DE69937059T2 - Antibiotische oder antiparasitäre zusammenstellungen aus anionischen oder kationischen dendrimeren - Google Patents

Antibiotische oder antiparasitäre zusammenstellungen aus anionischen oder kationischen dendrimeren Download PDF

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    • Y10S424/16—Dendrimers and dendritic polymers

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Hemmung von mikrobiellen und parasitischen Agentien, und insbesondere bezieht sie sich auf die Verwendung von Dendrimeren als Inhibitoren der Infektion von menschlichen und nichtmenschlich-tierischen Patienten durch Pathogene, wie Bakterien, Pilze oder Parasiten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Dendrimere sind dreidimensionale polymere Materialien mit niedriger Polydispersität, die durch eine große Zahl von oberflächlichen terminalen Gruppen gekennzeichnet sind. Außerdem ermöglicht die Art und Weise, in der diese Materialien hergestellt werden, eine strenge Kontrolle der Größe, Form und Anzahl sowie Art der Oberflächengruppen. Dendritische Materialien weisen mehrere Merkmale auf, die für die Verwendung als therapeutische Materialien nützlich sind: feste Form, die eine große und definierte Oberfläche bietet, mit der sie mit biologischen Oberflächen und Rezeptoren Wechselwirken können; und die große Zahl von terminalen Gruppen ermöglicht mehrfache Wechselwirkungen mit den biologischen Targets.
  • Die Internationalen Patentanmeldungen Nr. PCT/AU95/00350 ( WO 95/34595 ) und PCT/AU97/00447 ( WO 98/03573 ) offenbaren Dendrimere, wie Polyamidoamin- oder Polylysin-Dendrimere, mit einer Menge von terminalen Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist.
  • Die vorliegende Erfindung gibt die Verwendung von dendritischen Polymeren bei der Hemmung von mikrobiellen Agentien einschließlich bakterieller und pilzlicher Pathogene sowie von parasitischen Agentien an.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Hemmung eines mikrobiellen oder parasitischen Agens bei einem menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten angegeben, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Dendrimers mit einer Menge von terminalen Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist, an den Patienten umfasst.
  • Besonders bevorzugte Verbindungen zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind Dendrimere mit sulfonsäurehaltigen Struktureinheiten, carbonsäurehaltigen Struktureinheiten, phosphor- oder phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten, boronsäurehaltigen Struktureinheiten, neuramin- oder sialinsäurehaltigen Struktureinheiten oder Struktureinheiten, die Neuramin- oder Sialinsäure enthalten, primäres, sekundäres, tertiäres oder quartäres Amino enthaltenden Struktureinheiten, pyridiniumhaltigen Struktureinheiten, guanidiniumhaltigen Struktureinheiten, amidiniumhaltigen Struktureinheiten, phenolhaltigen Struktureinheiten, Heterocyclen, die saure oder basische Wasserstoffatome aufweisen, zwitterionischen Struktureinheiten oder Gemischen der obigen Struktureinheiten, welche mit terminalen Gruppen des Dendrimers verknüpft sind.
  • Die im Verfahren dieser Erfindung verwendeten Verbindungen werden hier als polyionische Dendrimere bezeichnet, und dieser Ausdruck wird in der gesamten Beschreibung so verwendet, dass er nicht nur die Dendrimere an sich, sondern auch ihre pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Salze umfasst, zum Beispiel die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, wie die Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, sowie pharmazeutisch annehmbare Anionen, wie Fluorid, Chlorid, Bromid, Iodid, Citrat, Acetat, p-Toluolsulfonat und dergleichen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Zu den bevorzugten Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gehören polyionische Dendrimere der allgemeinen Formel I:
    Figure 00030001
    wobei:
    I ein Initiatorkern ist;
    Z eine innere Verzweigungseinheit ist;
    n eine ganze Zahl ist, die die Zahl der Generationen des Dendrimers darstellt; und
    A eine anionische oder kationische Struktureinheit ist, die über eine fakultative Verknüpfungsgruppe X mit der inneren Verzweigungseinheit Z verknüpft sein kann.
  • Dendrimere sind makromolekulare, hochgradig verzweigte Verbindungen, die durch wiederholte Reaktionssequenzen ausgehend von einem anfänglichen Kernmolekül gebildet werden, wobei aufeinanderfolgende Schichten oder Stufen in aufeinanderfolgenden "Generationen" hinzugefügt werden, so dass eine dreidimensionale, hochgeordnete polymere Verbindung aufgebaut wird. Dendrimere sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet: (i) einen Starterkern (I), der eine oder mehrere reaktive Stellen aufweisen und punktartig oder von erheblicher Größe sein kann, so dass er die endgültige Topologie des Dendrimers beeinflusst; (ii) Schichten von verzweigten Repetiereinheiten (Z), die an den Starterkern gebunden sind; (iii) funktionelle terminale Gruppen (wie die Struktureinheiten A), die an die Oberfläche des Dendrimers gebunden sind, gegebenenfalls über Verknüpfungsgruppen (wie die Verknüpfungsgruppen X). Die vorliegende Erfindung verwendet dendritische Strukturen als Gerüste für die Bindung von ionischen Struktureinheiten; die Erfindung ist nicht auf die sphärischen Dendrimere beschränkt, die hier im Einzelnen beschrieben sind, sondern kann auf jeder dendritischen Struktur beruhen. Die Variabilität von Dendrimeren in Bezug sowohl auf Form als auch Konstitution ist dem Fachmann wohlbekannt.
  • Die Herstellung von Dendrimeren ist wohlbekannt und ist zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 (die Dendrimere auf der Basis von Schichten von Lysineinheiten beschreiben) sowie in den US-Patenten Nr. 4,507,466 , 4,558,120 , 4,568,737 und 4,587,329 (die Dendrimere auf der Basis von anderen Einheiten beschreiben, einschließlich Polyamidoamin- oder PAMAM-Dendrimeren) beschrieben. Die in diesen US-Patenten offenbarten Dendrimere sind als geeignet für Verwendungen wie als Oberflächenmodifizierungsmittel, als Metallchelatoren, als Demulgatoren oder Öl/Wasser-Emulsionen, Nassfestigkeitsmittel bei der Herstellung von Papier und als Mittel zum Modifizieren der Viskosität in wässrigen Zubereitungen, wie Lacken, beschrieben. In den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 wird auch vorgeschlagen, dass die Dendrimere auf der Basis von Lysineinheiten als Substrate für die Herstellung von pharmazeutischen Darreichungsformen verwendet werden können.
  • Die internationalen Patentschriften Nr. WO 88/01178 , WO 88/01179 und WO 88/01180 offenbaren Konjugate, bei denen ein Dendrimer mit einem anderen Material, wie einem pharmazeutischen oder agrikulturellen Material auf einem Träger, konjugiert oder assoziiert ist. Außerdem offenbart das Internationale Patent Veröffentlichungs-Nr. WO 95/24221 dendritische Polymerkonjugate, die aus wenigstens einem Dendrimer in Verbindung mit einem Trägermaterial, bei dem es sich um einen biologischen Reaktionsmodifikator handeln kann, und gegebenenfalls einem Ziellenker bestehen. Diese Patentschriften zusammen mit den oben genannten US-Patenten enthalten eine breite Offenbarung von verschiedenen Dendrimeren und Verfahren zu deren Herstellung.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Dendrimer" ist in seinem weitesten Sinn zu verstehen und umfasst alle Formen und Zusammensetzungen dieser Dendrimere, wie in den Patentschriften Nr. WO 88/01178 , WO 88/01179 und WO 88/01180 offenbart ist. Der Ausdruck umfasst auch miteinander verknüpfte oder verbrückte Dendrimere, wie in diesen Patentschriften offenbart ist.
  • Die bevorzugten Dendrimere der vorliegenden Erfindung umfassen einen mehrwertigen Kern, der kovalent an wenigstens zwei dendritische Zweige gebunden ist und sich vorzugsweise über wenigstens zwei Generationen erstreckt. Besonders bevorzugte Dendrimere sind Polyamidoamin(PAMAM)-Dendrimere, PAMAM(EDA)-Dendrimere, Polypropylenimin(PPI)-Dendrimere und Polylysin-Dendrimere.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist an wenigstens eine und vorzugsweise an eine erhebliche Zahl der Endgruppen auf der Oberfläche des Dendrimers eine anionische oder kationische Struktureinheit kovalent gebunden. Die Zweige des Dendrimers können in Aminogruppen oder anderen funktionellen reaktiven Gruppen, wie OH, SH oder dergleichen, enden, die anschließend mit den anionischen oder kationischen Struktureinheiten umgesetzt werden können.
  • Wenn die Endgruppen des Dendrimers Amingruppen sind, kann die anionische oder kationische Struktureinheit über eine Vielzahl von funktionellen Gruppen einschließlich Amid- und Thioharnstoff-Bindungen an das Dendrimer gebunden sein. Bevorzugte anionische oder kationische Struktureinheiten, die an die Endgruppen des Dendrimers gebunden sein können, sind sulfonsäurehaltige Struktureinheiten, carbonsäurehaltige Struktureinheiten (einschließlich neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten und modifizierten neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten), boronsäurehaltige Struktureinheiten, phosphor- und phosphonsäurehaltige Struktureinheiten (einschließlich veresterten phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten) sowie primäres, sekundäres, tertiäres oder quartäres Amino enthaltende Struktureinheiten, pyridiniumhaltige Struktureinheiten, guanidiniumhaltige Struktureinheiten, amidiniumhaltige Struktureinheiten, phenolhaltige Struktureinheiten, Heterocyclen, die saure oder basische Wasserstoffatome aufweisen, zwitterionische Struktureinheiten oder Gemische der obigen Struktureinheiten.
  • Geeignete anionische und kationische Struktureinheiten, die an die Amino- oder anderen Endgruppen gebunden sein können, sind zum Beispiel die folgenden Gruppen (wobei n = 0 oder eine positive ganze Zahl ist und n besonders bevorzugt = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist):
    Figure 00060001
    Figure 00070001
    Figure 00080001
    Figure 00090001
  • Außer den obigen können auch verschiedene neuramin- oder sialinsäurehaltige Struktureinheiten oder modifizierte neuramin- oder sialinsäurehaltige Struktureinheiten an die Dendrimere gemäß dieser Erfindung gebunden oder damit verknüpft sein. Zu diesen Struktureinheiten gehören die verschiedenen N- und O-substituierten Derivate von Neuraminsäure, insbesondere N- und O-Acyl-Derivate, wie N-Acetyl-, O-Acetyl- und N-Glycolyl-Derivate, sowie Struktureinheiten, bei denen die Neuraminsäuregruppe modifiziert ist. Zu den geeigneten modifizierten Neuraminsäuregruppen gehören Gruppen, die in der 4-Position mit einer Amino-, Amido-, Cyano-, Azido- oder Guanidinogruppe substituiert sind, sowie ungesättigte Neuraminsäuregruppen. Diese Struktureinheiten können über die 2-, 7-, 9- oder 5-NAc-Position mit den Dendrimeren verknüpft sein.
  • Vorzugsweise ist n in den polyionischen Dendrimeren der allgemeinen Formel I eine ganze Zahl von 1 bis 20 oder mehr, besonders bevorzugt 1 bis 10. Ebenfalls vorzugsweise enthalten die Dendrimere wenigstens drei oder mehr terminale Gruppen.
