DE69737658T2 - Polyanionische polymere als adjuvantien zur mukosalen immunisierung - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft mukosale (nicht-parenterale) Immunisierung von warmblütigen Tieren.
  • Es gibt zwei Hauptarten von Immunität, die einem Wirtsorganismus Schutz gegen Erkrankung und/oder Infektion bieten können: systemische (oder allgemeine) Immunität, die mittels parenteraler Vakzination bereitgestellt wird; und mukosale (oder lokale) Immunität, die mittels nicht-parenteraler Vakzination bereitgestellt wird.
  • Traditionell hat sich die Vakzinentwicklung auf die Induktion systemischer Immunität konzentriert, einschließlich humoraler (spezifische Antikörper der IgM- oder IgG-Klasse) und zellulärer Immunantworten (aktivierte T-Lymphozyten, aktivierte Makrophagen oder andere) mittels Verwendung von parenteralen Vakzinen. Solche parenteralen Vakzine werden unter anderem über intramuskuläre oder subkutane Wege verabreicht.
  • Obwohl das Sorgen für systemische Immunität mittels Verwendung von parenteralen Vakzinen und parenteraler Vakzination sich als effektiv beim Schaffen einer schützenden Immunität gegen viele verschiedene Pathogene erwiesen hat, ist dies nicht immer der Fall. Es existieren zahlreiche Beispiele, in denen eine solche Immunität sich als vollkommen oder zum Teil unwirksam erwiesen hat. Darüber hinaus weisen parenterale Vakzine und parenterale Vakzination, um systemische Immunität bereitzustellen, andere Nachteile, wie das Erfordernis, die Unversehrtheit der Haut des Organismus, der damit immunisiert wird, zu beeinträchtigen, die schwierige Verabreichung (wobei beispielsweise geschultes Personal erforderlich ist, um solche Vakzine zu verabreichen), den hohen Reinheitsgrad, der für solche Vakzine erforderlich ist, einen Mangel des Schaffens der Immunität an der Stelle der natürlichen Infektion, die Nichtverhinderung einer Infektion und einen nicht vollständigen Schutz des Organismus gegen sowohl klinische als auch nicht-klinische Symptome der Infektion sowie gegen die Infektion selbst. Des Weiteren können parenterale Vakzine Probleme darstellen, wenn die effektive Immunisierung von Wirten mit geschwächter Immunabwehr (d. h. junge Tiere mit maternalen Antikörpern) erwünscht ist.
  • Eine Vielzahl von Pathogenen infiziert ihre Wirte natürlich über die Schleimhautgewebe (z. B. die Gewebe der Atemwege, des Magen-Darm-Trakts oder der Genitalien). Mukosale (oder lokale) Immunität resultiert aus der lokalen (örtlichen) Bildung und Sekretion von Antikörpern der IgA-Klasse. Diese Antikörper bilden Dimere, die in das Lumen der Atmungs-, Magen-Darm- oder Genitalorgane sezerniert werden können. Spezifische IgA-Antikörper im Lumen können eine Infektion mindern, indem sie die Penetration des Wirtsgewebes durch das Pathogen behindern oder blockieren. Zu Mechanismen, von denen bekannt ist, dass sie der Inhibition von Wirtsgewebepenetration zugrunde liegen, zählen: die Neutralisierung von Viren; die Komplexbildung mit Enzymen, Toxinen oder anderen Komponenten, die von den Pathogenen produziert werden (was in entweder der Neutralisierung der Aktivität dieser Komponenten und/oder dem Blockieren der Adsorption dieser Komponenten resultiert); die Inhibition der Adhärenz der Pathogene an Schleimhautoberflächen; die Unterdrückung von antikörpervermittelten Entzündungsreaktionen an den Schleimhautoberflächen und Synergismus mit eigenen antibakteriellen Faktoren an der Schleimhautoberfläche.
  • Mukosale (nicht-parenterale) Vakzine und mukosale Vakzination haben andere zusätzliche Vorteile gegenüber parenteralen Vakzinen und parenteraler Vakzination. Zu diesen Vorteilen zählen die Eliminierung des Erfordernisses, die Unversehrtheit der Haut, Gewebe oder Organe des Wirts zu beeinträchtigen, eine einfache Verabreichung, die Möglichkeit, einen niedrigen Reinheitsgrad einzusetzen, das Schaffen der Immunität an der Stelle der natürlichen Infektion, die Verhinderung einer Penetration des Wirtsgewebes durch das Pathogen, ein vollständigerer Schutz des Organismus gegen sowohl klinische als auch nicht-klinische Symptome der Infektion sowie gegen die Infektion selbst, der Schutz gegen Latenz und die gleichzeitige Induktion von mukosaler und systemischer Immunität. Darüber hinaus ermöglichen mukosale Vakzine und mukosale Vakzination die effektive Immunisierung von Wirten mit geschwächter Immunabwehr (d. h. junge Tiere mit maternalen Antikörpern).
  • Somit lässt sich erkennen, dass die Verwendung von mukosalen (nicht-parenteralen) Vakzinen, mukosale Vakzination und die dadurch bereitgestellte Immunität in vielen Fällen gegenüber der Verwendung von parenteralen Vakzinen, parenterale Vakzination und die dadurch bereitgestellte Immunität vorzuziehen sind.
  • In Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren kann eine natürliche oder künstliche Infektion mit lebenden Mikroorganismen beachtliche Niveaus einer mukosalen Immunität induzieren. Zu diesen Faktoren zählen: der Infektionsweg, die Beschaffenheit des Mikroorganismus, die angewendete Infektionsdosis und der Immunstatus des Wirts.
  • Die Verabreichung von abgetöteten (sich nicht replizierenden) Antigenen verleiht jedoch wenig oder keine mukosale Immunität. Um dieses Problem zu mindern, werden Adjuvantien verwendet, um die Immunantworten auf abgetötete Antigene zu steigern.
  • Die adäquate Induktion von mukosaler Immunität mit abgetöteten (sich nicht replizierenden) Antigenen bedingt sowohl die Verabreichung von Antigen an die Schleimhäute als auch die Verwendung geeigneter Adjuvantien oder Antigendarreichungssysteme.
  • Obwohl zahlreiche Adjuvantien für parenterale Vakzine bekannt sind, wurde nur von einigen wenigen gezeigt, dass sie beim Verstärken der mukosalen Immunität von Nutzen sind. Zu solchen Adjuvantien zählen das Toxin von Vibrio cholerae (Choleraenterotoxin) oder Produkte davon (Choleraenterotoxin-Untereinheit B-CTB), das hitzelabile Toxin von E. coli oder Produkte davon, Bakterientoxine oder Produkte davon, die mit Antigenen konjugiert sind, Mikropartikel oder Mikrokapseln aus verschiedenen natürlichen oder synthetischen Polymeren, in denen Antigene eingebunden sind, Liposome mit darin eingebundenem Antigen oder mit Antigen gemischte Liposome, Lektine, immunstimulierende Komplexe, Muramyldipeptid und Derivate davon und kationische Polymere (siehe „Novel Delivery Systems for Oral Vaccines", CRC Press, London, 1994).
  • Obgleich sie wohl bekannt ist, ist die Verwendung von bekannten mukosalen Adjuvantien beschränkt gewesen. Dies lag in mehreren Faktoren begründet, darunter: die inakzeptablen Risiken, die mit den schädlichen Nebenwirkungen solcher Adjuvantien verbunden sind; Probleme einer unzureichenden Wirksamkeit; die (partielle) Denaturierung von Antigenen, die aus mechanischen und/oder chemischen Behandlungen resultiert, die mit ihrem Herstellungsverfahren einhergehen; komplizierte Produktionsverfahren, die damit verbunden sind; die Uneinheitlichkeit ihrer Produktion; die hohen Kosten ihrer Produktion; spezifische Immunantworten, die durch die Adjuvanskomponente ausgelöst werden; die Instabilität des Adjuvans oder des Vakzins, das das Adjuvans enthält; und die Verstärkung oder Aktivierung unspezifischer Immunantworten, die aus ihrer Verwendung resultieren.
  • Somit lässt sich erkennen, dass weiterhin ein dringender Bedarf an Adjuvantien für mukosale Vakzine (und insbesondere für mukosale Vakzine gegen Atemwegserkrankungen, Magen-Darm-Erkrankungen und sexuell übertragbare Krankheiten) besteht, die sicher, kostengünstig und leicht zu produzieren und in mukosale Vakzine einzubinden sind.
  • Es ist eine primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von mukosalen Adjuvantien bereitzustellen, die Immunantworten auf Antigene induzieren oder verstärken können.
  • Es ist eine weitere primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung von Adjuvantien für mukosale Vakzine (und insbesondere für mukosale Vakzine gegen Atemwegserkrankungen, Magen-Darm-Erkrankungen und sexuell übertragbare Krankheiten) bereitzustellen, die sicher, kostengünstig und leicht zu produzieren und in solche mukosalen Vakzine, in denen sie eingesetzt werden sollen, einzubinden sind.
  • Es ist noch eine weitere primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, mukosale Vakzine bereitzustellen, die solche mukosale Adjuvantien darin zum Induzieren oder Verstärken von Immunantworten auf Antigene einbinden.
  • Es ist noch eine weitere primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Induzieren oder Verstärken von Immunantworten auf Antigene bereitzustellen und Verfahren zum Bereitstellen von mukosalen Adjuvantien und mukosalen Vakzinen, die mukosale Adjuvantien umfassen, die zu einer solchen Induktion oder Verstärkung in der Lage sind, bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft mukosale Adjuvantien zur Einbindung in mukosale Vakzine und mukosale Vakzine, die solche Adjuvantien darin einbinden und zur Induktion oder Verstärkung von mukosalen und/oder systemischen Immunantworten auf Antigene von Nutzen sind, wie in Anspruch 1 definiert.
  • Wie hierin verwendet, weisen die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen auf:
    Der Ausdruck „wasserlöslich", wenn auf die polyanionischen Polymere der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, bezieht sich auf Polymere, die in einer Konzentration von mindestens 0,01 Gramm pro Liter in einer wässrigen Phase löslich sind.
  • Der Ausdruck „Polymer" bezieht sich auf Verbindungen mit mindestens drei identischen chemischen strukturellen Wiederholungseinheiten, wobei die Einheiten kovalent miteinander verbunden sind.
  • Der Ausdruck „strukturelle Wiederholungseinheit" bezieht sich auf die minimale Struktureinheit eines Polymers.
  • Der Ausdruck „Homopolymer" bezieht sich auf Polymere, die aus einem Typ von konstitutionellen Wiederholungseinheiten bestehen.
  • Der Ausdruck „Heteropolymer" bezieht sich auf Polymere mit zwei oder mehr unterschiedlichen strukturellen Wiederholungseinheiten.
  • Der Ausdruck „polyanionisches Polymer" bezieht sich auf Polymere, die, wenn sie in einem wässrigen Medium gelöst werden, aufgrund des Vorliegens von anionischen strukturellen Wiederholungseinheiten (z. B. Einheiten, die Sulfat-, Sulfonat-, Carboxylat-, Phosphat- und Boratgruppen enthalten) negativ geladen sind.
  • Der Ausdruck „anionische strukturelle Wiederholungseinheit" bezieht sich auf strukturelle Wiederholungseinheiten von Polymeren, die in wässrigem Medium in physiologischen Bedingungen negativ geladen sind.
