69728862T2

DE69728862T2 - Antivirales ausgangsmaterial

Info

Publication number: DE69728862T2
Application number: DE69728862T
Authority: DE
Inventors: Mitsuru Kagoshima-shi AKASHI; Masanori Kagoshima-shi BABA; Makoto Ashigarakami-gun ONISHI
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-08-08
Filing date: 1997-07-18
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2017-07-19
Also published as: DE69728862D1; WO1998006266A1; EP0883993A1; JPH1045601A; EP0883993B1; EP0883993A4; US5945514A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ausgangsmaterial, das einen Virus einfängt oder inaktiviert, wodurch es eine antivirale Aktivität besitzt.
Hintergrund der Erfindung
Die EP-A 0 295 073, EP-A 0 264 984 und WO 90/09832 beschreiben chromatographische Materialien, die Lektine aufweisen, die an ein hydrophobes Basismaterial gebunden sind. Die US 5 284 934 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Kohlehydrat-bindenden Lektin-Derivats. Keine dieser Schriften beschreibt die Verwendung feiner Teilchen, die erhältlich sind durch Binden von Lektin vom Mannose-bindenden Typ an ein Basismaterial aus einer hydrophoben hochmolekularen Kette über eine hydrophile hochmolekulare Kette zur Herstellung eines antiviralen Ausgangsmaterials.
Neuerdings wurden verschiedene Erkrankungen, die einem Virus zuzuordnen sind, ein ernsthaftes soziales Problem. Es ist z. B. bekannt, dass Krankheiten, wie AIDS, virale Hepatitis Typ B, virale Hepatitis Typ C und Erwachsenen-T-Zellen-Leukämie, durch HIV, HBV, HCV bzw. HTLV-I verursacht werden. Außerdem stellt das Auftreten neuer viraler Erkrankungen, wie z. B. Ebola-hämorrhagisches Fieber und Marburg-Krankheit, hervorgerufen vom Filovirus, und hämorrhagisches Fieber mit Nierensyndrom, hervorgerufen durch den Hantaan-Virus, eine große Gefahr für die Menschen dar.
Als eine der wichtigen Gegenmaßnahmen zur Verhütung von einem Virus zuzuschreibenden Krankheiten ist eine Vorbeugung gegenüber Infektion. Auf verschiedenen Gebieten, die von den Produktionsstellen von Blut-Derivaten oder Impfstoffen, Spitälern und biologischen Forschungsinstituten bis in unser tägliches Leben reichen, sind Gegenmaßnahmen gegen eine Infektion mit einem Virus gefordert. Als Methode zur Entfernung oder Inaktivierung eines Virus ist die Hitzebehandlungs-Methode allgemein bekannt, aber es ist in einigen Fällen schwierig, eine Hitzebehandlung durchzuführen, z. B. wenn eine biologische Komponente, die durch die Hitzebehandlung entartet oder deaktiviert wird, enthalten ist, oder wenn das zu behandelnde Objekt selbst ein Organismus ist.
Bekannte Beispiele für Methoden ohne Hitzebehandlung umfassen:

(1) eine Methode zur Inaktivierung eines Virus unter Verwendung eines Virus-inaktivierenden Mittels;
(2) eine Methode, um einen Virus an einem Material zu adsorbieren, das eine Zielzelle für den Virus aufweist oder einen dafür immobilisierten Rezeptor, wodurch der Virus entfernt wird (US-Patent Nr. 4 869 826); und
(3) eine Methode zum Einfangen eines Virus in Wasser unter Verwendung von Polyvinylpyridinium-Perlen, die durch Vernetzung unlöslich gemacht wurden (japanische Patentveröffentlichung Nr. SHO 62-41641).

Die vorstehend beschriebene Methode (1) weist jedoch Probleme im Hinblick auf die Sicherheit einer für die Inaktivierung eines Virus verwendeten Chemikalie auf, die Trennung der Chemikalie von der den inaktivierten Virus enthaltenden Behandlungslösung und die Degeneration wertvoller Proteine in der Behandlungslösung. Als Methode zur Inaktivierung eines Virus unter Verwendung einer Chemikalie wurde bereits eine Inaktivierungsmethode mit einem oberflächenaktiven Mittel, Aldehyd oder β-Propiolacton beschrieben. Es ist jedoch bekannt, dass die Inaktivierungsmethode eines Virus unter Verwendung einer solchen Chemikalie die physiologische Aktivität einer Protein-Komponente degeneriert oder beeinträchtigt. Gemäß dem Bericht, verbleibt β-Propiolacton in der Behandlungslösung sogar nach Inaktivierung eines Virus in der Behandlungslösung und zeigt Karzinogenizität, weshalb sie noch nicht weit verbreitet verwendet wurde. Außerdem wird eine Methode zur Entfernung eines Virus durch Behandlung des Virus mit einem lipolöslichen Virus-inaktivierenden Agens und nachfolgende Verteilung des Virus-inaktivierenden Agens in einem natürlichen Öl oder synthetischen Triglycerid geringer Toxizität vorgeschlagen (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. SHO 62-240623). Diese Methode ist jedoch mit dem Nachteil behaftet, dass sie einen mühsamen und zeitaufwendigen Vorgang darstellt.
