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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf antivirale Mittel und insbesondere auf
Dendrimere, bei denen sich gezeigt hat, dass sie eine erhebliche
antivirale Aktivität
gegen das humane Immunschwächevirus
(HIV) und andere komplexe Viren haben.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es
wurde festgestellt, dass bestimmte sulfonierte Polysaccharidverbindungen
antivirale Wirkung aufweisen, wenn sie gegen HIV durchmustert werden,
doch sind diese Verbindungen relativ instabil, und dementsprechend
sind große
Mengen dieser Verbindungen erforderlich, um effektive antivirale
Wirkungen zu erhalten. Außerdem
sind viele dieser Verbindungen, einschließlich zum Beispiel Heparin
und Dextransulfat, starke Antikoagulantien, und wegen dieser Aktivität sind sie
für die
klinische Verwendung als antivirale Mittel nicht besonders gut geeignet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von antiviralen Mitteln
bereit, die auf einer bestimmten Art von Polymer beruhen, die hier
als "Dendrimer" bezeichnet wird
und die eine erhebliche antivirale Aktivität gegen HIV1 und HIV2, CMV
und HSV aufweisen und die im Wesentlichen keine gerinnungshemmende Aktivität zeigen.
Diese Verbindungen sind daher für
die prophylaktische und therapeutische Verwendung als antivirale
Mittel beim Menschen gut geeignet.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine antivirale Verbindung gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
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Ein
solches Dendrimer wird hier als "anionisches
oder kationisches Dendrimer" bezeichnet,
und dieser Ausdruck wird in der gesamten Beschreibung und den folgenden
Ansprüchen
so verwendet, dass er nicht nur die Dendrimere an sich, sondern
auch ihre pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Salze umfasst,
zum Beispiel die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, wie die
Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Dendrimere
sind makromolekulare, hochgradig verzweigte Verbindungen, die durch
wiederholte Reaktionssequenzen ausgehend von einem anfänglichen
Kernmolekül
gebildet werden, wobei aufeinanderfolgende Schichten oder Stufen
in aufeinanderfolgenden "Generationen" hinzugefügt werden,
so dass eine dreidimensionale, hochgeordnete polymere Verbindung
aufgebaut wird. Eine verallgemeinerte Dendrimerstruktur ist in 1 gezeigt.
Dendrimere sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet: (i)
einen Starterkern (I), der eine oder mehrere reaktive Stellen aufweisen
und punktartig oder von erheblicher Größe sein kann, so dass er die
endgültige
Topologie des Dendrimers beeinflusst; (ii) Schichten von verzweigten
Repetiereinheiten, die an den Starterkern gebunden sind; (iii) funktionelle
terminale Gruppen (Z), die an die Oberfläche des Dendrimers gebunden
sind. Die vorliegende Erfindung verwendet dendritische Strukturen
als Gerüste
für die
Bindung von ionischen Struktureinheiten; die Erfindung ist nicht
auf die sphärischen
Dendrimere beschränkt,
die hier im Einzelnen beschrieben sind, sondern kann auf jeder dendritischen Struktur
beruhen. Die Variabilität
von Dendrimeren in Bezug sowohl auf Form als auch Konstitution ist
dem Fachmann wohlbekannt.
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Die
Herstellung von Dendrimeren ist wohlbekannt und ist zum Beispiel
in den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 (die Dendrimere auf
der Basis von Schichten von Lysineinheiten beschreiben) sowie in
den US-Patenten Nr. 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329
(die Dendrimere auf der Basis von anderen Einheiten beschreiben,
einschließlich
Polyamidoamin- oder PAMAM-Dendrimeren)
beschrieben. Die in diesen US-Patenten offenbarten Dendrimere sind
als geeignet für
Verwendungen wie als Oberflächenmodifizierungsmittel,
als Metallchelatoren, als Demulgatoren oder Öl/Wasser-Emulsionen, Nassfestigkeitsmittel
bei der Herstellung von Papier und als Mittel zum Modifizieren der
Viskosität
in wässrigen
Zubereitungen, wie Lacken, beschrieben. In den US-Patenten Nr. 4,289,872
und 4,410,688 wird auch vorgeschlagen, dass die Dendrimere auf der
Basis von Lysineinheiten als Substrate für die Herstellung von pharmazeutischen
Darreichungsformen verwendet werden können.
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Die
internationalen Patentschriften Nr. WO 88/01178, WO 88/01179 und
WO 88/01180 offenbaren Konjugate, bei denen ein Dendrimer mit einem
anderen Material, wie einem pharmazeutischen oder agrikulturellen
Material auf einem Träger,
konjugiert oder assoziiert ist. Diese Patentschriften zusammen mit
den oben genannten US-Patenten enthalten eine breite Offenbarung
von verschiedenen Dendrimeren und Verfahren zu deren Herstellung.
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EP-A-O
328 403, EP-A-O 339 695, WO 93/03766 und
US 5,229,490 beschreiben allesamt
verschiedene multiple antigenische Peptidsysteme, Verfahren zur
Herstellung solcher Systeme und Verwendungen solcher Systeme. Die
multiplen antigenischen Peptidsysteme dieser Literaturstellen des
Standes der Technik sind in der Lage, eine Immunantwort hervorzurufen,
wenn sie einem Patienten verabreicht werden. EP-A-O 328 403 beschreibt
insbesondere Polypeptide, die für
eine immunologische Konkurrenz mit HIV-gp120 wenigstens eines der
Stämme
des HIV-Retrovirus sorgen können.
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Die
Synthese von dendritischen Sialosid-Inhibitoren des Influenza-A-Virus-Hämagglutinins ist bei Roy et
al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1993, S. 1869–1993, offenbart.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Dendrimer" ist in seinem weitesten
Sinn zu verstehen und umfasst alle Formen und Zusammensetzungen
dieser Dendrimere, wie in den Patentschriften Nr. WO 88/01178, WO 88/01179
und WO 88/01180 offenbart ist. Der Ausdruck umfasst auch miteinander
verknüpfte
oder verbrückte Dendrimere,
wie in diesen Patentschriften offenbart ist.
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Die
bevorzugten Dendrimere der vorliegenden Erfindung umfassen einen
mehrwertigen Kern, der kovalent an wenigstens zwei dendritische
Zweige gebunden ist und sich vorzugsweise über wenigstens zwei Generationen
erstreckt. Besonders bevorzugte Dendrimere sind Polyamidoamin(PAMAM)-Dendrimere, PAMAM(EDA)-Dendrimere
und Polylysin-Dendrimere.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist an wenigstens eine und vorzugsweise an eine erhebliche
Zahl der Endgruppen auf der Oberfläche des Dendrimers eine anionische
oder kationische Struktureinheit kovalent gebunden. Die Zweige des
Dendrimers können
in Aminogruppen oder anderen funktionellen reaktiven Gruppen, wie
OH oder SH, enden, die anschließend
mit den kationischen und anionischen Struktureinheiten, die die äußere Schicht
des Dendrimers bilden, umgesetzt werden können. Wenn die Endgruppen des
Dendrimers Amingruppen sind, kann die anionische oder kationische
Struktureinheit über
eine Vielzahl von funktionellen Gruppen einschließlich Amid-
und Thioharnstoff-Bindungen an das Dendrimer gebunden sein. Bevorzugte
anionische oder kationische Struktureinheiten, die an die Endgruppen
des Dendrimers gebunden sein können, sind
sulfonsäurehaltige
Struktureinheiten, carbonsäurehaltige
Struktureinheiten, die von 2-Thiosialinsäure-Struktureinheit verschieden
sind, Trimethylammonium enthaltende Struktureinheiten oder Polyaminomakrocyclen
enthaltende Struktureinheiten.