  • Die fakultative Verknüpfungsgruppe X kann auch als Spacer zwischen dem Dendrimer und der Struktureinheit A wirken und kann aus einer Alkylkette (gegebenenfalls substituiert oder verzweigt), einer Alkoxy-, Polyalkoxy-, Alkylthio- oder Polyalkylthiokette (gegebenenfalls substituiert) oder einer Alkenyl-, multiplen Alkenyl-, Alkinyl- oder multiplen Alkinylkette (gegebenenfalls substituiert) bestehen. Zu den geeigneten Spacerketten gehören Gruppen der Formel -(CH2)m-Z-(CH2)m-, wobei Z = -CH2-, -CH=CH-, -C=C-, -O- oder -S- ist und m eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist.
  • Die anionischen oder kationischen Dendrimere dieser Erfindung können nach chemischen Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Geeignete Verfahren sind beispielhaft in den folgenden Beispielen beschrieben.
  • Wie bereits beschrieben, hat sich gezeigt, dass die anionischen oder kationischen Dendrimere der vorliegenden Erfindung mikrobielle und parasitische Agentien hemmen. Der hier verwendete Ausdruck "mikrobielles Agens" soll sich sowohl auf bakterielle als auch auf Hefe- oder Pilzagentien, insbesondere bakterielle und Hefe- oder Pilzpathogene, beziehen. Der Ausdruck beinhaltet also unter anderem Gram-positive und Gram-negative Bakterien, wie Escherichia coli, Salmonella typhimurium und Streptococcus-, Staphylococcus-, Shigella-, Pseudomonas-, Clostridium-, Neisseria- und Pneumococcus-Spezies. Außerdem beinhaltet dieser Ausdruck Hefepathogene, wie Candida, und Pilzpathogene, wie Aspergillus fumigatus.
  • Der Ausdruck "parasitisches Agens" wird hier so verwendet, dass er sich insbesondere auf parasitische Pathogene bezieht, einschließlich unter anderem parasitischen Agentien wie Plasmodium-, Trypanosoma- und Leishmania-Spezies, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii und Cryptosporidium parvum.
  • Der Ausdruck "Hemmung" wird hier in seinem weitesten Sinn verwendet, so dass er die entweder vollständige oder partielle Hemmung oder Unterdrückung einer Infektion eines menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten durch ein mikrobielles oder parasitisches Pathogen oder die vollständige oder partielle Hemmung oder Unterdrückung der pathogenen Wirkungen der Infektion eines solchen Patienten durch ein mikrobielles oder parasitisches Pathogen umfasst. Der Ausdruck wird auch so verwendet, dass er sowohl eine prophylaktische als auch eine therapeutische Behandlung umfasst.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung also eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzungen zur prophylaktischen oder therapeutischen Hemmung eines mikrobiellen oder parasitischen Agens bei einem menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten bereit, die ein Dendrimer, wie es oben allgemein beschrieben ist, in Verbindung mit wenigstens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfassen.
  • Die Zubereitung solcher Zusammensetzungen ist dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt. Zu den geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Verdünnungsmitteln gehören beliebige und alle herkömmlichen Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Füllstoffe, festen Träger, wässrigen Lösungen, Beschichtungen, antibakteriellen und fungiziden Mittel, isotonischen und resorptionsverzögernden Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt und ist zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben. Die Verwendung von jedem herkömmlichen Medium oder Mittel in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, solange es mit dem Wirkstoff verträglich ist. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
  • Zur leichteren Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung ist es besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen in Form von Darreichungsformen zuzubereiten. "Darreichungsform" bezieht sich hier auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosiseinheiten für die zu behandelnden menschlichen Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die so berechnet ist, dass die gewünschte therapeutische Wirkung erzielt wird, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält. Die genauen Eigenschaften der neuen Darreichungsformen der Erfindung werden bestimmt und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des Wirkstoffs und der besonderen therapeutischen Wirkung, die erzielt werden soll, und (b) den Einschränkungen, die der Technik des Compoundierens eines solchen Wirkstoffs für die besondere Behandlung inhärent sind.
  • In noch einem anderen Aspekt gibt diese Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines Dendrimers, wie es oben allgemein beschrieben ist, bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung oder bei der Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten durch Hemmung eines mikrobiellen oder parasitischen Agens an.
  • Eine Vielzahl von Verabreichungswegen steht zur Verfügung. Die besondere gewählte Methode wird selbstverständlich von dem besonderen behandelten Zustand und der für therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosierung abhängen. Die Verfahren dieser Erfindung können allgemein gesagt unter Verwendung einer beliebigen medizinisch annehmbaren Verabreichungsmethode angewendet werden, was jede Methode bedeutet, die therapeutische Konzentrationen der aktiven Komponente der Erfindung erzeugt, ohne klinisch unannehmbare nachteilige Wirkungen zu verursachen. Zu diesen Verabreichungsmethoden gehören die orale, rektale, topische, nasale, inhalatorische, transdermale oder parenterale (z.B. subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung. Zu den Zubereitungen für die orale Verabreichung gehören diskrete Einheiten, wie Kapseln, Tabletten, Pastillen und dergleichen. Andere Wege sind die intrathekale Verabreichung direkt in den Liquor, die direkte Einführung, wie etwa durch verschiedene Katheter- und Ballon-Angioplastie-Vorrichtungen, die dem Fachmann wohlbekannt sind, und die intraparenchymale Injektion in die Zielbereiche.
  • Die Zusammensetzungen können zweckmäßigerweise in einer Einheits-Darreichungsform präsentiert und nach einem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Zu diesen Verfahren gehören der Schritt des Verbindens der aktiven Komponente mit einem Träger, der einen oder mehrere Hilfsbestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem man die aktive Komponente gleichmäßig und innig mit einem flüssigen Träger, einem feinteiligen festen Träger oder beiden in Verbindung bringt und dann gegebenenfalls das Produkt formt.
  • Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge der aktiven Komponente enthalten, in Liposomen oder als Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nichtwässrigen Flüssigkeit, wie einem Sirup, einem Elixier oder einer Emulsion, präsentiert werden.
  • Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen zweckmäßigerweise ein steriles wässriges Präparat der aktiven Komponente, das vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Dieses wässrige Präparat kann nach bekannten Verfahren unter Verwendung solcher geeigneten Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel zubereitet werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, zum Beispiel eine Lösung in Polyethylenglycol, sein. Zu den annehmbaren Trägern und Lösungsmitteln, die eingesetzt werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden herkömmlicherweise sterile fette Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes milde fette Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride eingesetzt werden. Außerdem finden Fettsäuren, wie Ölsäure, in dem injizierbaren Präparat Verwendung.
  • Die aktive Komponente kann auch für die Abgabe in einem System zubereitet sein, das so gestaltet ist, dass die aktive Komponente intranasal oder durch Inhalation verabreicht wird, zum Beispiel als fein dispergiertes Aerosolspray, das die aktive Komponente enthält.
  • Andere Abgabesysteme können Abgabesysteme mit nachhaltiger Freisetzung umfassen. Bevorzugte Abgabesysteme mit nachhaltiger Freisetzung sind solche, die für die Freisetzung der aktiven Komponente der Erfindung in Pellets oder Kapseln mit nachhaltiger Freisetzung sorgen können. Viele Arten von Abgabesystemen mit nachhaltiger Freisetzung sind verfügbar. Dazu gehören unter anderem: (a) Erosionssysteme, bei denen die aktive Komponente innerhalb einer Matrix enthalten ist, und (b) Diffusionssysteme, bei denen die aktive Komponente mit einer kontrollierten Geschwindigkeit durch ein Polymer dringt. Außerdem kann ein Abgabegerät auf Pumpenbasis verwendet werden, von denen einige für die Implantation geeignet sind.
  • Die aktive Komponente wird in prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge bedeutet eine Menge, die notwendig ist, um wenigstens teilweise die gewünschte Wirkung zu erreichen oder das Einsetzen des besonderen behandelten Zustands zu verzögern, dessen Fortschreiten zu hemmen oder dessen Einsetzen oder Fortschreiten ganz zu unterbinden. Diese Menge wird selbstverständlich von dem besonderen behandelten Zustand, der Schwere des Zustands und den individuellen Patientenparametern einschließlich des Alters, der körperlichen Verfassung, der Größe, des Gewichts und der sonstigen Behandlung abhängen. Diese Faktoren sind dem Fachmann wohlbekannt und können mit bloßen Routineversuchen angegangen werden. Im Allgemeinen wird vorzugsweise eine maximale Dosis verwendet, d.h. die höchste, nach zuverlässigem medizinischen Urteil noch unbedenkliche Dosis. Der Fachmann wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass aus medizinischen Gründen, psychologischen Gründen oder aus praktisch beliebigen anderen Gründen auch eine niedrigere Dosis oder tolerierbare Dosis verabreicht werden kann.
  • Im Allgemeinen betragen die täglichen oralen Dosen der aktiven Komponente etwa 0,01 mg/kg pro Tag bis 1000 mg/kg pro Tag. Anfangs können kleine Dosen (0,01–1 mg) verabreicht werden, gefolgt von steigenden Dosen bis zu etwa 1000 mg/kg pro Tag. Falls ein Patient auf solche Dosen ungenügend anspricht, können noch höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen über einen anderen, besser lokalisierten Verabreichungsweg) eingesetzt werden, soweit der Patient sie verträgt. Mehrere Dosen pro Tag werden in Betracht gezogen, um geeignete systemische Konzentrationen von Verbindungen zu erreichen.
  • Die aktive Komponente gemäß der Erfindung kann auch zur Verwendung in Form von veterinärmedizinischen Zusammensetzungen vorgestellt werden, die zum Beispiel nach in der Technik herkömmlichen Verfahren hergestellt werden können. Beispiele für solche veterinärmedizinischen Zusammensetzungen sind solche, die geeignet sind für:
    • (a) orale Verabreichung, externe Verabreichung, zum Beispiel Arzneitränke (z.B. wässrige oder nichtwässrige Lösungen oder Suspensionen); Tabletten oder Boli; Pulver, Granulate oder Pellets zum Beimischen ins Futter; Pasten zum Auftragen auf die Zunge;
    • (b) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, z.B. als sterile Lösung oder Suspension; oder (gegebenenfalls) durch intramammäre Injektion, wobei eine Suspension oder Lösung über die Zitze in den Euter eingeführt wird;
    • (c) topische Verabreichung, z.B. als Creme, Salbe oder Spray, die bzw. das auf die Haut aufgetragen wird; oder
    • (d) intravaginal, z.B. als Pessar, Creme oder Schaum.
  • In der gesamten Beschreibung und den folgenden Ansprüchen impliziert das Wort "umfassen" oder Variationen davon, wie "umfasst" oder "umfassend", wenn der Kontext nichts anderes verlangt, den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen, aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • In den Begleitzeichnungen zeigen:
  • 1 die Wirkung von BRI 2999 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro.
  • 2 die Wirkung von BRI 6741 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro.
  • 3 die Wirkung von BRI 2998 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro.
  • 4 die Wirkung von BRI 7011 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro.