Die vorstehend beschriebene Methode (2) ist vom Standpunkt der Einstellung eines Materials, der Stabilität (Aufrechterhaltung der Aktivität) und der Wirtschaftlichkeit nicht zufriedenstellend, weil eine Zelle selbst oder ihr Rezeptor als Material verwendet wird. Zusätzlich ist sie mit dem Nachteil behaftet, dass sie aufgrund der hohen Spezifizität gegenüber einem Ziel-Virus nicht auf viele nicht-spezifische Viren angewendet werden kann.
Durch die vorstehend beschriebene Methode (3), die eine Polyvinylpyridinium-Struktur verwendet, kann ein Virus eingefangen und aus Leitungswasser oder dergleichen mit einem geringen Proteingehalt entfernt werden. Aus dem Plasma oder einer Zellkulturlösung, die Proteine und Lipide in hoher Konzentration enthalten, kann andererseits ein Virus nicht wirksam entfernt werden, weil hauptsächlich eine nicht-spezifische Adsorption von Protein-Komponenten und Lipiden auftritt.
Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein antivirales Ausgangsmaterial bereitzustellen, das die vorstehend beschriebenen Probleme überwindet. Insbesondere ist es eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung, ein Virus-Infektions- Prophylaktikum bereitzustellen, das für den Zweck einer Verhütung der Infektion durch ein Virus vorher dem Schleimgewebe verabreicht wird, wodurch das Eindringen eines Virus inhibiert wird; oder ein Viruzid, das sicher und leicht einen in einer Lösung oder der Luft vorhandenen Virus entfernen oder inaktivieren kann.
Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Im Hinblick darauf, ein antivirales Ausgangsmaterial zu erfinden, das die vorstehend beschriebenen Probleme überwindet, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung ausgedehnte Untersuchungen unternommen oder durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass ein Ausgangsmaterial, das eine hervorragende Formstabilität und Festigkeit aufweist und die antivirale Aktivität von Lektin wirksam zeigt, erhalten werden kann durch Binden eines Lektins vom Mannose-Bindungstyp an ein hydrophobes Basismaterial über eine hydrophile hochmolekulare Kette, was zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führte.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete antivirale Ausgangsmaterial besitzt das Merkmal, dass eine hydrophile hochmolekulare Kette, an die Lektin vom Mannose-Bindungstyp gebunden ist, an ein Basismaterial gebunden ist, das aus einer hydrophoben hochmolekularen Kette besteht. Beispiele für die bevorzugte Form des antiviralen Ausgangsmaterials umfassen feine Teilchen.
Der Ausdruck "Lektin" bedeutet einen Sammelnamen für Proteine vom Zucker-bindenden Typ, und es ist bekannt, Aktivitäten, wie z. B. die Agglutination von Zellen, die Induktion einer Teilung, eine funktionelle Aktivierung, funktionelle Unterdrückung und einen cytopathischen Effekt durch Binden an eine Zuckerkette eines konjugierten Polysaccharids einer Zellmembran zu zeigen.
Im Hinblick auf das in der vorliegenden Erfindung verwendete Lektin vom Mannose-Bindungstyp besteht keine besondere Beschränkung, soweit es sich um ein Lektin handelt, das einen Mannosyl-Rest in einem Polysaccharid oder konjugierten Polysaccharid erkennen kann. Beispiele für ein Lektin, das dazu fähig ist, einen α-Mannosyl-Rest zu erkennen, der eine Zucker-Komponente des Basiskerns einer Asparagin-bindenden Zuckerkette, die Conavalia ensiformis (Concanavalin A; Con A), Lens culinaris (LCA), Bowringia midbraedii (BMA), Dolichos lablab (DLA), Galanthus nivalis (GNA), Gerardiasavaglia (GSL), Machaerium biovulatum (MBA), Machaeriumu lunatus (MLA), Narcissus pseudonarcissus (NPA)I, Epipactis heleborin (EHA) und Listera ovata (LOA) enthält. Unter den vorstehend beschriebenen Lektinen vom Mannose-Bindungstyp ist Con A vom Standpunkt der Funktion und Wirtschaftlichkeit besonders geeignet.
In der vorliegenden Erfindung ist das Lektin vom Mannose-Bindungstyp so ausgestaltet, dass es seine Funktion zeigt, indem es an der hohen Mannose-Region eines Membran-Glykoproteins an der Oberflächenschicht eines Virus wirkt. Es ist erwünscht, das Ausgangsmaterial gemäß dem Verwendungszweck oder der Applikation festzulegen, weil der Grad der antiviralen Aktivität mit der Art des Lektins oder des Virus differiert.