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Geeignete
anionische und kationische Struktureinheiten, die an die Amino-
oder anderen Endgruppen von Dendrimeren gebunden sein können, sind
zum Beispiel die folgenden Gruppen (wobei n = 0 oder eine positive
ganze Zahl ist und n besonders bevorzugt = 0 oder eine ganze Zahl
von 1 bis 20 ist):
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Besondere
Struktureinheiten, die gemäß dieser
Erfindung an die Endgruppen des Dendrimers gebunden sein können, sind
Alkylsulfonsäuregruppen;
Sulfoacetamidgruppen; Sulfosuccinamsäuregruppen; N-Sulfoalkylsuccinamidgruppen,
wie N-(2-Sulfoethyl)succinamidgruppen; Aryl- oder Heteroarylthioharnstoffe,
die mit einer oder mehreren Sulfonsäuregruppen substituiert sind,
wie 4-Sulfophenylthioharnstoffgruppen, 3,6-Disulfonaphthylthioharnstoffgruppen,
4-Sulfonaphthylthioharnstoffgruppen, 3,5-Disulfophenylthioharnstoffgruppen
und 3,6,8-Trisulfonaphthylthioharnstoffgruppen; Aryl- oder Heteroarylamide,
die mit einer oder mehreren Sulfonsäure-, Sulfoalkyl-, Sulfoalkoxy-,
Sulfoalkylamino- oder Sulfoalkylthiogruppen substituiert sind, wie
4-(Sulfomethyl)benzamidgruppen oder 4-Sulfobenzamidgruppen; Aryl- oder Heteroarylalkanamide, die
mit einer oder mehreren Sulfonsäuregruppen
substituiert sind, wie N-(4-Sulfophenyl)propanamidgruppen; Aryl-
oder Heteroarylharnstoffe, die mit einer oder mehreren Sulfonsäuregruppen
substituiert sind, wie 4-Sulfophenylharnstoffgruppen; N,N,N-Trimethylderivate
von Aminosäuren,
wie N,N,N-Trimethylglycinamingruppen; Aryl- oder Heteroarylamide,
die mit einer oder mehreren Trialkylamino-, Trialkylaminoalkyl-,
Trialkylaminoalkyloxy-, Trialkylaminoalkylamino- oder Trialkylaminoalkylthiogruppen
substituiert sind, wie 4-Trimethylammoniumbenzamid- oder 4-(Trimethylammoniummethyl)benzamidgruppen;
N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamidgruppen;
Guanidinogruppen; 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamingruppen; oder makrocyclische
Polyaminogruppen, die einen oder mehrere makrocyclische Ringe enthalten,
die über
eine Alkyl- oder Aryl-Spacereinheit an die Endgruppe des Dendrimers
gebunden sind, wie 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamidgruppen.
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Die
anionischen oder kationischen Dendrimere dieser Erfindung können nach
chemischen Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann
wohlbekannt sind. Geeignete Verfahren sind beispielhaft in den folgenden
Beispielen 1 bis 20 beschrieben.
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Wie
bereits beschrieben, hat sich gezeigt, dass die anionischen oder
kationischen Dendrimere der vorliegenden Erfindung eine erhebliche
antivirale Aktivität
aufweisen, insbesondere gegen HIV. Dementsprechend sind diese anionischen oder
kationischen Dendrimere für
die prophylaktische und therapeutische Behandlung von viralen Infektionen
geeignet, zum Beispiel Infektionen durch HIV1 und HIV2 und andere
komplexe Viren einschließlich
Flaviviren, wie Hepatitis-B- und Hepatitis-C-Virus, Virus der Bovinen
Virus-Diarrhöe, Humaninfluenzavirus
A und B, Rhinovirus, Humanes Parainfluenza-Virus, Respiratory Syncytial
Virus (RSV), Varicella-zoster-Virus (VZV), Humanes Cytomegalievirus
(CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Humanes Papillom-Virus (HPV), Adenovirus-8,
Herpessimplex-Virus (HSV) Typ 1 und 2, Masernvirus und Vesikuläres Stomatitis-Virus
(VSV).
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung also eine
pharmazeutische oder veterinärmedizinische
Zusammensetzung zur prophylaktischen oder therapeutischen antiviralen
Behandlung eines Menschen oder eines nichthumanen Tiers, die ein
anionisches oder kationisches Dendrimer, wie es oben ausführlich diskutiert
wurde, in Verbindung mit wenigstens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch
annehmbaren Träger
oder Verdünnungsmittel
umfasst.
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Die
Zubereitung solcher Zusammensetzungen ist dem Fachmann auf diesem
Gebiet wohlbekannt. Zu den geeigneten pharmazeutisch annehmbaren
Trägern
und/oder Verdünnungsmitteln
gehören
beliebige und alle herkömmlichen
Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Füllstoffe,
festen Träger,
wässrigen
Lösungen,
Beschichtungen, antibakteriellen und fungiziden Mittel, isotonischen
und resorptionsverzögernden
Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel
für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt und ist zum Beispiel
in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA,
beschrieben. Die Verwendung von jedem herkömmlichen Medium oder Mittel in
den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
wird in Betracht gezogen, solange es mit dem Wirkstoff verträglich ist.
Ergänzende
Wirkstoffe können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
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Zur
leichteren Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung ist es besonders
vorteilhaft, Zusammensetzungen in Form von Darreichungsformen zuzubereiten.
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"Darreichungsform" bezieht sich hier
auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosiseinheiten für die zu
behandelnden menschlichen Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit
eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die so berechnet ist, dass
die gewünschte
therapeutische Wirkung erzielt wird, in Verbindung mit dem erforderlichen
pharmazeutischen Träger
und/oder Verdünnungsmittel
enthält.
Die genauen Eigenschaften der neuen Darreichungsformen der Erfindung
werden bestimmt und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen
Merkmalen des Wirkstoffs und der besonderen therapeutischen Wirkung,
die erzielt werden soll, und (b) den Einschränkungen, die der Technik des
Compoundierens eines solchen Wirkstoffs für die besondere Behandlung
inhärent
sind.
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
für die
prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer HIV- oder anderen
viralen Infektion bei einem Menschen oder nichthumanen Tier bereit,
das die Verabreichung einer prophylaktisch oder therapeutisch antiviral
wirksamen Menge eines anionischen oder kationischen Dendrimers,
wie es oben ausführlich
diskutiert wurde, an den Menschen oder das Tier umfasst.
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In
noch einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung die Verwendung
einer prophylaktisch oder therapeutisch antiviral wirksamen Menge
eines anionischen oder kationischen Dendrimers, wie es oben ausführlich diskutiert
wurde, bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung
oder bei der Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen
oder therapeutischen Behandlung einer HIV- oder anderen viralen
Infektion bei einem Menschen oder nichthumanen Tier bereit.
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Eine
Vielzahl von Verabreichungswegen steht zur Verfügung. Die besondere gewählte Methode
wird selbstverständlich
von dem besonderen behandelten Zustand und der für therapeutische Wirksamkeit
erforderlichen Dosierung abhängen.
Die Verfahren dieser Erfindung können
allgemein gesagt unter Verwendung einer beliebigen medizinisch annehmbaren
Verabreichungsmethode angewendet werden, was jede Methode bedeutet,
die therapeutische Konzentrationen der aktiven Komponente der Erfindung
erzeugt, ohne klinisch unannehm bare nachteilige Wirkungen zu verursachen.
Zu diesen Verabreichungsmethoden gehören die orale, rektale, topische,
nasale, transdermale oder parenterale (z.B. subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung.
Zu den Zubereitungen für
die orale Verabreichung gehören
diskrete Einheiten, wie Kapseln, Tabletten, Pastillen und dergleichen.
Andere Wege sind die intrathekale Verabreichung direkt in den Liquor,
die direkte Einführung,
wie etwa durch verschiedene Katheter- und Ballon-Angioplastie-Vorrichtungen,
die dem Fachmann wohlbekannt sind, und die intraparenchymale Injektion
in die Zielbereiche.