  • Der Ausdruck „hydrophobe strukturelle Wiederholungseinheit" bezieht sich auf strukturelle Wiederholungseinheiten von Polymeren, die sich dadurch auszeichnen, dass das entsprechende Monomer in einer wässrigen Phase weniger löslich ist als in einem organischen Lösemittel [das heißt, die Menge, in Gewichtseinheiten (in Gramm), des Monomers, das in einem festgelegten Volumen, in ml, einer wässrigen Phase gelöst werden kann, ist geringer als die Menge, in Gewichtseinheiten (in Gramm), des Monomers, das in dem gleichen festgelegten Volumen, in ml, des organischen Lösemittels gelöst werden kann].
  • Die mukosalen Adjuvantien werden aus polyanionischen Heteropolymeren mit zwei unterschiedlichen (verschiedenen) anionischen Gruppen ausgewählt, wobei eine Gruppe Acrylsäure ist und die andere Vinylsulfonsäure oder Acrylamidomethylpropansulfonsäure ist.
  • Die polyanionischen Polymere gemäß der vorliegenden Erfindung sind Poly(acrylat-co-acrylamidomethylpropansulfonsäure)-Copolymer (p(A-c-AMPS)), Poly(acrylat-co-vinylsulfonat)-Copolymer (p(A-c-VS)).
  • In noch einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist hierin die Verwendung der wasserlöslichen polyanionischen Polymere der vorliegenden Erfindung zur Herstellung oder Produktion von mukosalen Adjuvantien zur Induktion oder Verstärkung von mukosalen oder systemischen Immunantworten offenbart.
  • Wie hierin offenbart, wird das mukosale Adjuvans, das ein hierin offenbartes polyanionisches Polymer umfasst, zur Verstärkung von entweder systemischer oder mukosaler Immunität gegen Antigene mukosal verabreicht.
  • Das Antigen beinhaltet lebende oder inaktivierte Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten und andere Mikroorganismen als auch Komponenten oder Produkte, die von diesen Mikroorganismen abgeleitet sind, Produkte, die mittels chemischer Synthese erhalten wurden und eine schützende Immunität auslösen können, und Produkte, die durch ein beliebiges anderes Mittel erhalten wurden und eine schützende Immunität auslösen können.
  • Bevorzugte Antigene sind diejenigen, die eine schützende Immunität gegen Erkrankungen, bei denen es sich um Infektionen der Atemwege handelt, auslösen können. Beispiele solcher Erkrankungen sind Newcastle-disease-Virus, infektiöses Bronchitisvirus, Influenzavirus, Rhinovirus, Parainfluenzavirus, Adenovirus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes und Infektionen des Magen-Darm-Trakts mit beispielsweise Rotavirus, Parvovirus, Coronavirus, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, Clostridium, Vibrio und Giardia, Entamoeba und Cryptosporidium.
  • Die polyanionischen Polymere, die als die Adjuvantien der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, können entweder mittels Isolierung und Reinigung von natürlichen Formen dieser oder mittels Synthese dieser erhalten werden.
  • Verfahren zum Synthetisieren von polyanionischen Polymeren mit anionischen strukturellen Wiederholungseinheiten und/oder sowohl anionischen strukturellen Wiederholungseinheiten als auch hydrophoben strukturellen Wiederholungseinheiten sind im Stand der Technik wohl bekannt. Zu solchen Verfahren zählen: Copolymerisation von anionischen und hydrophoben Monomeren; direktes (partielles) Aufpfropfen von geeigneten Polymeren; indirektes (partielles) Aufpfropfen von geeigneten Polymeren und Teilhydrolyse von geeigneten Polymeren.
  • Die Verwendung der Adjuvantien in Vakzinen zur mukosalen Vakzination (Immunisierung) bietet gegenüber jenen bekannten mukosalen Adjuvantien (und gegenüber parenteralen Vakzinen) insofern verschiedene wichtige Vorteile, dass die Adjuvantien kostengünstig, nicht immunogen, wasserlöslich, chemisch beständig, leicht zu produzieren und leicht in die Vakzine, in denen sie verwendet werden sollen, einzubinden sind. Darüber hinaus sind diese Adjuvantien beim Induzieren der gewünschten mukosalen Immunantworten wirksamer als andere Adjuvantien, von denen wir wissen. Schließlich werden verschiedene der hierin beschriebenen Adjuvantien bereits in großem Umfang in Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Präparaten angewendet, wodurch ihre Annehmbarkeit gesteigert wird.
  • Die Beobachtungen im Hinblick auf die mukosalen Adjuvantien und die mukosalen Vakzine, die solche mukosalen Adjuvantien darin einbinden, die in den im Folgenden dargelegten Beispielen veranschaulicht sind, werden insofern als unerwartet erachtet, dass: die meisten wohl bekannten Adjuvantien für systemische Immunität beim Verstärken der mukosalen Immunität nicht wirksam sind; jene mukosalen Adjuvantien, die derzeit eingesetzt werden, mäßige oder schlechte Adjuvantien für systemische Immunität sind; es wichtige Unterschiede gibt, die zwischen den Mechanismen bestehen, die an der Induktion und der Entwicklung von systemischer und mukosaler Immunität beteiligt sind; und die hierin offenbarten polyanionischen Polymere wirksamer als mehrere der am meisten Erfolg versprechenden, derzeit bekannten mukosalen Adjuvantien sind.
  • Es wird weiterhin angemerkt, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten polyanionischen Polymere zur Induktion und/oder Verstärkung von mukosalen Immunantworten auf Antigene von Nutzen sind, wenn sie entweder in Verbindung mit dem Antigen oder separat vom Antigen über mukosale Wege verabreicht werden.
  • Die mukosalen Vakzine mit den Adjuvantien sind zur Induktion von mukosaler Immunität wirksam und enthalten sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvans, wobei das Adjuvans ein wasserlösliches polyanionisches Polymer ist.
  • Die Adjuvantien sind Feststoffe (sind beispielsweise in der Form eines Pulvers). Nach Wunsch können sie als solche verwendet werden, direkt auf die Oberfläche angewendet werden, an der eine Immunantwort erwünscht ist. In einem solchen Fall werden sie, da sie wasserlöslich sind, von den natürlichen Flüssigkeiten der Schleimhautoberflächen solubilisiert.
  • Alternativ können die mukosalen Adjuvantien in eine wässrige Lösung eingebunden werden, indem sie in einem flüssigen Medium gelöst oder in dieses eingebunden werden.
  • In dieser Hinsicht können die mukosalen Adjuvantien weiterhin in ein Vakzin mit einem flüssigen Medium (wie einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff) eingebunden werden. Dies kann erreicht werden, indem sie (beispielsweise als ein Pulver) zum Beispiel in einer Lösung (wie einer wässrigen Lösung), die beispielsweise ein Antigen (und/oder ein Arzneimittelmolekül) enthält, solubilisiert werden. Ein anderes alternatives Verfahren zum Erzielen dieses darin bestehen, dass das feste Adjuvans zunächst in einer wässrigen Phase gelöst wird, die dann entweder mit einer wässrigen Lösung des Antigens (und/oder Arzneimittelmoleküls) gemischt werden kann oder die dann ein in der Lösung, die das Adjuvans enthält, solubilisiertes lyophilisiertes Antigen (und/oder Arzneimittelmolekül) aufweisen kann.
  • Vorzugsweise sind die Vakzine so formuliert, dass sie zwischen 0,01 und 40 mg des polyanionischen Polymers (mukosalen Adjuvans) pro ml Vakzin aufweisen.
  • Mehr bevorzugt sind die Vakzine so formuliert, dass sie zwischen 0,02 und 20 mg des polyanionischen Polymers (mukosalen Adjuvans) pro ml Vakzin aufweisen.
  • Am meisten bevorzugt sind die Vakzine so formuliert, dass sie zwischen 0,25 und 5 mg des polyanionischen Polymers (mukosalen Adjuvans) pro ml Vakzin aufweisen.
  • Die Vakzine können über nicht-parenterale Wege, wie intranasal, oral, oronasal, intratracheal und intrakloakal, auf Schleimhautoberflächen von Tieren oder Menschen angewendet werden. Eine solche Anwendung kann mittels beispielsweise Verwendung von flüssigen Aerosolen, Trinkwasser, Nahrungsmittel usw. durchgeführt werden.
  • Wie hierin verwendet, sollen die folgenden Ausdrücke die Bedeutungen aufweisen, die dafür angegeben werden:
    Der Ausdruck „parenterale Immunisierung" bedeutet die Verabreichung eines Vakzins über die Haut mittels Verwendung einer Nadel oder einer anderen Vorrichtung unter Anwendung, unter anderem, eines der folgenden Wege:
    intrakutan, subkutan, intraperitoneal, intramuskulär und/oder intradermal.
  • Die Ausdrücke „nicht-parenterale Immunisierung" und „mukosale Immunisierung" beziehen sich auf die Verabreichung eines Vakzins an eine Schleimhautoberfläche mittels, unter anderem, eines der folgenden Wege:
    intranasal, oronasal, intratracheal, intragastral, intratestikulär, oral, rektal, intrakloakal und/oder intravaginal.
  • Der Ausdruck „systemische Immunität" bezieht sich auf antigenspezifische Wirtsabwehr, die von Serumantikörpern der IgM- oder IgG-Klasse oder von aktivierten T-Lymphozyten vermittelt wird.
  • Der Ausdruck „mukosale Immunität" bezieht sich auf antigenspezifische Wirtsabwehr, die von Antikörpern der IgA-Klasse vermittelt wird, die in dem Wirt vorhanden sind oder in das Lumen verschiedener Organe sezerniert werden.
  • Der Ausdruck „mukosales Vakzin" bezieht sich auf Vakzine, die über einen nicht-parenteralen Weg verabreicht werden, um die mukosale oder systemische Immunantwort auf ein Antigen zu steigern.
  • Der Ausdruck „mukosales Adjuvans" bezieht sich auf Adjuvantien, die über einen nicht-parenteralen Weg verabreicht werden, um die mukosale oder systemische Immunantwort auf ein Antigen zu steigern.
  • Der Ausdruck „Pfropfpolymer" bezieht sich auf Polymere, die mittels Addition von chemischen Gruppen mit einer maßgeblichen Auswirkung auf chemische, physikalisch-chemische oder biologische Eigenschaften des Polymers erhalten werden.
  • Der Ausdruck „Copolymer" bezieht sich auf Polymere, die mittels Polymerisation von zwei oder mehr unterschiedlichen Monomeren in Verbindung miteinander mit maßgeblich unterschiedlichen chemischen, physikalisch-chemischen oder biologischen Eigenschaften im Vergleich zu Polymeren, die aus einem der Monomere erhalten wurden, erhalten werden.
  • Der Ausdruck „flüssiges Medium" bezieht sich auf Medien von Flüssigkeit, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt: wässrige Lösungen, physiologische wässrige Lösungen, Emulsionen des Öl-in-Wasser-Typs und Suspensionen von unlöslichen Salzen in einer wässrigen Lösung (sowie andere Arten pharmazeutisch unbedenklicher Trägerstoffe).
  • Die bevorzugten flüssigen Medien sind wässrige Lösungen, wobei physiologische wässrige Lösungen am meisten bevorzugt sind, obwohl einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung darin besteht, dass die Vakzinformulierung, die die hierin offenbarten mukosalen Adjuvantien einbindet, nicht physiologisch sein muss.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, nur die Beispiele 20-21 und 24-27 fallen in den Schutzumfang der Ansprüche.