  • 5 die Wirkung von BRI 6181 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro.
  • Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen hervor, die zur Veranschaulichung, aber nicht zur Einschränkung der Erfindung aufgenommen sind. In den folgenden Beispielen bezieht sich "PAMAM-Dendrimere" auf Polyamidoamin-Dendrimere auf der Basis eines Ammoniackerns, wie es ausführlich in den US-Patenten Nr. 4,507,466 , 4,558,120 , 4,568,737 und 4,587,329 wiedergegeben ist; "PAMAM(EDA)-Dendrimere" bezieht sich auf Polyamidoamin-Dendrimere auf der Basis eines Ethylendiamin-Kerns; und "BHAlysxlysylysz-Dendrimere" bezieht sich auf unsymmetrische Polylysin-Dendrimere auf der Basis eines Benzhydrylamin-Kerns und Lysin-Verzweigungseinheiten, wie es in den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 beschrieben ist. Die Polyamidoamin-Dendrimere PAMAM 1.0, PAMAM 2.0, PAMAM 3.0, PAMAM 4.0, PAMAM 5.0 oder höhere Generationen, PAMAM 4.0 (EDA) und die Polylysin-Dendrimere BHAlyslys2, BHAlyslys2lys4, BHAlyslys2lys4lys8 und BHAlyslys2lys4lys8lys16, BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32, BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32lys64 oder höhere Generationen werden so hergestellt, wie es in den US-Patenten Nr. 4,289,872 , 4,410,688 , 4,507,466 , 4,558,120 , 4,568,737 und 4,578,239 und in den internationalen Patentschriften WO 88/01178 , WO 88/01179 , WO 88/01180 und WO 95/24221 , auf die oben Bezug genommen wurde, beschrieben ist.
  • Beispiel 1
  • Reaktion von dendritischen Polymeren mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure unter Bildung von Dendrimeren mit Sulfonsäure-Endgruppen
  • A. PAMAM 1.0
  • Festes Natriumcarbonat (0,13 g; 1,0 mmol) wurde langsam unter Rühren zu einer Lösung von 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (0,41 g; 2,0 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben. Nachdem die Gasentwicklung aufgehört hatte, betrug der pH-Wert der Lösung 8,0. Dann wurde eine Lösung von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in Wasser (1 ml) zu der Lösung gegeben, und dann wurden vier Tropfen einer 40%igen wässrigen Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid hinzugefügt. Dann wurde die Lösung drei Tage lang unter Stickstoff auf 60 °C erhitzt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet, was das sulfonierte PAMAM-1.0-Dendrimer als schmutzigweißen Feststoff (0.51 g) ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-1.0-Dendrimer (ca. 70:30). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1, 37,1, 37,7, 41,3, 48,6, 51,5, 53,1, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5, 178,3, 179,0, 179,8.
  • B. PAMAM 2.0
  • PAMAM 2.0 wurde gemäß der obigen Beschreibung mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet, was einen schmutzigweißen Feststoff ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-2.0-Dendrimer (ca. 65:35). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1, 37,1, 37,7, 41,3, 48,7, 51,5, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5, 178,4, 179,0, 179,1, 179,6. Als die obige Reaktion unter Weglassen des Benzyltrimethylammoniumhydroxids wiederholt wurde, wurde ein ähnliches Ergebnis erhalten.
  • C. PAMAM 3.0; BRI2783
  • PAMAM 3.0 wurde wie oben mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt, außer dass ein leichter Überschuss an Natriumcarbonat verwendet wurde und das Benzyltrimethylammoniumhydroxid weggelassen wurde. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-3.0-Dendrimer (ca. 50:50). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1, 36,9, 37,4, 41,1, 48,6, 51,5, 53,4, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,2, 178,9, 179,0, 179,8.
  • D. PAMAM 4.0; BRI2784
  • PAMAM 4.0 wurde so mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt, wie es für PAMAM 3.0 beschrieben wurde. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-4.0-Dendrimer (ca. 35:65). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1, 36,9, 37,3, 41,1, 48,5, 51,5, 53,5, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,1, 178,9, 179,0, 179,8.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen
  • A. PAMAM 1.0
  • Eine Lösung von 4-Nitrophenylbromacetat (0,40 g; 1,5 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 1.0 (0,18 g; 0,5 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende gelbe Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test negativ verlief. Die Lösung wurde konzentriert (30 °C/0,1 mm Hg), was ein gelbes Öl ergab. Dieses Öl wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit Chloroform (2x) und schließlich mit Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Lösung wurde konzentriert (35 °C/25 mm Hg), was das bromacetylierte PAMAM-1.0-Dendrimer als gelbes Öl ergab (0,36 g; 100%). 13C-NMR (D2O): δ 32,8, 33,3, 43,0, 43,5, 54,4, 174,5, 176,4.
  • Eine Lösung von Natriumsulfit (0,2 g; 1,6 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu einer Lösung des oben beschriebenen bromacetylierten PAMAM-1.0-Dendrimers (0,36 g; 0,5 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und die Lösung wurde elf Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die gelbe Lösung wurde konzentriert, was einen gelblichen Feststoff ergab (0,60 g). 13C-NMR (D2O): δ 34,4, 43,1, 43,4, 54,0, 61,7, 171,3, 177,2.
  • Die obige Reaktionssequenz konnte durchgeführt werden, ohne das bromacetylierte Dendrimer zu isolieren, indem man einfach die Natriumsulfitlösung zu dem aus der ersten Reaktion erhaltenen rohen wässrigen Extrakt gibt.
  • B. PAMAM 2.0
  • Verfahren 1:
  • Eine Lösung von 4-Nitrophenylbromacetat (0,18 g; 0,7 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 2.0 (0,10 g; 0,1 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende gelbe Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test negativ verlief. Die Lösung wurde dann unter Schwenken in Wasser (150 ml) gegeben, und das Gemisch wurde mit Chloroform (3x) und Ethylacetat extrahiert. Eine Lösung von Natriumsulfit (0,1 g; 0,8 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu der rohen bromacetylierten Dendrimerlösung gegeben, und das Gemisch wurde drei Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde die gelbliche Lösung konzentriert, was einen gelben festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt wurde, was das PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen ergab (103 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,0, 35,7, 36,0, 37,7, 40,3, 43,0, 43,2, 53,4, 53,7, 56,0, 61,6, 171,2, 174,6, 178,5.
  • Verfahren 2:
  • Festes Succinimidylacetylthioacetat (67 mg; 0,33 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 2.0 (52 mg; 0,05 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gemisch konzentriert (30 °C/10-3 mm Hg), was einen öligen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht wurde abgetrennt und konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (117 mg). 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten, dass das Öl ein Gemisch des acylierten Dendrimers mit N-Hydroxysuccinimid war. Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) ergab eine reine Probe des PAMAM-2.0-Dendrimers mit Acetylthioacetamid-Endgruppen (29 mg). 13C-NMR (D2O): δ 34,0, 34,2, 37,3, 43,0, 43,1, 43,3, 53,5, 54,0, 56,3, 175,4, 177,2, 177,5.
  • Dann wurde eine Lösung des obigen funktionalisierten Dendrimers in 40%iger wässriger Ameisensäure (7 ml) zu einer eiskalten, frisch hergestellten Lösung von Perameisensäure (1,6 mmol) in Ameisensäure (2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 0 °C und dann 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde eine kleine Menge Aktivkohle hinzugefügt, um überschüssige Persäure zu zersetzen, das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, dann filtriert und konzentriert, was ein viskoses Öl ergab.
  • Das Rohprodukt wurde in Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit wässrigen Natriumhydrogencarbonat auf 9,0 eingestellt, und das Material wurde entsalzt, indem man es durch eine Säule mit Sephadex G10 leitete. Nach der Lyophilisierung wurde ein weißer Feststoff (20 mg) erhalten, der spektroskopisch im Wesentlichen dasselbe war wie das durch Verfahren 1 erhaltene Material. 13C-NMR (D2O): δ 33,0, 38,7, 42,9, 43,0, 43,1, 53,9, 54,3, 56,5, 61,6, 171,2, 176,4, 177,0.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
  • A. PAMAM 1.0
  • Festes Maleinsäureanhydrid (0,11 g; 1,1 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben. Das Gemisch wurde etwas warm und bräunlich, als sich das Anhydrid auflöste, und die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung konzentriert (30 °C/10-4 mm Hg), was ein viskoses Öl ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 1.0 zum Trisamid zusammen mit etwas Maleinsäure. 13C-NMR (D2O): δ 33,1, 42,8, 43,1, 54,3, 135,0, 137,1, 169,1, 171,9, 173,3.
  • Dann wurde das rohe Trisamid in Wasser (4 ml) gelöst, und festes Natriumsulfit (0,20 g; 1,6 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde vier Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann konzentriert. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten ein 1:1-Gemisch der regioisomeren PAMAM-1.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt, was eine Probe der PAMAM-1.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen ergab (107 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,3, 39,6, 40,0, 42,9, 43,1, 54,0, 67,9, 69,4, 173,8, 176,3, 177,6, 181,8.
  • B. PAMAM 2.0
  • Ein Gemisch der regioisomeren PAMAM-2.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen wurde gemäß der obigen Beschreibung hergestellt. 13C-NMR des PAMAM-2.0-Maleamsäure-Derivats (D2O): δ 32,8, 33,0, 38,7, 42,9, 53,8, 54,3, 56,5, 135,2, 136,8, 169,2, 171,9, 173,5, 174,6. 13C-NMR der PAMAM-2.0-Natriumsulfosuccinamsäure-Derivate (D2O): δ 37,0, 40,1, 41,1, 43,0, 43,2, 43,9, 53,0, 53,3, 55,5, 68,0, 69,4, 173,8, 177,6, 179,1, 179,5, 179,8, 182,3.
  • C. PAMAM 4.0; BRI6038
  • Festes Maleinsäureanhydrid (60 mg; 0,6 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde anfangs trübe, ergab jedoch bald eine klare Lösung, die über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Dann wurde die Lösung konzentriert (35 °C/10-4 mm Hg), was ein viskoses Öl ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 4.0 zum Polyamid zusammen mit etwas Maleinsäure. Dann wurde das rohe Polyamid in Wasser (2 ml) gelöst, und eine Lösung von Natriumsulfit (126 mg; 1,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann konzentriert. 1H- und 13CNMR-Spektren (D2O) zeigten ein Gemisch der regioisomeren PAMAM-4.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was eine Probe von PAMAM 4.0 mit 24 regioisomeren Sulfosuccinamsäure-Endgruppen ergab (90 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,4-2,6; 2,7-3,1; 3,2-3,4; 3,9-4,0. 13C-NMR (D2O): δ 36,2; 39,8; 40,5; 43,0; 43,2; 53,5; 55,8; 68,1; 69,5; 173,8; 177,4; 177,6; 178,7; 182,3.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
  • a. Herstellung von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure
  • Festes Bernsteinsäureanhydrid (0,50 g; 5,0 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-2-aminoethylsulfonsäure (1,83 g; 5,0 mmol) in trockenem Dichlormethan (30 ml) gegeben. Das Bernsteinsäureanhydrid löste sich langsam auf, und die resultierende trübe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (2,41 g). Das 13C-NMR-Spektrum zeigte eine vollständige Umsetzung des gewünschten Monoamids zusammen mit einer kleinen Menge Bernsteinsäure. Wiederholte Fällung des Produkts durch tropfenweise erfolgende Zugabe einer Dichlormethan-Lösung zu einem großen Überschuss von Diethylether ergab Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure als weißen Feststoff (1,762 g; 76%), Schmp. 125–127 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 0,86 (t, 12H, 4 × CH3), 1,28 (m, 8H, 4 × CH2), 1,50 (m, 8H, 4 × CH2), 2,33 (m, 2H, CH2COOH), 2,44 (m, 2H, CH2CONH), 2,76 (m, 2H, CH2NHCO), 3,12 (m, 8H, 4 × CH2N), 3,50 (m, 2H, CH2SO3 -), 7,53 (br t, 1H, NH). 13C-NMR (CDCl3): δ 13,5, 19,5, 23,8, 30,1, 30,9, 35,6, 50,0, 58,5, 172,0, 174,1.