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Die
Zusammensetzungen können
zweckmäßigerweise
in Darreichungsform präsentiert
und nach einem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren
hergestellt werden. Zu diesen Verfahren gehören der Schritt des Verbindens
der aktiven Komponente mit einem Träger, der einen oder mehrere
Hilfsbestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen
hergestellt, indem man die aktive Komponente gleichmäßig und
innig mit einem flüssigen
Träger,
einem feinteiligen festen Träger
oder beiden in Verbindung bringt und dann gegebenenfalls das Produkt
formt.
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Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet
sind, können
als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder
Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge der aktiven Komponente
enthalten, in Liposomen oder als Suspension in einer wässrigen
Flüssigkeit oder
einer nichtwässrigen
Flüssigkeit,
wie einem Sirup, einem Elixier oder einer Emulsion, präsentiert
werden.
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Zusammensetzungen,
die für
die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen zweckmäßigerweise
ein steriles wässriges
Präparat
der aktiven Komponente, das vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch
ist. Dieses wässrige
Präparat
kann nach bekannten Verfahren unter Verwendung solcher geeigneten
Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel zubereitet werden.
Das sterile injizierbare Präparat kann
auch eine sterile injizierbare Lösung
oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel
oder Lösungsmittel,
zum Beispiel eine Lösung
in Polyethylen glycol, sein. Zu den annehmbaren Trägern und
Lösungsmitteln,
die eingesetzt werden können,
gehören
Wasser, Ringer-Lösung
und isotonische Natriumchloridlösung.
Außerdem
werden herkömmlicherweise
sterile fette Öle
als Lösungsmittel
oder Suspendiermedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes milde
fette Öl
einschließlich
synthetischer Mono- oder Diglyceride eingesetzt werden. Außerdem finden
Fettsäuren,
wie Oleinsäure,
in dem injizierbaren Präparat
Verwendung.
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Andere
Abgabesysteme können
Abgabesysteme mit nachhaltiger Freisetzung umfassen. Bevorzugte Abgabesysteme
mit nachhaltiger Freisetzung sind solche, die für die Freisetzung der aktiven
Komponente der Erfindung in Pellets oder Kapseln mit nachhaltiger
Freisetzung sorgen können.
Viele Arten von Abgabesystemen mit nachhaltiger Freisetzung sind
bekannt. Dazu gehören
unter anderem: (a) Erosionssysteme, bei denen die aktive Komponente
innerhalb einer Matrix enthalten ist, und (b) Diffusionssysteme,
bei denen die aktive Komponente mit einer kontrollierten Geschwindigkeit
durch ein Polymer dringt. Außerdem
kann ein Abgabegerät
auf Pumpenbasis verwendet werden, von denen einige zur Implantation
geeignet sind.
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Die
aktive Komponente wird in prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen
Mengen verabreicht. Eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame
Menge bedeutet eine Menge, die notwendig ist, um wenigstens teilweise
die gewünschte
Wirkung zu erreichen oder das Einsetzen des behandelten Zustands
oder dessen Fortschreiten zu verzögern oder dessen Einsetzen
oder Fortschreiten ganz zu unterbinden. Diese Menge wird selbstverständlich von
dem besonderen behandelten Zustand, der Schwere des Zustands und
den individuellen Patientenparametern einschließlich des Alters, der körperlichen
Verfassung, der Größe, des
Gewichts und der gleichzeitigen Behandlung abhängen. Diese Faktoren sind dem
Fachmann wohlbekannt und können
mit bloßen
Routineversuchen angegangen werden. Im Allgemeinen wird vorzugsweise
eine maximale Dosis verwendet, d.h. die höchste, nach zuverlässigem medizinischem
Urteil noch unbedenkliche Dosis. Der Fachmann wird sich jedoch darüber im Klaren
sein, dass aus medizinischen Gründen,
psychologischen Gründen
oder aus praktisch beliebigen anderen Gründen auch eine niedrigere Dosis
oder tolerierbare Dosis verabreicht werden kann.
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Im
Allgemeinen betragen die täglichen
oralen Dosen der aktiven Komponente etwa 0,01 mg/kg pro Tag bis
1000 mg/kg pro Tag. Anfangs können
kleine Dosen (0,01–1
mg) verabreicht werden, gefolgt von steigenden Dosen bis zu etwa
1000 mg/kg pro Tag. Falls ein Patient auf solche Dosen ungenügend anspricht,
können noch
höhere
Dosen (oder effektiv höhere
Dosen über
einen anderen, besser lokalisierten Verabreichungsweg) eingesetzt
werden, soweit der Patient sie verträgt. Mehrere Dosen pro Tag werden
in Betracht gezogen, um geeignete systemische Konzentrationen von
Verbindungen zu erreichen.
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In
der gesamten Beschreibung und den folgenden Ansprüchen impliziert
das Wort "umfassen" oder Variationen
davon, wie "umfasst" oder "umfassend", wenn der Kontext
nichts anderes verlangt, den Einschluss einer angegebenen ganzen
Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen, aber nicht den Ausschluss irgendeiner
anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen.
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Weitere
Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen
hervor, die zur Veranschaulichung, aber nicht zur Einschränkung der
Erfindung aufgenommen sind. In den folgenden Beispielen bezieht
sich "PAMAM-Dendrimere auf Polyamidoamin-Dendrimere
auf der Basis eines Ammoniakkerns, wie es ausführlich in den US-Patenten Nr.
4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329 wiedergegeben ist; "PAMAM(EDA)-Dendrimere" bezieht sich auf
Polyamidoamin-Dendrimere auf der Basis eines Ethylendiamin-Kerns;
und "BHAlysxlysylysZ-Dendrimere" bezieht sich auf
unsymmetrische Polylysin-Dendrimere auf der Basis eines Benzhydrylamin-Kerns
und Lysin-Verzweigungseinheiten, wie es in den US-Patenten Nr. 4,289,872
und 4,410,688 beschrieben ist. Die Polyamidoamin-Dendrimere PAMAM
1.0, PAMAM 2.0, PAMAM 3.0, PAMAM 4.0, PAMAM 5.0 oder höhere Generationen,
PAMAM 4.0 (EDA) und die Polylysin-Dendrimere BHAlyslys2,
BHAlyslys2lys4,
BHAlyslys2lys4lys8 und BHAlyslys2lys4lys8lys16,
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32, BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64 oder höhere Generationen
werden so hergestellt, wie es in den US-Patenten Nr. 4,289,872, 4,410,688,
4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329 und in den internationalen
Patentschriften WO 88/01178, WO 88/01179 und WO 88/01180, auf die
oben Bezug genommen wurde, beschrieben ist.
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Beispiel 1 Reaktion von
Polymeren mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure unter Bildung von Dendrimeren
mit Sulfonsäure-Endgruppen
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A. PAMAM 1.0
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Festes
Natriumcarbonat (0,13 g; 1,0 mmol) wurde langsam unter Rühren zu
einer Lösung
von 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (0,41 g; 2,0 mmol) in Wasser
(3 ml) gegeben. Nachdem die Gasentwicklung aufgehört hatte,
betrug der pH-Wert der Lösung
8,0. Dann wurde eine Lösung
von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in Wasser (1 ml) zu der Lösung gegeben,
und dann wurden vier Tropfen einer 40%igen wässrigen Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid
hinzugefügt.
Dann wurde die Lösung
drei Tage lang unter Stickstoff auf 60 °C erhitzt und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt und dann
gefriergetrocknet, was das sulfonierte PAMAM-1.0-Dendrimer als schmutzigweißen Feststoff
(0.51 g) ergab. 1H- und 13C-NMR-spektren
zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-1.0-Dendrimer
(ca. 70:30). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
37,1, 37,7, 41,3, 48,6, 51,5, 53,1, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5,
178,3, 179,0, 179,8.
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B. PAMAM 2.0 (Verbindung
Nr. 20)
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PAMAM
2.0 wurde gemäß der obigen
Beschreibung mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt.
Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser)
gereinigt und dann gefriergetrocknet, was einen schmutzigweißen Feststoff
ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren
zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-2.0-Dendrimer
(ca. 65:35). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
37,1, 37,7, 41,3, 48,7, 51,5, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5, 178,4,
179,0, 179,1, 179,6. Als die obige Reaktion unter Weglassen des
Ben zyltrimethylammoniumhydroxids wiederholt wurde, wurde ein ähnliches
Ergebnis erhalten.
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C. PAMAM 3.0
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PAMAM
3.0 wurde wie oben mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt,
außer
dass ein leichter Überschuss
an Natriumcarbonat verwendet wurde und das Benzyltrimethylammoniumhydroxid
weggelassen wurde. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten
ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-3.0-Dendrimer
(ca. 50:50). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
36,9, 37,4, 41,1, 48,6, 51,5, 53,4, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,2,
178,9, 179,0, 179,8.
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D. PAMAM 4.0
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PAMAM
4.0 wurde so mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt,
wie es für
PAMAM 3.0 beschrieben wurde. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von
dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-4.0-Dendrimer (ca. 35:65). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
36,9, 37,3, 41,1, 48,5, 51,5, 53,5, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,1,
178,9, 179,0, 179,8.
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Beispiel 2 Herstellung
von Dendrimeren mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen
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A. PAMAM 1.0
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Eine
Lösung
von 4-Nitrophenylbromacetat (0,40 g; 1,5 mmol) in trockenem DMF
(1 ml) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 1.0 (0,18 g; 0,5 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende
gelbe Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test
negativ verlief. Die Lösung wurde
konzentriert (30 °C/0,1
mm Hg), was ein gelbes Öl
ergab. Dieses Öl
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht
wurde abgetrennt und mit Chloroform (2x) und schließlich mit
Ethylacetat gewaschen. Die wässrige
Lösung
wurde konzentriert (35 °C/25
mm Hg), was das bromacetylierte PAMAM-1.0-Dendrimer als gelbes Öl ergab
(0,36 g; 100%). 13C-NMR (D2O): δ 32,8, 33,3,
43,0, 43,5, 54,4, 174,5, 176,4.
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Eine
Lösung
von Natriumsulfit (0,2 g; 1,6 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu einer
Lösung
des oben beschriebenen bromacetylierten PAMAM-1.0-Dendrimers (0,36
g; 0,5 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und die Lösung wurde elf Tage lang bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Die gelbe Lösung wurde konzentriert, was einen
gelblichen Feststoff ergab (0,60 g). 13C-NMR
(D2O): δ 34,4,
43,1, 43,4, 54,0, 61,7, 171,3, 177,2.
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Die
obige Reaktionssequenz konnte durchgeführt werden, ohne das bromacetylierte
Dendrimer zu isolieren, indem man einfach die Natriumsulfitlösung zu
dem aus der ersten Reaktion erhaltenen rohen wässrigen Extrakt gibt.
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B. PAMAM 2.0
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Verfahren 1:
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Eine
Lösung
von 4-Nitrophenylbromacetat (0,18 g; 0,7 mmol) in trockenem DMF
(1 ml) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 2.0 (0,10 g; 0,1 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende
gelbe Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test
negativ verlief. Die Lösung wurde
dann unter Schwenken in Wasser (150 ml) gegeben, und das Gemisch
wurde mit Chloroform (3x) und Ethylacetat extrahiert. Eine Lösung von
Natriumsulfit (0,1 g; 0,8 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu der rohen bromacetylierten
Dendrimerlösung
gegeben, und das Gemisch wurde drei Tage lang bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Dann wurde die gelblich Lösung konzentriert, was einen
gelben festen Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
wurde, was das PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen
ergab (103 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,0, 35,7,
36,0, 37,7, 40,3, 43,0, 43,2, 53,4, 53,7, 56,0, 61,6, 171,2, 174,6,
178,5.
-
Verfahren 2:
-
Festes
Succinimidylacetylthioacetat (67 mg; 0,33 mmol) wurde zu einer Lösung von
PAMAM 2.0 (52 mg; 0,05 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben, und
die resultierende Lösung
wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gemisch
konzentriert (30 °C/10–3 mm
Hg), was einen öligen
Rückstand
ergab. Der Rückstand
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht
wurde abgetrennt und konzentriert, was ein viskoses Öl ergab
(117 mg). 1H- und 13C-NMR-Spektren
zeigten, dass das Öl
ein Gemisch des acylierten Dendrimers mit N-Hydroxysuccinimid war.
Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) ergab eine reine Probe des
PAMAM-2.0-Dendrimers mit Acetylthioacetamid-Endgruppen (29 mg). 13C-NMR (D2O): δ 34,0, 34,2,
37,3, 43,0, 43,1, 43,3, 53,5, 54,0, 56,3, 175,4, 177,2, 177,5.
-
Dann
wurde eine Lösung
des obigen funktionalisierten Dendrimers in 40%iger wässriger
Ameisensäure
(7 ml) zu einer eiskalten, frisch hergestellten Lösung von
Perameisensäure
(1,6 mmol) in Ameisensäure
(2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 0 °C und dann
20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde eine kleine
Menge Aktivkohle hinzugefügt,
um überschüssige Persäure zu zersetzen,
das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, dann filtriert und konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab. Das Rohprodukt wurde in Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit wässrigen
Natriumhydrogencarbonat auf 9,0 eingestellt, und das Material wurde
entsalzt, indem man es durch eine Säule mit Sephadex G10 leitete.
Nach der Lyophilisierung wurde ein weißer Feststoff (20 mg) erhalten,
der spektroskopisch im Wesentlichen dasselbe war wie das durch Verfahren
1 erhaltene Material. 13C-NMR (D2O): δ 33,0,
38,7, 42,9, 43,0, 43,1, 53,9, 54,3, 56,5, 61,6, 171,2, 176,4, 177,0.
-
Beispiel 3 Herstellung
von Dendrimeren mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
-
A. PAMAM 1.0
-
Festes
Maleinsäureanhydrid
(0,11 g; 1,1 mmol) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben.
Das Gemisch wurde etwas warm und bräunlich, als sich das Anhydrid
auflöste,
und die resultierende Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde die Lösung
konzentriert (30 °C/10–4 mm
Hg), was ein viskoses Öl
ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 1.0
zum Trisamid zusammen mit etwas Maleinsäure. 13C-NMR
(D2O): δ 33,1,
42,8, 43,1, 54,3, 135,0, 137,1, 169,1, 171,9, 173,3.
-
Dann
wurde das rohe Triamid in Wasser (4 ml) gelöst, und festes Natriumsulfit
(0,20 g; 1,6 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde
vier Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann konzentriert. 1H- und 13C-NMR-Spektren
(D2O) zeigten ein 1:1-Gemisch der regioisomeren
PAMAM-1.0-Dendrimere
mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch
Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt, was eine Probe der
PAMAM-1.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen ergab (107 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,3, 39,6,
40,0, 42,9, 43,1, 54,0, 67,9, 69,4, 173,8, 176,3, 177,6, 181,8.
-
B. PAMAM 2.0
-
Ein
Gemisch der regioisomeren PAMAM-2.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
wurde gemäß der obigen
Beschreibung hergestellt. 13C-NMR des PAMAM-2.0-Maleamsäure-Derivats (D2O): δ 32,8,
33,0, 38,7, 42,9, 53,8, 54,3, 56,5, 135,2, 136,8, 169,2, 171,9,
173,5, 174,6. 13C-NMR der PAMAM-2.0-Natriumsulfosuccinamsäure-Derivate
(D2O): δ 37,0,
40,1, 41,1, 43,0, 43,2, 43,9, 53,0, 53,3, 55,5, 68,0, 69,4, 173,8,
177,6, 179,1, 179,5, 179,8, 182,3.