  • Beispiel 1
  • Synthese von Adjuvans mittels Copolymerisation von anionischen und hydrophoben Monomeren
  • 540 mmol Acrylsäure (Merck, Darmstadt, Deutschland), 60 mmol n-Butylacrylat (Janssen, Belgien) und 150 ml destilliertes Wasser wurden in einem Reaktionsgefäß miteinander vermischt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde gerührt und der pH-Wert wurde mit 10N NaOH auf 4,8 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Stickstoff gesättigt, um den darin vorhandenen Sauerstoff zu entfernen.
  • Dann wurden fünf ml einer Lösung von 88 mM Na2S2O8 und fünf ml einer Lösung von 175 mM Na2S2O5 zu dem Reaktionsgemisch gegeben und das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren inkubiert.
  • Das Reaktionsgemisch wurde anschließend unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Cut-Off von 10 kD (Spectra/Por) gegen 1 M NaCl und 0,15 M NaCl dialysiert und dann mindestens sieben Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, um das Polymer zu erhalten. Das Produkt wurde dann lyophilisiert, um das Wasser daraus zu entfernen, und als ein trockenes Pulver bei Raumtemperatur gelagert.
  • Eine Analyse des lyophilisierten Produkts mittels NMR (Protonen-NMR mit chemischer Verschiebung, aus TMS (0 ppm Standard) berechnet, in einer Vorrichtung mit 500 Megazyklen (BRUCKER AMX500) unter Verwendung von D2O als Lösemittel bei 25 °C) offenbarte, dass das Produkt ein Polymer war, das Butylacrylat-Monomere und Acrylat-Monomere in einem Molverhältnis von 5 Butylacrylat-Monomeren pro 95 Acrylat-Monomere enthielt. Eine Analyse des Molekulargewichts mittels Gelpermeationschromatographie (wie in Vaccine 12, 653-659 (1994)) des so gebildeten Polymers offenbarte ein durchschnittliches Molekulargewicht von mehr als 100.000 Dalton.
  • Beispiel 2
  • Synthese von Adjuvans mittels direkten (partiellen) Aufpfropfens von geeigneten Polymeren
  • Proben von Polyacrylsäure 907 (PAA-907) (CARBOPOL-907 von BFGoodrich, Cleveland, Ohio, USA) von jeweils einem Gramm wurden gemäß dem von Cohen (J. Polymer Sci. 14, 7-22, 1976) beschriebenen Verfahren verestert, indem sie in Proben reinen Alkanols (Octanol, Butanol bzw. Methanol) von jeweils 50 ml solubilisiert wurden, und die Lösungen wurden auf 135 °C erhitzt. Fünfzig μl 18 M H2SO4 wurden jeder der Lösungen zugesetzt und die Gemische wurden 10 bis 30 Minuten bei 135 °C gehalten. Die Reaktionen wurden dann abgebrochen, indem 50 ml kaltes destilliertes Wasser zu jedem Reaktionsgemisch gegeben und die Reaktionsgemische auf Raumtemperatur abgekühlt wurden. Der pH-Wert jedes Reaktionsgemischs wurde dann mit einer 1 M NaOH-Lösung auf 6 eingestellt und die Lösemittel wurden daraus abgezogen, indem die Gemische bei niedrigem Druck (10–6 bar) auf 80 °C erhitzt werden.
  • Die erhaltenen Produkte wurden dann in destilliertem Wasser solubilisiert, unter Verwendung einer Membran mit einem Cut-Off von 10 kD (Spectra/Por) mindestens sieben Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert, um das Wasser daraus zu entfernen.
  • Die auf diese Weise erhaltenen Verbindungen waren (die Pfropfpolymere) Octyl-PAA, Butyl-PAA und Methyl-PAA. Diese Pfropfpolymere wurden mittels NMR (Protonen-NMR mit chemischer Verschiebung, aus TMS (0 ppm Standard) berechnet, in einer Vorrichtung mit 500 Megazyklen (BRUCKER AMX500) unter Verwendung von DMSO als Lösemittel bei 120 °C) analysiert, um deren Veresterungsgrad (durchschnittliche Anzahl von Alkylgruppen pro Gesamtzahl von Carboxylgruppen des nativen Moleküls) zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser NMR offenbarten Veresterungsgrade von 16% für Octyl-PAA, 16% für Butyl-PAA und 15% für Methyl-PAA.
  • Beispiel 3
  • Synthese von Adjuvans mittels indirekten (partiellen) Aufpfropfens von geeigneten Polymeren
  • Es wurde eine Lösung von 36 Gramm PAA-907 (CARBOPOL-907 von BFGoodrich, Ohio, USA) pro Liter wasserfreiem Dimethylformamid hergestellt. Fünfzig ml dieser Lösung wurden dann mit 10 ml wasserfreiem Pyridin gemischt, um eine PAA-907-Lösung zu bilden.
  • Es wurde eine Lösung von CH3COCl mit einer Konzentration von 71,2 ml pro Liter wasserfreiem Dimethylformamid hergestellt. 7,5 ml dieser CH3COCl-Lösung wurden der PAA-907-Lösung zugesetzt (Molverhältnis von 0,3 CH3COCl pro COOH von PAA-907) und das Reaktionsgemisch wurde zunächst 6 Stunden bei 60 °C und dann 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch ein Anhydrid zwischen den COOH-Gruppen der PAA-907 und dem CH3COCl gebildet wurde.
  • Dem so gebildeten Gemisch wurden 7 ml reines, wasserfreies 1-Butanol zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde wiederum 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei das Anhydrid mit dem Butanol reagiert, wodurch Butyl-PAA-Ester und Butyl-O(C=O)CH3-Ester gebildet werden. Das erhaltene Produkt wurde dann unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Cut-Off von 10 kD (Spectra/Por) mindestens sieben Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Polymer wurde mittels NMR (Protonen-NMR mit chemischer Verschiebung, aus TMS (0 ppm Standard) berechnet, in einer Vorrichtung mit 500 Megazyklen (BRUCKER AMX500) unter Verwendung von DMSO als Lösemittel bei 25 °C) analysiert, was Butylacrylat-Monomere und Acrylat-Monomere in einem Molverhältnis von 16 Butylacrylat-Monomeren pro 84 Acrylat-Monomere offenbarte.
  • Beispiel 4
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und CTB auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA- und IgG-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde dann in verschiedenen Mengen eines Phosphatpuffers (pH = 7,5), der 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt, solubilisiert, um Butyl-PAA-Adjuvanslösungen(-formulierungen) mit wie im Folgenden in Tabelle 1 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu produzieren.
  • Choleraenterotoxin-Untereinheit B (CTB) wurde von Sigma bezogen. Die CTB wurde dann in verschiedenen Mengen eines Phosphatpuffers (pH = 7,5), der 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt, solubilisiert, um CTB-Adjuvanslösungen(-formulierungen) mit wie im Folgenden in Tabelle 1 dargelegten Konzentrationen des CTB-Adjuvans zu produzieren.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Der Newcastle-disease-Virus-Stamm (NDV-Stamm) Lasota (Solvay Duphar, Weesp, Niederlande) wurde auf Eiern wachsen gelassen (unter Befolgung der in Wilson et al., Avian Diseases, 28, 1079-1085 (1984), spezifizierten Verfahren und Bedingungen) und wurde auf Saccharosegradient gereinigt und mit β-Propiolacton inaktiviert (unter Befolgung der in Wilson et al., Avian Diseases, 28, 1079-1085 (1984), spezifizierten Verfahren und Bedingungen), um eine Antigenstammlösung zu ergeben. Die Endkonzentration der Antigenstammlösung enthielt 108,8 mittlere Embryo-Infektionsdosen pro ml vor der Inaktivierung.
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 1 spezifiziert, wurden dann mittels Mischen eines Volumens der jeweiligen verschiedenen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der Antigenstammlösung hergestellt.
  • Schließlich wurde eine Phosphatpufferlösung hergestellt, die 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt. Diese Phosphatpufferlösung wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung von Versuchstieren
  • Vierundzwanzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in vier Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der vier Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen der Phosphatpufferlösung (pH 7,5), in Teil 1 dieses Beispiels oben beschrieben, von jeweils 40 μl verabreicht, die weder Antigen noch Adjuvans enthielten, indem 20 μl der Phosphatpufferlösung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedem der Versuchstiere einer zweiten Gruppe (Gruppe 2) wurden dann Dosen von jeweils 40 µl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen zwei Gruppen (Gruppe 3 und 4) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans- Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 1 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl einer bestimmten Vakzinformulierung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der Phosphatpufferlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1), der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 2) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere von Gruppe 3 und 4) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden alle vier Gruppen von Versuchstieren erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden. Ihre Milzen wurden ebenfalls entnommen.
  • M199/FKS-Medium wurde hergestellt, das 500 ml M199-Medium (BioWhittaker), 30 ml fötales Kälberserum (Gibco BRL), 11,6 ml einer 1 M HEPES-Lösung (Sigma), 7 ml einer 5,6%-igen (w/w) NaHCO3-Lösung (Analar) und 145 μl einer Gentamycin-Lösung (Gibco BRL) aufwies.
  • Innerhalb jeder Gruppe wurden die Lungen von zwei Versuchstieren gepoolt und weiter als eine einzige Probe behandelt, was 3 Proben pro Gruppe ergab.
  • Die Lungen wurden in kleine Stücke geschnitten und 2 Stunden bei 37 °C in 5 ml des M199-FKS-Mediums (oben beschrieben), das weiter mit Kollagenase (Sigma) mit einer Endkonzentration von 0,4 mg pro ml und CaCl2 mit einer Endkonzentration von 0,01 M supplementiert worden war, inkubiert.
  • Die Milzzellen wurden auf dieselbe Weise wie die Lungenzellen behandelt, mit der Ausnahme, dass das M199/FKS-Medium nicht mit entweder Kollagenase oder CaCl2 supplementiert worden war.
  • Nach der Inkubation wurden die Lungenstücke durch ein Nylonsieb (Nybold, Maschenweite von 243 Mikron) zerkleinert und die Zellsuspensionen wurden durch ein Nylonsieb (Nybold, Maschenweite von 243 Mikron) filtriert und in Röhrchen rückgeführt.
  • Die Milzzellen wurden auf dieselbe Weise behandelt, gleichfalls in Röhrchen rückgeführt.
  • Die Röhrchen (die die Lungenzellsuspensionen und die Milzzellsuspensionen enthielten) wurden dann 5 Minuten mit 1000 U/min (180 g) bei 4 °C zentrifugiert und die Überstände wurden daraus abgezogen. Die verbleibenden Zellpellets wurden dann in 2 ml des M199/FKS-Mediums (oben beschrieben) resuspendiert. Die erhaltenen Zellsuspensionen wurden dann in Röhrchen gegeben, die 3 ml Ficoll-Paque (Pharmacia) enthielten, und die Röhrchen wurden 20 Minuten mit 2000 U/min (540 g) bei 18 °C zentrifugiert.
  • Die zwei leichtesten Fraktionen, die aus der Zentrifugierung resultierten und die die Lymphozyten enthielten, wurden dann in einer neuen Reihe von Röhrchen gesammelt. Die Zellen wurden anschließend mittels Zugabe von 8 ml des M199/FKS-Mediums (oben beschrieben) zu etwa 2 ml der Zellsuspensionen gewaschen und 5 Minuten mit 1000 U/min (180 g) bei 4 °C zentrifugiert. Dann wurde der resultierende Überstand abgezogen und der Waschvorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt.