  • b. Herstellung von Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamat
  • Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (45 mg; 0,22 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure (94 mg; 0,20 mmol) in Dichlormethan (2 ml) gegeben, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Suspension wurde filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was den rohen aktiven Ester ergab, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • A. Herstellung von PAMAM-Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI2786
  • Eine Lösung des rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats (0,30 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51,5 mg; 0,01 mmol) in 50%igem wässrigem DMF (3 ml) gegeben, und die resultierende gelbe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gemisch konzentriert (35 °C/10-5 mm Hg), und der gelbe Rückstand wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit Chloroform (2x) und Ethylacetat gewaschen und dann konzentriert, was ein gelbes 61 (134 mg) ergab. Das Rohprodukt wurde in das Natriumsalz umgewandelt, indem man es durch eine Säule mit Amberlite IR-120(Na) leitete, was 85 mg Material ergab. Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen ergab (45 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,2, 33,6, 35,5, 39,0, 39,5, 42,8, 43,2, 53,8, 54,1, 54,4, 56,6, 176,5, 176,9, 177,2, 178,9, 179,4.
  • Die entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-3.0(BRI2785)-Dendrimere mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
    13C-NMR PAMAM-3.0-Derivat (D2O): δ 33,4, 35,5, 39,0, 39,5, 42,9, 43,2, 53,8, 54,1, 54,3, 56,5, 176,4, 176,9, 177,4, 178,9, 179,4. 13C-NMR PAMAM-1.0-Derivat (D2O): δ 34,9, 35,5, 39,5, 42,9, 43,1, 53,7, 54,1, 179,0, 179,1, 179,3.
  • B. Herstellung von Polylysin-Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16; BRI2789
  • Trifluoressigsäure (1 ml) wurde zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (36,5 mg; 5,0 μmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in trockenem DMSO (2 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde eine Lösung des rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats (ca. 0,2 mmol) in DMSO (1 ml) hinzugetropft, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die gelbe Lösung konzentriert (50 °C/10-5 mm Hg), und der gelbe Rückstand wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit Chloroform (3x) und Ethylacetat gewaschen und dann konzentriert, was ein Öl (99 mg) ergab. Das Rohprodukt wurde in das Natriumsalz umgewandelt, indem man es durch eine Säule mit Amberlite IR-120(Na) leitete, was 81 mg Material ergab. Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen ergab (39 mg). 13C-NMR (D2O): δ 27,0, 32,3, 35,2, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,5, 132,0, 133,3, 145,1, 177,8, 178,0, 178,4, 178,8, 178,9, 179,2, 179,7, 179,8.
  • Die entsprechenden BHAlyslys2-, BHAlyslys2lys4-(BRI2787) und BHAlyslys2lys4lys8(BRI2788)-Dendrimere mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
    13C-NMR BHAlyslys2lys4lys8-Derivat (D2O): δ 26,9, 32,3, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,6, 131,9, 132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,2, 177,2, 177,8, 177,9, 178,0, 178,2, 178,3, 178,6, 178,7, 178,8, 178,9, 179,2, 179,3, 179,7, 179,8.
    13C-NMR BHAlyslys2lys4-Derivat (D2O): δ 26,9, 32,3, 35,1, 35,4, 35,7, 35,8, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 61,8, 131,7, 132,0, 132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,1, 177,3, 178,0, 178,3, 178,4, 178,7, 178,9, 179,0, 179,3, 179,7, 179,8.
    13C-NMR BHAlyslys2-Derivat (D2O): δ 26,9, 27,1, 32,2, 32,3, 34,7, 34,8, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,4, 54,1, 58,6, 61,8, 131,7, 131,9, 132,2, 132,3, 133,3, 144,9, 145,0, 177,7, 178,4, 178,8, 179,0, 179,3, 180,0.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
  • A. PAMAM 4.0; BRI2791
  • Festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (500 mg; 1,96 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (300 mg; 0,0582 mmol) in Wasser (10 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der gelbe feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (370 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,28; 2,52; 2,69; 3,15; 3,27; 3,60; 7,32 (d, J=9 Hz); 7,72 (d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,9; 41,1; 43,1; 48,3; 53,6; 55,8; 129,0; 131,1; 144,4; 178,5; 179,1; 184,4.
  • Die entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-2.0-(BRI2790), PAMAM-3.0- und PAMAM-5.0(BRI2991)-Dendrimere mit 3, 6, 12 bzw. 48 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
  • B. PAMAM 4.0 (EDA); BRI6045
  • Festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (130 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was PAMAM 4.0 mit 32 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (136 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30; 2,50; 2,70; 3,18; 3,62; 7,35 (d, J=9 Hz); 7,72 (d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,8; 41,0; 43,1; 48,4; 53,6; 55,7; 128,9; 131,0; 144,3; 178,5; 179,0; 184,5.
  • C. BHAlyslys2lys4lys8lys16; BRI2792
  • Trifluoressigsäure (4 ml) wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (0,73 g; 0,1 mmol) in trockenem Dichlormethan (4 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer kurzen Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtempe ratur gerührt und dann konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst, die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert, was BHAlyslys2lys4lys8lys16 als viskoses Öl ergab (0,49 g). Das Öl wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 3 ml) wurde hinzugefügt. Dann wurde festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (1,30 g; 5,1 mmol) hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na) geleitet und gefriergetrocknet, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (374 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,40; 1,72; 3,08; 3,42; 4,24; 4,60; 7,30; 7,40 (d, J=9 Hz); 7,78 (d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 27,3; 32,5; 35,9; 43,7; 48,9; 58,6; 63,3; 128,8; 131,0; 143,7; 144,7; 145,1; 177,7; 178,1; 183,8; 185,2.
  • Die entsprechenden BHAlyslys2lys4lys8-, BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32(BRI2992)- und BHAlyslys2lys4lys3lys16lys32lys64(BRI2993)-Dendrimere mit 16, 64 bzw. 128 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
  • A. PAMAM 4.0; BRI2923
  • Festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (160 mg; 0,41 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der braune feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als bräunlichen Feststoff ergab (73 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30; 2,60; 2,74; 3,20; 3,57; 7,75; 7,86; 8,28. 13C-NMR (D2O): δ 35,0; 39,9; 43,1; 48,1; 53,8; 56,1; 128,4; 128,6; 129,3; 131,0; 131,3; 136,0; 136,8; 138,2; 145,5; 146,0; 177,2; 177,8; 185,5.
  • Das entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • B. PAMAM 4.0 (EDA); BRI6046
  • Festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (220 mg; 0,57 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0 mit 32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als lohfarbenen Feststoff ergab (148 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30; 2,80; 3,20; 3,54; 7,74; 7,85; 8,25. 13C-NMR (D2O): δ 36,0; 40,8; 43,1; 48,3; 53,6; 55,9; 128,5; 129,4; 131,0; 131,3; 136,0; 136,8; 138,3; 145,5; 146,0; 178,2; 185,6.
  • C. BHAlyslys2lys4lys8lys16; BRI2999
  • Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (73 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer kurzen Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst, die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert, was BHAlyslys2lys4lys8lys16 als viskoses Öl ergab. Das Öl wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 3 ml) wurde hinzugefügt. Dann wurde festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (234 mg; 0,60 mmol) hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na) geleitet und gefriergetrocknet, was BHAlyslys2lys4lys8lys16 mit 32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen schmutzigweißen Feststoff ergab (119 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,0-2,0; 3,18; 3,43; 4,31; 7,22; 7,80; 7,89; 8,25. 13C-NMR (D2O): δ 27,2; 32,4; 35,3; 43,7; 49,0; 58,5; 63,6; 128,4; 129,1; 131,4; 136,1; 136,6; 138,6; 139,0; 145,1; 145,6; 178,4; 184,8; 186,7.
  • Beispiel 7
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI2997
  • Festes Natrium-4-sulfonaphthylisothiocyanat (180 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Das Wasser wurde unter reduziertem Druck von der resultierenden Suspension abdestilliert, und der schmutzigweiße feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (60 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,20; 2,60; 3,14; 3,48; 7,23; 7,47; 7,56; 7,77; 7,93 (d, J=6 Hz); 8,56 (d, J=6 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 35,8; 40,5; 43,1; 48,4; 53,6; 55,9; 127,6; 128,6; 130,3; 131,9; 132,5; 133,5; 134,7; 140,5; 142,7; 177,8; 178,0; 185,4.
  • Beispiel 8
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI6039
  • Festes Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (110 mg; 0,32 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als schmutzigweißen Feststoff ergab (110 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,53; 3,08; 3,36; 3,66; 7,90; 7,95. 13C-NMR (D2O): δ 34,8; 41,0; 43,1; 48,0; 53,7; 56,2; 124,1; 128,6; 143,5; 148,8; 177,6; 185,0.
  • Beispiel 9
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI2998
  • Festes Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylisothiocyanat (250 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 1 ml) in Wasser (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, was einen orangefarbenen Feststoff ergab. Der feste Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst und durch eine kurze Säule mit Amberlite IR-120(Na) geleitet. Dann wurde das Filtrat konzentriert, und der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex 11-120; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefrierge trocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als schmutzigweißen Feststoff ergab (102 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,65; 3,02; 3,30; 3,66; 8,05; 8,42; 8,59; 8,67. 13C-NMR (D2O): δ 33,2; 38,7; 43,2; 43,7; 47,8; 54,0; 54,3; 56,7; 131,0; 131,3; 131,9; 135,9; 138,0; 139,6; 143,8; 144,1; 145,6; 176,2; 176,5; 186,0.
  • Das entsprechende Dendrimer mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen, BHAlyslys2lys4lys8lys16 BRI 7011, wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Beispiel 10
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI6040
  • Festes 4-Nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (200 mg; 0,68 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (70 mg; 0,014 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben, und die resultierende gelbe Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung konzentriert (10-4 mm Hg; 40 °C), und der Rückstand wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) extrahiert. Der feste Rückstand wurde in DMSO (5 ml) gelöst, und eine Lösung von Natriumsulfit (130 mg; 1 mmol) in Wasser (3 ml) wurde hinzugefügt. Das resultierende leicht trübe Gemisch wurde vier Tage lang stehen gelassen, und danach führte die Zugabe von weiterem Wasser (2 ml) zur Bildung einer klaren homogenen gelben Lösung. Dann wurde die Lösung konzentriert, zuerst bei 25 mm Hg und 40 °C und dann bei 10-4 mm Hg und 50 °C, was das Rohprodukt ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen ergab (24 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,25; 2,66; 3,08; 3,20; 3,33; 3,38; 4,01; 7,40 (br d); 7,62 (br d). 13C-NMR (D2O): δ 36,7; 40,9; 43,0; 43,6; 53,5; 55,5; 61,0; 131,6; 135,0; 137,2; 140,4; 174,5; 178,6; 179,2.
