WO2005061550A1 - Derives carboxy-reduits de l'acide hyaluronique, leur preparation, leur application comme medicament et les compositions pharmaceutiques les renfermant - Google Patents

Derives carboxy-reduits de l'acide hyaluronique, leur preparation, leur application comme medicament et les compositions pharmaceutiques les renfermant Download PDF

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WO2005061550A1
WO2005061550A1 PCT/FR2004/003227 FR2004003227W WO2005061550A1 WO 2005061550 A1 WO2005061550 A1 WO 2005061550A1 FR 2004003227 W FR2004003227 W FR 2004003227W WO 2005061550 A1 WO2005061550 A1 WO 2005061550A1
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hyaluronic acid
carboxy
derivatives
reduced
derivative
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PCT/FR2004/003227
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Wolfgang Ulmer
Christian Viskov
Philippe Hubert
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Aventis Pharma S.A.
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • the present invention relates to new glycosaminoglycans as well as their pharmaceutically acceptable addition salts and more specifically to carboxy-reduced and chemioselectively O-sulfated derivatives of Hyaluronic acid, isolated or in mixture, their applications as medicaments and pharmaceutical compositions. containing them.
  • Glycosaminoglycans are essentially formed of alternating uronic acid-amino sugar units (or vice versa), of the type encountered in the oligo or polysaccharide chains of biologically active natural GAGs such as heparin, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitins, chondroitins sulfates or hyaluronic acid.
  • the uronic acid patterns more specifically respond to the D-glucoronic or L-iduronic acid structure and the amino sugar patterns to that of D-glucosamine or D-galactosamine.
  • Natural GAGs exhibit therapeutic activities as inhibitors of Thrombin. They therefore exhibit antithrombotic and anticoagulant activity and are used in cardiovascular pathologies in which there is a risk of thrombosis.
  • O-persulfated derivatives of hyaluronic acid have been described and studied for their anticoagulant properties (JP200080102-A).
  • N O-sulfated derivatives of Hyaluronic acid have been described and studied for their antiulcer properties (WO- 00/01394-A1) or for their anti-coagulant properties (WO99 / 43728-A1, WO 98/45335-A1).
  • Hyaluronic acid sulfated derivatives of Hyaluronic acid are described for their anticoagulant properties (FR2584728).
  • the present invention relates to a new process implementing a carboxy-reduction step and a sulfation step making it possible to obtain new derivatives of Hyaluronic acid having advantageous properties making it possible to treat or prevent disorders which display a increased activity of at least one of the matrix metalloproteinases.
  • the carboxy-reduced and chemoselectively O-sulfated derivatives of hyaluronic acid of formula (I) according to the invention have a very regular polymeric structure with degrees of purity of the order of 90%. This results in reproducible and unexpected biological properties.
  • the degradation of aggrecan the main proteoglycan of articular cartilage
  • the pathological loss of aggrecan is caused by proteolytic cleavages in its interglobular domain.
  • Amino acid sequence analyzes of proteoglycan metabolites isolated from the synovial fluid of patients with joint damage, osteoarthritis or inflammatory joint disorder have shown that there is a proteolytic cleavage between the amino acids Glu 373 and Ala 374 in the interglobular field of human aggrecan (Lohmander, et al., Arthritis Rheum., 36: 1214-1222 (1993)).
  • the proteolytic activity responsible for this cleavage is called "aggregase” and can be attributed to the superfamily of metalloproteinases (MP) or matrix metalloproteinases (MMP).
  • MP metalloproteinases
  • MMP matrix metalloproteinases
  • Zinc is an essential element in the catalytically active center of metalloproteinases.
  • MMPs cleave collagen, laminin, proteoglycans, elastin or gelatin under physiological conditions. Therefore, they play an important role in bone and connective tissue.
  • a large number of different MMP inhibitors are known (see, for example, patent applications EP0606046 or WO94 / 28889).
  • known inhibitors of MMPs frequently have a significant disadvantage. They lack specificity for any particular class of MMP.
  • most MMP inhibitors simultaneously inhibit a plurality of MMPs. Therefore, there is a need for MMP inhibitors with more narrowly defined specificities in order to better treat or prevent specific disorders.
  • a very particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Hyaluronic acid of formula (I):
  • R represents S0 3 M
  • Ri represents H or S0 3 M
  • n is an integer between 0 and 25000
  • M is a alkali metal
  • the subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Hyaluronic acid according to formula (I) characterized in that the M is chosen from sodium, calcium, magnesium and potassium.
  • M is a sodium atom.
