WO1992013541A1 - Die verwendung substituierter polysaccharide zur behandlung von degenerativen gelenkerkrankungen - Google Patents

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WO1992013541A1
WO1992013541A1 PCT/EP1992/000065 EP9200065W WO9213541A1 WO 1992013541 A1 WO1992013541 A1 WO 1992013541A1 EP 9200065 W EP9200065 W EP 9200065W WO 9213541 A1 WO9213541 A1 WO 9213541A1
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substituted
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formula
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cation
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PCT/EP1992/000065
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Inventor
Ruth Raiss
Matthias Wiesner
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters

Definitions

  • Osteoarthritis is a degenerative joint disease with inflammatory episodes and progressive cartilage destruction, which can lead to functional impairment or complete stiffening. So far, inflammation and pain can be treated with this disease, but so far there is no drug that has been shown to stop or heal the progressive breakdown of cartilage.
  • Known therapeutic agents for arthrosis are, for example, mixtures of sulfated glucosaminoglucans (Current Therapeutic Research, 40, 6 (1086) 1034) or non-steroidal anti-inflammatory agents, which, however, cannot stop the loss of cartilage.
  • chondrocytes cartilaginous cells
  • PG proteoglycans
  • the invention therefore relates to the use of at least one substituted polysaccharide, which may be linear or branched, which consists of uniform or different natural or synthetic monomers, and may also contain a substituted or unsubstituted amino group per monomer and 10 to 100% of its OH Groups are substituted with a group of the formula -OS0 3 M, where M is a physiologically acceptable cation and optionally 5 to 80% of the remaining OH groups are substituted with a group of the formula -XBY, where X is an oxy group or a group of the formula I means
  • B is a non-aromatic hydrocarbon radical having 2 to 30 C atoms, in the alkyl chain of which up to 3 methylene units can be replaced by oxy groups, in which up to three CC double bonds can be present and which can be substituted with up to three C ⁇ -C ⁇ AlkvIreste and
  • Y - if X is an oxy group - can be hydrogen, -C00R or -0S0 3 R ⁇ , in which R is a physiologically compatible mono- or divalent cation, or R is a hydrocarbon radical with up to 20 C atoms or a mono- or bisether radical with 3 to 10 carbon atoms,
  • R 1 represents a physiologically compatible cation
  • X is a radical of the formula I - represents hydrogen or -C00R, in which R has the meanings given above, with the exception of substituted polysaccharides in which the monomers contain a substituted or unsubstituted amino group and 10 to 100% of their OH groups are substituted with a group of the formula -OSO 3 M, for the manufacture of medicaments, for the prophylaxis and treatment of degenerative joint diseases.
  • Substituted polysaccharides which have a polysaccharide skeleton which is composed of uniform or different monomers, selected from the following group of compounds or consists of the following compounds, are preferred: xylose, arabinose, rhamnose, fucose, glucose, mannose, galactose, fructose, glucosamine , Galactosamine, mannosamine, glucuronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid, carrageenans, fucoidan, laminaran, alginate, lentinan, plurane, xylan, dextran, heparin, xanthan, araban, keratan sulfate, chondroitin 4 and 6 sulfate, dermatan sulfate, heparuronic acid , Ponduronic acid and partial hydrolysates of starch, cellulose, glycogen, chitin or pectin.
  • the compounds mentioned can be of synthetic as well as natural,
  • the compounds which already occur in sulfated form in nature can be used both with their natural sulfate content and after additional sulfation.
  • the OH groups of the abovementioned polysaccharides are preferably 5 to 80%, particularly preferably 5 to 50% and in particular 10 to 40% substituted with a group of the formula -XBY and further preferably 10 to 95%, particularly preferably 45 up to 95% and in particular 50 to 90% substituted with a group of the formula 0SO 3 M, preferably between 0 and 40%, particularly preferably between 0 and 20% and in particular between 0 and 10% of the OH groups being unsubstituted.
  • Preferred radicals B have 2 to 20 C atoms, have one or no double bond and are unsubstituted or simply substituted by a C 1 -C 4 -alkyl group.
  • Y is preferably H, C00R, 0S0 3 R ⁇ where R is an alkaline application; in particular potassium or sodium or a branched or unbranched C 1 -C 8 alkyl group, R 1 is preferably an alkaline application, in particular sodium.
  • X is a radical of the formula 2
  • Y preferably denotes H or a radical of the formula C00R, where R is an alkaline application, preferably sodium or potassium, a branched or unbranched or is a mono- or bisether radical having 6 to 9 carbon atoms.
  • radicals of the formula -XBY are ethyloxy, propyloxy, isopropyloxy, butyloxy, hexyloxy, octyloxy, decyloxy, dodecyloxy, propionyloxy, butyryloxy, valeryloxy, hexanoyloxy, octanoyloxy, decanoyloxy, dodecanoyloxy, palmitoyloxy, stoyoyloxyxoxy, steaoyyloxyloxy, styloyloxyoxy, stoyrooxyoxy, steaoyloxy, stoyrooxyoxy , Linolenoyloxy, cholesteryloxy, hydroxyoxalyloxy, hydroxy alonyloxy, hydroxysuccinyloxy, hydroxyglutaryloxy, hydroxyadipoyloxy, crotonoyloxy, mesaconoyloxy or the esters
  • the dodecanoyloxy and stearoyloxy radicals are particularly important, especially on a xylan polysaccharide skeleton.
  • the substituted polysaccharides can have an average molecular weight that covers a wide range.
  • the substituted polysaccharides preferably have an average molecular weight of up to 100 kD, particularly preferably of up to 40 kD, in particular between 1 and 22 kD.
  • Substituted polysaccharides whose polysaccharide structure consists of xylan or dextran and which have an average molecular weight of 1 to 22 kD are of particular importance.
  • the substituted polysaccharides can be prepared in different ways.
  • Polysaccharides in which X is an oxy group consists in partially etherifying the polysaccharides under basic catalysis with an alkyl halide or an ⁇ -halocarboxylic acid salt and then completely or partially sulfating them directly or after alkoxylation. With this procedure the
  • Alkylation e.g. with an alkyl halide or w-halocarboxylic acid salt in an anhydrous solvent such as e.g. DMF, dioxane, DMSO etc. instead, with the basic catalyst e.g. an alkali hydroxide can be used.
  • an alkyl halide or w-halocarboxylic acid salt in an anhydrous solvent such as e.g. DMF, dioxane, DMSO etc.
  • the basic catalyst e.g. an alkali hydroxide
  • Alkyl halides are particularly suitable for the alkyl bromides and iodides.
  • a particularly preferred variant of this method is in general
  • the substituted polysaccharides in which X is a group of the formula I can be prepared by partially acylating the polysaccharides with a mono- or dicarboxylic acid or with a dicarboxylic acid monoester and sulfating the remaining OH groups of the polysaccharides in whole or in part.
  • Different methods can be used for acylation (cf. e.g. Organikum, VEB, Verlag dermaschineen, Berlin 1977, Chapter 7 or Houben-Weyl, Vol. 8, p. 503, Georg-Thieme-Verlag Stuttgart (1952)).
  • a preferred method is that a solution of the carboxylic acid to be introduced into the polysaccharide or its derivative in an organic solvent, e.g. anhydrous DMF or DMSO at a temperature of about 20 to 60 ° C with an equimolar amount of N, N-carbonyldiimidazole and acylated with the acylimidazole formed, the respective polysaccharide, which at about 20 to 60 ° C by adding the respective polysaccharide in the solvents already mentioned can happen.
  • the degree of acylation is determined by the quantitative ratio of the acylimidazole to the respective polysaccharide.
  • a preferred method for acylation of the polysaccharides is described in general working procedure II.
  • the sulfation of the substituted polysaccharides can take place in different ways (cf., for example, Whistler et al. In Carbohydr. Chem. 2, 298 (1963), US 2,715,091 or CH 293 566).