Als Gesamtstruktur des Basismaterials, das erfindungsgemäß mit einem Lektin vom Mannose-Bindungstyp gebunden wird, ist es zweckmäßig, dass eine hydrophile hochmolekulare Kette und eine hydrophobe hochmolekulare Kette als Block- oder Pfropfcopolymer ausgebildet sind, und insbesondere die hydrophile hochmolekulare Kette als Pfropfpolymerkette der hydrophoben hochmolekularen Kette vorhanden ist. Die Verwendung der hydrophoben hochmolekularen Kette als Basismaterial macht es möglich, ein antivirales Ausgangsmaterial bereitzustellen, das eine verbesserte Festigkeit und Größenstabilität in Wasser besitzt sowie ein hervorragendes Verhalten und Funktionsfähigkeit. Zusätzlich bedeckt die hydrophile hochmolekulare Kette, die als Pfropfpolymerkette verwendet wird, den Oberflächenschicht-Teil des Basismaterials aus der hydrophoben hochmolekularen Kette, unterdrückt die Adsorption nicht-spezifischer Proteine aufgrund einer hydrophoben Wechselwirkung in einem wässerigen Lösungsmittel, wodurch eine Umgebung geschaffen wird, die die leichte Durchführbarkeit einer selektiven Adsorption von Lektin erlaubt. Im Falle, bei dem das Basismaterial die Form feiner Teilchen annimmt, ermöglicht die hydrophile hochmolekulare Kette, die an der Oberfläche vorhanden ist, eine gleichmäßige Dispersion im wässerigen Lösungsmittel. Im Hinblick auf die Struktur der in der vorliegenden Erfindung verwendeten hydrophoben hochmolekularen Kette besteht keine besondere Beschränkung. Es ist jedoch bevorzugt, dass die hydrophobe hochmolekulare Kette aus einem wasserunlöslichen hochmolekularen Molekül besteht, das ein Wasser-Absorptionsverhältnis von weniger als 2% aufweist, weil die Wasser-Absorptionsverhältnisse, die nicht weniger als 2% betragen, die Festigkeit oder Größenstabilität des Materials in Wasser verschlechtern oder die Teilchengröße der feinen Teilchen verringern, wodurch die Oberfläche vergrößert wird, und es schwierig wird, die Menge an festzuhaltendem Lektin zu erhöhen.
Die hydrophobe hochmolekulare Kette ist ausgewählt aus Acrylatestern, Methacrylatestern, Polymeren oder Copolymeren von Styrol oder seinen Derivaten, Polyolefinen, Polysulfonen, Polyamiden, Polyestern, Polyurethanen und Polyimiden. Copolymere einer solchen hydrophoben hochmolekularen Kette können ebenfalls verwendet werden.
Im Hinblick auf die Struktur der in der vorliegenden Erfindung verwendeten hydrophilen hochmolekularen Kette besteht keine besondere Beschränkung. Ein Polymer, das löslich ist oder ein Absorptionsverhältnis von nicht weniger als 2% in einer wässerigen Lösung aufweist, und eine wiederkehrende aus Monomeren gebildete Struktur aufweist, ist jedoch bevorzugt, weil eine nicht-spezifische Adsorption aufgrund einer hydrophoben Wechselwirkung oder Agglutination zwischen feinen Teilchen dazu tendiert, Wasser-Absorptionsverhältnisse von weniger als 2% zu besitzen.
Als hydrophile hochmolekulare Kette werden Polymere oder Copolymere verwendet, von denen jedes als Komponente Acrylamid oder Methacrylamid oder ein Derivat enthält; ein Monomer, wie z. B. Acrylsäure oder Methacrylsäure, das in seinem Molekül eine Carboxylgruppe aufweist; ein Monomer, wie z. B. Vinylschwefelsäure oder Styrolsulfonsäure, die in ihrem Molekül eine Schwefelsäuregruppe aufweisen; ein Monomer, wie z. B. Vinylamin oder Allylamin, die in ihrem Molekül ein Amin aufweisen; N-Vinylacetamid oder ein N-Vinylalkylamid; Vinylpyrrolidon oder Vinylpyrrolidinon; ein Vinylether, ein hydrophiles Monomer mit einer Aminosäure oder einem Zucker in seinem Molekül; eine Aziridinverbindung, ein Monomer mit einem Phospholipid in seinem Molekül; oder ein Acrylatester oder Methacrylatester, das einem hydrophilen hochmolekularen Molekül entspricht. Irgendeine andere von Polyetherverbindungen, Polysacchariden, Polyamiden, Polyestern und Polyurethanen kann ebenfalls verwendet werden, sofern sie ein Wasser-Absorptionsverhältnis von nicht weniger als 2% besitzt.
Bevorzugte Beispiele der hydrophilen hochmolekularen Kette umfassen wasserlösliche hochmolekulare Ketten, wie z. B. Acrylamid, Derivate davon und N-Vinylacetamide, die die nichtspezifische Adsorption von Proteinen unterdrücken können.
Hochmolekulare Ketten, wie z. B. quaternäre Ammoniumsalze, mit einer stark basischen Ionen-Austauschgruppe; und hydrophobe hochmolekulare Moleküle, wie z. B. Polypropylen und Polyethylen, sind nicht bevorzugt, weil sie die nicht-spezifische Protein-Adsorption erhöhen, wodurch sie die Lektin-induzierte antivirale Wirkung vergrößern.