  • a more particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Hyaluronic acid as described above, characterized in that R and Ri represent S0 3 Na.
  • a more particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Hyaluronic acid as described above, characterized in that R represents S0 3 Na and Ri represents H.
  • the polysaccharides according to the invention thus comprise an even number of saccharides.
  • the carboxy-reduced persulfated derivatives of Hyaluronic acid according to the invention are obtained according to the process implementing successively the following steps: trans-salification of Hyaluronic acid - Sulfation in organic medium of trans-salified Hyaluronic acid followed salification, carboxy-reduction of the persulfated derivative - Either a) by means of a carbodiimide derivative in the presence of a reducing agent, - Either b) by esterification, the persulfate derivative being if necessary previously trans-salified with a quaternary ammonium salt, followed by a reduction of the corresponding ester derivative by action of a reducing agent then, if necessary, trans- salification of the carboxy-reduced persulfate derivative with a quaternary ammonium salt then resuifatation followed by salification.
  • the process according to the present invention is characterized by the high chemoselectivity of the carboxy-reduction and sulfation reactions.
  • the resulting products are remarkably homogeneous and lead to true polymers.
  • the carboxy-reduced Hyaluronic acid derivatives have purities of the order of 90%. This homogeneity is determined by NMR and infrared structural analysis. This results in reproducible and unexpected biological properties.
  • the persulfation reactions are preferably carried out in an organic medium by means of a sulfuric anhydride complex with an organic base such as pyridine or trimethylamine. They are generally followed by a salification reaction, for example by the action of sodium acetate.
  • the benzethonium salt in the presence of 10 to 30 equivalents of pyridine-sulfuric anhydride complex per hydroxyl function to be sulfated.
  • the reaction will preferably be carried out at temperatures between 10 and 70 ° C.
  • the persulfation of the benzethonium salt of Hyaluronic acid is carried out very particularly between 50 and 70 ° C. This is illustrated in example 2a or 2b.
  • the carboxy-reduction of the derivatives of Hyaluronic acid is carried out in the presence of a carbodiimide derivative.
  • a carbodiimide derivative As an example, it is possible to use 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride.
  • derivatives of Hyaluronic acid is meant the persulfated derivatives of Hyaluronic acid, the benzethonium salt of Hyaluronic acid, the persulfated derivatives of benzethonium salts of Hyaluronic acid as well as Hyaluronic acid sodium salt.
  • the actual reduction is preferably carried out with an alkali metal borohydride.
  • the reaction with the carbodiimide derivative is carried out with sodium borohydride.
  • the reaction for forming the adduct with the carbodiimide derivative preferably places 5 to 20 equivalents of reagent at a pH between 4 and 5.
  • reaction with the carbodiimide derivative is carried out in the presence of 7 to 13 equivalents of reagent and at a pH of between 4.3 and 4.9.
  • the actual reduction of the activated adduct of the hyaluronic acid derivative is carried out with 10 to 300 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature between 10 and 70 ° C. More preferably, the reduction of the aforementioned adduct is carried out in the presence of 140 to 250 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature between 20 and 50 ° C.
  • the reduction can be carried out by reduction of an ester of the derivatives of Hyaluronic acid. For example, it is possible to use a methyl ester derivative.
  • the hyaluronic acid previously trans-salified in the form of a benzethonium salt is esterified by the conventional esterification methods known to man. of the profession by using an alkyl halide containing 1 to 6 carbon atoms such as methyl iodide or an arylalkyl halide such as benzyl chloride in an organic medium.
  • the actual esterification of the derivative of Hyaluronic acid, benzethonium salt is preferably carried out in dichloromethane in the presence of 2 to 20 equivalents of methyl iodide and at a temperature in the region of 20 ° C.
  • esterification is carried out in dichloromethane in the presence of 4 to 10 equivalents of methyl iodide for approximately 6 days and at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the actual reduction of the methyl ester of the derivative of Hyaluronic acid is carried out with 10 to 300 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature between 10 and 70 ° C.
  • the reduction of the methyl ester is carried out with sodium borohydride.
  • the reduction of the above-mentioned methyl ester is carried out in the presence of 140 to 250 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the subject of the invention is the method implementing the following steps: - Trans-salification of Hyaluronic Acid with Benzethonium chloride
  • the sodium hydrogencarbonate solution is a solution of 0.1 to 1 mol / l. Even more preferably, the separation is carried out at a concentration of 1 mole / 1. Detection is carried out by refractometry.
  • the subject of the invention is also the carboxy-reduced and chemoselectively O-sulfated derivatives of hyaluronic acid, isolated or in mixture as defined above, capable of being obtained according to the process or processes as defined above.