  • Die resultierenden Zellpellets wurden dann in 2 ml des M199/FKS-Mediums (oben beschrieben) resuspendiert und jeder Probe wurden 2 ml 0,83%-igen (w/v) NH4Cl zugesetzt. Die Zellsuspensionen wurden anschließend behutsam gemischt, worauf eine Zentrifugierung für 5 Minuten mit 1000 U/min (180 g) bei 4 °C folgte. Das resultierende Zellpellet wurde dann sofort in 8 ml des M199/FKS-Mediums (oben beschrieben) resuspendiert. Die Röhrchen wurden danach erneut 5 Minuten mit 1000 U/min (180 g) bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand von den Pellets abgezogen und die Zellpellets wurden in dem M199/FKS-Medium (oben beschrieben) resuspendiert. Dann wurde die Anzahl der lebenden Zellen unter dem Mikroskop unter Verwendung von Trypan Blue (SIGMA) bestimmt und die Suspensionen wurden auf 2,106 Zellen pro 0,1 ml (100 µl) eingestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen Ig-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Anzahl von antigenspezifischen IgA- und IgG-produzierenden Zellen in sowohl den Lungenzellsuspensionen als auch den Milzzellsuspensionen wurde mittels eines ELISA-Plaque-Assays (ELISPOT), wie von Sedwick und Holt (J. Immunol. Meth. 87, 37-44) beschrieben, mit den folgenden Spezifikationen gemessen: Die ELISA-Platten wurden über Nacht mit 50 μl einer Lösung von gereinigtem, inaktiviertem NDV (Lasota-Stamm, Solvay Duphar) in einem Carbonatpuffer (pH = 9,6), der 0,015 M Na2CO3 und 0,035 M NaHCO3 enthielt, mit einer Konzentration von 108,8 mittlerer Embryo-Infektionsdosis pro ml vor der Inaktivierung überzogen. Die Platten wurden anschließend 5 Mal mit 0,05%-igem (v/v) Tween 20 (Merck) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Oxoid; PBS/Tween 20) gewaschen.
  • Dann wurden 100 μl des M199/FKS-Mediums (oben beschrieben) in jedes Well gegeben. Danach wurden 100 μl der Zellsuspensionen, die 2,106 Zellen pro 100 μl enthielten, in die Wells der ersten Spalte gegeben und anschließend zweifach in den Wells der gleichen Reihe seriell verdünnt.
  • Dann wurden die Platten abgedeckt und 4 Stunden bei 37 °C in einem vibrationsfreien Inkubator, um eine Ablösung der Zellen zu verhindern, die sich auf dem Boden der Wells abgesetzt hatten, inkubiert. Nach der Inkubation wurde vollentsalztes Wasser mit genügend Kraft in jedes Well injiziert, so dass Zellen, die daran anhafteten, daraus entfernt wurden. Die Platten wurden dann anschließend fünf Mal mit PBS/Tween 20 (oben beschrieben) gewaschen. Danach wurden 50 μl Ziege-Antimaus-IgA, das mit Biotin (Zymed) konjugiert worden war, das 500-fach in M199/FKS-Medium (oben beschrieben) verdünnt worden war, in jedes Well gegeben und die Platten wurden 2 Stunden bei 37 °C inkubiert.
  • Die Platten wurden dann 10 Mal mit PBS/Tween 20 (oben beschrieben) gewaschen und danach wurden 50 μl Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase (Zymed), das zuvor 500-fach in M199/FKS-Medium (oben beschrieben) verdünnt worden war, in jedes Well gegeben und die Platten wurden 18 Stunden bei 4 °C inkubiert.
  • Die Platten wurden dann 10 Mal mit PBS/Tween 20 (oben beschrieben) gewaschen. Danach wurden 100 μl eines warmen (40 °C) Substratpuffers, der sich aus 4 Volumina einer Lösung von 1 mM 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (SIGMA) in 1 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol-Puffer (pH = 10,25; Sigma) und 1 Volumen einer Lösung von 3%-iger (w/v) Agarose (Sigma) in jedes Well gegeben. Die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und die Anzahl von blauen Punkten in den Wells, die zwischen 10 und 40 blauen Punkten enthielten, wurde unter dem Mikroskop (100-fache Vergrößerung) gezählt. Anschließend wurde die Anzahl von blauen Punkten pro 106 Zellen berechnet, indem die Anzahl von in einem Well gezählten Punkten durch die Anzahl von in diesen Well gegebenen Zellen dividiert und das Ergebnis mit 106 multipliziert wurde.
  • Die jeweiligen Lungenzellsuspensionen (jede Suspension stammte von den Lungen von zwei individuellen Versuchstieren) wurden dann in dreifacher Ausführung im ELISPOT geprüft. Die jeweiligen Milzzellsuspensionen (jede Suspension stammte von den Milzen von zwei individuellen Versuchstieren) wurden danach in dreifacher Ausführung im ELISPOT geprüft. Anschließend wurden die Mittelwerte und der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) der drei Proben der Lungen- und Milzzellsuspensionen berechnet.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 1 dargelegt. TABELLE 1
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 Keines/Keines [0] 0 0
    2 NDV/Keines [0] 2 1
    3 NDV/BUTYL-PAA [10] 336 35
    4 NCV/CTB [1,0] 8 6
    IgA in der Milz
    1 Keines/Keines [0] 0 0
    2 NDV/Keines [0] 27 21
    3 NDV/BUTYL-PAA [10] 248 226
    4 NCV/CTB [1,0] 84 23
    IgA in der Lungen
    1 Keines/Keines [0] 0 0
    2 NDV/Keines [0] 0 0
    3 NDV/BUTYL-PAA [10] 112 23
    4 NCV/CTB [1,0] 10 11
    IgA in der Milz
    1 Keines/Keines [0] 0 0
    2 NDV/Keines [0] 7 2
    3 NDV/BUTYL-PAA [10] 64 32
    4 NCV/CTB [1,0] 8 0
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 5
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und SL-CD/Squalan/Wasser auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 2 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • Eine Sulfolipocyclodextrin/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierung (SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierung) wurde unter Befolgung des in Hilgers (Vaccine 12, 653-660, 1994), für die Sulfolipopolysaccharose/Squalan/Wasser-Formulierung beschriebenen Protokolls hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Sulfolipocyclodextrin (SL-CD) synthetisiert wurde, indem Sulfat- und Lauroylgruppen zu Beta-Cyclodextrin gegeben wurden, wie von Hilgers (Immunology, 60, 141-146, 1987) für die Synthese von Sulfolipopolysaccharose, indem Sulfat- und Lauroylgruppen zu Polysaccharose gegeben wurden, beschrieben, in einem Molverhältnis von 1 Mol Sulfat, 8 Mol Lauroyl und 1 Mol Cyclodextrin. Ein Gramm des erhaltenen SL-CD wurde dann in zwei Gramm Tween 80 gelöst. Dann wurden der SL-CD/Tween-80-Lösung 8 Gramm Squalan und 390 Gramm phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde anschließend emulgiert, indem es durch einen Microfluidizer (Microfluidics Inc.) laufen gelassen wurde, wie von Hilgers (Vaccine 12, 653-660, 1994) für SL-Polysaccharose/Squalan/Wasser beschrieben, wodurch eine SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvansemulsion gebildet wurde. Die Endkonzentrationen von SL-CD, Tween 80 und Squalan, die in den SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierungen vorlagen, die in den jeweiligen Beispielen im Folgenden verwendet wurden, waren 2,5 Gramm SL-CD pro Liter Adjuvansemulsion, 5,0 Gramm Tween 80 pro Liter Adjuvansemulsion und 20 Gramm Squalan pro Liter Adjuvansemulsion.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 2 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung von Versuchstieren
  • Achtzehn weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in drei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der drei Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen zwei Gruppen (Gruppe 2 und 3) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 2 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl einer bestimmten Vakzinformulierung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere von Gruppe 2 und 3) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden alle drei Gruppen von Versuchstieren erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere von Gruppe 1 und Gruppe 2 (wie im Folgenden in. Tabelle 2 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in beiden Zellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurde.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 2 dargelegt. TABELLE 2
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 Keines/Keines [0] 19 5
    2 NDV/BUTYL-PAA [10] 453 249
    3 NDV/SL-CD/Squalan/Wasser [2,5] 23 19
    IgA in der Milz
    1 Keines/Keines [0] 92 59
    2 NDV/BUTYL-PAA [10] 324 116
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 6
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und PAA-907 auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 3 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) wurde in verschiedenen Mengen eines Phosphatpuffers (pH = 7,5), der 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt, solubilisiert, um die PAA-907- Adjuvanslösungen(-formulierungen) mit wie im Folgenden in Tabelle 3 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans zu produzieren.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 3 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zweiundvierzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sieben Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sieben Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen sechs Gruppen (Gruppe 2, 3, 4, 5, 6 und 7) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 3 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl einer bestimmten Vakzinformulierung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2-7) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden alle sieben Gruppen von Versuchstieren erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen 7
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 3 dargelegt. TABELLE 3
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 4 2
    2 NDV/BUTYL-PAA [0,5] 169 237
    3 NDV/BUTYL-PAA [1,7] 586 78
    4 NDV/BUTYL-PAA [5,0] 1906 2064
    5 NDV/PAA-907 [0,5] 80 52
    6 NDV/PAA-907 [1,7] 120 100
    7 NDV/PAA-907 [5,0] 118 152
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 7
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und PAA-907 auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 4 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 4 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 4 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Dann wurden außerdem verschiedene abgestufte Verdünnungen der NDV-Antigene, d. h. Verdünnungen von 1/12 (Standarddosis) (v/v), 1/40 (v/v) und 1/120 (v/v) in PBS, aus der Antigenstammlösung mittels Verdünnung dieser mit geeigneten Mengen von PBS hergestellt. Diese Verdünnungen ergaben Antigenlösungen mit 107,8 mittleren Embryo-Infektionsdosen pro ml vor der Inaktivierung, 107,3 mittleren Embryo-Infektionsdosen pro ml vor der Inaktivierung bzw. 106,8 mittleren Embryo-Infektionsdosen pro ml vor der Inaktivierung.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Vierundfünfzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in neun Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der neun Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere von drei Gruppen (Gruppe 1, 2 und 3) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der jeweiligen Verdünnungen der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden. Die genaue Verdünnung der reinen NDV-Antigenstammlösung, die den Versuchstieren jeder der Gruppen 1, 2 und 3 verabreicht wurde, ist im Folgenden in Tabelle 4 dargelegt.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen sechs Gruppen (Gruppe 4, 5, 6, 7, 8 und 9) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten) von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 4 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl einer bestimmten Vakzinformulierung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere der Gruppen 1-3) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 4-9) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppen 1 und 4 (wie im Folgenden in Tabelle 4 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 4 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 4 dargelegt. TABELLE 4
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV [1/12]/Keines [0] 34 14
    2 NDV [1/40]/Keines [0] 7 9
    3 NDV [1/120]/Keines [0] NDV [1/12]/BUTYL-PAA 2 3
    4 [2,5] NDV [1/40]/BUTYL-PAA 181 64
    5 [2,5] NDV [1/120]/BUTYL-PAA 19 27
    6 [2,5] NDV [1/12]/PAA-907 [2,5] 3 3
    7 NDV [1/40]/PAA-907 [2,5] NDV [1/120]/PAA-907 [2,5] 83 41
    8 33 38
    9 0 0
    IgA in der Milz
    1 NDV [1/12]/Keines [0] 3 1
    2 NDV [1/12]/Keines [0] 25 1
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 8
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und PAA-907 auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 5 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 5 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 5 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zweiundvierzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sieben Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sieben Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen sechs Gruppen (Gruppe 2, 3, 4, 5, 6 und 7) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 5 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl einer bestimmten Vakzinformulierung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2-7) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen von nur zwei Proben von Gruppe 3 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 5 dargelegt. TABELLE 5
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 39 29
    2 NDV/BUTYL-PAA [0,5] 60 32
    3 NDV/BUTYL-PAA [1,7] 369 240
    4 NDV/BUTYL-PAA [5,0] 115 72
    5 NDV/PAA-907 [0,5] 38 17
    6 NDV/PAA-907 [1,7] 432 472
    7 NDV/PAA-907 [5,0] 94 75
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 9
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, PAA-907, PAA-934PH, Al(OH)3, Liposomen und CTB auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 6 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 6 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • CTB und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 6 dargelegten Konzentrationen des CTB-Adjuvans hergestellt.