Beispiele für die erfindungsgemäß verwendbare Methode zur Bindung eines Lektins vom Mannose-Bindungstyp an ein hydrophiles hochmolekulares Molekül umfassen zuerst als kovalente Bindungsmethode die Cyanogenbromid-Aktivierungsmethode über ein Imidocarbonat-Derivat, die Kondensationsreagensmethode unter Verwendung eines Carbodiimid-Reagenz oder Woodward-Reagens, eine Diazo-Methode über eine Diazoniumverbindung, einer Säureazid-Derivatmethode, eine halogenierte Acetyl-Derivatmethode, eine Triazinyl-Derivatmethode, eine halogenierte Methacryl(acryl)säure-Derivatmethode und eine Vernetzungsmethode unter Verwendung eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels, wie z. B. Glutaraldehyd oder eine beidseitig terminierte Epoxyverbindung.
Eine solche Bindungsmethode wird verwendet, weil angenommen wird, dass Lektin eine funktionelle Gruppe, wie z. B. Carboxyl, Amino, Hydroxy, Imidazol oder Phenol, aufweist, wodurch eine funktionelle Gruppe, wie z. B. ein Diazoniumsalz, Säureazid, Isocyanat, halogeniertes Alkyl, Epoxy oder Aldehyd, das mit der vorstehenden funktionellen Gruppe reagiert, in eine hydrophile hochmolekulare Kette eingeführt werden kann, oder mit Lektin unter geeigneten Bedingungen umgesetzt werden kann, indem man ein Vernetzungsmittel oder Kondensationsmittel verwendet.
Um eine funktionelle Gruppe in eine hydrophile hochmolekulare Kette einzuführen, kann die Copolymerisation eines Monomers mit dieser funktionellen Gruppe, Überführung eines Monomers mit einer anderen funktionellen Gruppe oder dergleichen verwendet werden.
Als von der kovalenten Bindungsmethode verschiedene Methode wird eine Ionen-Austauschgruppe oder Lektin-Bindungsstelle in eine hydrophile hochmolekulare Kette eingeführt, wodurch man eine nicht-kovalente Bindungsimmobilisierung durchführt, indem man von der elektrostatischen Wechselwirkung oder spezifischen Affinität Gebrauch macht.
Wenn ein Depot-Effekt von Lektin nicht erstrebt wird, ist die Immobilisierung durch die kovalente Bindungsmethode bevorzugt.
Als nächstes wird eine Beschreibung von der verwendeten Form des antiviralen Ausgangsmaterials gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht.
Das erfindungsgemäße antivirale Ausgangsmaterial liegt vorzugsweise in Form von feinen Teilchen vor, weil verschiedene Typen von Zubereitungen oder Materialien mit antiviralen Wirkungen unter Verwendung eines solchen Ausgangsmaterials ausgebildet werden können. Durch Dispergieren eines feinteiligen antiviralen Ausgangsmaterials in einer Flüssigkeit wird es z. B. möglich, eine Vielzahl von Zubereitungen auszubilden, die nicht nur eine Aerosolzubereitung umfassen, die durch Sprühen auf eine Membrangewebe verwendet wird, das ein Infektionsweg ist, um einer Infektion mit einem Virus vorzubeugen, sondern auch eine halbfeste Zubereitung, wie z. B. eine Salbe oder Creme, und eine feste Zubereitung. Zusätzlich kann ein antivirales Ausgangsmaterial in Form von feinen Teilchen verwendet werden, indem es in eine Säule gefüllt wird, oder indem es mit einem Press-Form-Ausgangsmaterial oder einem Oberflächenbehandlungsmittel gemischt wird.
Beispiele der Methode zum Erhalt des feinen teilchenförmigen Materials umfassen eine Methode, die von einer mechanischen Pulverisierung oder einem Abrieb Gebrauch macht, eine Methode des Ausfällens von feinen Teilchen während der Synthese-Stufe der hochmolekularen Moleküle und eine Methode des Formens feiner Teilchen durch Insolubilisierung oder Kühlung und Verfestigung des Materials in der Form einer Lösung oder im geschmolzenen Zustand.
Beispiele des Verfahrens zur Herstellung von feinen Teilchen aus einer hydrophilen hochmolekularen Kette zur Bindung von Lektin und einer hydrophoben hochmolekularen Kette, die eine Hauptkomponente des Basismaterial ist, umfassen:

(1) ein Verfahren zum Formen von antiviralen feinen Teilchen durch Formen feiner Teilchen einer hydrophoben hochmolekularen Kette als Basismaterial und dann Binden oder Aufpfrop fen einer hydrophilen hochmolekularen Kette an die Oberfläche des resultierenden Basismaterials;
(2) ein Verfahren zum Formen von antiviralen feinen Teilchen durch Herstellen hydrophober feiner Teilchen unter Verwendung eines Monomers oder Makromonomers mit einer funktionellen Gruppe, die durch Hydrolyse oder dergleichen von einer hydrophoben Gruppe in eine hydrophile Gruppe überführbar ist; und dann Überführen der hydrophoben feinen Teilchen in eine hydrophile hochmolekulare Kette unter Verwendung einer Hydrolyse oder dergleichen; und
(3) ein Verfahren zum Formen von antiviralen feinen Teilchen unter Verwendung hydrophiler und hydrophober Ausgangsmaterialien in Kombination, z. B. unter Verwendung eines hydrophilen Makromonomers und eines hydrophoben Monomers oder eines hydrophoben Makromonomers und eines hydrophilen Monomers in Kombination.