  • the polysaccharides of formula (I), isolated or in mixtures, can be used as medicaments.
  • polysaccharides exhibit in particular a strong inhibitory activity of certain matrix metalloproteases. These inhibitors are particularly indicated for the treatment of pathological conditions where a strong increase in the activity of matrix metalloproteinases is observed.
  • the medical conditions to which the present invention refers involve an increase in the activity of at least one of the following matrix metalloproteinases: the neutrophil elastase, the matrilysin (MMP-7), the agrecanase, the hADAMTSl and the gelatinase A (MMP-2).
  • MMP-7 matrilysin
  • MMP-2 gelatinase A
  • the compounds can therefore be used for the prevention and treatment of diseases such as degenerative joint disorders (such as osteoarthrosis), spondylosis, chondrolysis associated with trauma joints or prolonged joint immobilizations (often following an injury meniscus or patellar or ruptured ligaments), injury-related disorders, periodontal disorders, chronic musculoskeletal disorders (such as chronic or acute inflammatory or immunological or metabolic arthritis), arthropathies, myalgas or disorders related to bone metabolism.
  • diseases such as degenerative joint disorders (such as osteoarthrosis), spondylosis, chondrolysis associated with trauma joints or prolonged joint immobilizations (often following an injury meniscus or patellar or ruptured ligaments), injury-related disorders, periodontal disorders, chronic musculoskeletal disorders (such as chronic or acute inflammatory or immunological or metabolic arthritis), arthropathies, myalgas or disorders related to bone metabolism.
  • a subject of the invention is also the pharmaceutical compositions containing the compounds of formula (I) isolated or in mixture as well as one or more excipients, vehicle or pharmaceutically acceptable additives.
  • Another aspect of the invention is a process for preparing the pharmaceutical compositions containing the compounds of formula (I) characterized in that: mixing an amount corresponding to a desired dosage of a compound of formula (I) with one or more excipients, pharmaceutically acceptable additive vehicle.
  • the compounds of formula (I) can be administered by different routes. They can include but are not limited to subcutaneous, intraarticular, intraperitoneal or intravenous injections.
  • Administration can also be rectal, oral, inhalation, or even transdermally.
  • the doses can range from 5 ⁇ g to approximately 200 mg of compound of formula (I) and preferably from 10 ⁇ g to 40 mg.
  • the daily dosage indicated for the treatment of an adult patient of approximately 70 Kg is from 10 ⁇ g to 500 mg of active ingredients generally from 20 mg to approximately 100 mg. However depending on the circumstances higher or lower daily doses may be appropriate.
  • These doses can be administered once daily as a single dosage unit.
  • the doses can be administered in a plurality of smaller given doses repeatedly at defined intervals over time.
  • Hyaluronic acid used for the preparation of the compounds illustrating this invention has a molecular mass of 2.7 ⁇ 10 6 Daltons. He is prepared and marketed by CAREF under the name of Hyaluronate Na F100.
  • Example 1 Preparation of reduced carboxy hyaluronic acid, sodium salt (without the essential sulfation step)
  • a solution of 1 g of hyaluronic acid sodium salt in 150 ml of water is prepared.
  • the pH is adjusted to pH 4.7 ⁇ 0.1 with a 0.1N hydrochloric acid solution.
  • 4.48 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride are added and then stirred. maintaining the pH at 4.7 ⁇ 0.1.
  • 17.89 g of sodium borohydride and 250 ml of water are then added in small portions.
  • the reaction medium is stirred for approximately 2 hours at a temperature in the region of 50 ° C.
  • the reaction medium After cooling to a temperature in the region of 5 ° C, the reaction medium is neutralized with hydrochloric acid at a pH in the region of 7 (volume of acid 160 ml).
  • the white suspension is loaded into a PM 10000 cellulose ester membrane and dialyzed by changing the water baths regularly for 72 hours (the third bath is carried out with a 0.2N sodium chloride solution).
  • the contents of the membranes are freeze-dried. 0.86 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 95%.
  • the reaction medium is filtered and the cake is washed with three 60 ml portions of methanol.
  • the solid obtained is dissolved in water and then loaded into a membrane of cellulose ester PM 10000 and put into dialysis by changing the water baths regularly for 72 hours (the second bath is carried out with a solution of sodium chloride 0 , 2N).
  • the contents of the membrane are freeze-dried. 2.65 g of a white lyophilisate are obtained. The yield obtained is 86%.
  • a solution of 0.5 g of hyaluronic acid persulfate sodium salt in 30 ml of water is prepared.