  • Beispiel 11
  • Herstellung von Dendrimeren mit 4-Sulfobenzamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA); BRI6116
  • Festes Kalium-N-hydroxysuccinimidyl-4-sulfobenzoat (100 mg; 0,3 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (35 mg; 0,005 mmol) in 0,1 M Boratpuffer (5 ml) mit pH 8,5 gegeben, und die Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende milchige Lösung hatte in diesem Stadium einen pH-Wert von 4,5. Dann wurde 1 M Natriumcarbonatlösung (1 ml) hinzugefügt, was eine klare Lösung ergab, die konzentriert wurde, was das Rohprodukt als weißen Feststoff ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfobenzamid-Endgruppen ergab (47 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,25; 2,42; 2,63; 3,05; 3,18; 3,31; 3,38; 7,72 (d, J=8 Hz); 7,78 (d, J=8 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,0; 40,4; 43,0; 43,7; 53,7; 55,8; 130,2; 132,2; 140,4; 150,1; 173,6; 178,0; 178,5.
  • Beispiel 12
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA); BRI6117
  • Festes Natrium-N-(4-sulfophenyl)acrylamid (250 mg; 1 mmol) und festes Natriumcarbonat (106 mg; 1 mmol) wurden nacheinander unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (78 mg; 0,011 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde vier Tage lang unter Stickstoff gerührt und dann gefriergetrocknet, was einen flockigen weißen Feststoff ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 64 Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen ergab (206 mg). Das 13C-NMR-Spektrum zeigte eine schwache Spur von vermutlich monoalkylierten terminalen Aminogruppen. 1H-NMR (D2O): δ 2,10; 2,48; 2,58; 2,79; 3,20; 7,42 (d, J=7 Hz); 7,65 (d, J=7 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,5; 37,9; 41,1; 53,4; 55,6; 124,8; 130,9; 143,0; 144,2; 177,4; 178,5.
  • Beispiel 13
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA); BRI6115
  • Eine Lösung von Natriumsulfanilsäure (195 mg; 1 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) wurde tropfenweise zu einer Lösung von N,N'-Disuccinimidylcarbonat (530 mg; 2 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben, und die resultierende bräunliche Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (75 mg; 0,011 mmol) in trockenem DMSO (1 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde weitere 18 Stunden lang gerührt. Dann wurde die Lösung unter Hochvakuum (10-5 mm Hg; 35 °C) konzentriert, was einen gelblichen halbfesten Stoff ergab. Das Rohprodukt wurde in DMSO (4 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter kräftigem Rühren zu 200 ml Ethylacetat gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen und mit Ethylacetat (2x) und Ether (2x) gewaschen und dann getrocknet, was ein weißes Pulver ergab (275 mg). Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen ergab (106 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,31; 2,55; 2,75; 3,19; 7,32 (d, J=9 Hz); 7,63 (d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,3; 40,7; 43,3; 43,8; 53,7; 55,7; 123,3; 130,9; 140,9; 146,0; 161,4; 178,2; 178,6.
  • Beispiel 14
  • Herstellung von Dendrimeren mit N,N,N-Trimethylglycinamidchlorid-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16; BRI2922
  • Trifluoressigsäure (4 ml) wurde zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (220 mg; 30 μmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in trockenem DMSO (5 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde festes 4-Nitrophenyl-N,N,N-trimethylglycinatchlorid (0,50 g; 1,8 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die trübe Lösung konzentriert (50 °C/10-5 mm Hg), und der Rückstand wurde mit Wasser und Dichlormethan ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit Dichlormethan (3x) und Ethylacetat gewaschen und dann konzentriert, was ein Öl (1,128 g) ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer mit N,N,N-Trimethylglycinamid-Endgruppen ergab (116 mg). 13C-NMR (D2O): δ 25,5, 30,5, 30,8, 33,4, 42,1, 56,5, 57,1, 67,5, 68,1, 166,7, 167,0, 167,1, 176,0, 176,2.
  • Beispiel 15
  • Herstellung von Dendrimeren mit 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI6043
  • 1,1'-Carbonyldiimidazol (85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von 4-Trimethylammoniumbenzoesäureiodid (154 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (4 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Während dieser Zeit schied sich ein weißer Feststoff aus der Lösung ab. Dann wurde eine Lösung von PAMAM 4.0 (58 mg; 0,011 mmol) in trockenem DMF (2 ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach hatte sich der größte Teil des Niederschlags aufgelöst, und ein Ninhydrin-Test der Lösung war negativ. Das Gemisch wurde konzentriert (10-4 mm Hg; 30 °C), was einen weißen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen als Essigsäuresalz ergab (89 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,96; 2,65-2,85; 3,25-3,55; 3,64; 7,92. 13C-NMR (D2O): δ 25,8; 33,1; 33,5; 38,7; 43,1; 43,5; 53,5; 54,1; 56,4; 61,2; 124,8; 133,6; 139,9; 153,2; 173,2; 176,3; 176,8; 182,6.
  • Das entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Beispiel 16
  • Herstellung von Dendrimeren mit 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI6044
  • Festes 4-Nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (150 mg; 0,5 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (52 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) gegeben. Die resultierende gelbe Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test negativ verlief (pH ca. 8,5). Dann wurde die Lösung konzentriert (10-5 mm Hg; 40 °C), und der Rückstand wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) ausgeschüttelt. Das unlösliche gelartige Material wurde durch Filtration aufgefangen, mit Wasser (2x) und Dichlormethan (2x) gewaschen und dann an der Luft getrocknet. Das rohe Dendrimer mit 4-(Chlormethyl)benzamid-Endgruppen wurde in 25%igem wässrigem Trimethylamin (20 ml) gelöst, und die gelbe Lösung wurde über Nacht stehen gelassen. Dann wurde die Lösung konzentriert, der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet. Das farblose Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt wurde, was PAMAM 4.0 mit 24 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen ergab (90 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,88; 2,65-2,80; 2,98; 3,10-3,60; 7,52 (br d, J=9 Hz); 7,72 (br d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 26,6; 33,4; 38,8; 43,2; 43,5; 53,6; 53,6; 54,1; 56,8; 62,8; 73,0; 132,1; 135,3; 137,5; 140,0; 176,4; 176,9; 183,6.
  • Beispiel 17
  • Herstellung von Dendrimeren mit N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0
  • Festes 1,1'-Carbonyldiimidazol (85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von N-(2-Acetoxyethyl)-N-(carboxymethyl)-N,N-dimethylammoniumbromid (135 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff gerührt. Dann wurde eine Lösung von PAMAM 4.0 (60 mg; 0,012 mmol) in DMF (2 ml) hinzugefügt, was die sofortige Bildung eines flockigen Niederschlags bewirkte, der sich langsam wieder auflöste. Das Gemisch wurde zwei Tage lang gerührt und dann konzentriert (10-4 mm Hg; 40 °C), was ein viskoses Öl ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen ergab (64 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,93; 2,05; 2,70; 3,10-3,60; 3,28; 3,93 (m); 4,14; 4,48 (m). 13C-NMR (D2O): δ 24,6; 26,2; 33,2; 38,7; 42,8; 42,9; 53,9; 57,4; 62,6; 67,3; 67,5; 168,9; 176,4; 176,8; 177,3; 183,2.
  • Beispiel 18
  • Herstellung von Dendrimeren mit Guanidino-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI6042
  • Eine Lösung von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) und Methylthiopseudoharnstoffsulfat (170 mg; 0,61 mmol) in Wasser (5 ml) (pH 10,5) wurde zwei Stunden lang bei 80 °C unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, und der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 Guanidino-Endgruppen als Acetatsalz ergab (107 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,00; 2,80 (br t); 3,09 (br t); 3,32; 3,45 (br t); 3,60 (br t). 13C-NMR (D2O): δ 25,2; 33,2; 33,4; 38,7; 41,2; 42,6; 43,4; 44,7; 53,5; 54,0; 56,3; 176,5; 176,7; 176,9; 181,6.
  • Das entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs Guanidino-Endgruppen wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Beispiel 19
  • Herstellung von Dendrimeren mit 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methy)benzamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0; BRI6041
  • Eine Lösung von 1-(4-Carboxyphenyl)methyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-Tetrahydrochlorid (120 mg; 0,25 mmol), N-Hydroxysuccinimid (60 mg; 0,52 mmol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (250 mg; 1,3 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml) wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dann wurde eine Lösung von PAMAM 4.0 (32 mg; 0,006 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde zwei Tage lang stehen gelassen und dann konzentriert. Der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit ca. 12 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid- Endgruppen ergab, wie durch 1H- und 13C-NMR bestimmt wurde (80 mg). Dann wurde das Produkt in Wasser gelöst und durch eine Säule mit Amberlite-IRA-401(Cl)-Harz geleitet und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst, konzentrierte HCl (1 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde mit Ethanol (30 ml) verdünnt, so dass ein weißer Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen (68 mg). Erneut zeigten 1H- und 13C-NMR ca. 50% Funktionalisierung der terminalen Aminogruppen. 1H-NMR (D2O): δ 2,17; 2,36; 2,50; 2,78; 2,85; 3,25; 3,40; 3,50; 3,60; 3,62; 4,49; 7,63 (br d); 7,78 (br d). 13C-NMR (D2O): δ 22,7; 23,1; 33,2; 38,8; 39,9; 40,2; 40,3; 41,0; 41,2; 42,0; 42,9; 43,2; 43,6; 45,5; 46,1; 49,1; 52,2; 53,9; 54,3; 56,6; 62,7; 132,5; 135,7; 137,1; 139,7; 174,3; 176,2; 176,3; 176,7; 177,0; 178,2; 178,5.
  • Beispiel 20
  • Herstellung von Dendrimeren mit 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA); BRI6119
  • Natriumcyanoborhydrid (32 mg; 0,5 mmol) wurde zu einem Gemisch von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol), 4-Formyl-2-hydroxybenzoesäure (83 mg; 0,5 mmol) und Natriumhydrogencarbonat (42 mg; 0,5 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Das inhomogene orangefarbene Gemisch wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, und während dieser Zeit wurde es homogen. Dann wurde die orangefarbene Lösung konzentriert, und der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit ca. 32 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen ergab (91 mg). 1H- und 13C-NMR (D2O) zeigten größtenteils Monoalkylierung, aber mit einigen Anzeichen der Dialkylierung der terminalen Aminogruppen, und beide Spektren zeigten breite Signale. 13C-NMR (D2O): δ 37,0; 41,1; 50,9; 53,4; 55,5; 55,8; 61,5; 120,9; 122,2; 122,4; 132,3; 132,7; 135,0; 135,8; 163,5; 163,7; 169,0; 178,6; 179,3. 1H-NMR (D2O): δ 2,20; 2,35; 2,60; 3,15; 3,30; 3,55; 4,25; 6,68; 7,12; 7,55.