Unter den oben beispielhaft beschriebenen Methoden ist eine Methode zur Ausbildung antiviraler feiner Teilchen während der Synthese-Stufe eines hochmolekularen Moleküls vom Standpunkt der Gleichmäßigkeit der feinen Teilchen und der Leichtigkeit der Herstellung bevorzugt.
Wenn z. B. ein hydrophiles Makromonomer einer Dispersionscopolymerisation mit einem hydrophoben Monomer, z. B. Styrol oder Butylmethylmethacrylat, in Wasser, Ethanol oder einem gemischten Lösungsmittel aus Ethanol und Wasser unterworfen wird, können hochmolekulare Mikrokugeln, die als Mikrokugeln oder Nanokugeln bezeichnet werden und eine relativ gleichmäßige Teilchengröße und gute Dispergierbarkeit in Wasser aufweisen, synthetisiert werden (Mitsuru Akashi "Water-soluble Macromonomer", High-molecular Processing, 37, 120–125). Die Verwendung dieser Methode macht es möglich, leicht und gleichmäßig feine Teilchen herzustellen, die ein hydrophobes hochmolekulares Molekül als Kern und eine Oberfläche aufweisen, die mit einer hydrophilen hochmolekularen Kette bedeckt ist. Die nach dieser Methode erhältlichen feinen Teilchen weisen eine hervorragende Festigkeit und Stabilität auf (die Größenveränderung aufgrund eines Quellens ist klein), weshalb sie als Basismaterial (Träger) zur Immobilisierung von Lektin geeignet sind.
Der Ausdruck "Makromonomer" bedeutet ein Polymer mit einer Funktion als polymerisierbares Monomer. Das Makromonomer wird durch Synthese eines Hauptkettenpolymers und Einführung einer polymerisierbaren funktionellen Gruppe ausgebildet. Beispiele der Methode umfassen eine Methode, die von der Kettenübertragungsreaktion in einer anionischen lebenden Polymerisation (Terminierungsmethode, Initiierungsmethode), von einer kationischen Polymerisation (lebende kationische Ringöffnungs-Polymerisation, kationische Vinylpolymerisation, kationische Polymerisation unter Verwendung eines Initiators) oder einer radikalischen Polymerisation Gebrauch macht; und eine Methode der Einführung einer polymerisier baren funktionellen Gruppe zu einer funktionellen Gruppe am Ende des Hauptkettenpolymers, indem man Chlormethylstyrol, Glycidylmethacrylat, Methacryloylisocyanat, Methacrolein, Methacrylsäurechlorid oder dergleichen verwendet (Ryuzo Asami "Synthesis and Polymerizsation of Macromer", Hich-molecular Processing, 33, 439–445).
Die bevorzugte feine Teilchengröße des antiviralen Ausgangsmaterials gemäß der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich von 100 nm bis 1 mm. Die Teilchengröße muss verringert werden, um die Oberfläche der feinen Teilchen pro Volumeneinheit zu vergrößern. Wenn die Teilchengröße nicht größer als 100 nm ist, erreicht sie die Größe eines Virus, was ihre Wirkungen bei der Trennung oder Inaktivierung verringert. Auf der anderen Seite erniedrigen Teilchengröße, die 1 mm übersteigen, die Adsorptionsrate und Effizienz, wodurch die praktische Verwendbarkeit beeinträchtigt wird.
Die vorliegende Erfindung lässt sich bei jedem Virus anwenden, für den Lektin vom Mannose-Bindungstyp inaktivierende Wirkungen zeigt, und als einer der brauchbarsten und wichtigsten Ziel-Viren existiert ein kausaler Virus (HIV) von AIDS, der neuerdings zum sozialen Problem wurde. Lektin vom Mannose-Bindungstyp, wie z. B. Con A, wird an eine Zuckerkette von gp120 gebunden, die ein Hüllen-Glykoprotein von HIV ist, und Anti-HIV-aktivität zeigt. Es wird deshalb erwartet, dass das Lektin Wirkungen zeigt zur Entfernung von infektiösen HIV-Teilchen aus einer behandelten Lösung oder einer Körperflüssigkeit und eine Infektionsvorbeugung; oder zur Entfernung von gp120, das als Substanz betrachtet wird, die eine Krankheit im Organismus verursacht, oder eines Antigen-Antikörper-Komplexes davon.
Das erfindungsgemäße antivirale Ausgangsmaterial kann für alles, was eine antivirale Aktivität erfordert, verwendet werden.