  • the pH is adjusted 4.7 ⁇ 0.1 with a 0.1N hydrochloric acid solution.
  • 1.11 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride are added and then the mixture is stirred while maintaining the pH at 4.7 ⁇ 0.1.
  • 4.44 g of sodium borohydride are then added in small portions.
  • the reaction medium is stirred for approximately 2 hours at a temperature in the region of 50 ° C. After cooling to a temperature in the region of 10 ° C, the reaction medium is neutralized to pH 7 with concentrated hydrochloric acid (12 N).
  • the white suspension is loaded into a cellulose ester membrane PM 10000 and put into dialysis by changing the water baths regularly for 72 hours (the second bath is carried out with a 0.2N sodium chloride solution).
  • the contents of the membrane are freeze-dried. 0.36 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 76%.
  • the benzethonium salt of hyaluronic acid is prepared according to Example 2 a. b) Preparation of hyaluronic acid persulfate, sodium salt (Sulfation)
  • Hyaluronic acid persulfate, sodium salt is prepared according to Example 2 a. c) Preparation of the benzethonium salt of hyaluronic acid persulfate (Trans-salification)
  • the mixture obtained is loaded into a cellulose ester membrane PM 10000 and put on dialysis by changing the water baths regularly for 4 days.
  • the contents of the membrane are freeze-dried. 44 mg of a white lyophilisate are obtained.
  • the yield obtained is 44%.
  • 0.45 g of hyaluronic acid reduced carboxy persulfate, benzethonium salt are dissolved in 35 ml of anhydrous dimethylformamide.
  • a solution of 0.61 g of pyridine-sulfuric anhydride complex in 28 ml of anhydrous dimethylformamide is added.
  • a mixture of 32 ml of water and 190 ml of a 10% solution of sodium acetate in methanol is added.
  • the suspension is filtered.
  • the cake is washed with 4 portions of 50 ml of methanol.
  • the white solid obtained is dissolved in 10 ml of water and then filtered through a 0.45 ⁇ m membrane.
  • the filtrate is loaded into a PM 10000 cellulose ester membrane and placed on dialysis, changing the water baths regularly for 24 hours.
  • the contents of the membranes are freeze-dried. 0.197 g of a white lyophilisate is obtained.
  • the yield obtained is quantitative.
  • the microplate is coated with 100 ⁇ l per well of a commercial IgG goat anti-mouse antibody for 1 hour at room temperature (5 ⁇ g / ml in phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS buffer)). After washing with PBS buffer containing 0.1% Tween-20 (washing buffer), the wells are blocked by a one hour incubation step using 100 ⁇ l per well of 5% albumin serum bovine in PBS buffer containing 0.05% Tween-20.
  • PBS buffer phosphate buffered saline pH 7.4
  • each well is incubated with 100 ⁇ l of a solution diluted to 1: 1000 of BC-3 antibody in a PBS buffer containing 0.05% of T een 20 and 0.5% bovine serum albumin at room temperature for one hour.
  • This antibody recognizes fragments of typical cleavage of aggrecanase (Hughes CE. et al., Biochem. J. 305 (3), 799-804, 1995).
  • the complete set of mixtures from the previous digestion is transferred well by well to this plate and incubated at room temperature for one hour.
  • the plate is again washed as above.
  • 100 ⁇ l of the second antibody anti-human IgG antibody, labeled with peroxidase, 1: 1000 in PBS containing 0.5% ASB and 0.05% T een-20
  • the second antibody anti-human IgG antibody, labeled with peroxidase, 1: 1000 in PBS containing 0.5% ASB and 0.05% T een-20
  • the development of color is initiated by adding 100 ⁇ l of ABTS substrate solution (2 mg / ml, 2,2'-azinobis (3 ethylbenzothiazoline) sulfonic acid) in 40 mM sodium citrate plus 60 mM disodium hydrogen phosphate, adjusted to pH 4.4 by addition of acetic acid; 0.25 ⁇ l of 35% hydrogen peroxide added per ml immediately before the measurement).
  • the measurement is carried out by means of the sieve mode using a detection at 405 nm relative to a reference filter (620 nm) with automatic readings at intervals of 5 seconds. Development is stopped as soon as the maximum signal (405 nm) in the absorbance range from 1.0 to 1.4 is reached.
  • Table 1 Table 1
  • bovine chondrocytes cultured in alginate matrix gels are stimulated with 10 ng / ml of IL-1 ⁇ for 3 days according to the method of Hughes CE. et al., J. Biol. Chem. 273, 30576-30582, 1998.