  • PAA-934PH (CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) wurde in verschiedenen Mengen eines Phosphatpuffers (pH = 7,5), der 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt, solubilisiert, um die PAA-934PH-Adjuvanslösungen(-formulierungen) mit den im Folgenden in Tabelle 6 dargelegten variierenden Konzentrationen des PAA-934PH-Adjuvans zu produzieren.
  • Liposome, die aus jeweils Eigelb-Phosphatidylcholin (Sigma), Cholesterin (Sigma) und Cetylphosphat (Sigma) in einem Molverhältnis von 4:5:1 bestanden, wurden wie von de Haan et al. (Vaccine 13, 155-162, 1995) beschrieben hergestellt. Diese Liposome wurden dann in verschiedenen Mengen eines Phosphatpuffers (pH = 7,5), der 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt, suspendiert, um die Liposom-Adjuvanslösungen(-formulierungen) mit den im Folgenden in Tabelle 6 dargelegten variierenden Konzentrationen des Liposom-Adjuvans zu produzieren.
  • Al(OH)3 (SUPERFOS) wurde in verschiedenen Mengen eines Phosphatpuffers (pH = 7,5), der 15,16 Gramm Na2HPO4 und 2,83 Gramm NaH4PO4·2H2O pro Liter Reinstwasser enthielt, suspendiert, um die Al(OH)3-Adjuvanslösungen(-formulierungen) mit den im Folgenden in Tabelle 6 dargelegten variierenden Konzentrationen des Al(OH)3-Adjuvans zu produzieren.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 6 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zweiundvierzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sieben Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sieben Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen sechs Gruppen (Gruppe 2, 3, 4, 5, 6 und 7) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 6 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl einer bestimmten Vakzinformulierung in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2-7) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 6 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milz wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 6 dargelegt. TABELLE 6
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 10 6
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 72 34
    3 NDV/PAA-907 [2,5] 65 41
    4 NDV/PAA-934PH [2,5] 156 147
    5 NDV/Al(OH)3 [2,5] 6 2
    6 NDV/Liposome [0,5] 16 19
    7 NDV/CTB [0,5] 29 16
    IgA in der Milz
    1 NDV/Keines [0] 11 6
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 36 8
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 10
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, PAA-907, PAA-934PH, Al(OH)3, Liposomen und CTB auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 7 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 7 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • CTB und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 7 dargelegten Konzentrationen des CTB-Adjuvans hergestellt.
  • PAA-934PH (CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon, Liposom und die Adjuvansformulierungen davon und Al(OH)3 (SUPERFOS) und die Adjuvansformulierungen davon wurden alle wie oben in Beispiel 9 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 7 dargelegten Konzentrationen der jeweiligen Adjuvantien hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 7 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zweiundvierzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sieben Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sieben Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV- Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen sechs Gruppen (Gruppe 2, 3, 4, 5, 6 und 7) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 7 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2-7) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 7 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen von nur zwei Proben von Gruppe 1 bestimmt wurden.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 7 dargelegt. TABELLE 7
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 2 0
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 202 300
    3 NDV/PAA-907 [2,5] 12 1
    4 NDV/PAA-934PH [2,5] 126 97
    5 NDV/Al(OH)3 [2,5] 8 14
    6 NDV/Liposome [0,5] 11 14
    7 NDV/CTB [0,5] 62 32
    IgA in der Milz
    1 NDV/Keines [0] 14 3
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 21 7
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 11
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, PAA-907, PAA-934PH, Al(OH)3, Liposomen und CTB auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 8 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 8 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • CTB und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 8 dargelegten Konzentrationen des CTB-Adjuvans hergestellt.
  • PAA-934PH (CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon, Liposom und die Adjuvansformulierungen davon und Al(OH)3 (SUPERFOS) und die Adjuvansformulierungen davon wurden alle wie oben in Beispiel 9 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 8 dargelegten Konzentrationen der jeweiligen Adjuvantien hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 8 spezifiziert, wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zweiundvierzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sieben Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sieben Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen sechs Gruppen (Gruppe 2, 3, 4, 5, 6 und 7) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 8 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2-7) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 8 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 8 dargelegt. TABELLE 8
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 4 1
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 107 77
    3 NDV/PAA-907 [2,5] 11 7
    4 NDV/PAA-934PH [2,5] 10 3
    5 NDV/Al(OH)3 [2,5] 6 3
    6 NDV/Liposome [0,5] 51 36
    7 NDV/CTB [0,5] 62 65
    IgA in der Milz
    1 NDV/Keines [0] 8 3
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 40 5
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 12
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, PAA-907, PAA-934PH, Al(OH)3 auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 9 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 9 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • PAA-934PH (CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon und Al(OH)3 (SUPERFOS) und die Adjuvansformulierungen davon wurden alle wie oben in Beispiel 9 beschrieben mit den Konzentrationen des PAA-394PH-Adjuvans oder des Al(OH)3-Adjuvans, im Folgenden in Tabelle 9 dargelegt, hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Sechzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in zehn Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der zehn Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere von zwei Gruppen (Gruppe 1 und Gruppe 2) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen acht Gruppen (Gruppe 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 9 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1 und von Gruppe 2) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 3-10) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere von fünf der Gruppen (Gruppe 1, 3, 5, 7 und 9) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser fünf Gruppen (Gruppe 1, 3, 5, 7 und 9) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 3 (wie im Folgenden in Tabelle 9 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen- und der Milzzellen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • An Tag 28 (Woche 4) wurden die Versuchstiere der anderen fünf Gruppen (Gruppe 2, 4, 6, 8 und 10) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser fünf Gruppen (Gruppe 2, 4, 6, 8 und 10) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 2 und der Gruppe 4 (wie im Folgenden in Tabelle 9 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 6 und 8 bestimmt wurden.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1-4 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 9 dargelegt. TABELLE 9
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen
    3 Wochen nach der Immunisierung 4 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1, 2 NDV/Keines [0] 3 3 1 1
    3, 4 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 100 63 80 84
    5, 6 NDV/PAA-907 [2,5] 49 46 4 6
    7, 8 NDV/PAA-934PH [2,5] 161 129 72 27
    9, 10 NDV/Al(OH)3 [2,5] 9 5 6 3
    IgA in der Milz
    1,2 NDV/Keines [0] 13 8 1 1
    3, 4 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 30 5 4 3
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 13
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und PAA-907 auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung der Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 10 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 10 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Vierundachtzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in vierzehn Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der vierzehn Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere von zwei Gruppen (Gruppe 1 und Gruppe 2) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen zwölf Gruppen (Gruppe 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 und 14) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 10 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1 und von Gruppe 2) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 3-14) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere von sieben der Gruppen (Gruppe 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser sieben Gruppen (Gruppe 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 3 (wie im Folgenden in Tabelle 10 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • An Tag 28 (Woche 4) wurden die Versuchstiere der anderen sieben Gruppen (Gruppe 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser sieben Gruppen (Gruppe 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 2 und der Gruppe 4 (wie im Folgenden in Tabelle 10 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 10 und 12 bestimmt wurden.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zeilen in den Milzzellsuspensionen von drei Proben nur der Gruppen 1-4 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 10 dargelegt. TABELLE 10
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen
    3 Wochen nach der Immunisierung 4 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1, 2 NDV/Keines [0] 2 2 3 3
    3, 4 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 333 21 43 7
    5, 6 NDV/BUTYL-PAA [1,7] 304 131 312 55
    7, 8 NDV/BUTYL-PAA [5,0] 102 1 66 20
    9, 10 NDV/PAA-907 [0,5] 97 13 4 3
    NDV/PAA-907 [1,7] 640 67 78 0
    NDV/PAA-907 [5,0] 720 8 114 55
    IgA in der Milz
    1, 2 NDV/Keines [0] 25 4 6 2
    3, 4 NDV/BUTYL-PAA [1,7] 188 24 282 178
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 14
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und SL-CD/Squalan/Wasser auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 11 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • Sulfolipocyclodextrin/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierungen (SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierungen) wurden wie oben in Beispiel 5 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 11 dargelegten Konzentrationen des SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zweiundsiebzig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in zwölf Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der zwölf Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere von vier Gruppen (Gruppe 1, Gruppe 2, Gruppe 3 und Gruppe 4) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von Dosen von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen acht Gruppen (Gruppe 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 11 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere der Gruppen 1-4) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 5-12) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere von drei der Gruppen (Gruppe 1, 5 und 9) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen (Gruppe 1, 5 und 9) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 5 (wie im Folgenden in Tabelle 11 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • An Tag 28 (Woche 4) wurden die Versuchstiere von drei anderen Gruppen (Gruppe 2, 6 und 10) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen (Gruppe 2, 6 und 10) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 2 und der Gruppe 6 (wie im Folgenden in Tabelle 11 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • An Tag 35 (Woche 5) wurden die Versuchstiere von drei anderen Gruppen (Gruppe 3, 7 und 11) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen (Gruppe 3, 7 und 11) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 3 und der Gruppe 7 (wie im Folgenden in Tabelle 11 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • An Tag 49 (Woche 7) wurden die Versuchstiere von drei anderen Gruppen (Gruppe 4, 8 und 12) erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen (Gruppe 4, 8 und 12) wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 4 und der Gruppe 9 (wie im Folgenden in Tabelle 11 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von drei Proben nur der Gruppen 1-8 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 11 dargelegt.