  • Beispiel 21
  • Herstellung von Dendrimeren mit 4-Carboxyphenylamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes 4-Carboxyphenylisothiocyanat (86 mg; 0,48 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben. Der pH-Wert der resultierenden trüben Lösung wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung auf 9 eingestellt, und die Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren gelassen. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als weißen flockigen Feststoff ergab (68 mg).
  • Beispiel 22
  • Herstellung von Dendrimeren mit 3,5-Dicarboxyphenylamid-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes 3,5-Dicarboxyphenylisothiocyanat (112 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (70 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben. Der pH-Wert der resultierenden trüben Lösung wurde mit 1 M Na2CO3-Lösung auf 10 eingestellt, und die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 53 °C unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen bräunlichen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als blassbraunen Feststoff ergab (112 mg).
  • Beispiel 23
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonooxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes Natrium-4-phosphonooxyphenylisothiocyanat (251 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben. Die resultierende Lösung (pH 9) wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen weißen Feststoff ergab (86 mg).
  • Beispiel 24
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes Natrium-4-(phosphonomethyl)phenylisothiocyanat (97 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (30 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde 3 Tage lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, wobei der pH-Wert durch regelmäßige Zugabe von gesättigter NaHCO3-Lösung auf 8 gehalten wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen weißen Feststoff ergab (102 mg).
  • Beispiel 25
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natriumethyl-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes Natriumethyl-4-(phosphonomethyl)phenylisothiocyanat (109 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in DMF (30 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde 17 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, wobei der pH-Wert durch regelmäßige Zugabe von gesättigter NaHCO3-Lösung auf 8 gehalten wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen weißen Feststoff ergab (30 mg).
  • Beispiel 26
  • Herstellung von Dendrimeren mit Cn-Alkyl-verknüpften 2-Thiosialosid-Endgruppen
  • Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
  • Zu einer Lösung von Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-S-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat (Hasegawa et al., 1986) (100 mg) in trockenem Dimethylformamid (1 ml) wurden 8-Bromoctansäure (41 mg) und Diethylamin (280 mg) gegeben, und die Lösung wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und eiskalter 5%iger Salzsäure ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen Rückstand ergab (130 mg). Dieser wurde in Ethylacetat (5 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid (26 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (46 mg) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch Flash-Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit Ethylacetat eluiert wurde. Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden miteinander kombiniert und eingedampft, was einen weißen Schaum ergab (97 mg, 71%).
  • In ähnlicher Weise wurden hergestellt:
    Methyl[(11-undecansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
    Methyl[(essigsäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
    Methyl[(4-butansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
    Methyl[(4-methylbenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
  • A. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6112
  • Zu einer Lösung des PAMAM [EDA] 4.0 (50 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (4 ml) unter einer inerten Atmosphäre wurde Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat (300 mg) gegeben, und die Lösung wurde 60 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol (2 ml) gelöst. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Methanol eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 als weißes Pulver erhalten (182 mg; 93%).
  • Dieses wurde nach dem folgenden Verfahren in das freie Sialosid umgewandelt:
    Zu einer Lösung von PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 (182 mg) in trockenem Methanol (3 ml) unter Argon bei 20 °C wurde eine frisch hergestellte 0,19 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (7 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser (10 ml) gelöst, und es wurde 3 Stunden lang gerührt. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als blass zitronengelbes Pulver erhalten (110 mg; 77%).
  • Nach einem ähnlichen Verfahren wurden hergestellt:
    PAMAM [EDA] 4.0 [(11-Undecanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6147
    PAMAM [EDA] 4.0 [(Acetamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6121
    PAMAM [EDA] 4.0 [(4-Methylbenzamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6120
  • B. BHAlyslys2lys4lys8lys16 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6169
  • Eine Lösung von BHAlyslys2lys4lys8lys16(t-Boc)32 (20,3 mg) in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (2 ml) und Dichlormethan (2 ml) wurde 2 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in trockenem Dimethylsulfoxid (1 ml) gelöst, und Diisopropylethylamin (25 mg) und Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat (78 mg) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde 60 Stunden lang bei 20 °C unter Argon gerührt, und dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in einer frisch hergestellten 0,1 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (2,5 ml) gelöst, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 20 °C unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst und 17 Stunden lang gerührt. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt BHAlyslys2lys4lys8lys16 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als weißes Pulver erhalten (44 mg; 86%).
  • Beispiel 27
  • Herstellung von dendritischen Sialosiden, die in der 4-Position von Sialinsäure modifiziert sind.
  • Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-S-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Zu einer Lösung von Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-chlor-3,4,5-tridesoxy-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosonat (Sabesan, 1994) (5 g) in trockenem Dichlormethan (150 ml) wurde fein gepulvertes Kaliumthiolacetat (5,8 g) gegeben, und die Suspension wurde 48 Stunden lang bei 20 °C kräftig gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und eingedampft, was einen hellbraunen Schaum ergab (5,2 g). Das erforderliche Produkt wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC [C18, 30% Acetonitril/Wasser] als weißer Schaum isoliert (3,9 g; 72%).
  • Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
  • Zu einer Lösung von Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-S-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat (300 mg) in trockenem Dimethylformamid (3,5 ml) wurden 8-Bromoctansäure (155 mg) und Diethylamin (1,26 ml) gegeben, und die Lösung wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und eiskalter 10%iger Salzsäure ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen gelben Schaum ergab (385 mg). Dieser wurde in Ethylacetat (20 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid (95 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (175 mg) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC [C18, 30% Acetonitril/Wasser] gereinigt, was einen weißen Schaum ergab (340 mg; 83%).
  • A. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6146
  • Zu einer Lösung des PAMAM [EDA] 4.0 (72 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (5 ml) wurde unter einer inerten Atmosphäre Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat (318 mg) gegeben, und die Lösung wurde 60 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol (2 ml) gelöst. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Methanol eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 als weißer Schaum erhalten (225 mg; 81%).
  • Das freie Sialosid wurde nach dem folgenden Verfahren erhalten:
    Zu einer Lösung von PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 (215 mg) in trockenem Methanol (1 ml) unter Argon bei 20 °C wurde eine frisch hergestellte 1 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (1 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst, und es wurde 17 Stunden lang gerührt. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als flockiges weißes Pulver erhalten (160 mg; 90%).
  • B. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6149
  • Ein langsamer Strom von Schwefelwasserstoffgas wurde 5 Tage lang bei 20 °C in eine Lösung von PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 (25 mg) in einem Gemisch von Pyridin (40 ml) und Wasser (20 ml) geleitet. Dann wurde 2 Tage lang Stickstoff durch die Lösung perlen gelassen, um überschüssigen Schwefelwasserstoff zu entfernen. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) aufgenommen und durch einen 0,45-μm-Membranfilter filtriert, um Schwefel zu entfernen. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als flockiges weißes Pulver erhalten (23 mg; 96%).
  • Beispiel 28
  • Herstellung von Dendrimeren mit Boronsäure-Endgruppen
  • 4-Carboxyphenylboronsäure-N-hydroxysuccinimidester
  • Zu einer Lösung von 4-Carboxyphenylboronsäure (500 mg) in trockenem Dimethylformamid (5 ml) wurden N-Hydroxysuccinimid (380 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (680 mg) gegeben. Das Gemisch wurde 64 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen weißen Feststoff ergab, der aus Acetonitril/Wasser in Form von feinen Nadeln kristallisiert wurde (730 mg; 92%).
  • PAMAM [EDA] 4.0 [4-Benzamidoboronsäure]32; BRI6160
  • Zu einer Lösung des PAMAM [EDA] 4.0 (69 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (5 ml) unter einer inerten Atmosphäre wurde 4-Carboxyphenylboronsäure-N-hydroxysuccinimidester (130 mg) gegeben, und die Lösung wurde 65 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Zu der dicken Aufschlämmung wurde 1 M Natriumcarbonatlösung (1 ml) gegeben, und die klare Lösung wurde noch weitere 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 10% Ammoniaklösung (5 ml) gelöst. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit einer 10%igen Ammoniaklösung eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [4-Benzamidoboronsäure]32 als flockiger weißer Feststoff erhalten (110 mg; 94%).
  • Beispiel 29
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
  • Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (147 mg) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und dann wurde festes 3,6-Disulfonaphthylisothiocyanat (400 mg) hinzugefügt. Dann wurde der pH-Wert des Gemischs durch Zugabe von 1 M Natriumcarbonat auf 9,5 eingestellt, und die Lösung wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, und der Rückstand wurde in Wasser wieder aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR-120(Na) geleitet. Das Filtrat wurde konzentriert, was das Rohprodukt ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt wurde, was BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-3,6-disulfonaphthylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab (175 mg).
  • Beispiel 30
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
  • Trifluoressigsäure (3 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (300 mg; 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 401 (OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (187 mg). Das Öl wurde in einem 1:1-Gemisch von Pyridin/Wasser (8 ml) gelöst, und festes Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (680 mg; 2 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys2lys4lys8lys15lys32 mit 64 Natrium-3,6-disulfophenylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab.
  • Beispiel 31
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-dicarboxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32; BRI6741
  • Trifluoressigsäure (3 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (300 mg; 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 401 (OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (186 mg). Das Öl wurde in einem 1:1-Gemisch von Pyridin/Wasser (8 ml) gelöst, und Natrium-3,5-dicarboxyphenylisothiocyanat (450 mg; 2 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde 13 Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-3,6-dicarboxyphenylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab.
  • Das entsprechende Dendrimer PAMAM 4.0 (EDA) mit Natrium-3,5-dicarboxyphenylthioharnstoff-Endgruppen, BRI6195, wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Beispiel 32
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonooxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32; BRI6181
  • Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (147 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert, was ein viskoses Öl ergab. Das Öl wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und festes 4-Phosphonooxyphenylisothiocyanat (250 mg) wurde hinzugefügt. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde mit 1 M Natriumcarbonat auf 10 eingestellt, und das Gemisch wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde in Wasser wieder aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 120 (Na) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert. Dann wurde der Rückstand durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-4-phosphonooxyphenylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab (150 mg).
  • Beispiel 33
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonophenylthioharnstoff-Endgruppen
  • BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
  • Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (147 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert, was ein viskoses Öl ergab. Das Öl wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und festes 4-Phosphonophenylisothiocyanat (250 mg) wurde hinzugefügt. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung auf 9 eingestellt, und das Gemisch wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde in Wasser wieder aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 120 (Na) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert. Dann wurde der Rückstand durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-4-phosphonophenylharnstoff-Gruppen (BRI6196) als weißen flockigen Feststoff ergab (152 mg).
  • Beispiel 34
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4,6-diphosphononaphthylthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0
  • Eine Lösung von Natrium-4,6-diphosphononaphthylisothiocyanat (165 mg) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (2 ml) gegeben. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung auf 9,5 eingestellt, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur kräftig gerührt und dann drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen braunen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4,6-diphosphononaphthylthioharnstoff-Endgruppen als braunen Feststoff ergab (81 mg).