  • 200 ⁇ l of chondrocyte supernatant containing a aggrecanase activity are mixed with 100 ⁇ l of DMEM cell culture medium.
  • the serial dilutions of the test compound are prepared in a 0.046 M Tris pH 8.4 buffer containing 0.15 M NaCl, 0.007 M EDTA, 0.1% T een 80 and 0.12 IU / ml of human antithrombin III.
  • the 50 ⁇ l samples of the respective dilutions are incubated with 50 ⁇ l of bovine factor Xa (13.6 U / ml) at 37 ° C for 80 seconds.
  • 50 ⁇ l of 1.1 mM chromogenic substrate S-2765 are added.
  • the absorbance at 405 nm is measured in a photometer.
  • the activity of the unlocked factor Xa is indicated by the emission of p-nitroaniline from the substrate.
  • glycosamonoglycans When compared to the reference low molecular weight heparin compound (100 U / mg), the glycosamonoglycans exhibit a factor Xa of inhibitory activity much lower: Product example 2: 0.485 U / mg Product example 3: 1.75 U / mg Effect of the carboxy-reduced persulfate derivative (Example 2) of the human metalloproteases MMP-2 (gelatinase-A) and MMP7
  • kits such as those supplied for example by the company Amersham Biosciences, kits RPN2617 and RPN 2620 were used respectively for the determination of the inhibitory activity of the enzymes MMP-2 and MMP-7.
  • the enzyme concentrations are 800 ng / ml for MMP-2 and 300 ng / ml for MMP-7, respectively.
  • the tests were carried out in accordance with the manufacturer's recommendations by carrying out a series of dilutions of the compound to be studied in a PBS pH 7.5 buffer.
  • the enzymes MMP-2 and MMP-7 were both inhibited in a concentration-dependent manner.
  • IC 50 0.8 ⁇ g / ml (effect on MMP-2) 0.2 ⁇ g / ml (effect on MMP-7)
  • a commercially available enzyme e.g., human neutrophil elastase, Sigma # E8140
  • a commercially available enzyme is reconstituted into 0.1 mg aliquots per vial using 0.276 ml of 50 mM sodium acetate buffer pH 5.5 containing 200 mM NaCl (stock solution of the enzyme); 11 ⁇ l of this mother solution are diluted with 1.1 ml of the HEPES buffer above (test solution of the enzyme).
  • the substrate solution is prepared by dissolving 118 mg of Methoxy-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p-nitroanilide in 1 ml of DMSO (stock solution, for example, Sigma No. M4765 ).
  • 9 ⁇ l of stock solution are then diluted in 1.19 ml of water.
  • test compounds are prepared in 100 mM HEPES buffer containing 500 mM NaCl.
  • the analysis is carried out on colorless 96-well polystyrene microplates (for example, Corning Costar, no. 3695).
  • Example 2 inhibits the human neutrophil elastase with an IC50 of 0.15 ⁇ g / ml.
  • the inhibition by the product of Example 3 is significantly lower with an IC50 of 7.0 ⁇ g / ml.

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Abstract

La présente invention concerne les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique de formule (I) : dans laquelle R ou R1 représentent H ou SO3M, n est un entier compris entre 0 et 25000, M est un métal alcalin, isolés ou en mélanges, leurs diastéréoisomères, leur procédé de préparation, leurs applications à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les contenant.

Description

DERIVES CARBOXY-REDUITS DE L'ACIDE HYALURONIQUE, LEUR PREPARATION, LEUR APPLICATION COMME MEDICAMENT ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES RENFERMANT
La présente invention concerne de nouveaux Glycosaminoglycanes ainsi que leurs sels d'addition pharmaceutiquement acceptable et plus précisément des dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de l'acide Hyaluronique, isolés ou en mélange, leurs applications à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les contenant.
Les Glycosaminoglycanes (GAGs) sont essentiellement formés de motifs alternés acide uronique-sucre aminé (ou l'inverse), du type de ceux rencontrés dans les chaînes oligo ou polysaccharidiques de GAGs naturels biologiquement actifs comme l'héparine, l'heparane- sulfate, le dermatan-sulfate, les chondroïtines, les chondroïtines sulfates ou l'acide hyaluronique.
Les motifs acides uroniques répondent plus spécialement à la structure acide D-glucoronique ou L-iduronique et les motifs sucres aminés à celle de la D-glucosamine ou de la D-galactosamine .
Les GAGs naturels présentent des activités thérapeutiques en tant qu'inhibiteurs de la Thrombine. Ils présentent donc une activité antithrombotique et anticoagulante et sont utilisés dans les pathologies cardiovasculaires dans lesquelles il y a un risque de thrombose.