  • a preferred method is that the polysaccharide to be sulfated is taken up in an organic solvent, preferably DMF, and then complexed sulfur trioxide, preferably complexed with pyridine, is added at a temperature of about 0 to 60 ° C., preferably 20 to 50 ° C. .
  • the reaction product can be taken up in water, preferably neutralized with NaOH and then worked up by known methods.
  • a particularly preferred method for Sulfation of the polysaccharides according to the invention is described in general working instruction III.
  • Polysaccharides in which an amino function is present should be provided with a protective group before sulfation, which can be split off again after the reaction has taken place.
  • Suitable protecting groups are e.g. by E. Wünsch in Houben-Weyl, Vol. 15, 5/55, Georg Thieme Verlag Stuttgart (1974).
  • the invention also relates to medicaments which contain at least one substituted polysaccharide, which may be linear or branched, which consists of uniform or different natural or synthetic monomers, and may also contain a substituted or unsubstituted amino group per monomer and 10 to 100% of their OH Groups are substituted with a group of the formula -OS0 3 M, where M is a physiologically acceptable cation and optionally 5 to 80% of the remaining OH groups are substituted with a group of the formula -XBY, where X is an oxy group or a group of the formula I.
  • substituted polysaccharide which may be linear or branched, which consists of uniform or different natural or synthetic monomers, and may also contain a substituted or unsubstituted amino group per monomer and 10 to 100% of their OH Groups are substituted with a group of the formula -OS0 3 M, where M is a physiologically acceptable cation and optionally 5 to 80% of the remaining OH groups are substituted with
  • B is a non-aromatic hydrocarbon radical with 2 to 30 C atoms, in the alkyl chain of which up to 3 methylene units can be replaced by oxy groups, in which up to three CC double bonds can be present and which can be substituted with up to three C ⁇ C -Alkyl residues and
  • Y - if X is an oxy group - can be hydrogen, C00R or 0S0 3 R ⁇ , in which R is a physiologically compatible mono- or divalent cation, or R is a hydrocarbon radical with up to 20 C atoms or one Represents a mono- or bisether radical having 3 to 10 carbon atoms,
  • R 1 represents a physiologically compatible cation, or Y - if X is a radical of the formula I - represents hydrogen or C00R, in which R has the meanings given above, with the exception of substituted polysaccharides in which the monomers contain a substituted or unsubstituted amino group and 10 up to 100% of their OH groups are substituted with a group of the formula -OS0 3 M.
  • the medicaments according to the invention can be administered intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously, intra-articularly, peri-articularly, rectally or orally.
  • Degenerative joint diseases include, for example, arthrosis, other diseases of the rheumatic type with cartilage degradation, chronic polyarthritis, cartilage loss after joint trauma, for example after meniscus or patella injuries or torn ligaments, or in the case of cartilage loss after a long period of inactivity of joints.
  • the pharmaceuticals according to the invention are produced by at least one substituted polysaccharide, optionally with other auxiliaries and / or carriers, being brought into a suitable dosage form.
  • the additives and carriers come from the group of carriers, preservatives and other common auxiliaries.
  • auxiliaries such as starches, for example potato, corn or wheat starch, cellulose or their derivatives, in particular microcrystalline cellulose, silicon dioxide, various sugars such as milk sugar, magnesium carbonate and / or calcium phosphate can be used for oral dosage forms. It is also advantageous to add auxiliaries to the oral dosage forms which improve the tolerability of the medicaments, such as, for example, slime formers and resins. For better tolerability, the medication can also be in the form of capsules insoluble in gastric juice. In addition, it may be advantageous to add a retarding agent to the dosage form or a component of the combination preparation, if appropriate in the form of permeable membranes, such as those based on cellulose or polystyrene resin or ion exchangers.
  • a retarding agent to the dosage form or a component of the combination preparation, if appropriate in the form of permeable membranes, such as those based on cellulose or polystyrene resin or ion exchangers.
  • the dosage of the medicament according to the invention to be used depends on various factors such as the dosage form of the medicament and the condition, weight and type of disease of the patient.
  • a daily dose of about 100 to 3000 mg of a polysaccharide substituted according to the invention should, however, only be exceeded for a short time, preferably 300 to 1500 mg are indicated.
  • the daily dose of the polysaccharides substituted according to the invention can be administered in the form of a single administration or in several small doses. Administration in 2 to 4 doses per day is preferred.
  • the hyaline cartilage is removed from the ankles of freshly slaughtered cattle, the native matrix is enzymatically broken down with Pronase (Boehringer Mannheim) and Collagenase (Sigma), and the chondrocytes are dissolved in 1% "Iow melting"
  • Complete medium contains HAMs F12 (Biochrom KG, Berlin) and 10 fetal calf serum (Boehringer Mannheim), the test substance is dissolved in the medium, usually added in a concentration of 10 "5 M and added again each time the medium is changed.
  • Treatment takes place from the third to tenth day of the primary culture, on the 9th day 20 ⁇ C / ⁇ Na ⁇ SO, (7.4 * 10 5 Bq) is added to the medium for 24 h.
  • the dissociative extraction of the proteoglycans from the agarose layer is carried out with 8M guanidinium hydrochloride and added proteinase inhibitors (Sigma) with shaking at 4 ° C. for 24 h. After centrifugation on a PD 10 (R) Sephadex G 25 column, the supernatant is separated into free and incorporated sulfate, the activity of which is measured after aliquoting in the ⁇ -scintillation counter.
  • the parameter for the matrix production of the chondrocytes is the amount of proteoglycans synthesized, measured as sulfate incorporation in cpm.
  • the complete medium as in test 1 is additionally 5 u / ml human rec.
  • Interleukin-1 alpha IL-1, Sigma
  • was added which, like the test substance, is added again each time the medium is changed.
  • Treatment is from the 5th to the 13th day of the primary culture, on the 12th day
  • Proteoglycans and measurement of sulfate incorporation are carried out as in test 1.
  • IL-1 leads to an inhibition of synthesis and to an increase in degradation of the proteoglycans, which is reflected in the lower content of labeled matrix molecules in the agarose layer.
  • the percentages are calculated as in test 1.
  • Standardized slices of hyaline cartilage are punched out from the ankles of freshly slaughtered cattle and cultivated in 24-well multiwell dishes with approx. 200 mg per well.
  • the complete medium as in test 1 is additionally 10 u / ml human rec.
  • Interleukin-1 alpha is added which, like the test substance, is added again each time the medium is changed.
  • Treatment takes place from the 3rd to the 10th day of the explant culture, on the 9th day turns 20
  • Freezing and thawing carried out. After centrifugation on a PD 10 Sephadex G 25 column, the supernatant is separated into free and incorporated sulfate, the activity of which is measured after aliquoting in the ⁇ -scintillation counter.
  • IL-1 leads to an inhibition of synthesis and to an increase in degradation of the proteoglycans, which is reflected in the lower content of labeled matrix molecules in the cartilage explant.
  • the polysaccharide to be sulfated is taken up in DMF and sulfated with an excess of sulfur trioxide-pyridine complex (1.5-3 equivalents per free OH group) at 50 ° C. for 3 hours. After the solvent has been stripped off, the residue is taken up in water, neutralized with NaOH and the solution is concentrated again to remove pyridine and DMF. The residue is redissolved in water and by ultrafiltration over a membrane with suitable Exclusion limit freed from salts and impurities. Phosphate buffer pH 7.2% by weight, based on the dry substance, is added to the retentate and spray-dried or freeze-dried.
  • Example 9 Propionyl dextran sulfate, Na salt, from dextran 6,000 D.
  • Example 11 Dodecanoyl dextran sulfate, Na salt, from dextran 10,000 D.
  • Example 13 Dextran sulfate, sodium salt, from hydrogenated dextran 5000 D.