Beispiele für das Material, für das das antivirale Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, umfassen Pharmazeutika oder verschiedene Produkte (verschiedene Produkte für eine medizinische Verwendung, zur Pflege oder für die tägliche Verwendung), die zur Vorbeugung einer sekundären Infektion aus einem Virusträger verwendet werden; Ausgangsmaterialien oder Additive für medizinische Mittel oder klinische Untersuchungsartikel, die an einem medizinischen Standort oder klinischen Prüfungsort verwendet werden, wo eine virale Infektion vermutlich auftritt; Behandlungsapparate zur Verringerung der Virus-Belastung infizierter Patienten; und Virus-Konzentrationsapparate, die in einer Prüfung oder einem Test verwendet werden.
Spezifische Beispiele umfassen ein antivirales Mittel für die vorhergehende Verabreichung an einen Weg, der mit einem Virus infiziert wird, um der viralen Infektion vorzubeugen; ein antivirales Medikament zur Inaktivierung eines Virus oder eine biologische Probe, die für eine klinische Prüfung oder dergleichen verwendet wird, oder einen medizinischen Behälter mit einem darin enthaltenen Medikament; eine Salbe oder Creme, die auf die Haut oder derglei chen appliziert wird, um der viralen Infektion vorzubeugen, und ein medizinisches Gerät zur Inaktivierung von HIV oder Entfernung von gp120 aus dem Körper des Patienten, der mit HIV infiziert ist, um die Virusbelastung zu verringern.
Es ist insbesondere notwendig, eine billige und zweckmäßige Prophylaxe für AIDS bereitzustellen, um die Expansion dieser Infektion zu inhibieren. Die Infektion mit HIV aufgrund eines Geschlechtsverkehrs oder dergleichen kann verhindert werden, indem man das antivirale Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung zu einem Spray, einer festen Zubereitung, einer halbfesten Zubereitung oder dergleichen überführt und dann in den Infektionsweg, wie z. B. die Vagina, einführt.
Das erfindungsgemäße antivirale Ausgangsmaterial ist deshalb ein Ausgangsmaterial zur Verringerung des Risikos einer viralen Infektion (die der viralen Infektion vorbeugt) oder zur Verbesserung des krankhaften Zustands, der einem Virus zuzuschreiben ist, indem man alle oder einige Viruspartikel adsorbiert oder inaktiviert. Es kann nicht nur als feine Teilchen zum Einfangen oder zur Inaktivierung eines Virus verwendet werden, sondern auch als Additiv, um einem Form- oder Guss-Ausgangsmaterial oder einem Oberflächenbehandlungsmittel antivirale Aktivität zu verleihen, als prophylaktisches Mittel gegen die Infektion eines Organismus (Mensch, Pflanzen, Tiere, Fische und Schalentiere), als Additiv für ein medizinisches Instrument oder ein Behandlungselement oder eine selbstständige Komponente.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun näher durch Beispiele beschrieben. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf oder durch die folgenden Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1 und Vergleichsbeispiele 1 bis 3
(1) Synthese von feinen Teilchen mit einer hydrophilen hochmolekularen Kette
In Tetrahydrofuran wurde t-Butylmethacrylat (t-BMA) gelöst. Die resultierende Lösung wurde bei 60°C 6 Stunden lang in einem Stickstoffgasstrom in Gegenwart eines Kettenübertragungsmittels (2-Mercaptoethanol) und eines Polymerisationsinitiators (Azobisisobutyronitril; AIBN) polymerisiert. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in einer gemischten Lösung aus Wasser und Methanol (1/1, v/v) ausgefällt, unter vermindertem Druck getrocknet und in Isopropanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde in einer gemischten Lösung aus Wasser und Methanol wieder ausgefällt, wodurch ein t-BMA-Oligomer mit einer Hydroxygruppe als Ende erhalten wurde [siehe M. Riza, S. Tokura, M. Iwasaki, E. Yashima, A. Kishida, M. Akashi, J. Polym. Sci. Teil A: Polym. Chem. Ausgabe 33, 1219–1225 (1995)].