Des dérivés O-persulfatés de l'acide hyaluronique ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés anticoagulantes (JP200080102-A) . Des dérivés N, O-sulfatés de l'acide Hyaluronique ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés antiulcêre (WO- 00/01394-Al) ou pour leurs propriétés anti-coagulantes (W099/43728-A1, WO 98/45335-A1) .
De même, des dérivés sulfatés de l'acide Hyaluronique sont décrits pour leurs propriétés anticoagulantes (FR2584728) .
Par ailleurs, des dérivés O-persulfatës de l'acide Hyaluronique ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés dans l'arthrite rhumatoide (W09213541-A1) .
La présente invention a pour objet un nouveau procédé mettant en œuvre une étape de carboxy-réduction et une étape de sulfatation permettant d'obtenir de nouveaux dérivés de l'acide Hyaluronique présentant des propriétés avantageuses permettant de traiter ou de prévenir des désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice.
Les dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O- sulfatës de l'acide hyaluronique de formule (I) selon l'invention possèdent une structure polymérique très régulière avec des degrés de pureté de l'ordre de 90 %. II en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues .
Dans l'état pathologique de l'ostéoarthrose, la dégradation de l' aggrecan, le protëoglycane principal du cartilage articulaire, représente un événement très précoce et crucial . La perte pathologique de l' aggrecan est provoquée par des clivages protéolytiques dans son domaine interglobulaire. Les analyses de séquences d'acides aminés des métabolites de protéoglycane isolés à partir du liquide synovial des patients souffrant de dommages articulaires, d'ostëoarthrose ou de désordre inflammatoire des articulations, ont montré qu'il existe un clivage protéolytique entre les acides aminés Glu373 et Ala374 dans le domaine interglobulaire de l' aggrecan humain (Lohmander, et al . , Arthritis Rheum. , 36 : 1214- 1222 (1993)). L'activité protêolytique responsable de ce clivage est dénommée "aggrêcanase" et peut être attribuée à la superfamille des métalloprotéinases (MP) ou mêtalloprotéinases de matrice (MMP) .
Le zinc est un élément essentiel dans le centre catalytiquement actif des métalloprotéinases. Les MMP clivent le collagène, la laminine, les protéoglycanes, l'élastine ou la gélatine dans des conditions physiologiques. Donc, elles jouent un rôle important dans le tissu osseux et conjonctif. Un grand nombre de différents inhibiteurs des MMP sont connus (voir, par exemple les demandes de brevet EP0606046 ou W094/28889) . Toutefois, les inhibiteurs connus des MMP ont fréquemment un désavantage significatif. Ils manquent de spécificité pour toute classe particulière de MMP. Au contraire, la plupart des inhibiteurs de MMP inhibent simultanément une pluralité de MMP. Par conséquent, il existe un besoin d'inhibiteurs de MMP ayant des spécificités plus étroitement définies afin de mieux traiter ou de prévenir des désordres spécifiques . L'invention a tout particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique de formule (I) :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle R représente S03M, et Ri représente H ou S03M, n est un entier compris entre 0 et 25000, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastérëoisomères .
En particulier, l'invention a pour objet les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon la formule (I) caractérisés en ce que le M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium.
Parmi les aspects préférés de l'invention, M est un atome de sodium.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-rëduits de l'acide Hyaluronique tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R et Ri représentent S03Na.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R représente S03Na et Ri représente H.
Les polysaccharides selon l'invention comportent ainsi un nombre pair de saccharides.
Les dérivés persulfatés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'invention sont obtenus selon le procédé mettant en oeuvre successivement les étapes suivantes : trans-salification de l'acide Hyaluronique - Sulfatation en milieu organique de l'acide Hyaluronique trans-salifié suivie d'une salification, carboxy-réduction du dérivé persulfaté - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide en présence d'un agent réducteur, - Soit b) par estérification, le dérivé persulfate étant le cas échéant préalablement trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action d'un agent réducteur puis, le cas échéant, trans-salification du dérivé persulfate carboxy-reduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resuifatation suivie d'une salification.
Le schéma reactionnel suivant illustre la présente invention :
Figure imgf000008_0001
Acide Hyaluronique, sel de sodium
Figure imgf000008_0002
Soit
Figure imgf000008_0003
Soit
Figure imgf000008_0004
Figure imgf000008_0005
Le procédé selon la présente invention est caractérisé par la forte chemiosélectivitë des réactions de carboxy- réduction et de sulfatation. Les produits qui en résultent sont remarquablement homogènes et conduisent à des polymères vrais. Les dérivés de l'acide Hyaluronique carboxy-reduit possèdent des pureté de l'ordre de 90 %. Cette homogénéité est déterminée par analyse structurale RMN et Infrarouge. Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues.