-
C. PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 14)
-
Festes
Maleinsäureanhydrid
(60 mg; 0,6 mmol) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben.
Das Gemisch wurde anfangs trübe,
ergab jedoch bald eine klare Lösung,
die über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt
wurde. Dann wurde die Lösung
konzentriert (35 °C/10–4 mm
Hg), was ein viskoses Öl
ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 4.0
zum Polyamid zusammen mit etwas Maleinsäure. Dann wurde das rohe Polyamid in
Wasser (2 ml) gelöst,
und eine Lösung
von Natriumsulfit (126 mg; 1,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde hinzugefügt. Die
resultierende Lösung
wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann
konzentriert. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten ein Gemisch der regioisomeren
PAMAM-4.0-Dendrimere mit
Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch
Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was eine Probe
von PAMAM 4.0 mit 24 regioisomeren Sulfosuccinamsäure-Endgruppen
ergab (90 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,4–2,6; 2,7–3,1; 3,2–3,4; 3,9–4,0. 13C-NMR (D2O): δ 36,2; 39,8;
40,5; 43,0; 43,2; 53,5; 55,8; 68,1; 69,5; 173,8; 177,4; 177,6; 178,7;
182,3.
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Beispiel 4 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
-
a. Herstellung von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure
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Festes
Bernsteinsäureanhydrid
(0,50 g; 5,0 mmol) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von Tetrabutylammonium-2-aminoethylsulfonsäure (1,83 g; 5,0 mmol) in trockenem
Dichlormethan (30 ml) gegeben. Das Bernsteinsäureanhydrid löste sich
langsam auf, und die resultierende trübe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Gemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert,
was ein viskoses Öl ergab
(2,41 g). Das 13C-NMR-Spektrum zeigte eine
vollständige
Umsetzung des gewünschten
Monoamids zusammen mit einer kleinen Menge Bernsteinsäure. Wiederholte
Fällung
des Produkts durch tropfen weise erfolgende Zugabe einer Dichlormethan-Lösung zu
einem großen Überschuss
von Diethylether ergab Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure als
weißen
Feststoff (1,762 g; 76%), Schmp. 125–127 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 0,86
(t, 12H, 4x CH3), 1,28 (m, 8H, 4x CH2), 1,50 (m, 8H, 4x CH2),
2,33 (m, 2H, CH2COOH), 2,44 (m, 2H, CH2CONH), 2,76 (m, 2H, CH2NHCO),
3,12 (m, 8H, 4x CH2N), 3,50 (m, 2H, CH2SO3 –),
7,53 (br t, 1H, NH). 13C-NMR (CDCl3): δ 13,5,
19,5, 23,8, 30,1, 30,9, 35,6, 50,0, 58,5, 172,0, 174,1.
-
b. Herstellung von Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamat
-
Eine
Lösung
von Dicyclohexylcarbodiimid (45 mg; 0,22 mmol) in trockenem Dichlormethan
(1 ml) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure (94 mg; 0,20 mmol) und
4-Nitrophenol (28 mg; 0,20 mmol) in Dichlormethan (2 ml) gegeben,
und das Gemisch wird über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Die resultierende Suspension wurde filtriert, und das Filtrat wurde
konzentriert, was den rohen aktiven Ester ergab, der ohne weitere
Reinigung verwendet wurde.
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A. Herstellung von PAMAM-Dendrimeren
mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0
-
Eine
Lösung
des rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats
(0,30 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu
einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51,5 mg; 0,01 mmol) in 50%igem wässrigem DMF (3 ml) gegeben,
und die resultierende gelbe Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde das Gemisch konzentriert (35 °C/10–5 mm
Hg), und der gelbe Rückstand
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht
wurde abgetrennt, mit Chloroform (2x) und Ethylacetat gewaschen
und dann konzentriert, was ein gelbes Öl (134 mg) ergab. Das Rohprodukt
wurde in das Natriumsalz umgewandelt, indem man es durch eine Säule mit
Amberlite IR-120(Na) leitete, was 85 mg Material ergab. Dieses Material
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt,
was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
ergab (45 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,2, 33,6,
35,5, 39,0, 39,5, 42,8, 43,2, 53,8, 54,1, 54,4, 56,6, 176,5, 176,9,
177,2, 178,9, 179,4.
-
Die
entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-3.0-Dendrimere mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
wurden in ähnlicher
Weise hergestellt. 13C-NMR PAMAM-3.0-Derivat (D2O): δ 33,4, 35,5, 39,0,
39,5, 42,9, 43,2, 53,8, 54,1, 54,3, 56,5, 176,4, 176,9, 177,4, 178,9,
179,4. 13C-NMR PAMAM-1.0-Derivat (D2O): δ 34,9,
35,5, 39,5, 42,9, 43,1, 53,7, 54,1, 179,0, 179,1, 179,3.
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B. Herstellung von Polylysin-Dendrimeren
mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16
-
Trifluoressigsäure (1 ml)
wurde zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (36,5
mg; 5,0 μmol) in
trockenem Dichlormethan (1 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde
zwei Stunden lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und
dann konzentriert. Der Rückstand
wurde in trockenem DMSO (2 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit
Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde eine Lösung des
rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats
(ca. 0,2 mmol) in DMSO (1 ml) hinzugetropft, und das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde die gelbe Lösung
konzentriert (50 °C/10–5 mm
Hg), und der gelbe Rückstand
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht
wurde abgetrennt, mit Chloroform (3x) und Ethylacetat gewaschen
und dann konzentriert, was ein Öl (99
mg) ergab. Das Rohprodukt wurde in das Natriumsalz umgewandelt,
indem man es durch eine Säule
mit Amberlite IR-120(Na) leitete, was 81 mg Material ergab. Dieses
Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter
gereinigt, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer
mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen ergab (39 mg). 13C-NMR (D2O): δ 27,0, 32,3,
35,2, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,5, 132,0, 133,3,
145,1, 177,8, 178,0, 178,4, 178,8, 178,9, 179,2, 179,7, 179,8.
-
Die
entsprechenden BHAlyslys2-, BHAlyslys2lys4- und BHAlyslys2lys4lys8-Dendrimere
mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen wurden in ähnlicher
Weise hergestellt.
13C-NMR BHAlyslys2lys4lys8-Derivat
(D2O): δ 26,9,
32,3, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,6, 131,9,
132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,2, 177,2, 177,8, 177,9, 178,0,
178,2, 178,3, 178,6, 178,7, 178,8, 178,9, 179,2, 179,3, 179,7, 179,8.
13C-NMR BHAlyslys2lys4-Derivat (D2O): δ 26,9, 32,3,
35,1, 35,4, 35,7, 35,8, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 61,8, 131,7, 132,0,
132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,1, 177,3, 178,0, 178,3, 178,4,
178,7, 178,9, 179,0, 179,3, 179,7, 179,8.
13C-NMR
BHAlyslys2-Derivat (D2O): δ 26,9, 27,1,
32,2, 32,3, 34,7, 34,8, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,4, 54,1, 58,6,
61,8, 131,7, 131,9, 132,2, 132,3, 133,3, 144,9, 145,0, 177,7, 178,4,
178,8, 179,0, 179,3, 180,0.
-
Beispiel 5 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
-
A. PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 1)
-
Festes
Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (500 mg; 1,96 mmol)
wurde zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (300 mg; 0,0582 mmol) in Wasser (10 ml) gegeben, und die
resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der gelbe feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurde vereinigt
und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
als flockigen weißen
Feststoff ergab (370 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,28;
2,52; 2,69; 3,15; 3,27; 3,60; 7,32 (d, J = 9 Hz); 7,72 (d, J = 9
Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,9; 41,1;
43,1; 48,3; 53,6; 55,8; 129,0; 131,1; 144,4; 178,5; 179,1; 184,4.