  • Beispiel 35
  • Herstellung von Dendrimeren mit Fluoresceinthioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes Fluoresceinisothiocyanat (188 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben. Gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung wurde hinzugefügt, um den pH-Wert auf 9 einzustellen, und die resultierende homogene Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der orangefarbene Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 (EDA) mit 21 Fluoresceinthioharnstoff-Endgruppen als flockigen orangefarbenen Feststoff ergab (193 mg).
  • Beispiel 36
  • Herstellung von Dendrimeren mit Natrium(phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-Endgruppen
  • PAMAM 4.0 (EDA)
  • Festes (Phenyl-3-boronsäure)isothiocyanat (100 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben. Zu dem gelösten Isothiocyanat wurde 1 M Natriumcarbonat gegeben (pH ca. 10). Dann wurde das Gemisch zwei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt und dann filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen bräunlichen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium(phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-Endgruppen als weißen flockigen Feststoff ergab (87 mg).
  • Beispiel 37
  • Herstellung von Dendrimeren mit Pyridiniumdodecylcarboxamido-Endgruppen
  • PAMAM-2.0-Dendrimer; BRI-6807
  • Ein PAMAM-Generation-2.0-Kern (0,0479 mmol; 50 mg) wurde durch Eindampfen aus 0,5 ml einer Lösung in MeOH erhalten und dann in 10 ml Wasser wieder aufgelöst. Zu der Lösung wurden 1-N-Pyridinium-12-dodecansäurebromid (0,14 g; 0,384 mmol), N-Hydroxybenzotriazolhydrat [HOBT] (52 mg; 0,384 mmol), Triethylamin (53 μl; 0,384 mmol) und 1-(3-Diethylaminopropyl-3-ethyl)carbodiimid·HCl [EDC] (74 mg; 0,384 mmol) gegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Volumen wurde unter reduziertem Druck auf ein Drittel reduziert, und die Lösung wurde an einer LH20-Säule unter Verwendung von Wasser als Eluent chromatographiert. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden aufgefangen, und Pyridiniumdodecylcarboxamid-PAMAM-2.0-bromid wurde durch Gefriertrocknen als weißer flockiger Feststoff isoliert.
    1H-NMR (D2O): δ 1,15, 1,45, 1,9, 2,15, 2,75, 2,8, 3,15, 3,35, 3,5, 4,55, 8,05, 8,5, 8,8.
  • PAMAM-4.0-Dendrimer; BRI-6809
  • Ein PAMAM-Generation-4.0-Kern (0,05 mmol; 69 mg) wurde durch Eindampfen aus 1,0 ml einer Lösung in MeOH erhalten und dann in 15 ml Wasser wieder aufgelöst. Zu der Lösung wurden 1-N-Pyridinium-12-dodecansäurebromid (0,143 g; 0,4 mmol), N-Hydroxybenzotriazolhydrat [HOBT] (77 mg; 0,4 mmol), Triethylamin (56 μl; 0,4 mmol) und 1-(3-Diethylaminopropyl-3-ethyl)carbodiimid·HCl [EDC] (77 mg; 0,4 mmol) gegeben.
  • Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Volumen wurde unter reduziertem Druck auf ein Drittel reduziert, und die Lösung wurde an einer LH20-Säule unter Verwendung von 1% Triethylamin in Wasser als Eluent chromatographiert. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden aufgefangen, und Pyridiniumdodecylcarboxamid-PAMAM-4.0-bromid wurde durch Gefriertrocknen als weißer flockiger Feststoff isoliert.
  • Eine kleine Menge des Produkts wurde mit Essigsäureanhydrid umgesetzt, um die vollständige Verkappung der NH2-Endgruppen des Dendrimerkerns zu bestätigen.
    1H-NMR (D2O): δ 1,10, 1,45, 1,9, 2,1, 2,30, 2,5, 2,7, 3,2, 4,5, 8,00, 8,45, 8,80.
  • Beispiel 38
  • Herstellung von Dendrimeren mit Saccharin-Endgruppen
  • PAMAM-4.0-Dendrimer; BRI-6157
  • Zu einer Lösung von Ethylendiamin-Kern-PAMAM-4.0-Dendrimerkern (275 mg; 39,8 μM) in trockenem Dimethylformamid (25 ml) wurde 6-(Benzosulfimido)isothiocyanat (400 mg; 1,67 mM) gegeben, und das Gemisch wurde 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die trübe Lösung wurde aufgeklärt, indem man den pH-Wert mit Natriumcarbonatlösung auf pH 10–10,5 einstellte. Diese Lösung wurde weitere 24 h gerührt, und flüchtige Substanzen wurden auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Die Lösung wurde auf einer großen Sephadex-LH20-Säule chromatographiert, und die Vorlauffraktion wurde aufgefangen. Die übrigen Fraktionen wurden aufgefangen und auf einer kleineren Säule erneut chromatographiert. Die kombinierten Vorlauffraktionen wurden eingedampft und gefriergetrocknet, was das Dendrimerprodukt mit Saccharin-Endgruppen (450 mg; 78%) als weißen flockigen Feststoff ergab.
    1H-NMR (D2O): δ 2,20, 2,50, 3,23, 3,46, 3,63, 7,52, 7,87.
  • Das entsprechende BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32-Dendrimer mit Saccharin-Endgruppen BRI-6189 wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Beispiel 39
  • Antiparasitische in-vitro-Assays
    • I: Der folgende Assay wurde als in-vitro-Assay durchgeführt, um auf Hemmung von Trypanosomen zu testen.
  • A. Materialien und Verfahren
    Medium: "Balz-MEM" plus 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum
    Trypanosoma-Stämme: STIB 900 (T. brucei rhodesiense, kloniert aus STIB 704) STIB 920 (T. b. brucei, kloniert aus STIB 348) STIB 930 (T. b. gambiense, kloniert aus STIB 754)
    Standardwirkstoffe: Melarsoprol (Arsobal, Specia, Frankreich), Pentamidin (Pentacarinat, Rhone-Poulenc), Suramin (Germanin, Bayer, Deutschland)
    Inkubationsbedingungen: 72 Stunden bei 37 °C und 5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre
    Testsystem: 96-Napf-Mikrotiterplatte, 100 μl pro Napf, 200–1000 Trypanosomen pro Napf (je nach Stamm) und Auswertung mit zwei Endpunktablesungen
    Bewertung: a. durch mikroskopische Bestimmung des MIC b. Fluoreszenzablesung nach BCECF/AM-Zugabe oder Zählen der Zellen mit Counter Counter oder CASY
    Wirkstoffpräparat: Stammlösung von 10 mM in 10% Lösungsmittel (DMSO, Ethanol usw.), höchste Wirkstoffkonzentration beträgt 50 μM
    Ausführliches Testverfahren: Der Test beruht auf LILIT: Low Inoculum Long Incubation Test (Brun und Lun, Vet. Par. 52 (1994), 37–46)
    • 1. Man gibt 50 μl vollständiges Medium in Näpfe der Reihen B-H, Spalten Nr. 2–10, einer 96-Napf-Platte (markierte Näpfe).
    • 2. Man gibt 75 μl Medium, das das Doppelte der höchsten zu testenden Wirkstoffkonzentration enthält, in die Näpfe B-D (D1) und F-H (D2), Spalte Nr. 11.
    • 3. Man stellt mit Hilfe einer Multipipette eine Verdünnungsreihe her, indem man 25 μl aus den Näpfen Nr. 11 in die Näpfe Nr. 10 überträgt und durch mindestens zehnmaliges Ansaugen und Ausspülen von Medium mischt.
    • 4. Man fahre mit der Verdünnung von rechts nach links fort, bis 25 μl aus Napf Nr. 5 in Napf Nr. 4 gegeben werden. Nach dem Mischen werden die übrigen 25 μl verworfen. Die Näpfe Nr. 2 und 3 in jeder Reihe dienen als Kontrollnäpfe ohne Wirkstoff.
    • 5. Man gibt 50 μl Trypanosomensuspension in die Näpfe B, C und F, G, Nr. 2 bis 11 der Platte mit einer Aussaatdichte von 4 × 103/ml (ergibt 200/Napf). Man gibt 50 μl Baltz-Medium ohne Trypanosomen in die Näpfe 2-11 der Reihen D und E als Hintergrundkontrollen für den Fluoreszenzassay.
    • 6. Man inkubiert die Platte 72 Stunden lang bei 37 °C, 5% CO2.
    • 7. Man beobachtet die Platte unter einem inversen Mikroskop, um mikroskopisch die MIC (minimale inhibitorische Konzentration) zu bestimmen: die niedrigste Wirkstoffkonzentration, bei der keine Trypanosomen mit nor maler Morphologie und Beweglichkeit im Vergleich zu den Kontrollnäpfen beobachtet werden können, oder die Konzentration, bei der keine Trypanosomen überlebten.
    • 8. Der Test kann werter nach der Zugabe von BCECF/AM durch Fluoreszenzablesung oder durch Bewertung der Wachstumshemmung mit einem Coulter Counter bewertet werden.
  • B. Ergebnisse
  • Die folgenden Dendrimere wurden getestet.
    BRI-Nr. MOL-Name Art der Verbindung
    BRI 2923 PAMAM 4.0(NHCSNHNaphth[SO3Na]2)24 Dendrimer
    BRI 2998 PAMAM 4.0(NHCSNHNapth-3,6,8-triSO3Na)24 Dendrimer
    BRI 6039 PAMAM 4.0(NHCSNH-1-Ph-3,5-[SO3Na]2)24 Dendrimer
    BRI 6041 PAMAM 4.0(NHCOPhCH2cyclam·4HCl)32 Dendrimer
    BRI 6042 PAMAM 4.0(NHC=NHNH2·HOAc)24 Dendrimer
    • (i) In-vitro-Aktivität von 4 getesteten Verbindungen gegen T. b. rhodesiense (STIB 900) in einem 72-h-Fluoreszenzassay. Alle Verbindungen wurden in einer Konzentration von 4 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst und dann in vollständigem Kulturmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
    Verbindung MTC (μg/ml) MIC (μg/ml) EC50 (μg/ml)
    BRI 2998 > 100 333 3,7 4,1 7 6,3
    • MIC = minimale inhibitorische Konzentration (keine Trypanosomen am Leben)
    • MTC = maximale tolerierte Konzentration (Wirkstoff zeigt keine Wirkung)
    • (ii) In-vitro-Aktivität von 5 getesteten Verbindungen gegen T. b. rhodesiense (STIB 900) in einem 72-h-Fluoreszenzassay. Alle Verbindungen wurden in einer Konzentration von 20 μg/ml in destilliertem Wasser gelöst und dann in vollständigem Kulturmedium (BMEM plus 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum) 1:10 verdünnt.
    Verbindung MTC MIC EC50
    μg/ml μM μg/ml μM μg/ml μM
    BRI 6042 666 87,7 74 9,7 120 15,8
    BRI 6041 666 62,3 74 6,9 190
    BRI 6039 1000 75,2 12,3 0,9 22 1,65
    BRI 2923 > 1000 > 70 37 2,5 170
    • II Die folgenden Assayergebnisse wurden in einem in-vitro-Assay erhalten, um auf Hemmung von Trypanosoma(T)- und Plasmodium(P)-Spezies zu testen.
  • Die folgenden Verbindungen wurden getestet.
    BRI-Nr. MOL-Name
    BRI 6157 PAMAM 4.0 EDA(NHCSNHSaccharinNa)32 Saccharin-substituiertes Dendrimer mit Polyamidaminkern.