  • Example 14 Dextran sulfate, sodium salt, from dextran 5000 D.
  • Example 15 Dextran sulfate, sodium salt, from dextran 10,000 D.
  • Example 16 Arabane sulfate, potassium salt
  • Example 17 Xanthansulfate, sodium salt

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Abstract

Die Verwendung von mindestens einem substituierten Polysaccharid, das linear oder verzweigt sein kann, das aus einheitlichen oder unterschiedlichen natürlichen oder synthetischen Monomeren besteht, und pro Monomer auch eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten kann und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OSO3M substituiert sind, wobei M ein physiologisch verträgliches Kation darstellt und gegebenenfalls 5 bis 80 % der verbliebenen OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -X-B-Y substituiert sind, wobei X eine Oxygruppe oder eine Gruppe der Formel I-COO bedeutet, deren Kohlenstoffatom an B gebunden ist, B einen nicht aromatischen Kohlenwasserstoff mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, der substituiert sein kann und Y Wasserstoff, COOR oder -OSO3R1 sein kann, worin R ein physiologisch verträgliches ein- oder zweiwertiges Kation ist, ein C¿1?-C20-Alkyl oder ein Mono- oder Bisetherrest mit 3 bis 10 C-Atomen ist und R?1¿ ein physiologisch verträgliches Kation darstellt, wobei substituierte Polysaccharide ausgenommen sind, bei denen die Monomere eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OSO¿3?M substituiert sind, zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Behandlung degenerativer Gelenkerkrankungen, diese enthaltende Arzneimittel, sowie Verfahren zur Herstellung der Arzneimittel wird beschrieben.

Description

Beschreibung
Die Verwendung substituierter Polysaccharide zur Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen
Arthrose ist eine degenerative Gelenkerkrankung mit entzündlichen Episoden und progredienter Knorpelzerstörung, die zu Funktionsbeeinträchtigung bis hin zu völliger Versteifung führen kann. Bisher sind zwar Entzündungen und Schmerz bei dieser Erkrankung therapierbar, es gibt jedoch bisher kein Arzneimittel, das erwiesenermaßen den fortschreitenden Knorpelabbau aufzuhalten bzw. zu heilen vermag.
Bekannte Therapeutika der Arthrose sind beispielsweise Mischungen von sulfatierten Glucosaminoglucanen, (Current Therapeutic Research, 40, 6 (1086) 1034) oder nichtsteroidale Antiinflammatorika, die jedoch den Knorpelverlust nicht aufzuhalten vermögen.
Wenn auch die Pathogenese der Arthrose noch nicht im Einzelnen aufgeklärt, ist, gilt als gesichert, daß die Chondrozyten (Knorpeizellen) maßgeblich an dem verstärkten Matrixverlust beteiligt sind, und daß von den Hauptbestandteilen dieser Matrix vor allem die Proteoglykane (PG) als erste enzymatisch abgebaut werden.
In der Absicht, bessere Verbindungen zur Behandlung und Prophylaxe degenerativer Gelenkerkrankungen zu erhalten, wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäß substituierten Polysaccharide, die in vitro Synthese von Knorpelmatrix-Proteoglykanen erhöhen und den Abbau von Knorpelmasse inhibieren. Einige der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen sind bereits aus der japanischen Patentanmeldung Sho-46-36277 bekannt, in der allerdings unter anderem nur eine Stabilisierung und Aktivierung von Bindegewebe beschrieben wird. Die Gelenk-Knorpeldegradation im Verlauf der Arthrose ist ein spezifischer, durch zunächst verstärkte Matrixsynthese und dann vermehrte Wassereinlagerung gekennzeichneter Prozeß, der nicht mit anderen Bindegewebs- Abbauvorgängen einhergeht, oder mit diesen vergleichbar wäre. Die Wirksamkeit der genannten Verbindungen bei Arthrosen war angesichts der bereits bekannten Wirkungen der Verbindungen - wie z.B. Erweiterung der periphären Gefäße und Verbesserung des Blutkreislaufs - nicht zu erwarten.
Darüber hinaus ist das Auffinden von pharmazeutisch wirksamen polymeren Verbindungen besonders schwierig, weil die pharmazeutische Wirksamkeit von niedermolekularen Verbindungen in keiner Weise Rückschlüsse über die pharmazeutische Wirksamkeit von Polymeren zuläßt. So ist z.B. bekannt, daß einige niedermolekulare Wirkstoffe hinsichtlich ihrer Zellmembrangängigkeit durch Einführung lipophiler Gruppen verändert werden, wohingegen bei hochmolekularen Substanzen eine derartige Veränderung bei Einführung lipophiler Gruppen nicht auftritt (Advanced Drug Deiivery Reviews 1, 1987, 235-248, Elsevier).
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von mindestens einem substituierten Polysaccharid, das linear oder verzweigt sein kann, das aus einheitlichen oder unterschiedlichen natürlichen oder synthetischen Monomeren besteht, und pro Monomer auch eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten kann und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind, wobei M ein physiologisch verträgliches Kation darstellt und gegebenenfalls 5 bis 80 % der verbliebenen OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -X-B-Y substituiert sind, wobei X eine Oxygruppe oder eine Gruppe der Formel I bedeutet
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deren Kohlenstoffatom an B gebunden ist, B einen nicht-aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, in dessen Alkylkette bis zu 3 Methyleneinheiten durch Oxygruppen ersetzt sein können, in der bis zu drei C-C-Doppelbindungen vorliegen können und der substituiert sein kann mit bis zu drei C^-C^AIkvIresten und
Y - falls X eine Oxygruppe ist - Wasserstoff, -C00R oder -0S03R\ sein kann, worin R ein physiologisch verträgliches ein- oder zweiwertiges Kation ist, oder R einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 C-Atomen oder einen Mono- oder Bisetherrest mit 3 bis 10 C-Atomen darstellt,
R1 ein physiologisch verträgliches Kation darstellt, oder
Y - falls X ein Rest der Formel I ist - Wasserstoff oder -C00R darstellt, worin R die obengenannten Bedeutungen hat, wobei substituierte Polysaccharide ausgenommen sind, bei denen die Monomere eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OSO3M substituiert sind, zur Herstellung von Arzneimitteln, zur Prophylaxe und Behandlung degenerativer Gelenkerkrankungen.
Bevorzugt sind substituierte Polysaccharide, die ein Polysaccharidgerüst besitzen, das aus einheitlichen oder verschiedenen Monomeren, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verbindungen aufgebaut ist bzw. aus folgenden Verbindungen besteht: Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fucose, Glucose, Mannose, Galactose, Fructose, Glucosamin, Galactosamin, Mannosamin, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Mannuronsäure, Carrageenane, Fucoidan, Laminaran, Alginat, Lentinan, Pluran, Xylan, Dextran, Heparin, Xanthan, Araban, Keratansulfat, Chondroitin-4- und -6-sulfat, Dermatansulfat, Heparinsulfat, Hyaluronsäure, Teichuronsäure sowie Teilhydrolysate von Stärke, Cellulose, Glycogen, Chitin oder Pektin. Die genannten Verbindungen können sowohl synthetischer als auch natürlicher, d.h. insbesondere pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft sein. Besonders bevorzugte Polysaccharidgerüste sind solche, die aus Xylan, Dextran, Xanthan oder Araban bestehen.
Die Verbindungen, die bereits in der Natur in sulfatierter Form auftreten, können sowohl mit ihrem natürlichen Sulfatgehalt als auch nach zusätzlicher Sulfatierung verwendet werden.