Les réactions de persulfatation s'effectuent de préférence en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine . Elles sont suivies en général par une réaction de salification par exemple par action d'acétate de sodium.
Pour une chemiosélectivité optimale des réactions de persulfatation, il est préférable de mettre en oeuvre le sel de benzethonium en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater. De même, la réaction sera effectuée préfèrentiellement à des températures comprises entre 10 et 70°C.
La persulfatation du sel de benzethonium de l'acide Hyaluronique est réalisée tout particulièrement entre 50 et 70°C. Ceci est illustré à l'exemple 2a ou 2b.
Lors de la sulfatation du dérivé sulfaté carboxy -réduit, sel de benzethonium, (composés de formule (I) avec RX=H et R=S03Na, deuxième sulfatation) il est préférable d'opérer en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine à des températures voisines de 20°C. Ceci est illustré à l'exemple 3.
La carboxy-réduction des dérivés de l'acide Hyaluronique est réalisée en présence d'un dérivé carbodiimide . A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le chlorhydrate de l-éthyl-3- (3-dimêthylaminopropyl) carbodiimide. Par dérivés de l'acide Hyaluronique, on entend les dérivés persulfatés de l'acide Hyaluronique, le sel de benzethonium de l'acide Hyaluronique, les dérivés persulfatés sels de benzethonium de l'acide Hyaluronique ainsi que l'acide Hyaluronique sel de sodium.
La réduction proprement dite est réalisée de préférence avec un borohydrure de métal alcalin. A titre d'exemple, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée avec le borohydrure de sodium. La réaction de formation de l'adduit avec le dérivé carbodiimide met préfèrentiellement en présence 5 à 20 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4 et 5.
Encore plus préférentiellement, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée en présence de 7 à 13 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4,3 et 4,9.
La réduction proprement dite de l'adduit activé du dérivé de l'acide hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70°C. Plus préférentiellement, la réduction de l'adduit sus mentionné est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 20 et 50 °C. Selon un autre mode de la présente invention, la carboxy- reduction peut être réalisée par réduction d'un ester des dérivés de l'acide Hyaluronique. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser un dérivé ester méthylique.
On estérifie l'acide Hyaluronique préalablement trans- salifié sous forme de sel de Benzethonium, par les méthodes classiques d'estërification connues de l'homme du métier en mettant en oeuvre un halogënure d'alkyle refermant de 1 à 6 atomes de carbone tel que le iodure de méthyle ou un halogénure d'arylalkyle tel que le chlorure de benzyle en milieu organique. L'estérification proprement dite du dérivé d'acide Hyaluronique, sel de benzethonium est réalisée de façon préférentielle, dans le dichlorométhane en présence de 2 à 20 équivalents d' iodure de méthyle et à une température voisine de 20°C.
En particulier, l'estérification est réalisée dans le dichlorométhane en présence de 4 à 10 équivalents d' iodure de méthyle pendant environ 6 jours et à une température voisine de 20°C.
La réduction proprement dite de l'ester methylique du dérivé de l'acide Hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70°C. A titre d'exemple, la réduction de l'ester methylique est réalisée avec le borohydrure de sodium.
Plus préférentiellement, la réduction de l'ester methylique sus mentionné est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température voisine de 20°C.
En particulier l'invention a pour objet le procédé mettant en œuvre les étapes suivantes : - Trans-salification de l'Acide Hyaluronique par le chlorure de Benzethonium
- Sulfatation d'un sel d'ammonium quaternaire de l'acide Hyaluronique en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec la pyridine ou la trimethylaminé, suivie d'une salification par l'acétate de sodium, - Soit a) Carboxy-réduction au moyen du chlorhydrate de 1- (3-dimêthyl aminopropyl) -3-ëthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, - soit b) estérification par action de iodure de méthyle sur le dérivé de l'Acide Hyaluronique préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzethonium puis réduction de l' ester methylique correspondant par le borohydrure de sodium. - le cas échéant trans-salification du dérivé sulfaté carboxy-reduit par le chlorure de Benzethonium puis resuifatation par le complexe d'anhydride sulfurique - base organique, suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
Au cas où l'on désire obtenir des dérivés isolés à partir du mélange de dérivés carboxy-réduits de l'acide
Hyaluronique tels qu'obtenus selon le procédé décrit plus haut, le procédé suivant doit ensuite être appliqué au mélange :
- Fractionnement du mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide. Le mélange est élue par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium.