  • Figure 00580001
  • Beispiel 15
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und SL-CD/Squalan/Wasser auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 12 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • Sulfolipocyclodextrin/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierungen (SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvansformulierungen) wurden wie oben in Beispiel 5 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 12 dargelegten Konzentrationen des SL-CD/Squalan/Wasser-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtzehn weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in drei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der drei Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen zwei Gruppen (Gruppe 2 und Gruppe 3) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenstammlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 12 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere der Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2 und 3) wurde an Tag 21 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 42 (Woche 6) wurden die Versuchstiere der drei Gruppen erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 12 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zeilen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppe 1 bestimmt wurden.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 12 dargelegt. TABELLE 12
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 6 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 Keines/Keines [0] 1 1
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 138 12
    3 NDV/SL-CD/Squalan/Wasser [2,5] 4 0
    IgA in der Milz
    1 Keines/Keines [0] 3 1
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 29 6
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 16
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und CTB auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 13 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • CTB und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 13 dargelegten Konzentrationen des CTB-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtzehn weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in drei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der drei Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere einer Gruppe (Gruppe 1) wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen zwei Gruppen (Gruppe 2 und Gruppe 3) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 13 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere der Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2 und 3) wurde an Tag 21 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 42 (Woche 6) wurden die Versuchstiere der drei Gruppen erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 13 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 13 dargelegt. TABELLE 13
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 6 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 1 0
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 4181 2589
    3 NDV/CTB [0,5] 23 16
    IgA in der Milz
    1 Keines/Keines [0] 1 1
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 13 3
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 17
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und Liposomen auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen davon mit den im Folgenden in Tabelle 14 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • Liposom und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 9 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 14 dargelegten Konzentrationen des Liposom-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtzehn weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in drei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der drei Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere der Gruppe 1 wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen zwei Gruppen (Gruppe 2 und Gruppe 3) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans- Gemische, die 20 μl der Antigenlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 14 spezifiziert, immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen NDV-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere der Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2 und 3) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere der drei Gruppen erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser drei Gruppen wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 14 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milzen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 14 dargelegt. TABELLE 14
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 23 13
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 411 211
    3 NDV/Liposome [85] 23 50
    IgA in der Milz
    1 NDV/Keines [0] 18 4
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 58 5
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 18
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, PAA-907, PAA-934PH, Liposomen und CTB auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungen- und Milzzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen davon mit den im Folgenden in Tabelle 15 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • Adjuvansformulierungen von PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 15 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • Adjuvansformulierungen von PAA-934PH (CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) und Adjuvansformulierungen von Al(OH)3 (SUPERFOS) wurden wie oben in Beispiel 9 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 15 dargelegten Konzentrationen des jeweiligen Adjuvans darin hergestellt.
  • CTB und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 15 dargelegten Konzentrationen des CTB-Adjuvans hergestellt.
  • Liposom und die Adjuvansformulierungen davon wurden wie oben in Beispiel 9 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 15 dargelegten Konzentrationen des Liposom-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Ein gereinigtes, inaktiviertes Influenzavirus, Stamm MRC-11, wurde bezogen (SOLVAY DUPHAR, Weesp, Niederlande) und in embryonalen Eiern wachsen gelassen, mittels Zentrifugierung auf einem Saccharosegradienten gereinigt und mittels Inkubation mit 0,05%-igem (v/v) β-Propiolacton plus 0,01%-igem (w/v) Thimerosal 4 Tage bei 4 °C und anschließend 3 Tage bei Raumtemperatur inaktiviert, wie in Vaccine 12, 653-660 (1994), beschrieben.
  • Dann wurde aus dem inaktivierten MRC-11 eine Antigenstammlösung hergestellt, die 50 µg Hämagglutinin von gereinigtem inaktiviertem Influenzavirusstamm MRC-11 pro ml Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) enthielt.
  • Die zu verwendende Vakzinformulierung wurde dann erhalten, indem 1 Volumen Antigenlösung mit 1 Volumen Adjuvanslösung gemischt wurde.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Sechsunddreißig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sechs Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sechs Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere der Gruppe 1 wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen MRC-11-Antigenstammlösung, wie oben beschrieben, und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen fünf Gruppen (Gruppen 2-6) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl der Antigenlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 15 spezifiziert, (wobei die Vakzinformulierungen wie oben beschrieben erhalten wurden) immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen MRC-11-Antigenstammlösung (an die Versuchstiere von Gruppe 1) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2-6) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere der sechs Gruppen erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser sechs Gruppen wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Im Fall der Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 2 (wie im Folgenden in Tabelle 15 spezifiziert) wurden ihre Milzen ebenfalls entnommen.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen und der Milz wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppe 1 bestimmt wurden und dass die Platten für den ELISPOT mit 25 µg gereinigtem inaktiviertem Influenzavirusstamm MRC-11 pro ml Überzugspuffer überzogen wurden.
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Milzzellsuspensionen von nur zwei Proben der Gruppen 1 und 2 bestimmt wurden und dass die Platten für den ELISPOT mit 25 µg gereinigtem inaktiviertem Influenzavirusstamm MRC-11 pro ml Überzugspuffer überzogen wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 15 dargelegt. TABELLE 15
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-NDV-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 MRC-11/Keines [0] 1 2
    2 MRC-11/BUTYL-PAA [2,5] 1943 837
    3 MRC-11/PAA-907 [2,5] 379 360
    4 MRC-11/PAA-934PH [2,5] 780 462
    5 MRC-11/Liposome [85] 1 1
    6 MRC-11/CTB [0,5] 82 57
    IgA in der Milz
    1 MRC-11/Keines [0] 0 0
    2 MRC-11/BUTYL-PAA [10] 23 3
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 19
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und PAA-907 auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen und die Anzahlen von Anti-RSA-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Der Butylester von Polyacrylsäure (BUTYL-PAA), wie oben in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen davon mit den im Folgenden in Tabelle 16 dargelegten Konzentrationen des Butyl-PAA-Adjuvans zu bilden.
  • Adjuvansformulierungen von PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich) wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben mit den im Folgenden in Tabelle 16 dargelegten Konzentrationen des PAA-907-Adjuvans hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die Newcastle-disease-Virus-Antigenstammlösung und die verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Rinderserumalbumin (RSA) (aus RSA, Fraktion V, SIGMA) wurde mittels Lösens in PBS mit einer Endkonzentration von 500 µg/ml hergestellt.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Sechsunddreißig weibliche Mäuse (NMRI, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sechs Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt.
  • An Tag 0 wurden die Versuchstiere jeder der sechs Gruppen mit Ether leicht betäubt.
  • Jedem der Versuchstiere der Gruppe 1 wurden dann Dosen von jeweils 40 μl verabreicht, die ein Gemisch von 20 μl der reinen NDV-Antigenstammlösung und 20 μl Phosphatpuffer, pH = 7,5 (oben beschrieben), enthielten, indem 20 μl dieses Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Jedem der Versuchstiere der Gruppe 4 wurden dann Dosen der reinen BSA-Antigenstammlösung von jeweils 40 μl verabreicht, indem 20 μl der Antigenstammlösung in jedes Nasenloch getropft wurden.
  • Jedes der Versuchstiere der übrigen vier Gruppen (Gruppe 2, 3, 5 und 6) wurde dann intranasal mit Dosen der Vakzinformulierungen (Antigen/Adjuvans-Gemische, die 20 μl einer bestimmten Antigenlösung und 20 μl einer bestimmten Adjuvansformulierung enthielten), von jeweils 40 μl, wie im Folgenden in Tabelle 16 spezifiziert, (wobei die Vakzinformulierungen wie oben beschrieben erhalten wurden) immunisiert, indem 20 μl des Gemischs in jedes Nasenloch jedes Versuchstiers getropft wurden.
  • Die Verabreichung entweder der reinen Vakzinformulierung (an die Versuchstiere der Gruppe 1 und der Gruppe 4) oder der Antigen/Adjuvans-Vakzinformulierungen (an die Versuchstiere der Gruppen 2, 3, 5 und 6) wurde an Tag 14 mit demselben Gemisch und unter Anwendung desselben Protokolls wie oben für Tag 0 beschrieben wiederholt.
  • Teil 4: Herstellung von Zellsuspensionen
  • An Tag 21 (Woche 3) wurden die Versuchstiere der sechs Gruppen erneut mit Ether betäubt und so viel Blut wie möglich aus jedem Venenplexus dieser abgenommen.
  • Die Versuchstiere dieser sechs Gruppen wurden dann mittels zervikaler Dislokation getötet und ihre Lungen vorsichtig entnommen, um das Einfließen von Blut in diese zu vermeiden.
  • Dann wurden Zellsuspensionen der Lungen wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Die Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Lungenzellsuspensionen wurde wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT für die Versuchstiere der Gruppen 4, 5 und 6 mit 25 µg RSA pro ml Überzugspuffer überzogen wurden.