-
Die
entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-2.0-, PAMAM-3.0- und PAMAM-5.0-(Verbindung Nr. 2)-Dendrimere
mit 3, 6, 12 bzw. 48 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
wurden in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
B. PAMAM 4.0 (EDA) (Verbindung
Nr. 3)
-
Festes
Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (130 mg; 0,5 mmol)
wurde zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben, und
die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurde vereinigt
und gefriergetrocknet, was PAMAM 4.0 mit 32 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
als flockigen weißen
Feststoff ergab (136 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30;
2,50; 2,70; 3,18; 3,62; 7,35 (d, J = 9 Hz); 7,72 (d, J = 9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,8; 41,0;
43,1; 48,4; 53,6; 55,7; 128,9; 131,0; 144,3; 178,5; 179,0; 184,5.
-
C. BHAlyslys2lys4lys8lys16 (Verbindung
Nr. 14)
-
Trifluoressigsäure (4 ml)
wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (0,73 g; 0,1 mmol) in trockenem Dichlormethan
(4 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer kurzen
Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur gerührt und
dann konzentriert. Der zurückbleibende
Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst,
die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert,
was BHAlyslys2lys4lys8lys16 als viskoses Öl ergab
(0,49 g). Das Öl
wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer
(pH 9,5; 3 ml) wurde hinzugefügt.
Dann wurde festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat
(1,30 g; 5,1 mmol) hinzugefügt,
und die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche
feste Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurde vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na)
geleitet und gefriergetrocknet, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer
mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen
weißen
Feststoff ergab (374 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,40;
1,72; 3,08; 3,42; 4,24; 4,60; 7,30; 7,40 (d, J = 9 Hz); 7,78 (d,
J = 9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 27,3; 32,5;
35,9; 43,7; 48,9; 58,6; 63,3; 128,8; 131,0; 143,7; 144,7; 145,1;
177,7; 178,1; 183,8; 185,2.
-
Die
entsprechenden BHAlyslys2lys4lys8-, BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32-(Verbindung Nr. 5)- und BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64-(Verbindung Nr. 6)-Dendrimere mit 16,
64 bzw. 128 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen wurden
in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
Beispiel 6 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
A. PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 9)
-
Festes
Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (160 mg; 0,41 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und die
resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der braune feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurde vereinigt
und konzentriert, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
als bräunlichen
Feststoff ergab (73 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30;
2,60; 2,74; 3,20; 3,57; 7,75; 7,86; 8,28. 13C-NMR
(D2O): δ 35,0;
39,9; 43,1; 48,1; 53,8; 56,1; 128,4; 128,6; 129,3; 131,0; 131,3;
136,0; 136,8; 138,2; 145,5; 146,0; 177,2; 177,8; 185,5.
-
Das
entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen wurde
in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
B. PAMAM 4.0 (EDA) (Verbindung
Nr. 11)
-
Festes
Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (220 mg; 0,57 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben,
und die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche
feste Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurde vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0
mit 32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als lohfarbenen
Feststoff ergab (148 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30;
2,80; 3,20; 3,54; 7,74; 7,85; 8,25. 13C-NMR (D2O): δ 36,0;
40,8; 43,1; 48,3; 53,6; 55,9; 128,5; 129,4; 131,0; 131,3; 136,0;
136,8; 138,3; 145,5; 146,0; 178,2; 185,6.
-
C. BHAlyslys2lys4lys8lys16 (Verbindung
Nr. 12)
-
Trifluoressigsäure (2 ml)
wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (73 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan
(2 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer
kurzen Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur gerührt
und dann konzentriert. Der zurückbleibende
Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst,
die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert,
was BHAlyslys2lys4lys8lys16 als viskoses Öl ergab.
Das Öl
wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5;
3 ml) wurde hinzugefügt.
Dann wurde festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (234
mg; 0,60 mmol) hinzugefügt,
und die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche
feste Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na)
geleitet und gefriergetrocknet, was BHAlyslys2lys4lys8lys16 mit
32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen
schmutzigweißen
Feststoff ergab (119 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,0–2,0; 3,18;
3,43; 4,31; 7,22; 7,80; 7,89; 8,25. 13C-NMR
(D2O): δ 27,2;
32,4; 35,3; 43,7; 49,0; 58,5; 63,6; 128,4; 129,1; 131,4; 136,1;
136,6; 138,6; 139,0; 145,1; 145,6; 178,4; 184,8; 186,7.
-
Beispiel 7 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 8)
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Festes
Natrium-4-sulfonaphthylisothiocyanat (180 mg; 0,5 mmol) wurde zu
einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und das
Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt
und dann abgekühlt.
Das Wasser wurde unter reduziertem Druck von der resultierenden
Suspension abdestilliert, und der schmutzigweiße feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden
vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit
Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff
ergab (60 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,20; 2,60;
3,14; 3,48; 7,23; 7,47; 7,56; 7,77; 7,93 (d, J = 6 Hz); 8,56 (d,
J = 6 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 35,8; 40,5;
43,1; 48,4; 53,6; 55,9; 127,6; 128,6; 130,3; 131,9; 132,5; 133,5;
134,7; 140,5; 142,7; 177,8; 178,0; 185,4.
-
Beispiel 8 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 7)
-
Festes
Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (110 mg; 0,32 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und
die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche feste
Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0
mit 24 Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als schmutzigweißen Fest stoff
ergab (110 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,53; 3,08;
3,36; 3,66; 7,90; 7,95. 13C-NMR (D2O): δ 34,8; 41,0;
43,1; 48,0; 53,7; 56,2; 124,1; 128,6; 143,5; 148,8; 177,6; 185,0.
-
Beispiel 9 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 10)
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Festes
Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylisothiocyanat (250 mg; 0,5 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer
(pH 9,5; 1 ml) in Wasser (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei
Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Das
Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, was einen orangefarbenen
Feststoff ergab. Der feste Rückstand wurde
in Wasser (2 ml) gelöst
und durch eine kurze Säule
mit Amberlite IR-120(Na) geleitet. Dann wurde das Filtrat konzentriert,
und der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was das
PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
als schmutzigweißen
Feststoff ergab (102 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,65; 3,02;
3,30; 3,66; 8,05; 8,42; 8,59; 8,67. 13C-NMR
(D2O): δ 33,2;
38,7; 43,2; 43,7; 47,8; 54,0; 54,3; 56,7; 131,0; 131,3; 131,9; 135,9;
138,0; 139,6; 143,8; 144,1; 145,6; 176,2; 176,5; 186,0.
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Beispiel 10 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 13)
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Festes
Natrium-4-nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (200 mg; 0,68 mmol)
wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (70 mg; 0,014 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben,
und die resultierende gelbe Lösung
wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung konzentriert (10–4 mm
Hg; 40 °C),
und der Rückstand
wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) extrahiert.
Der feste Rückstand
wurde in DMSO (5 ml) gelöst,
und eine Lösung
von Natriumsulfit (130 mg; 1 mmol) in Wasser (3 ml) wurde hinzugefügt. Das
resultierende leicht trübe
Gemisch wurde vier Tage lang stehen gelassen, und danach führte die
Zugabe von weiterem Wasser (2 ml) zur Bildung einer klaren homogenen
gelben Lösung.
Dann wurde die Lösung
konzentriert, zuerst bei 25 mm Hg und 40 °C und dann bei 10–4 mm
Hg und 50 °C,
was das Rohprodukt ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration
(Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen
ergab (24 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,25; 2,66;
3,08; 3,20; 3,33; 3,38; 4,01; 7,40 (br d); 7,62 (br d). 13C-NMR (D2O): δ 36,7; 40,9;
43,0; 43,6; 53,5; 55,5; 61,0; 131,6; 135,0; 137,2; 140,4; 174,5;
178,6; 179,2.