Die OH-Gruppen der obengenannten Polysaccharide sind vorzugsweise zu 5 bis 80 %, besonders bevorzugt zu 5 bis 50 % und insbesondere zu 10 bis 40 % substituiert mit einer Gruppe der Formel -X-B-Y und weiterhin vorzugsweise zu 10 bis 95 %, besonders bevorzugt zu 45 bis 95 % und insbesondere zu 50 bis 90 % substituiert mit einer Gruppe der Formel 0S03M, wobei vorzugsweise zwischen 0 und 40 %, besonders bevorzugt zwischen 0 und 20 % und insbesondere zwischen 0 und 10 % der OH-Gruppen unsubstituiert sind.
Bevorzugte Reste B weisen 2 bis 20 C-Atome auf, haben eine oder keine Doppelbindung und sind nicht oder einfach substituiert mit einer C^C-Alkylgruppe.
Sofern X eine Oxygruppe ist, ist Y vorzugsweise H, C00R, 0S03R\ wobei R ein Alkalikation; insbesondere Kalium oder Natrium oder eine verzweigte oder unverzweigte C.,-C8-Alkylgruppe ist, R1 ist vorzugsweise ein Alkalikation, insbesondere Natrium.
Falls X ein Rest der Formel 2 ist, bedeutet Y vorzugsweise H oder einen Rest der Formel C00R, wobei R ein Alkalikation, vorzugsweise Natrium oder Kalium, eine verzweigte oder unverzweigte
Figure imgf000006_0001
oder ein Mono- oder Bisetherrest mit 6 bis 9 C-Atomen ist.
Beispielhafte Reste der Formel -X-B-Y sind Ethyloxy, Propyloxy, Isopropyloxy, Butyloxy, Hexyloxy, Octyloxy, Decyloxy, Dodecyloxy, Propionyloxy, Butyryloxy, Valeryloxy, Hexanoyloxy, Octanoyloxy, Decanoyloxy, Dodecanoyloxy, Palmitoyloxy, Stearoyloxy, 2-Methylbutyryloxy, 9-0ctadecenoyloxy, Linoloyloxy, Linolenoyloxy, Cholesteryloxy, Hydroxyoxalyloxy, Hydroxy alonyloxy, Hydroxysuccinyloxy, Hydroxyglutaryloxy, Hydroxyadipoyloxy, Crotonoyloxy, Mesaconoyloxy bzw. die Ester der genannten Dicarbonsäurederivate mit unverzweigten C^Ce-Alkoholen oder [(1,3-Diisopropyloxy)-propyl-2- oxycarbonyl] propanoy loxy .
Besondere Bedeutung besitzen die Dodecanoyloxy- und die Stearoyloxyreste, insbesondere an einem Xylan-Polysaccharidgerüst.
Die substituierten Polysaccharide können ein mittleres Molekulargewicht aufweisen, das einen weiten Bereich überstreicht. Vorzugsweise haben die substituierten Polysaccharide ein mittleres Molekulargewicht von bis zu 100 kD, besonders bevorzugt von bis zu 40 kD, insbesondere zwischen 1 und 22 kD. Eine besondere Bedeutung haben substituierte Polysaccharide, deren Polysaccharidgerüst aus Xylan oder Dextran besteht und die ein mittleres Molekulargewicht von 1 bis 22 kD aufweisen.
Die substituierten Polysaccharide können auf unterschiedliche Weise hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von substituierten
Polysacchariden, in denen X eine Oxygruppe ist besteht darin, die Polysaccharide unter basischer Katalyse mit einem Alkylhalogenid oder einem ω-Halogencarbonsäuresalz partiell zu verethern und anschließend direkt oder nach Alkoxylierung ganz oder teilweise zu sulfatieren. Bei diesem Verfahren findet die
Alkylierung z.B. mit einem Alkylhalogenid bzw. w-Halogencarbonsäuresalz in einem wasserfreien Lösungsmittel wie z.B. DMF, Dioxan, DMSO etc. statt, wobei als basischer Katalysator z.B. ein Alkalihydroxid herangezogen werden kann. Als
Alkylhalogenide eignen sich insbesondere die Alkylbromide und -jodide. Eine besonders bevorzugte Variante dieses Verfahrens ist in der allgemeinen
Arbeitsvorschrift I beschrieben. Ferner können die substituierten Polysaccharide, in denen X eine Gruppe der Formel I ist dadurch hergestellt werden, daß man die Polysaccharide mit einer Mono- oder Dicarbonsäure oder mit einem Dicarbonsäuremonoester partiell acyliert und die verbleibenden OH-Gruppen der Polysaccharide ganz oder teilweise sulfatiert. Zur Acylierung können unterschiedliche Methoden benutzt werden (vgl. z.B. Organikum, VEB, Verlag der Wissenschaften, Berlin 1977, Kapitel 7 oder Houben-Weyl, Bd. 8, S. 503, Georg-Thieme-Verlag Stuttgart (1952)).
Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß man eine Lösung der in das Polysaccharid einzuführenden Carbonsäure bzw. deren Derivat in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. wasserfreiem DMF oder DMSO bei einer Temperatur von ca. 20 bis 60°C mit einer äquimolaren Menge N,N-Carbonyldiimidazol umsetzt und mit dem gebildeten Acylimidazol das jeweilige Polysaccharid acyliert, was bei ca. 20 bis 60 °C durch Zufügen des jeweiligen Polysaccharids in den bereits genannten Lösungsmitteln geschehen kann. Der Acylierungsgrad wird dabei bestimmt von dem Mengenverhältnis des Acylimidazols zu dem jeweiligen Polysaccharid. Ein bevorzugtes Verfahren zur Acylierung der Polysaccharide ist in der allgemeinen Arbeitsvorschrift II beschrieben.
Die Sulfatierung der substituierten Polysaccharide kann auf unterschiedliche Weise geschehen (vgl. z.B. Whistler et al. in Carbohydr. Chem. 2, 298 (1963), US 2 715 091 oder CH 293 566). Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß man das zu sulfatierende Polysaccharid in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise DMF aufnimmt und anschließend mit komplexiertem Schwefeltrioxid, vorzugsweise komplexiert mit Pyridin, bei einer Temperatur von etwa 0 bis 60 °C, vorzugsweise 20 bis 50 °C, versetzt. Erfahrungsgemäß sind zur Sulfatierung einer OH-Gruppe ca. 1,5 bis 3 Äquivalente an Schwefeltrioxid-Komplex nötig. Nach erfolgter Sulfatierung kann das Reaktionsprodukt in Wasser aufgenommen, vorzugsweise mit NaOH neutralisiert werden und anschließend nach bekannten Methoden aufgearbeitet werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Sulfatierung der erfindungsgemäßen Polysaccharide ist in der allgemeinen Arbeitsvorschrift III beschrieben.
Polysaccharide, in denen eine Aminofunktion vorhanden ist, sollten vor der Sulfatierung mit einer Schutzgruppe versehen werden, die nach erfolgter Reaktion wieder abgespalten werden kann. Geeignete Schutzgruppen sind z.B. von E. Wünsch in Houben-Weyl, Bd. 15, 5/55, Georg Thieme Verlag Stuttgart (1974) beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel die mindestens ein substituiertes Polysaccharid enthalten, das linear oder verzweigt sein kann, das aus einheitlichen oder unterschiedlichen natürlichen oder synthetischen Monomeren besteht, und pro Monomer auch eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten kann und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind, wobei M ein physiologisch verträgliches Kation darstellt und gegebenenfalls 5 bis 80 % der verbliebenen OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -X-B-Y substituiert sind, wobei X eine Oxygruppe oder eine Gruppe der Formel I
-C (l)
deren Kohlenstoffatom an B gebunden ist,
B einen nicht-aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, in dessen Alkylkette bis zu 3 Methyleneinheiten durch Oxygruppen ersetzt sein können, in der bis zu drei C-C-Doppelbindungen vorliegen können und der substituiert sein kann mit bis zu drei C^C-Alkylresten und
Y - falls X eine Oxygruppe ist - Wasserstoff, C00R oder 0S03R\ sein kann, worin R ein physiologisch verträgliches ein- oder zweiwertiges Kation ist, oder R einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 C-Atomen oder einen Mono- oder Bisetherrest mit 3 bis 10 C-Atomen darstellt,
R1 ein physiologisch verträgliches Kation darstellt, oder Y - falls X ein Rest der Formel I ist - Wasserstoff oder C00R darstellt, worin R die obengenannten Bedeutungen hat, wobei substituierte Polysaccharide ausgenommen sind, bei denen die Monomere eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan, intraartikulär, periartikulär, rektal oder oral verabreicht werden.