Das so erhaltene t-BMA-Oligomer wurde in 100 ml DMF (N,N-Dimethylformamid) gelöst, dann das 5-fache des molaren Äquivalents eines Phasen-Transfer-Katalysators (Tetrabutylphosphoniumbromid) und das 10-fache des molaren Äquivalents einer 50%igen wässerigen KOH-Lösung, bezogen auf das Oligomer, zugegeben. Nach Rühren bei 30°C während 60 Minuten wurde der Reaktionsmischung das 10-fache des molaren Äquivalents von p-Chlormethylstyrol zugegeben und unter Rühren bei 30°C während 48 Stunden reagieren gelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt in einer gemischten Lösung aus Wasser und Methanol (1/1, v/v) ausgefällt, unter vermindertem Druck getrocknet und dann wieder in Isopropanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde in einer gemischten Lösung aus Wasser und Ethanol ausgefällt, wodurch ein t-BMA-Makromonomer mit einer Vinylbenzylgruppe als Endgruppe erhalten wurde. Das Molekulargewicht des Makromonomers kann durch Synthesebedingungen kontrolliert werden, normalerweise wird jedoch ein Makromonomer mit einem Molekulargewicht (Mn) von 2.000 bis 10.000 verwendet. In einem entlüfteten und versiegelten Rohr wurde das resultierende t-BMA-Makromonomer und Styrol bei 60°C während 48 Stunden in Ethanol in Gegenwart von AIBN als Initiator umsetzen gelassen. Das Reaktionsprodukt wurde dann durch Dialyse in Methanol gereinigt und unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch feine Teilchen (die nachfolgend als "Mikrokugeln" bezeichnet werden) erhalten. Die resultierende Mikrokugeln wurden danach in Ethanol dispergiert. Zur Dispersion wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (Ethanol/Chlorwasserstoffsäure; 5/1, v/v) zugegeben und die resultierende Mischung bei 75°C 12 Stunden lang reagieren gelassen, wodurch die t-BMA-Kette in eine Methacrylsäure-Kette überführt wurde. Nach der Entfernung des Überstandes und Aufkonzentrieren wurde die Reinigung mittels Dialyse mit Wasser bewirkt.
Durch das vorstehend beschriebene Verfahren wurden Mikrokugeln mit Polymethacrylsäure als hydrophile hochmolekulare Kette und Polystyrol als hydrophobe hochmolekulare Kette erhalten.
Die Größe der Mikrokugeln kann durch die Monomerzusammensetzung oder die Synthesebedingungen gesteuert werden, und solche mit einer Größe im Bereich von 100 nm bis 1000 nm werden vorzugsweise verwendet. In diesem Beispiel wurde der folgende Test unter Verwendung von Mikrokugeln mit einer Teilchengröße von 200 nm bis 400 nm durchgeführt.
(2) Immobilisierung von Lektin vom Mannose-Bindungstyp
Als Beispiel wird als nächstes eine Immobilisierungsmethode mit Concanavalin A (Con A) beschrieben, das ein Lektin vom Mannose-Bindungstyp ist.
Zu 1,2 ml einer Dispersion (250 mg/ml) der vorstehend erhaltenen Mikrokugeln (M1) wurden 0,15 ml einer 0,5 M KHP₂O₄-Lösung und 0,15 ml einer 1,0 Gew.-% wässerigen Lösung von WSC (1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid) zugegeben. Die resultie rende Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen, wodurch die Carboxygruppe an der Oberfläche der Mikrokugeln aktiviert wurde. Durch Zentrifugentrennung bei 13.000 UpM während 20 Minuten wurden die Mikrokugeln von der Lösung abgetrennt. Sofort nach der Entfernung des Lösungsanteils (Überstand) wurde eine 1,0 mg/ml-Con-A-Lösung (10 mM HEPES-Puffer, pH 8,0, 4°C) zum Rückstand zugegeben. Die resultierende Mischung wurde bei 4°C während 24 Stunden stehen gelassen, wodurch Con A an die Mikrokugeln immobilisiert wurde. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die zentrifugale Trennung (bei 13.000 UpM während 20 Minuten) und Redispersion wiederholt, wodurch ein unumgesetzter Anteil an Con A entfernt wurde.
Die Menge an immobilisiertem Con A auf der Oberfläche der Mikrokugeln wurde aus einer Kalibrierkurve, die vorher in einer Con A-Lösung durch Farbentwicklung einer durch Hydrolyse in 2 N HCl bei 100°C während 2 Stunden ausgebildeten Aminosäure aufgestellt wurde, bestimmt. Die immobilisierte Menge an Con A auf der Oberfläche kann durch die Struktur der Mikrokugeln oder die Reaktionsbedingungen gesteuert werden, aber im folgenden Test wurde die Anti-HIV-Wirkung unter Verwendung von Mikrokugeln, die immobilisiertes Con A in einer Menge von 2 mg/cm² aufwiesen, gemessen.
(3) Messung der Anti-HIV-Wirkung
Mit HIV, der ein AIDS verursachender Virus ist, als Ziel, wurde die Anti-HIV-Wirkung von Con A-immobilisierten Mikrokugeln bewertet.
Die HIV-Virus-Stammlösung wurde durch Kultivieren von MOLT-4/HIV, das eine HTLV-III_B-beständige infektiöse Zelle ist, in einem 10% FCS enthaltenden RPMI 1640-Medium, und der nachfolgende Zentrifugentrennung der resultierenden kultivierten Lösung, um die Zell-Komponenten davon abzutrennen, hergestellt. Die so erhaltene Virus-Stammlösung wurde auf eine HIV-Lösung mit einem vorgegebenen infektiösen Wert eingestellt, indem man 10% FCS enthaltendes RPMI 1640-Medium vor der Verwendung zugab. Der HIV-infektiöse Wert wurde berechnet als Gewebskultur-infektiöse Dosis 50% (TCID 50/ml) durch Messen der cytopathischen Wirkungen (CPE) an MT-4-Zellen gemäß der konventionellen Methode. Die Menge an gp120, die ein Hüllen-Glykoprotein von HIV ist, wurde andererseits unter Verwendung von "gp120 Capture ELIZA kit", hergestellt von AGMED Inc., bestimmt.