    BRI 6181 BHAlys31lys32(NHCSNHPhOP[O][ONa]2)64 Phenylphosphat-substituiertes Dendrimer mit Lysinkern
    BRI 6195 PAMAM 4.0 EDA(NHCSNH-3,5 Ph[COOH]2)32 Phenylcarboxylat-substituiertes Dendrimer mit Polyamidaminkern
  • Die Tests wurden unter Verwendung der folgenden Stämme durchgeführt:
    Parasit Stamm Stadium Standard
    T. b. rhodesiense STIB 900 trypomastigote Form Melarsoprol
    P. falciparum NF54 alle Chlorochin
    Ergebnisse: (alle Werte in μg/ml)
    Verbindung T. b. rhodensis P. falciparum Cytotoxizität
    MIC IC-50 IC-50 MIC
    BRI6157 33 5 22 > 100
    BRI6181 > 100 > 100 24 > 100
    BRI6195 > 100 > 100 20 > 100
  • Beispiel 40
  • Bestimmung der antibakteriellen Aktivität
  • Die in diesem Assay verwendeten Bakterien waren:
    • Staphylococcus aureus (ATCC 29213)
    • Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
    • Escherichia coli (ATCC 25922)
  • Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) und die minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBC) wurden durch Mikrobrühenverdünnung (NCCLS – M7A3 1993) in Cation Adjusted Mueller-Hinton Broth (pH 7) unter Verwendung von 2–5 × 104 cfu (log-Phase) als Inokulum und 24 sowie 48 h aerobe Inkubation bei 35 °C bestimmt. MBC wird als Titer genommen, der eine Reduktion des Inokulums um drei Zehnerpotenzen zeigt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt (alle Einheiten in μg/ml).
    Testverbindung S. aureus E. faecalis E. coli
    BRI-6807 32 (128) > 256 128
    BRI-6809 8 (8) 128 (128) > 256
    • MIC = minimale inhibitorische Konzentration
    • (MBC) = minimale bakterizide Konzentration
  • Beispiel 41
  • Quantifizierung der Wirkung von Dendrimeren auf die Invasion und das Wachstum des humanen Malariaparasiten Plasmodium faiciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro
  • Verfahren
  • Malaria-Parasiten. 3D7 ist eine wohlcharakterisierte in-vitro-Kultur-adaptierte Linie von P. falciparum. Der Parasit durchläuft mehrere Zyklen von Wachstum und Replikation innerhalb von humanen roten Blutkörperchen. Die Dauer jedes Zyklus beträgt 48 Stunden, beginnend mit jungen Parasiten im Ringstadium, die über pigmentierte Trophozoiten (während der ersten 24 Stunden des Zyklus) zu segmentierten Schizonten reifen, die aufbrechen und dabei infektiöse Merozoiten freisetzen, die schnell frische rote Blutkörperchen befallen. Frisch eingefallene Merozoiten werden zu Ringformen, und der Zyklus beginnt von neuem.
  • Parasitenkultur und Wachstumsassays. P.-falciparum(Linie 3D7)-Parasiten wurden in synchroner in-vitro-Kultur in frisch gesammelten humanen roten Blutkörperchen gehalten, wobei gut etablierte Techniken verwendet wurden. Für Invasionsassays wurden rote Blutkörperchen, die reife, pigmentierte Trophozoiten enthielten, durch Gelatineflotation gereinigt, dann in frischen humanen roten Blutkörperchen resuspendiert, so dass ungefähr eines pro 200 rote Blutkörperchen parasitiert war (0,5% Parasitämie). Dann wurde frisches Kulturmedium hinzugefügt, was eine endgültige Konzentration an roten Blutkörperchen von 2 × 108 roten Blutkörperchen/ml ergibt.
  • Aliquote der Suspension der roten Blutkörperchen (jeweils 95 μl) wurden in doppelten Ansätzen in 96-Napf-Platten eingebracht. 5 μl Parasitenkulturmedium, das entweder die Testverbindung (BRI 2999, BRI 6741, BRI 2998, BRI 7011, BRI 6181) oder PBS (Kontrolle) enthielt, wurden zu geeigneten Näpfen gegeben, und die Platten wurden bei 37 °C und 1% 02 inkubiert. Dünne Abstriche von jedem der Näpfe wurden sofort (Zeit = 0) und dann nach 24, 48 und 72 Stunden Kultur durchgeführt. Von jedem Abstrich wurden die Parasitämie und das Stadium der Parasitenreifung durch mikroskopische Untersuchung der Abstriche nach Anfärbung mit Giemsa bei pH 7,2 quantifiziert. Dies ermöglichte eine Quantifizierung der Invasion, der Parasitenentwicklung und der anschließenden Reinvasion. Bei jedem Probenahmezeitpunkt wurde das Kulturmedium (entweder mit oder ohne Verbindung) in den übrigen Näpfen vollständig ersetzt.
  • Die Testverbindungen wurden zuerst mit 20 mg/ml in steriler isotonischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) gelöst, dann weiter verdünnt, um konzentrierte Stammlösungen im Bereich zwischen 1 mg/ml und 200 μg/ml herzustellen. Die Stammlösungen wurden während der gesamten Dauer des Assays bei 4 °C aufbewahrt und gegebenenfalls in geeigneter Weise in Parasitenkulturmedium verdünnt.
  • Ergebnisse
  • Getrennte Invasions-/Wachstumsexperimente wurden für jede Verbindung durchgeführt, und die Ergebnisse sind in den 1 bis 5 graphisch dargestellt. Die Wirkung jeder Verbindung wurde bei Endkonzentrationen von 10, 25 und 50 μg/ml getestet. Jede der fünf Verbindungen zeigte für jede gegebene Konzentration eine konzentrationsabhängige hemmende Wirkung auf die Invasion, das Wachstum und die Replikation des Parasiten, wobei das absolute Niveau der Hemmung zwischen den verschiedenen Verbindungen variierte. Bei allen getesteten Konzentrationen (bis zu einschließlich 50 μg/ml) hatte keine der fünf Testverbindungen irgendeine erkennbare ungünstige Wirkung auf die Morphologie de roten Blutkörperchen. In Experimenten, bei denen BRI 7011 und BRI 6181 getestet wurden (4 und 5), war das Niveau der Reinvasion von Parasiten in Kontrollnäpfen nach 72 Stunden niedriger, als man es normalerweise beobachtet. Dies war auf eine sichtbare Verzögerung des Parasitenwachstums irgendwann nach 48 Stunden Kultur zurückzuführen, so dass nach 72 Stunden ein großer Anteil der Schizonten noch nicht aufgebrochen war und invasive Merozoiten freisetzte.

Claims (11)

  1. Verwendung eines Dendrimers mit einer Menge von terminalen Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist, zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische oder therapeutische Hemmung eines Bakterien-, Hefe-, Pilz- oder Parasitenagens.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Dendrimer einen mehrwertigen Kern umfasst, der kovalent an wenigstens zwei dendritische Äste gebunden ist und sich über wenigstens zwei Generationen erstreckt.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polyamidoamin-Dendrimer auf der Basis eines Ammoniakkerns ist.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polyamidoamin-Dendrimer auf der Basis eines Ethylendiaminkerns ist.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polylysin-Dendrimer auf der Basis eines Benzhydrylamin- oder anderen geeigneten Kerns ist.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polypropylenimin-Dendrimer ist.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein polyionisches Dendrimer der allgemeinen Formel I ist:
    Figure 00640001
    wobei: I ein Initiatorkern ist; Z eine innere Verzweigungseinheit ist; n eine ganze Zahl ist, die die Zahl der Generationen des Dendrimers darstellt; und A eine anionische oder kationische Struktureinheit ist, die über eine fakultative Verknüpfungsgruppe X mit der inneren Verzweigungseinheit Z verknüpft sein kann.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die anionische oder kationische Struktureinheit oder die anionischen oder kationischen Struktureinheiten über Amid- oder Thioharnstoffbindungen an Amin-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder andere reaktive terminale Gruppen des Dendrimers gebunden sind.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die anionischen oder kationischen Struktureinheiten aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus sulfonsäurehaltigen Struktureinheiten, carbonsäurehaltigen Struktureinheiten (einschließlich neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten und modifizierten neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten), boronsäurehaltigen Struktureinheiten, phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten (einschließlich veresterten phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten), primäres, sekundäres, tertiäres oder quartäres Amino enthaltenden Struktureinheiten, pyridiniumhaltigen Struktureinheiten, guanidiniumhaltigen Struktureinheiten, amidiniumhaltigen Struktureinheiten, phenolhaltigen Struktureinheiten, Heterocyclen, die saure oder basische Wasserstoffatome aufweisen, und zwitterionischen Struktureinheiten besteht.
  10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Struktureinheit oder Struktureinheiten in dem Dendrimer, die an Amin- oder andere reaktive terminale Gruppen des Dendrimers gebunden sind, aus den folgenden Gruppen ausgewählt sind, wobei n = 0 oder eine positive ganze Zahl ist:
    Figure 00650001
    Figure 00660001
    Figure 00670001
    Figure 00680001
  11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Dendrimer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: i. Alkylsulfonsäure-terminierte Dendrimere; ii. Sulfoacetamid-terminierte Dendrimere; iii. Sulfosuccinamsäure-terminierte Dendrimere; iv. N-(2-Sulfoethyl)succinamid-terminierte Dendrimere; v. 4-Sulfophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; vi. 3,6-Disulfonaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; vii. 4-Sulfonaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; viii. 3,5-Disulfophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; ix. 3,6,8-Trisulfonaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; x. 4-(Sulfomethyl)benzamid-terminierte Dendrimere; xi. 4-Sulfobenzamid-terminierte Dendrimere; xii. N-(4-Sulfophenyl)propanamid-terminierte Dendrimere; xiii. 4-Sulfophenylharnstoff-terminierte Dendrimere; xiv. N,N,N-Trimethylglycinamid-terminierte Dendrimere; xv. 4-Trimethylammoniumbenzamid-terminierte Dendrimere; xvi. 4-(Trimethylammoniummethyl)benzamid-terminierte Dendrimere; xvii. N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamidterminierte Dendrimere; xviii. Guanidino-terminierte Dendrimere; xix. 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid-terminierte Dendrimere; xx. 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-terminierte Dendrimere; xxi. 4-Carboxyphenylamid-terminierte Dendrimere; xxii. 3,5-Dicarboxyphenylamid-terminierte Dendrimere; xxiii. 4-Phosphonooxyphenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxiv. 4-(Phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxv. Ethyl-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxvi. (8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxvii. (11-Undecanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxviii. (Acetamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxix. (4-Butanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxx. (4-Methylbenzamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxxi. (8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxxii. (8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxxiii. 4-Benzamidoboronsäure-terminierte Dendrimere; xxxiv. 3,5-Dicarboxyphenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxv. 4-Phosphonooxyphenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxvi. 4-Phosphonophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxvii. 4,6-Diphosphononaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxviii. Fluoresceinthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxix. (Phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-terminierte Dendrimere; xi. Pyridiniumdodecylcarboxamid-terminierte Dendrimere; und xii. Saccharin-terminierte Dendrimere.
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