Zu den degenerativen Gelenkerkrankungen gehören beispielsweise Arthrosen, weitere Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises mit Knorpeiabbau, chronische Polyarthritis, Knorpelschwund nach Gelenktrauma beispielsweise nach Meniskus- oder Patellaverletzungen oder Bänderrissen, oder bei Knorpelschwund nach längerer Stillegung von Gelenken.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Arzneimittel erfolgt, indem mindestens ein substituiertes Polysaccharid gegebenenfalls mit weiteren Hilfs- und/oder Trägerstoffen in eine geeignete Darreichungsform gebracht wird. Die Hiifs- und Trägerstoffe stammen aus der Gruppe der Trägermittel, Konservierungsstoffe und anderer üblicher Hilfsstoffe.
Zum Beispiel können für orale Darreichungsformen Hilfsstoffe wie Stärken, z.B. Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke, Gellulose bzw. deren Derivate, insbesondere mikrokristalline Celluiose, Siliziumdioxid, verschiedene Zucker wie Milchzucker, Magnesiumcarbonat und/oder Caiciumphosphate verwendet werden. Weiterhin ist es vorteilhaft, den oralen Darreichungsformen Hilfsstoffe zuzusetzen, die die Verträglichkeit der Medikamente verbessern, wie z.B. Schleimbildner und Harze. Zwecks besserer Verträglichkeit können die Medikamente auch in Form von magensaftunlöslichen Kapseln verabreicht werden. Darüber hinaus kann es vorteilhaft sein, der Darreichungsform, bzw. einer Komponente des Kombinationspräparates, ein Retardierungsmittel zuzusetzen, gegebenenfalls in Form von permeablen Membranen, wie z.B. solche auf Cellulose- oder Polystyrolharzbasis oder Ionenaustauscher.
Die anzuwendende Dosierung der erfindungsgemäßen Arzneimittel ist abhängig von verschiedenen Faktoren wie Darreichungsform des Medikamentes und Zustand, Gewicht und Art der Erkrankung des Patienten. Eine Tagesdosis von etwa 100 bis 3000 mg eines erfindungsgemäß substituierten Polysaccharids sollte jedoch nur kurzzeitig überschritten werden, vorzugsweise sind 300 bis 1500 mg indiziert. Die Verabreichung der Tagesdosis der erfindungsgemäß substituierten Polysaccharide kann in Form einer einzelnen Verabreichung oder in mehreren kleinen Dosen erfolgen. Bevorzugt ist die Verabreichung in 2 bis 4 Dosen pro Tag.
Die Wirksamkeit der Polysaccharide wird in vitro in folgenden Versuchen nachgewiesen.
1. Wirksamkeit in der Synthese-Stimulierung von Knorpel-Matrix, Prüfung in der Chondrozyten-Kultur
Methodenbeschreibung:
Zellen:
Den Fußgelenken frisch geschlachteter Rinder werden der hyaline Knorpel entnommen, mit Pronase (Boehringer Mannheim) und Collagenase (Sigma) die native Matrix enzymatisch abgebaut, und die Chondrozyten in 1 %iger "Iow melting
Agarose" in 24er Multiwell-Schalen in einer Zelldichte von 4 x 106 pro well ausplatiert. Medium:
Komplettes Medium enthält HAMs F12 (Biochrom KG, Berlin) und 10 foetales Kälberserum (Boehringer Mannheim), die Testsubstanz wird im Medium gelöst, üblicherweise in einer Konzentration von 10"5M zugegeben und bei jedem Mediumwechsel erneut zugefügt.
Vesuchs-Durchf ührung :
Die Behandlung erfolgt vom dritten bis zehnten Tag der Primärkultur, am 9. Tag wird 20 μC/π Na^SO, (7,4*105Bq) für 24 h dem Medium zugefügt.
Die dissoziative Extraktion der Proteoglykane aus der Agarose-Schicht wird mit 8M Guanidinium-Hydrochlorid und beigefügten Proteinase-Inhibitoren (Sigma) unter Schütteln bei 4°C über 24 h durchgeführt. Der Überstand wird nach Zentrifugation über eine PD 10 (R)Sephadex G 25 Säule in freies und inkorporiertes Sulfat getrennt, dessen Aktivität nach Aliquotierung im ß-Szintillationscounter gemessen wird.
Auswertung:
Der Parameter für die Matrixproduktion der Chondrozyten ist die Menge synthetisierter Proteoglykane, gemessen als Sulfatinkorporation in cpm. Aus vier wells pro Gruppe wird der Mittelwert errechnet und als Prozentwert bezogen auf die unbehandelte Kontrollgruppe = 100 % angegeben.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 :
Stimulierung der Proteoglykan-Synthese in der Agarose-Zellkultur
Präparat % ∞SO^Inkorporation Beispiel Nr. bezogen auf unbehandelte Kontrolle = 100 %
Arteparon** 96 - 140 * 1 163 2 137
3 188
4 137
5 160
6 209
7 137
8 582
9 160
10 593
11 914
12 551
13 202
14 105
15 190
16 184
17 118
Bereiche der Mittelwerte mehrerer gleichartiger Versuche Luitpold-Werk München, FRG 2. Wirksamkeit in der chondrozytären Chondrolyse, Prüfung in der Chondrozyten-Kultur
Methodenbeschreibung:
Zellen werden gewonnen und platiert wie in Experiment 1
Medium:
Dem kompletten Medium wie in Test 1 wird zusätzlich ab Behandlungsbeginn 5 u/ml humanes rec. lnterleukin-1 alpha (IL-1, Sigma) zugesetzt, das wie die Testsubstanz bei jedem Mediumwechsel erneut zugefügt wird.
Versuchs-Durchführung :
Die Behandlung erfolgt vom 5. bis 13. Tag der Primärkultur, am 12. Tag wird
20 C/ml Na2 35S04 für 24 h dem Medium zugefügt. Die dissoziative Extraktion der
Proteoglykane sowie Messung der Sulfatinkorporation wird wie in Test 1 durchgeführt.
Auswertung:
IL-1 führt zu einer Synthesehemmung sowie zu einer Degradationssteigerung der Proteoglykane, was sich im geringeren Gehalt an markierten Matrixmolekülen in der Agarose-Schicht widerspiegelt. Die Prozentwerte werden berechnet wie in Test 1.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Einfluß auf IL-1 -induzierte Chondrolyse in der Agarose-Zellkultur
Figure imgf000015_0001
Bereiche der Mittelwerte mehrerer gleichartiger Versuche 3. Wirksamkeit in der chondrozytären Chondrolyse, Prüfung in der Knorpel-Explant-Kultur
Methodenbeschreibung :
Knorpelgewebe:
Aus den Fußgelenken frisch geschlachteter Rinder werden genormte Scheiben hyalinen Knorpels ausgestanzt und in 24er Multiwell-Schalen mit ca. 200 mg pro well kultiviert.
Medium:
Dem kompletten Medium wie in Test 1 wird zusätzlich ab Behandiungsbeginn 10 u/ml humanes rec. lnterleukin-1 alpha zugesetzt, das wie die Testsubstanz bei jedem Mediumwechsel erneut zugefügt wird.