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Beispiel 11 Herstellung
von Dendrimeren mit 4-Sulfobenzamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (EDA)
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Festes
Kalium-N-hydroxysuccinimidyl-4-sulfobenzoat (100 mg; 0,3 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (35 mg; 0,005 mmol) in 0,1 M Boratpuffer (5
ml) mit pH 8,5 gegeben, und die Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur gerührt.
Die resultierende milchige Lösung
hatte in diesem Stadium einen pH-Wert von 4,5. Dann wurde 1 M Natriumcarbonat
hinzugefügt,
was eine klare Lösung
ergab, die konzentriert wurde, was das Rohprodukt als weißen Feststoff
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser)
gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfobenzamid-Endgruppen ergab
(47 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,25; 2,42;
2,63; 3,05; 3,18; 3,31; 3,38; 7,72 (d, J = 8 Hz); 7,78 (d, J = 8
Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,0; 40,4;
43,0; 43,7; 53,7; 55,8; 130,2; 132,2; 140,4; 150,1; 173,6; 178,0;
178,5.
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Beispiel 12 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (EDA)
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Festes
Natrium-N-(4-sulfophenyl)acrylamid (250 mg; 1 mmol) und festes Natriumcarbonat
(106 mg; 1 mmol) wurden nacheinander unter Rühren zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (EDA) (78 mg; 0,011 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Die
resultierende Lösung
wurde vier Tage lang unter Stickstoff gerührt und dann gefriergetrocknet,
was einen flockigen weißen
Feststoff ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex
LH20; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 64 Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen
ergab (206 mg). Das 13C-NMR-Spektrum zeigte
eine schwache Spur von vermutlich monoalkylierten terminalen Aminogruppen. 1H-NMR (D2O): δ 2.10; 2.48;
2.58; 2.79; 3.20; 7.42 (d, J = 7 Hz); 7.65 (d, J = 7 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36.5; 37.9;
41.1; 53.4; 55.6; 124.8; 130.9; 143.0; 144.2; 177.4; 178.5.
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Beispiel 13 Herstellung
von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (EDA)
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Eine
Lösung
von Natriumsulfanilsäure
(195 mg; 1 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) wurde tropfenweise zu
einer Lösung
von N,N'-Disuccinimidylcarbonat
(530 mg; 2 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben, und die resultierende
bräunliche
Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (75
mg; 0,011 mmol) in trockenem DMSO (1 ml) wurde hinzugefügt, und
die Lösung wurde
weitere 18 Stunden lang gerührt.
Dann wurde die Lösung
unter Hochvakuum (10–5 mm Hg; 35 °C) konzentriert,
was einen gelblichen halbfesten Stoff ergab. Das Rohprodukt wurde
in DMSO (4 ml) gelöst,
und die Lösung
wurde unter kräftigem
Rühren
zu 200 ml Ethylacetat gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff
wurde durch Filtration aufgefangen und mit Ethylacetat (2x) und
Ether (2x) gewaschen und dann getrocknet, was ein weißes Pulver
ergab (275 mg). Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex
LH20; Wasser) weiter gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen
ergab (106 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,31; 2,55;
2,75; 3,19; 7,32 (d, J = 9 Hz); 7,63 (d, J = 9 Hz). 13C-NMR
(D2O): δ 36,3;
40,7; 43,3; 43,8; 53,7; 55,7; 123,3; 130,9; 140,9; 146,0; 161,4;
178,2; 178,6.
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Beispiel 14 Herstellung
von Dendrimeren mit N,N,N-Trimethylglycinamidchlorid-Endgruppen
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BHAlyslys2lys4lys8lys16 (Verbindung
Nr. 15)
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Trifluoressigsäure (4 ml)
wurde zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (220
mg; 30 μmol) in
trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde
zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und
dann konzentriert. Der Rückstand
wurde in trockenem DMSO (5 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit
Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde festes 4-Nitrophenyl-N,N,N-trimethylglycinatchlorid
(0,50 g; 1,8 mmol) hinzugefügt,
und das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde die trübe
Lösung
konzentriert (50 °C/10–5 mm
Hg), und der Rückstand
wurde mit Wasser und Dichlormethan ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht
wurde abgetrennt, mit Dichlormethan (3x) und Ethylacetat gewaschen
und dann konzentriert, was ein Öl
(1,128 g) ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex
LH20; Wasser) gereinigt, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer
mit N,N,N-Trimethylglycinamid-Endgruppen ergab (116 mg). 13C-NMR (D2O): δ 25,5, 30,5,
30,8, 33,4, 42,1, 56,5, 57,1, 67,5, 68,1, 166,7, 167,0, 167,1, 176,0,
176,2.
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Beispiel 15 Herstellung
von Dendrimeren mit 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 16)
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1,1'-Carbonyldiimidazol
(85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von 4-Trimethylammoniumbenzoesäureiodid
(154 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (4 ml) gegeben, und das Gemisch
wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Während dieser
Zeit schied sich ein weißer
Feststoff aus der Lösung
ab. Dann wurde eine Lösung
von PAMAM 4.0 (58 mg; 0,011 mmol) in trockenem DMF (2 ml) hinzugefügt, und
das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Danach hatte sich der größte Teil
des Niederschlags aufgelöst,
und ein Ninhydrin-Test der Lösung
war negativ. Das Gemisch wurde konzentriert (10–4 mm
Hg; 30 °C),
was einen weißen
festen Rückstand
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20;
10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen ergab
(89 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,96; 2,65–2,85; 3,25–3,55; 3,64;
7,92. 13C-NMR (D2O): δ 25,8; 33,1;
33,5; 38,7; 43,1; 43,5; 53,5; 54,1; 56,4; 61,2; 124,8; 133,6; 139,9;
153,2; 173,2; 176,3; 176,8; 182,6.
-
Das
entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen wurde
in ähnlicher
Weise hergestellt.
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Beispiel 16 Herstellung
von Dendrimeren mit 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 17)
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Festes
4-Nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (150 mg; 0,5 mmol) wurde unter
Rühren
zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (52 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) gegeben. Die
resultierende gelbe Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test
negativ verlief (pH ca. 8,5). Dann wurde die Lösung konzentriert (10–5 mm
Hg; 40 °C),
und der Rückstand wurde
mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) ausgeschüttelt. Das
unlösliche
gelartige Material wurde durch Filtration aufgefangen, mit Wasser
(2x) und Dichlormethan (2x) gewaschen und dann an der Luft getrocknet.
Das rohe Dendrimer mit 4-(Chlormethyl)benzamid-Endgruppen wurde
in 25%igem wässrigem
Trimethylamin (20 ml) gelöst,
und die gelbe Lösung
wurde über
Nacht stehen gelassen. Dann wurde die Lösung konzentriert, der Rückstand
wurde in Wasser (5 ml) gelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet. Das farblose Filtrat wurde konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt
wurde, was PAMAM 4.0 mit 24 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen
ergab (90 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,88; 2,65–2,80; 2,98;
3,10–3,60;
7,52 (br d, J = 9 Hz); 7,72 (br d, J = 9 Hz). 13C-NMR
(D2O): δ 26,6;
33,4; 38,8; 43,2; 43,5; 53,6; 53,6; 54,1; 56,8; 62,8; 73,0; 132,1;
135,3; 137,5; 140,0; 176,4; 176,9; 183,6.
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Beispiel 17 Herstellung
von Dendrimeren mit N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0
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Festes
1,1'-Carbonyldiimidazol
(85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von N-(2-Acetoxyethyl)-N-(carboxymethyl)-N,N-dimethylammoniumbromid
(135 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben, und die resultierende
Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff gerührt. Dann wurde eine Lösung von
PAMAM 4.0 (60 mg; 0,012 mmol) in DMF (2 ml) hinzugefügt, was
die sofortige Bildung eines flockigen Niederschlags bewirkte, der
sich langsam wieder auflöste.