Jede der in Tabelle 1 gezeigten Substanzen wurde mit einer äquivalenten Menge an HIV-I-Viruslösung gemischt. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur 60 Minuten lang inkubiert, dann bei 4°C und 1.500 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Eine Menge von im Überstand enthaltenem gp120-Antigen und der infektiösen Wert wurden bestimmt. Mikrokugeln im Vergleichsbeispiel 1 haben eine Oberfläche, die nicht mit Con A immobilisiert ist, während die im Vergleichsbeispiel 2 mit Con A versetzt aber nicht immobilisiert sind, und ihre Konzentration ist ähnlich zur Konzentration von Con A, das frei als Einlagerung in einer Lösung schwebender Mikrokugeln vorhanden ist.
Es wurde gefunden, dass die Con-A-immobilisierten Mikrokugeln in Beispiel 1 gp120 einfingen, dass ein Membran-Glykoprotein ist, dass bei der Infektion von HIV bei Wirtszellen mit einer Effizienz, die so hoch wie 90% oder höher ist, einen starken Einfluss besitzt. Es wurde außerdem gefunden, dass im Vergleich zur Kontrolllösung der infektiöse Wert von Con-A-immobilisierten Mikrokugeln um ca. 60% verringert war.
Industrielle Anwendbarkeit
Da das antivirale Ausgangsmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung ein Lektin vom Mannose-Bindungstyp ist, das über eine hydrophile hochmolekulare Kette an ein Basismaterial aus einer hydrophoben hochmolekularen Kette gebunden ist, hat es eine hervorragende Formstabilität und Festigkeit und besitzt eine effektive antivirale Aktivität von Lektin.
Durch Herstellen des antiviralen Ausgangsmaterials der vorliegenden Erfindung in Form von feinen Teilchen mit einem Durchmesser von 100 nm bis 1 mm kann eine Vielzahl von Formulierungen oder Materialien hergestellt werden. Es ist z. B. möglich, eine große Vielzahl von Formulierungen zuzubereiten, die nicht nur eine Aerosol-Zubereitung, die durch Sprühen auf ein Membrangewebe oder dergleichen verwendet wird, um der viralen Infektion vorzubeugen, umfassen, sondern auch halbfeste Zubereitungen, wie z. B. Salben oder Cremes, aber auch feste Zubereitungen. Es wurde außerdem möglich, es zu einem Press- oder Formmaterial oder zu einem Oberflächenbehandlungsmittel vor der Überführung in eine gewünschte Form zuzugeben; oder das gegossene oder geformte Produkt mit einer antiviralen Wirkung zu versehen.

Claims

Verwendung von feinen Teilchen, die durch Binden von Lektin vom Mannose-Bindungstyp über eine hydrophile hochmolekulare Kette an ein Basismaterial aus einer hydrophoben hochmolekularen Kette erhältlich sind, zur Herstellung eines antiviralen Ausgangsmaterials, wobei die hydrophile hochmolekulare Kette ein Polymer oder Copolymer ist, das aus einem Monomer besteht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acrylamid, Methacrylamid und Derivaten davon, einem Monomer mit einer Carboxygruppe, einem Monomer mit einer Schwefelsäuregruppe, einem Monomer mit einem Amin, einem hydrophilen Monomer, das in seinem Molekül eine oder mehrere der Gruppen aufweist, ausgewählt aus N-Vinylacetamid, N-Vinylalkylamid, Vinylpyrrolidon, Vinylpyrrolidinon, Vinylethern, Aminosäure und Saccharid; und einem Monomer, das in seinem Molekül eine Aziridinverbindung oder ein Phospholipid aufweist, und worin die hydrophobe hochmolekulare Kette ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acrylatestern, Methacrylatestern, Polymeren oder Copolymeren von Styrol oder seinen Derivaten, Polyolefinen, Polysulfonen, Polyamiden, Polyestern, Polyurethanen und Polyimiden.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die hydrophile hochmolekulare Kette ein Wasser-Absorptionsverhältnis von 2% oder mehr aufweist, und die hydrophobe hochmolekulare Kette ein Wasser-Absorptionsverhältnis von weniger als 2% aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das feine Teilchen einen Durchmesser von 100 nm bis 1 mm hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die feinen Teilchen ein hydrophobes hochmolekulares Molekül als Kern und eine mit einer hydrophilen hochmolekularen Kette bedeckte Oberfläche aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die hydrophile hochmolekulare Kette ein Polymer oder Copolymer eines Monomers mit einer Carboxygruppe ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das antivirale Ausgangsmaterial eine antivirale Aktivität gegenüber HIV besitzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das antivirale Ausgangsmaterial zur Herstellung einer Aerosol-Zubereitung, einer halbfesten Zubereitung oder einer festen Zubereitung verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 7, worin die halbfeste Zubereitung eine Salbe oder Creme ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin die feste Zubereitung ein Additiv oder ein Guss- oder Formmaterial ist.