Versuchs-Durchführung:
Die Behandlung erfolgt vom 3. bis 10. Tag der Explantkultur, am 9. Tag wird 20
//C/ml Na2 35S04 für 24 h dem Medium zugefügt. Die dissoziative und anschließend assoziative Extraktion der Proteoglykane aus den Knorpelexplanten wird mit 8M
Guanidinium-Hydrochlorid und beigefügten Proteinase-Inhibitoren unter mehrfachem
Tieffrieren und Auftauen durchgeführt. Der Überstand wird nach Zentrifugation über eine PD 10 Sephadex G 25 Säule in freies und inkorporiertes Sulfat getrennt, dessen Aktivität nach Aliquotierung im ß-Szintillationscounter gemessen wird.
Auswertung:
IL-1 führt zu einer Synthesehemmung sowie zu einer Degradationssteigerung der Proteoglykane, was sich im geringeren Gehalt an markierten Matrixmolekülen im Knorpelexplantat widerspiegelt.
Aus sechs wells pro Gruppe wird der Mittelwert errechnet und als Prozentwert bezogen auf die unbehandelte Kontrollgruppe = 100 angegeben. Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3:
Einfluß auf IL-1 -induzierte Chondrolyse in der Knorpel- Explantkultur
Figure imgf000017_0001
Allgemeine Arbeitsvorschrift I:
Alkylierung und Sulfatierung von Polysacchariden Das Kohlenhydrat wird in wasserfreiem DMSO ca. 5 %ig gelöst und unter Ausschluß von Sauerstoff (Stickstoff oder Argon-Atmosphäre) mit den für den gewünschten Veretherungsgrad notwendigen Mengen Kaliumhydroxid und Alkylbror.iid oder Alkyljodid (Verhältnis Base zu Alkylierungsmittel 1,5:1) unter Erwärmung 16 Stunden gerührt. Dann gibt man einen 1,5- bis 3-fachen Überschuß an Schwefeltrioxid- Pyridin-Komplex zu (bezogen auf die freien OH-Gruppen) und sulfatiert weitere 3 Stunden bei 50 °C. Die Lösung wird anschließend im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Wasser aufgenommen und mit wäßriger NaOH neutralisiert. Die Reinigung und Entsalzung erfolgt durch Ultrafiltration über eine geeignete Membran.
Allgemeine Arbeitsvorschrift II: Acylierung von Polysacchariden
In eine Lösung der einzuführenden Carbonsäure in wasserfreiem DMSO wird bei 50°C unter Rühren portionsweise die äquimolare Menge N.N'-Carbonyldiimidazol (CDI) eingetragen, wobei das Entweichen von C02 die Bildung des reaktiven Acylimidazols anzeigt. Man rührt noch eine Stunde bei 50 °C und fügt dann eine Lösung des Polysaccharids in DMSO zu, wobei die Menge entsprechend dem gewünschten Veresterungsgrad zu wählen ist. Die Reaktionsmischung wird 3 Stunden bei 50 °C belassen und anschließend im Vakuum eingeengt.
Allgemeine Arbeitsvorschrift III: Sulfatierung von Polysacchariden
Das zu sulfatierende Polysaccharid wird in DMF aufgenommen und mit einem Überschuß Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex (1,5 - 3 Äquivalente pro freier OH-Gruppe) 3 Stunden bei 50 °C sulfatiert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels nimmt man den Rückstand in Wasser auf, neutralisiert mit NaOH und engt die Lösung zur Entfernung von Pyridin und DMF nochmal ein. Der Rückstand wird wieder in Wasser gelöst und durch Ultrafiltration über eine Membran mit geeigneter Ausschlußgrenze von Salzen und Verunreinigungen befreit. Das Retentat wird mit Phosphatpuffer pH 7,2 Gew.-% bezogen auf die Trockensubstanz, versetzt und sprüh- oder gefriergetrocknet.
Beispiel 1 Dodecanoyl-xylansulfat, Na-Salz
Entsprechend AAV II und III werden 9,1 g (0,045 mol) Dodecansäure, 7,36 g (0,045 mol) CDI, 15 g (0,114 mol) Xylan in 200 ml DMSO abs. umgesetzt, das Reaktionsprodukt mit 60 g (0,38 mol) S03-Pyridin-Komplex in 300 ml DMF abs. sulfatiert.
Ausbeute: 30,5 g schwach bräunliches amorphes Pulver Acylierungsgrad: 20 % der OH-Gruppen (nach 13C-NMR) Sulfatierungsgrad: 72,5 %
Analyse: 30,4 % C 4,4 % H 12,0 % S IR (KBr): 1740 cm"1 (st, Ester-CO)
13C-NMR (D20): δ = 174 - 178.5 (bs, CO), 94.5 - 106 (bs, C-1), 57 - 83.5 (m,
C-2,3,4,5, C0-CH2), 35.3, 33.4, 31.5, 26.0, 24.1 (bs, 9 x CH2), 15.7 ppm (s, CH3).
Beispiel 2 Hexanoyl-dextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 10.000 D
Entsprechend AAV II und III werden 1,1 ml (1,08 g, 9 mmol) Hexansäure, 1,5 g (9 mmol) CDI, 5 g (31 mmol) Dextran (M ~ 10.0000) in 50 ml abs. DMSO umgesetzt, das Reaktionsprodukt mit 30 g (189 mmol) S03-Pyridin-Komplex in 100 ml abs. DMF sulfatiert. Ausbeute: 10,7 g weißes amorphes Pulver Acylierungsgrad: 10 % der OH-Gruppen (nach 13C-NMR) Sulfatierungsgrad: 51% Analyse: 27,0 % C 4,2 % H 14,1 % S IR (KBr): 1738 cm"1 (m, Ester-CO)
13C-NMR (D20): δ = 175.5 - 178 (m, CO), 96 - 99 (m, C-1), 66 - 81 (m,
C-2,3,4,5,6, CO-CH2), 35.7, 32.1, 25.5, 23.4 (s, 4 x CH2), 15.0 ppm (s, CH3).
Beispiel 3 Hexanoyl-dextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 10.000 D
Entsprechend AAV II und III werden 5,8 ml (5,38 g, 46 mmol) Hexansäure, 7,5 g (46 mmol) CDI, 5 g (31 mmol) Dextran (M- 10.000 D) in 50 ml DMSO abs. umgesetzt, das Reaktionsprodukt anschließend mit 20 g (126 mmol) S03-Pyridin-Komplex in 100 ml abs. DMF sulfatiert.
Ausbeute: 12,2 g weißes, amorphes Pulver
Acylierungsgrad: 44 % der OH-Gruppen (nach 13C-NMR) Sulfatierungsgrad: 50 %
Analyse: 33,6 % C 5,2 % H 9,7 % S
IR (KBr): 1741 cm"1 (sst, Ester-CO)
13C-NMR (D20): δ - 172.5 - 179 (m, CO), 96.2 - 99.7 (m, C-1),
65 - 79 (m, C-2,3,4,5,6, C0-CH2), 35.6, 32.2, 25.7, 23.8
(s, 4 x CH2), 14.8 ppm (s, CH3). Beispiel 4 Hexanoyldextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 6.000 D
Acylierungsgrad: 14 % der OH-Gruppen (nach 13C-NMR) Sulfatierungsgrad: 66 %
Analyse: 22,9 % C
3,9 % H
14,1 % 5
Beispiel 5 Propanoyldextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 6.000 D
Acylierungsgrad: 22 % der OH-Gruppen Sulfatierungsgrad: 59 %
Analyse: 23,7 % C
4,0 % H
13,9 % S
Beispiel 6 Hexadecanoylxylansulfat, Na-Salz
20 g (152 mmol) Xylan werden in 200 ml wasserfreiem DMSO entsprechend AAV II mit 15,5 g (60.5 mmol) Palmitinsäure und 9,8 g (60.5 mmol) N.N'-Carbonyldiimidazol 3 Stunden bei 70 °C umgesetzt. Das Lösungsmittel wird anschließend im Vakuum abgezogen und der Rückstand entsprechend AAV III in 200 ml DMF mit 80 g (0.5 mol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex 3 Stunden bei 50 °C sulfatiert.