Das Gemisch wurde zwei Tage lang gerührt und dann konzentriert (10–4 mm
Hg; 40 °C),
was ein viskoses Öl
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10%
AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen
ergab (64 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,93; 2,05;
2,70; 3,10–3,60;
3,28; 3,93 (m); 4,14; 4,48 (m). 13C-NMR
(D2O): δ 24,6;
26,2; 33,2; 38,7; 42,8; 42,9; 53,9; 57,4; 62,6; 67,3; 67,5; 168,9;
176,4; 176,8; 177,3; 183,2.
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Beispiel 18 Herstellung
von Dendrimeren mit Guanidino-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 18)
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Eine
Lösung
von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) und Methylthiopseudoharnstoffsulfat
(170 mg; 0,61 mmol) in Wasser (5 ml) (pH 10,5) wurde zwei Stunden
lang bei 80 °C
unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, und der
Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM
4.0 mit 24 Guanidino-Endgruppen als Acetatsalz ergab (107 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,00; 2,80
(br t); 3,09 (br t); 3,32; 3,45 (br t); 3,60 (br t). 13C-NMR
(D2O): δ 25,2;
33,2; 33,4; 38,7; 41,2; 42,6; 43,4; 44,7; 53,5; 54,0; 56,3; 176,5;
176,7; 176,9; 181,6.
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Das
entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs Guanidino-Endgruppen
wurde in ähnlicher
Weise hergestellt.
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Beispiel 19 Herstellung
von Dendrimeren mit 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (Verbindung
Nr. 19)
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Eine
Lösung
von 1-(4-Carboxyphenyl)methyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-Tetrahydrochlorid
(120 mg; 0,25 mmol), N-Hydroxysuccinimid (60 mg; 0,52 mmol) und
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (250 mg;
1,3 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml) wurde eine Stunde lang
bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dann wurde eine Lösung von
PAMAM 4.0 (32 mg; 0,006 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml)
hinzugefügt.
Das Gemisch wurde zwei Tage lang stehen gelassen und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; 10% AcOH) gereinigt, was
PAMAM 4.0 mit ca. 12 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid-Endgruppen ergab,
wie durch 1H- und 13C-NMR
bestimmt wurde (80 mg). Dann wurde das Produkt in Wasser gelöst und durch
eine Säule
mit Amberlite-IRA-401(Cl)-Harz
geleitet und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser (1
ml) gelöst,
konzentrierte HCl (1 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde
mit Ethanol (30 ml) verdünnt,
so dass ein weißer
Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen
(68 mg). Erneut zeigten 1H- und 13C-NMR ca. 50% Funktionalisierung der terminalen
Aminogruppen. 1H-NMR (D2O): δ 2,17; 2,36;
2,50; 2,78; 2,85; 3,25; 3,40; 3,50; 3,60; 3,62; 4,49; 7,63 (br d);
7,78 (br d). 13C-NMR (D2O): δ 22,7; 23,1;
33,2; 38,8; 39,9; 40,2; 40,3; 41,0; 41,2; 42,0; 42,9; 43,2; 43,6;
45,5; 46,1; 49,1; 52,2; 53,9; 54,3; 56,6; 62,7; 132,5; 135,7; 137,1;
139,7; 174,3; 176,2; 176,3; 176,7; 177,0; 178,2; 178,5.
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Beispiel 20 Herstellung
von Dendrimeren mit 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen
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PAMAM 4.0 (EDA)
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Natriumcyanoborhydrid
(32 mg; 0,5 mmol) wurde zu einem Gemisch von PAMAM 4.0 (EDA) (69
mg; 0,01 mmol), 4-Formyl-2-hydroxybenzoesäure (83 mg; 0,5 mmol und Natriumhydrogencarbonat
(42 mg; 0,5 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Das inhomogene orangefarbene
Gemisch wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, und
während
dieser Zeit wurde es homogen. Dann wurde die orangefarbene Lösung konzentriert,
und der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was
PAMAM 4.0 (EDA) mit ca. 32 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen
ergab (91 mg). 1H- und 13C-NMR
(D2O) zeigten größtenteils Monoalkylierung,
aber mit einigen Anzeichen der Dialkylierung der terminalen Aminogruppen,
und beide Spektren zeigten breite Signale. 13C-NMR
(D2O): δ 37,0;
41,1; 50,9; 53,4; 55,5; 55,8; 61,5; 120,9; 122,2; 122,4; 132,3;
132,7; 135,0; 135,8; 163,5; 163,7; 169,0; 178,6; 179,3. 1N-NMR (D2O): δ 2,20; 2,35; 2,60;
3,15; 3,30; 3,55; 4,25; 6,68; 7,12; 7,55.
-
Beispiel 21 Test auf gerinnungshemmende
Aktivität
-
Rinderblut
wurde vom Schlachthof erhalten, wo ein Tier in einen Eimer, der
Natriumcitrat in einer Konzentration von 3,5 g pro Liter Frischblut
enthielt, bluten gelassen wurde. Dieses Blut wurde ins Labor zurückgebracht,
wo es in einem Wasserbad von 37 °C
gehalten wurde.
-
Dann
wurden Aliquote des Vollbluts 5 Minuten lang mit 3000 U/min zentrifugiert,
um das Plasma abzutrennen. Dieses wurde aufgefangen und in das Wasserbad
zurückgestellt.
Zusätzliches
Plasma wurde ebenfalls hergestellt und für spätere Tests in flüssigem Stickstoff
aufbewahrt.
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Mit
dem Verfahren wird tatsächlich
die Recalcifizierungszeit des citratierten Bluts bei 37 °C getestet. Alle
Glaswaren wurden gewaschen, getrocknet und mit "Coatasil" silanisiert, bevor sie erneut gewaschen
und getrocknet wurden. Jedes Kulturröhrchen von 12 × 75 mm
enthielt 0,1 ml Plasma, 0,1 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl), gefolgt von
0,1 ml 0,025 M CaCl2, und zu diesem Zeitpunkt
wurde die Stoppuhr gestartet. Alle 15 Sekunden wurde das Röhrchen auf
eine Seite gekippt, und die Gerinnung wurde bewertet. Wenn ein festes
Gerinnsel entstanden war, wurde die Uhr gestoppt, und die Zeit wurde
aufgezeichnet. Wenn Antikoagulantien getestet wurden, wurde die
Kochsalzlösung
durch 0,1 ml der Testsubstanz ersetzt. Die Zeiten für eine Reihe
von Konzentrationen der Testverbindungen sind in Tabelle 1 aufgezeichnet.
Heparin, Natriumcitrat und Testverbindung wurden in Wasser als Lösungen von
10 mg/ml zubereitet. Diese Lösungen
wurden verdünnt,
was eine Reihe von Konzentrationen ergab. Die Endkonzentrationen
in den Reagenzgläsern
sind in der Tabelle angegeben. Die Zahlen in der Tabelle stellen
mittlere Zeiten für
bis zu zehn Parallelansätze
dar.
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Beispiel 23 Test auf antivirale
Aktivität
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Die
Ergebnisse der Tests auf Aktivität
gegen HIV1, HIV2, CMV und verschiedene Herpes-simplex-Viren (HSV)
sind in den Tabellen 2 bis 5 aufgezeichnet.
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Tabelle
4 Aktivität gegen
Human-Cytomegalievirus-Zellkultur (Davis-Stamm)
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Tests bei humanen embryonalen
Lungenzellen (HEL).
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- IC50 = Inhibitorische Konzentration,
bei der die Virusplaques um 50% reduziert werden.
- CC50 = cytotoxische Konzentration, die
erforderlich ist, um das Wachstum der HEL-Zellen um 50% zu reduzieren.
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Tabelle
5 Aktivität von BRI-Verbindungen
gegen verschiedene Viren
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- a erforderlich, um eine mikroskopisch
nachweisbare Veränderung
der normalen Morphologie zu verursachen
- b erforderlich, um die virusinduzierte
Cytopathogenität
um 50% zu reduzieren.