  • Die Ergebnisse solcher Berechnungen sind unten in Tabelle 16 dargelegt. TABELLE 16
    Gruppe Antigen/Adjuvans [mg/ml] Anti-Antigen-Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV/Keines [0] 41 27
    2 NDV/BUTYL-PAA [2,5] 635 103
    3 NDV/PAA-907 [2,5] 189 140
    4 RSA/Keines [0] 0 0
    5 RSA/BUTYL-PAA [2,5] 117 108
    6 RSA/PAA-907 [2,5] 8 8
    • [mg/ml] ist mg Adjuvans/ml Adjuvanslösung
  • Beispiel 20
  • Synthese von Poly(acrylat-co-acrylamidomethylpropansulfonsäure)-Copolymer (p(A-c-AMPS))
  • Zwei p(A-c-AMPS)-Copolymere wurden wie von Iliopoulos und Audebert in Macromolecules 24, 2566-2575 (1991), beschrieben synthetisiert. In Kürze: Monoacrylsäure (AS; Merck) und Acrylamidomethylpropansulfonsäure (AMPS; Merck) wurden in Reinstwasser gelöst, der pH-Wert wurde mit 10 N NaOH-Lösung auf 7,4 eingestellt und Reinstwasser wurde auf eine endgültige Gesamtmonomerkonzentration von 2 M zugegeben. Luft wurde aus der Lösung abgezogen, indem sie mindestens 20 Min. durch Stickstoff geleitet wurde. (NH4)2S2O8 und Na2S2O5 wurden auf Endkonzentrationen von 1,46 mM bzw. 2,91 mM zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff und ständigem Rühren 2,25 Std. bei 24 °C oder 3 Std. bei 20 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein Überschuss an Methanol zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Der gebildete Niederschlag wurde in einer Lösung von 9 g NaCl pro I Reinstwasser zurückgewonnen und bei 4 °C dialysiert (Spectra/Por; MG-Cut-Off 12.000-14.000 D), bis in dem Diafiltrat keine Monomere mehr nachgewiesen wurden (Extinktion bei 210 nm < 0,1 Absorptionseinheiten), und dann gegen Reinstwasser dialysiert (Spectra/Por; MG-Cut-Off 12.000-14.000 D). Das Retentat wurde lyophilisiert und die Copolymere wurden als Pulver zurückgewonnen und bis zur Verwendung bei Umgebungstemperatur gelagert. Das Molekulargewicht der Polymere wurde mittels Gelpermationschromatographie auf einer Sephacryl-S400-Säule (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung von Polyacrylatpolymeren mit einem MG von 5, 90, 450, 750, 1000 und 3000 kD (Aldrich) als Standardsubstanzen und einer Extinktion von 210 nm als Erfassungssystem bestimmt. Der Prozentanteil von AMPS-Monomer in dem erhaltenen Copolymer wurde mittels Elementaranalyse bestimmt. Einzelheiten zum Herstellungsverfahren der Copolymere und zu den erhaltenen Copolymeren sind unten in Tabelle 17 dargelegt. Tabelle 17: Herstellung von Copolymer p(A-c-AMPS) Nr. 1 und Nr. 2 mittels Copolymerisation von Monoacrylsäure (AS) und Acrylamidomethylpropansulfonsäure (AMPS)
    Nr. AS (g) AMPS (g) Inkubationszeit (Std.) Inkubationstemp. (°C) % AMPS MG (kD)
    1 25,9 8,3 2,25 24 9 350
    2 38,9 12,4 3 20 12 370
  • Beispiel 21
  • Synthese von Poly(acrylat-co-vinylsulfonat)-Copolymer (p(A-c-VS))
  • Ein p(A-c-VS)-Copolymer wurde wie oben in Beispiel 20 für p(A-c-AMPS) beschrieben synthetisiert. In Kürze: Monoacrylsäure (AS; Merck) und Vinylsulfonsäure-Natriumsalz (VS; Fluka) wurden in Reinstwasser gelöst, der pH-Wert wurde mit 10 N NaOH-Lösung auf 7,4 eingestellt und Reinstwasser wurde auf eine endgültige Gesamtmonomerkonzentration von 2 M zugegeben. Luft wurde abgezogen, indem die Lösung mit Stickstoff gesättigt wurde. (NH4)2S2O8 und Na2S2O5 wurden auf Endkonzentrationen von 1,46 mM bzw. 2,91 mM zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff und ständigem Rühren 6 Std. bei 19 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein Überschuss an Methanol zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Der gebildete Niederschlag wurde in einer Lösung von 9 g NaCl pro I Reinstwasser zurückgewonnen und bei 4 °C dialysiert (Spectra/Por; MG-Cut-Off 12.000-14.000 D), bis in dem Diafiltrat keine Monomere mehr nachgewiesen wurden (Extinktion bei 210 nm < 0,1 Absorptionseinheiten), und dann gegen Reinstwasser dialysiert (Spectra/Por; MG-Cut-Off 12.000-14.000 D). Das Retentat wurde lyophilisiert und das Copolymer wurde als Pulver zurückgewonnen und bis zur Verwendung bei Umgebungstemperatur gelagert. Das Molekulargewicht des Polymers wurde mittels Gelpermationschromatographie auf einer Sephacryl-S400-Säule (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung von Polyacrylatpolymeren mit einem MG von 5, 90, 450, 750, 1000 und 3000 kD (Aldrich) als Standardsubstanzen und einer Extinktion von 210 nm als Erfassungssystem bestimmt. Der Prozentanteil von VS-Monomer in dem erhaltenen Copolymer wurde mittels Elementaranalyse bestimmt. Einzelheiten zum Herstellungsverfahren des Copolymers und zum Copolymer sind unten in Tabelle 18 dargelegt. Tabelle 18: Herstellung von Copolymer p(A-c-VS) Nr. 3 mittels Copolymerisation von Monoacrylsäure (AS) und Vinylsulfonsäure-Natriumsalz (VS)
    Nr. AS (g) VS (g) Inkubationszeit (Std.) Inkubationstemp. (°C) % VS MG (kD)
    3 34,6 47,9 6 19 33 300
  • Beispiel 22
  • Synthese von p(A-c-VBS)-Copolymeren
  • p(A-c-VBS)-Copolymere wurden wie oben in Beispiel 20 für p(A-c-AMPS) beschrieben synthetisiert. In Kürze: Monoacrylsäure (AS; Merck) und Vinylbenzolsulfonsäure-Natriumsalz (VBS) wurden in Reinstwasser gelöst, der pH-Wert wurde mit 10 N NaOH-Lösung auf 7,4 eingestellt und Reinstwasser wurde auf eine endgültige Gesamtmonomerkonzentration von 2 M zugegeben. Die Lösungen der zwei Monomere wurden mindestens 20 Min. mit Stickstoff gesättigt. (NH4)2S2O8 und Na2S2O5 wurden auf Endkonzentrationen von 1,46 mM bzw. 2,91 mM zugegeben. Die Gemische wurden unter Stickstoff und ständigem Rühren der Lösung 6 oder 24 Std. bei 20 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein Überschuss an Methanol zugegeben und die Gemische wurden über Nacht bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Die gebildeten Niederschläge wurden in einer Lösung von 9 g NaCl pro I Reinstwasser zurückgewonnen und bei 4 °C dialysiert (Spectra/Por; MG-Cut-Off 12.000-14.000 D), bis in dem Diafiltrat keine Monomere mehr nachgewiesen wurden (Extinktion bei 210 nm < 0,1 Absorptionseinheiten), und dann gegen Reinstwasser dialysiert (Spectra/Por; MG-Cut-Off 12.000-14.000 D). Die Retentate wurden lyophilisiert und die Copolymere wurden als Pulver zurückgewonnen und bis zur Verwendung bei Umgebungstemperatur gelagert. Das Molekulargewicht der Polymere wurde mittels Gelpermationschromatographie auf einer Sephacryl-S400-Säule (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung von Polyacrylatpolymeren von 5, 90, 450, 750, 1000 und 3000 kD (Aldrich) als Standardsubstanzen und einer Extinktion von 210 nm als Erfassungssystem bestimmt. Der Prozentanteil von VBS-Monomer in dem erhaltenen Copolymer wurde mittels Elementaranalyse bestimmt. Einzelheiten zum Herstellungsverfahren der Copolymere und zu den Copolymeren sind unten in Tabelle 19 dargelegt. Tabelle 19: Herstellung von Copolymer p(A-c-VBS) Nr. 4, Nr. 5, Nr. 6 und Nr. 8 mittels Copolymerisation von Monoacrylsäure (AS) und Vinylbenzolsulfonsäure-Natriumsalz (VBS)
    Nr. AS (g) VBS (g) Inkubationszeit (Std.) Inkubationstemp. (°C) % VBS MG (kD)
    4 34,6 24,7 24 20 55 > 800
    5 34,6 24,7 24 20 63 400
    6 34,6 24,7 6 20 73 400
    8 41,1 6,2 24 20 19 433
  • Beispiel 23
  • Synthese von p(A-c-VBS)-Copolymeren
  • Die p(A-c-VBS)-Copolymere Nr. 11 bis Nr. 18 wurden wie oben in Beispiel 22 für p(A-c-VBS) beschrieben synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Inkubationszeit zwischen 24 und 168 Std. betrug, die Inkubationstemperatur 37 °C war und die Copolymere mittels Diafiltration über eine 100-kD-(UPF-100-E6, AGFiltration) und eine 10-kD-Membran (UPF-10-E6, AGFiltration) zurückgewonnen wurde, was zwei Fraktionen von Polymeren mit einem MG von > 100 kD und 10-100 kD ergab. Das Polymer wurde lyophilisiert und bis zur Verwendung bei Umgebungstemperatur gelagert. Einzelheiten zu den Copolymeren und deren Herstellungsverfahren sind unten in Tabelle 20 ausgeführt. Tabelle 20: Herstellung von Copolymer p(A-c-VBS) Nr. 11 bis Nr. 18 mittels Copolymerisation von Monoacrylsäure (AS) und Vinylbenzolsulfonsäure-Natriumsalz (VBS)
    Nr. AS (g) VBS (g) Inkubationszeit (Std.) Inkubationstemp. (°C) % VBS MG* > 100 kD MG* 10-100 kD
    11 0 59,3 168 37 n. b. n. b. n. b.
    12 72,5 59,3 120 37 n. b. n. b. n. b.
    13 73,2 49,6 120 37 n. b. n. b. n. b.
    14 72,7 39,6 120 37 n. b. n. b. n. b.
    15 73,1 29,6 144 37 n. b. n. b. n. b.
    16 72,6 20,0 144 37 n. b. n. b. n. b.
    17 73,3 9,9 168 37 n. b. n. b. n. b.
    18 72,6 0,0 24 37 n. b. n. b. n. b.
    • Mittels Diafiltration über 100- und 10-kD-Membran erhaltene Fraktionen.
    • n. b. = nicht bestimmt.
  • Beispiel 24
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, p(A-c-VS)- und p-(A-c-VBS)-Copolymeren und Polystyrolsulfonat (PSS) auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA, p(A-c-VS) und p(A-c-VBS) wurden synthetisiert und wie oben in den Beispielen 2, 21 und 22 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 21 dargelegten Konzentrationen zu bilden.
  • Polystyrolsulfonat mit einem MG von 6000 kD (PSS, Polysience Inc.) wurde in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die Adjuvansformulierung mit der im Folgenden in Tabelle 21 dargelegten Konzentration des Polymers zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die im Folgenden in Tabelle 21 spezifizierten verschiedenen Vakzinformulierungen wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
  • Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Dreißig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in fünf Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 21 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methodik.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben.
  • Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 21 dargelegt. Tabelle 21
    Gruppe Antigen Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NOV Keines 54 38
    2 NOV BUTYL-PAA [2,5] 377 399
    3 NOV p(A-c-VS) Nr. 3 [2,5] 423 369
    4 NDV p(A-c-VBS) Nr. 5 [2,5] 1088 1097
    5 NDV PSS [2,5] 492 462
  • Beispiel 25
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, p(A-c-VS)- und p-(A-c-VBS)-Copolymeren und PSS auf die Anzahlen von Anti-NDV-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Beispiel 24 wurde wiederholt und die Ergebnisse sind unten in Tabelle 22 dargelegt. Tabelle 22
    Gruppe Antigen Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 NDV Keines 36 33
    2 NDV BUTYL-PAA [2,5] 538 557
    3 NDV p(A-c-VS) Nr. 3 [2,5] 113 99
    4 NDV p(A-c-VBS) Nr. 5 [2,5] 8705 4510
    5 NDV PSS [2,5] 492 462
  • Beispiel 26
  • Auswirkungen von p-(A-c-AMPS)-Copolymeren auf die Anzahlen von Anti-A/Swine-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • p(A-c-AMPS), wie oben in Beispiel 20 beschrieben synthetisiert, wurde in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die im Folgenden in Tabelle 23 dargelegte Adjuvansformulierung zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Das Antigenpräparat A/Swine: der Influenzavirusstamm A/Swine wurde in embryonalen Eiern wachsen gelassen, mittels Zentrifugierung auf einem Saccharosegradienten gereinigt und mittels Inkubation mit 0,05%-igem (v/v) Beta-Propiolacton plus 0,01%-igem (w/v) Thimerosal 4 Tage bei 4 °C und anschließend 3 Tage bei Raumtemperatur inaktiviert, wie in Vaccine 12, 653-660 (1994), beschrieben. Es wurde eine Antigenstammlösung von 250 µg HA pro ml hergestellt. Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 23 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der A/Swine-Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Sechsunddreißig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sechs Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 23 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methodik.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Swine pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden.
  • Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 23 dargelegt. TABELLE 23
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Swine [250] Keines 18 20
    2 A/Swine [250] p(A-c-AMPS) Nr. 1 [2,0] 21 29
    3 A/Swine [250] p(A-c-AMPS) Nr. 2 [2,0] 49 48
  • Beispiel 27
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, p(A-c-VS)-Copolymer, Dextransulfat (DXS) und PSS auf die Anzahlen von Anti-A/Swine-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Butyl-PAA, p(A-c-VS) und PSS wie oben in Beispiel 4, 22 bzw. 24 erhalten.
  • Dextransulfat mit einem MG von 500 kD (DXS; Pharmacia, Schweden) wurde in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die Adjuvansformulierung mit der im Folgenden in Tabelle 24 dargelegten Konzentration des Polymers zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • A/Swine-Antigenstammlösung, wie oben in Beispiel 26 beschrieben hergestellt, wurde auf Endkonzentrationen von 50 µg HA pro ml eingestellt.