Nach Aufarbeitung, Ultrafiltration und Gefriertrocknung erhält man 46,2 g eines gelblichen, amorphen Pulvers. Acylierungsgrad: 20 % der OH-Gruppen Sulfatierungsgrad: 50 %
Analyse: 38,65 % C 5,95 % H 9,1 % S
IR (KBr): 1742 cm"1 (sst, Ester-CO)
13C-NMR (D20): δ = 171-178.5 (m, CO), 92.5-100.5 (m, C-1),
47-81 (m, C-2,3,4,5, CO-CH2), 34.1, 31.8, 26.5, 24.4 (m, 14 x CH^, 15.2 ppm (s, CH3).
Beispiel 7 Hexanoyldextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 6.000 D
Entsprechend AAV il und III werden 14 ml (12.9 g, 111 mmol) Capronsaure mit 18 g (111 mmol) CDI und 20 g (123 mmol) Dextran (M 6.000 D) in 200 ml wasserfreiem DMSO umgesetzt und anschließend mit 90 g (566 mmol) S03-Pyridin- Komplex in 300 ml abs. DMF sulfatiert. Nach Aufarbeitung, Ultrafiltrtion und Gefriertrocknung erhält man 43,9 g eines weißen, amorphen Pulvers.
Acylierungsgrad: 30 % der OH-Gruppen (nach 13C-NMR) Sulfatierungsgrad: 62 %
Analyse: 31,0 % C
3,9 % H
13,4 % S
13C-NMR (D20): δ = 171-177 (m, CO), 96,0-99,4 (m, C-1), 66,0-79,2 (m,
C-2,3,4,5,6, CO-CH2), 36,1, 32,1, 26,0, 23,7 (s, 4xCH2), 15,3 ppm (s, CH3).
IR (KBr): 1740 cm-1 (sst, Ester-CO). Beispiel 8 Dodecanoyl-dextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 6.000 D
Entsprechend AAV II und III werden in 100 ml abs. DMSO 11,1 g (56 mmol) Laurinsäure mit 9,1 g (56 mmol) CDI und anschließend mit 10 g (62 mmol) Dextran (M 6.000 D) umgesetzt, das Reaktionsprodukt anschließend mit 45 g (283 mmol) S03-Pyridin-Komplex in 100 ml wasserfreiem DMF sulfatiert.
Ausbeute: 27,7 g weißes, amorphes Pulver. Acylierungsgrad: 29 % der OH-Gruppen Sulfatierungsgrad: 66 %
Analyse: 37,5 % C 5,4 % H 12,1 % S IR (KBr): 1741 cnrϊ1 (sst, Ester-CO)
13C-NMR (D20): δ = 175,0 - 180,4 (m, CO), 96,4 - 99,4 (m, C-1),
64,5 - 80,0 (m, C-2,3,4,5,6, C0-CH2), 35,4, 33,7, 31,0, 26,4, 24,4 (bs, 10 x CH2), 15,3 ppm (s, CH3).
Beispiel 9 Propionyl-dextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 6.000 D
Wie in AAV II und III beschrieben, wurden 6,9 ml (6,9 g, 93 mmol) Propionsaure in 200 ml wasserfreiem DMSO mit 15 g (9.3 mmol) CDI und anschließend mit 20 g (123 mmol) Dextran (M 6.000 D) umgesetzt und das Reaktionsprodukt dann mit 90 g (566 mmol) S03-Pyridin-Komplex in 300 ml abs. DMF sulfatiert. Aufarbeitung, Ultrafiltration und Gefriertrocknung liefern 44,1 g als weißes, amorphes Pulver. Acylierungsgrad: 22 % der OH-Gruppen (nach 13C-NMR) Sulfatierungsgrad: 75 %
Analyse: 22,3 % C
2,4 % H
16,8 % S
IR (KBr): 1742 cm.- (sst, Ester-CO)
13C-NMR (D20): δ = 179 (bs, CO), 96,4 - 98,8 (m, C-1), 65,5 - 79,9 (M,
C-2,3,4,5,6, C0-CH2), 30,4 (s, CH2), 9,2 ppm (s, CH3).
Beispiel 10 Hexanoyl-dextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 6.000 D
Nach AAV II und III werden 10 g Dextran (62 mmol), M 6.000 D) mit 5,1 ml (4,7 g, 41 mmol) Capronsaure und 6,6 g (41 mmol) CDI in 150 ml wasserfreiem DMSO acyliert und anschließend im gleichen Lösungsmittel mit 45 g (283 mmol) S03-Pyridin-Komplex in einer Eintopfreaktion sulfatiert.
Ausbeute: 19,8 g als gelbliches amorphes Pulver
Acylierungsgrad: 22 % der OH-Gruppen Sulfatierungsgrad: 72 %
Analyse: 20,9 % C
3,6 % H
12,2 % S
IR (KBr): 1741 cm"1 (sst, Ester-CO) 13C-NMR (D20): δ = 171,5 - 179,0 (m, CO), 95,9 - 99,1 (m, C-l),
62,0 - 68,1 (m, C-2,3,4,5,6, CO-CH2), 37,1, 33,4, 26,1 23,7 (s, 4 x CH2), 14,1 ppm (s, CH3).
Beispiel 11 Dodecanoyl-dextransulfat, Na-Salz, aus Dextran 10.000 D
Entsprechend AAV II und III werden 46,4 g (231 mmol) Laurinsäure mit 37,5 g (231 mmol) CDI und anschließend 50 g (309 mmol) Dextran (M 10.000 D) in 500 ml wasserfreiem DMSO umgesetzt und im weiteren mit 220 g (1 ,39 mol) S03-Pyridin- Komplex sulfatiert. Ausbeute: 137,2 g als gelbliches, amorphes Pulver
Acylierungsgrad: 27 % der OH-Gruppen Sulfatierungsgrad: 62 %
Analyse: 37,8 % C
5,2 % H
12,2 % S
IR (KBr): 1740 crrϊ1 (sst, Ester-SO)
13C-NMR (D20): δ - 175,0 - 180,1 (m, CO), 96,0 - 99,8 (m, C-1)
66,5 - 82,2 (m, C-2,3,4,5,6, C0-CH2), 36,1 , 34,4, 30,0, 27,0, 25,1 (bs, 10 x CH3), 14,2 ppm (s, CH3).
Beispiel 12 Dodecanoyl-arabansulfat, Na-Salz
Wie in AAV II und III dargelegt, werden 10 g (76 mmol) Araban aus Rüben mit 9,1 g (45 mmol) Laurinsäure und 7,4 g (45 mmol) CDI in 150 ml wasserfreiem DMSO acyliert und das Reaktionsprodukt mit 36 g (227 mmol) S03-Pyridin-Komplex in 100 ml abs. DMF sulfatiert.
Nach Aufarbeitung, Ultrafiltration über eine Membran mit der Ausschlu grenze 3.000 D und Gefriertrocknung erhält man 28,1 g eines braunen, amorphen Pulvers.
Acylierungsgrad: 20 % der OH-Gruppen Sulfatierungsgrad: 75 %
Analyse: 30,0 % C
4,1 % H
14,6 % S
IR (KBr): 1742 cm"1 (Ester-CO)
Beispiel 13: Dextransulfat, Natriumsalz, aus hydriertem Dextran 5000 D
20 g hydriertes Dextran (Molgewicht ca. 5000 D, Pfeifer und Langen, Dormagen) werden in 400 ml DMF gelöst und unter Rühren mit 120 g S03-Pyridin-Komplex versetzt. Man sulfatiert 3 Stunden bei 50 °C, engt die Lösung anschließend im Vakuum ein, nimmt den Rückstand in Wasser auf und neutralisiert mit wassriger NaOH auf pH 7. Die Lösung wird über eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Ausschlußgrenze von 3000 D filtriert und gefriergetrocknet. Ausbeute: 36.5 g als weißes, amorphes Pulver.