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 24 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der oben beschriebenen A/Swine-Antigenstammlösung hergestellt.
  • Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Sechsunddreißig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen und in sechs Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 24 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methodik.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Swine pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden.
  • Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 24 dargelegt. Tabelle 24
    Gruppe Antigen [μg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Swine [50] Keines 21 16
    2 A/Swine [50] BUTYL-PAA [1,0] 40 46
    3 A/Swine [50] p(A-c-VS) Nr. 3 [1,0] 74 41
    4 A/Swine [50] p(A-c-VS) Nr. 3 [1,0] 32 24
    5 A/Swine [50] PSS [1,0] 15 29
    6 A/Swine [50] DXS [1,0] 38 64
  • Beispiel 28
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA auf die Anzahlen von Anti-A/Swine-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA wurde synthetisiert und wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierung mit der im Folgenden in Tabelle 25 dargelegten BUTYL-PAA-Konzentration zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • A/Swine-Antigenstammlösung, wie oben in Beispiel 26 beschrieben hergestellt, wurde auf Endkonzentrationen von 50, 150 und 500 µg HA pro ml eingestellt. Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 25 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen einer der oben beschriebenen A/Swine-Antigenstammlösungen hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Sechsunddreißig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in 6 Gruppen mit 6 Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 25 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie n Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten mit 50 µg Influenzastamm A/Swine pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden.
  • Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 25 dargelegt. Tabelle 25
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Swine [500] Keines 143 217
    2 A/Swine [150] Keines 50 42
    3 A/Swine [50] Keines 13 18
    4 A/Swine [500] BUTYL-PAA [1,0] 157 172
    5 A/Swine [150] BUTYL-PAA [1,0] 245 285
    6 A/Swine [50] BUTYL-PAA [1,0] 40 42
  • Beispiel 29
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA auf die Anzahlen von Anti-A/Swine-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA wurde synthetisiert und wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierung mit den im Folgenden in Tabelle 26 dargelegten verschiedenen Konzentrationen zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 26 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen einer der wie oben beschrieben hergestellten A/Swine-Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Vierundzwanzig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in vier Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 26 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Swine pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 26 dargelegt. Tabelle 26
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwer SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Swine [250] Keines 441 421
    2 A/Swine [250] BUTYL-PAA [1,0] 932 447
    3 A/Swine [250] BUTYL-PAA [1,5] 1487 1118
    4 A/Swine [250] BUTYL-PAA [2,0] 1454 2127
  • Beispiel 30
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvans- und Antigenformulierungen
  • BUTYL-PAA wurde synthetisiert und wie oben in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, um die Adjuvansformulierung mit der im Folgenden in Tabelle 27 dargelegten Konzentration zu bilden. Antigenpräparat A/Texas: Der Influenzavirusstamm A/Texas (Texas) wurde in embryonalen Eiern wachsen gelassen, mittels Zentrifugierung auf einem Saccharosegradienten gereinigt und mittels Inkubation mit 0,05%-igem (v/v) Beta-Propiolacton plus 0,01%-igem (w/v) Thimerosal 4 Tage bei 4 °C und anschließend 3 Tage bei Raumtemperatur inaktiviert, wie in Vaccine 12, 653-660 (1994), beschrieben. Hämagglutinin/Neuramidase-Untereinheiten (HA/NA-Untereinheiten) des Virus wurden unter Verwendung eines Detergens bzw. von Detergentien vom Virus isoliert. Es wurde eine Antigenstammlösung von 250 µg HA pro ml hergestellt.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 27 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der wie oben beschrieben hergestellten A/Texas-Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Zwölf weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in zwei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 27 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 27 dargelegt. Tabelle 27
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 0 0
    2 2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 1245 1315
  • Beispiel 31
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Der Versuch von Beispiel 30 wurde wiederholt und die Ergebnisse sind unten in Tabelle 28 dargelegt. Tabelle 28
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 0 0
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 4409 4489
  • Beispiel 32
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und p(A-c-VBS)-Copolymeren auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA und p(A-c-VBS) wurden wie oben in Beispiel 4 bzw. 21 beschrieben synthetisiert und in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 29 dargelegten Konzentrationen zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 29 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der wie oben in Beispiel 30 beschrieben hergestellten A/Texas-Antigenstammlösung hergestellt.
  • Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Vierundzwanzig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in vier Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 29 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 29 dargelegt. Tabelle 29
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 0 0
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 431 559
    3 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 5 [2,0] 664 1403
    4 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 6 [2,0] 78 107
  • Beispiel 33
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und p(A-c-VBS)-Copolymeren auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • Beispiel 32 wurde mit zwei Formulierungen des p(A-c-VBS)-Copolymer-Adjuvans wiederholt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 30 dargelegt. Tabelle 30
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 14 22
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 2014 2099
    3 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 5 [2,0] 8784 13800
  • Beispiel 34
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA, Dextransulfat (DXS) und Polystyrolsulfonat (PSS) auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA, PSS und DXS wurden wie oben in Beispiel 4, 24 bzw. 27 beschrieben synthetisiert, um die Adjuvantien mit den im Folgenden in Tabelle 31 dargelegten Konzentrationen zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 31 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der wie oben in Beispiel 30 beschrieben hergestellten A/Texas-Antigenstamm lösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Vierundzwanzig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in vier Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 31 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 31 dargelegt. Tabelle 31
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 3 8
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 9179 17420
    3 A/Texas [250] DXS [2,0] 6 7
    4 4 A/Texas [250] PSS [2,0] 1613 2225
  • Beispiel 35
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und verschiedenen p(A-c-VBS)-Copolymeren auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA und p(A-c-VBS)-Copolymere wurden wie oben in Beispiel 4 und 23 beschrieben synthetisiert, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 32 dargelegten Konzentrationen zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 32 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der wie oben in Beispiel 30 beschrieben hergestellten A/Texas-Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtundvierzig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in 8 Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 32 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 32 dargelegt. Tabelle 32
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 12 27
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 16887 24708
    3 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 13a [2,0] 14443 22667
    4 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 14a [2,0] 4319 4080
    5 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 15a [2,0] 5642 6438
    6 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 16a [2,0] 2923 2870
    7 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 17a [2,0] 2629 2135
    8 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 18a [2,0] 135 123
  • Beispiel 36
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und verschiedenen p(A-c-VBS)-Copolymeren auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA und p(A-c-VBS)-Copolymere wurden wie oben in Beispiel 4 und 23 beschrieben synthetisiert, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 33 dargelegten Konzentrationen zu bilden. Die zwei Fraktionen mit einem MG von 10-100 und > 100 kd der p(A-c-VBS)-Copolymere Nr. 12, Nr. 13 und Nr. 16, wie oben in Beispiel 23 beschrieben synthetisiert und gereinigt, wurden in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die Adjuvansformulierung mit der im Folgenden in Tabelle 33 dargelegten Konzentration des p(A-c-VBS)-Adjuvans zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 33 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der wie oben in Beispiel 30 beschrieben hergestellten A/Texas-Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtundvierzig weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in 8 Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 33 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 33 dargelegt. Tabelle 33
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 6 16
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 6417 7783
    3 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 12, 10-100 kD [2,0] 223 390
    4 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 13, 10-100 kD [2,0] 1139 1474
    5 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 16, 10-100 kD [2,0] 55 99
    6 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 12, 100 kD [2,0] p(A-c-VBS) Nr. 20796 25319
    7 A/Texas [250] 13, 100 kD [2,0] p(A-c-VBS) Nr. 16, 100 kD [2,0] 12219 20102
    8 A/Texas [250] 6530 7593
  • Beispiel 37
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und p(A-c-VBS)-Copolymer Nr. 5 auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA und das p(A-c-VBS)-Copolymer Nr. 5 wurden wie oben in Beispiel 4 und 22 beschrieben synthetisiert, um die Adjuvansformulierungen mit den im Folgenden in Tabelle 34 dargelegten Konzentrationen zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 34 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der wie oben in Beispiel 30 beschrieben hergestellten A/Texas-Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtzehn weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in drei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 34 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 34 dargelegt. Tabelle 34
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zeilen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 5 13
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 1747 1995
    3 A/Texas [250] p(A-c-VBS) Nr. 5 [2,0] 14951 15294
  • Beispiel 38
  • Auswirkungen von BUTYL-PAA und CTB auf die Anzahlen von Anti-A/Texas-IgA-produzierenden Zellen in Lungenzellsuspensionen
  • Teil 1: Herstellung von Adjuvansformulierungen
  • BUTYL-PAA, wie oben in Beispiel 4 beschrieben synthetisiert, wurde in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die im Folgenden in Tabelle 35 dargelegte Adjuvansformulierung zu bilden. CTB wurde in Phosphatpufferlösung (pH = 7,5) gelöst, um die Adjuvansformulierung mit der im Folgenden in Tabelle 35 dargelegten CTB-Konzentration zu bilden.
  • Teil 2: Herstellung der Vakzinformulierungen
  • Die verschiedenen Vakzinformulierungen, im Folgenden in Tabelle 35 spezifiziert, wurden dann mittels Mischens eines Volumens der jeweiligen Adjuvansformulierungen, wie oben beschrieben hergestellt, mit einem Volumen der Antigenstammlösung hergestellt. Die Phosphatpufferlösung (pH = 7,5), wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wurde im folgenden Versuch als eine Kontrolle verwendet.
  • Teil 3: Immunisierung der Versuchstiere
  • Achtzehn weibliche Mäuse (BALG/c, Charles River, Deutschland) wurden bezogen, in drei Gruppen mit sechs Versuchstieren pro Gruppe aufgeteilt und mit den in Tabelle 35 ausgeführten Vakzinen behandelt, gemäß der allgemeinen Methodik von Beispiel 4.
  • Teil 4: Herstellung der Zellsuspensionen
  • Wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Teil 5: Bestimmung der Anzahl von antigenspezifischen IgA-produzierenden Zellen in den Zellsuspensionen
  • Wie oben in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten für den ELISPOT mit 50 µg Influenzastamm A/Texas pro ml in Beispiel 4 beschriebenem Überzugspuffer überzogen wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 35 dargelegt. Tabelle 35
    Gruppe Antigen [µg/ml] Adjuvans [mg/ml] Spezifische Ig-produzierende Zellen/106 Zellen 3 Wochen nach der ersten Immunisierung
    Mittelwert SEM
    IgA in den Lungen
    1 A/Texas [250] Keines 1 3
    2 A/Texas [250] BUTYL-PAA [2,0] 25437 24105
    3 A/Texas [250] CTB [2,0] 961 846

Claims (3)

  1. Verwendung eines wasserlöslichen polyanionischen Polymers zur Herstellung eines mukosalen Adjuvans zur Induktion oder Verstärkung von mukosalen Immunantworten auf Antigene, wobei das polyanionische Polymer aus zwei unterschiedlichen an ionischen strukturellen Wiederholungseinheiten besteht, wobei eine Einheit Acrylsäure ist und die andere Einheit aus Vinylsulfonsäure oder Acrylamidomethylpropansulfonsäure ausgewählt ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, die weiterhin eine wässrige Lösung des wasserlöslichen Polymers in einem flüssigen Medium umfasst.
  3. Verwendung eines mukosalen Adjuvans, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, zur Herstellung eines mukosalen Vakzins zur Behandlung von Atemwegserkrankungen, Magen-Darm-Erkrankungen oder sexuell übertragbare Krankheiten.
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