Analyse: 15.8 C, 1.8 % H, 18.9 % S. Sulfatierungsgrad: 90 % der OH-Gruppen. Beispiel 14: Dextransulfat, Natriumsalz, aus Dextran 5000 D
Wie in Beispiel 13 beschrieben werden 20 g Dextran (Molgewicht ca. 5000 D,
Pfeifer und Langen; Dormagen) sulfatiert und aufgearbeitet.
Ausbeute: 34.4 g als weißes, amorphes Pulver.
Analyse: 15.2 % C, 1.9 % H, 19.4 % S. Sulfatierungsgrad: 95 % der OH-Gruppen.
Beispiel 15: Dextransulfat, Natriumsalz, aus Dextran 10.000 D
10 g Dextran (Molgewicht ca. 10.000 D, Pfeifer und Langen, Dormagen) und 15 g S03-Pyridin-Komplex werden in 200 ml wasserfreiem DMSO gelöst und bei 50 °C 3 Stunden gerührt. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels, Aufnehmen des Rückstand in Wasser und Neutralisieren mit wassriger Natronlauge filtriert man die Lösung über eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Ausschlußgrenze 5000 D. Ausbeute: 13.1 g als weißes, amorphes Pulver. Analyse: 28.3 % C, 3.8 % H, 9.3 % S. Sulfatierungsgrad: 25 % der OH-Gruppen.
Beispiel 16: Arabansulfat, Kaliumsalz
5 g Araban aus Rüben (Südzucker AG, Offstein) werden mit 24 g S03-Pyridin- Komplex in 100 ml wasserfreiem DMF 3 Stunden sulfatiert und wie beschrieben aufgearbeitet. Zur Neutralisation wird wässrige KOH verwendet. Nach Ultrafiltration über eine 5000 D Membran und Gefriertrocknung fällt das Produkt als beiger, amorpher Feststoff an. Ausbeute: 7.7 g. Analyse: 16.5 % C, 2.2 % H, 15.3 % S. Sulfatierungsgrad: 87 % der OH-Gruppen.
Beispiel 17: Xanthansulfat, Natriumsalz
20 g Xanthan (Roth GmbH, Karlsruhe) werden in 300 ml wasserfreiem DMSO gelöst und bei 50 °C mit 125 g S03-Pyridin-Komplex 3 Stunden sulfatiert. Die Lösung wird anschließend eingeengt und der Rückstand nach dem Lösen in Wasser neutralisiert. Ultrafiltration über eine 5000 D Membran und anschließende Gefriertrocknung liefert ein weißes, amorphes Produkt. Ausbeute: 53.2 g.
Analyse: 14.9 % C, 2.6 % H, 16.7 % S. Sulfatierungsgrad: ca. 80 % der OH-Gruppen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:
1. Verwendung von mindestens einem substituierten Polysaccharid, as linear oder verzweigt sein kann, das aus einheitlichen oder unterschiedlichen natürlichen oder synthetischen Monomeren besteht, und pro Monomer auch eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten kann und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind, wobei M ein physiologisch verträgliches Kation darstellt und gegebenenfalls 5 bis 80 % der verbliebenen OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -X-B-Y substituiert sind, wobei X eine Oxygruppe oder eine Gruppe der Formel I bedeutet
Figure imgf000029_0001
deren Kohlenstoffatom an B gebunden ist, B einen nicht-aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, in dessen Alkylkette bis zu 3 Methyleneinheiten durch Oxygruppen ersetzt sein können, in der bis zu drei C-C-Doppelbindungen vorliegen können und der substituiert sein kann mit bis zu drei C1-C4-Alkylresten und
Y - falls X eine Oxygruppe ist - Wasserstoff, -COOR oder -0S03R1 sein kann, worin R ein physiologisch verträgliches ein- oder zweiwertiges Kation ist, oder R einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 C-Atomen oder einen Mono- oder Bisetherrest mit 3 bis 10 C-Atomen darstellt
R1 ein physiologisch verträgliches Kation darstellt oder
Y - falls X ein Rest der Formel I ist - Wasserstoff oder -COOR darstellt, worin R die obengenannten Bedeutungen hat, wobei substituierte Polysaccharide ausgenommen sind, bei denen die Monomere eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind, zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Behandlung von degenerativeπ Gelenkerkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß X eine Oxygruppe und Y Wasserstoff, COOR oder OS03R1 bedeutet, worin R ein physiologisch verträgliches Kation ist oder einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 C-Atomen und R1 ein physiologisch verträgliches Kation ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Gruppe der Formel I ist und Y Wasserstoff oder COOR darstellt, wobei R die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen besitzt.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das substituierte Polysaccharid aus einheitlichen oder verschiedenen Monomeren, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verbindungen aufgebaut ist:
Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fucose, Glucose, Mannose, Galactose, Fructose, Glucosamin, Galactosamin, Mannosamin, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Mannuronsäure, Carrageenane, Fucoidan, Laminaran, Alginat, Lentinan, Pluran, Xylan, Dextran, Heparin, Keratansulfat, Chondroitin-4- und -6-sulfat, Dermatansulfat, Heparinsulfat, Hyaluronsäure, Teichuronsäure oder Teilhydrolysate von Stärke, Cellulose, Glycogen, Chitin oder Pektin.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das substituierte Polysaccharid ein sulfatiertes Xylan, Dextran, Xanthan oder Araban ist.
6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das substituierte Polysaccharid ein mittleres Molekulargewicht von bis zu 100 KD aufweist.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das substituierte Polysaccharid Xylan oder Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 1000 bis 22000 enthält.
8. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zur Erhöhung der Synthese von Knorpelmatrixproteoglykanen oder Inhibierung des Knorpelabbaus.
9. Arzneimittel zur Prophylaxe und Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen, die mindestens ein substituiertes Polysaccharid enthalten, das linear oder verzweigt sein kann, das aus einheitlichen oder unterschiedlichen natürlichen oder synthetischen Monomeren besteht, und pro Monomer auch eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten kann und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind, wobei M ein physiologisch verträgliches Kation darstellt und gegebenenfalls 5 bis 80 % der verbliebenen OH-Gruppen mit einer Gruppe der Formel -X-B-Y substituiert sind, wobei
X eine Oxygruppe oder eine Gruppe der Formel I bedeutet
Figure imgf000031_0001
deren Kohlenstoffatom an B gebunden ist, B einen nicht-aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 30 C-Atomen bedeutet, in dessen Alkylkette bis zu 3 Methyleneinheiten durch Oxygruppen ersetzt sein können, in der bis zu drei C-C-Doppelbindungen vorliegen können und der substituiert sein kann mit bis zu drei C^C^Alkylresten und Y - falls X eine Oxygruppe ist - Wasserstoff, -COOR oder -0S03R1 sein kann, worin
R ein physiologisch verträgliches ein- oder zweiwertiges Kation ist, oder R einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 20 C-Atomen, oder einen Mono- oder
Bisetherrest mit 3 bis 10 C-Atomen darstellt,
R1 ein physiologisch verträgliches Kation darstellt oder Y - falls X ein Rest der Formel I ist - Wasserstoff oder COOR darstellt, worin R die obengenannten Bedeutungen hat, wobei substituierte Polysaccharide ausgenommen sind, bei denen die Monomere eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe enthalten und 10 bis 100 % von deren OH-Gruppen von mit einer Gruppe der Formel -OS03M substituiert sind.
10. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankuπgen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein substituiertes Polysaccharid nach Anspruch 9 mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen in eine geeignete Darreichungsform gebracht wird.
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