De préférence, la solution d'hydrogénocarbonate de sodium est une solution de 0,1 à 1 mole/1. Encore plus préférentiellement, la séparation est réalisée à une concentration de 1 mole/1. La détection est réalisée par rëfractometrie .
L'invention a également pour objet les Dérivés carboxy- réduits et chemiosélectivement O-sulfatés de l'acide hyaluronique, isolés ou en mélange tels que définis plus haut, susceptibles d'être obtenus selon le ou les procédés tels que définis précédemment. Les polysaccharides de formule (I) , isolés ou en mélanges sont utilisables à titre de médicaments.
Ces polysaccharides présentent en particulier une forte activité inhibitrice de certaines métalloproteases de matrice. Ces inhibiteurs sont particulièrement indiqués pour le traitement d'états pathologiques où une forte augmentation de l'activité des métalloprotéinases de matrice est constatée.
Les états pathologiques auxquels la présente invention fait référence impliquent une augmentation de l'activité d'au moins une des métalloprotéinases de matrice suivante : la neutrophile elastase, la matrilysin (MMP- 7), l'aggrecanase, l'hADAMTSl et la gélatinase A (MMP-2) .
Les composés peuvent donc être utilisés, pour la prévention et le traitement de maladies telles que les désordres joint dégënératifs (tels que l'ostéoarthrose) , les spondyloses, les chondrolyse associéees avec les joint Trauma ou les immobilisations prolongées jointes (souvent suite à une blessure du ménisque ou patellar ou les ruptures de ligaments) , les désordres liés à des blessures, les désordres periodontique, les désordres chroniques du système locomoteur ( tels que arthritides chroniques ou aiguës inflammatoires, immunologique ou du métabolisme) , les arthropathies, myalgas ou les désordres liés au métabolisme osseux.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) isolés ou en mélange ainsi qu'un ou plusieurs excipients, véhicule ou additifs pharmaceutiquement acceptable. Un autre aspect de l' invention est un procédé de préparation des compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) caractérisés en ce qu'on mélange une quantité correspondant à un dosage désiré d'un composé de formule (I) avec un ou plusieurs excipients, véhicule additifs pharmaceutiquement acceptable . Les composés de formule (I) peuvent être administrés par différente voie. Elles peuvent inclure sans être limité aux injections par voie subcutanée, intraarticulaire, intrapéritonée ou intraveineuse.
L'administration peut également être rectale, orale, par inhalation, ou encore par voie transdermique.
Dans le cas de solutions pour injection (par exemple sous forme d'ampoule) , les doses peuvent s'échelonner de 5 μg à environ 200 mg de composé de formule (I) et de préférence de 10 μg à 40 mg. Le dosage quotidien indiqué pour le traitement d'un patient adulte d'environ 70 Kg est de 10 μg à 500 mg d' ingrédients actifs généralement de 20 mg à environ 100 mg. Cependant selon les circonstances des doses quotidiennes plus hautes ou plus basses peuvent être appropriées .
Ces doses peuvent être administrées une fois par jour sous la forme d'une seule unité de dosage.
Alternativement, les doses peuvent être administrées dans une pluralité de doses plus petites données de manière répétée à des intervalles définis au cours du temps.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
L'acide Hyaluronique utilisé pour la préparation des composés illustrant cette invention présente une masse moléculaire de 2,7 106 Daltons. Il est préparé et commercialisé par la société CAREF sous le nom d'Hyaluronate Na F100.
Exemple 1 : Préparation de l'acide hyaluronique carboxy réduit, sel de sodium (sans l'étape essentielle de sulfatation)
Figure imgf000015_0001
(Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R ≈ RI = H)
A une température voisine de 20°C, on prépare une solution de 1 g d'acide hyaluronique sel de sodium dans 150 ml d'eau. Le pH est ajusté à pH 4,7 ± 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute 4,48 g de chlorhydrate de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 ± 0,1. Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute alors par petites portions 17,89 g de borohydrure de sodium ainsi que 250 ml d'eau. Le milieu reactionnel est agité environ 2 heures à une température voisine de 50°C. Après refroidissement à une température voisine de 5°C, le milieu reactionnel est neutralisé par de l'acide chlorhydrique à un pH voisin de 7 (volume d'acide 160ml) . La suspension blanche est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures (le troisième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 0,2 N) . Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,86 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 95 %. Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K (δ en ppm - Mélange des ëpimères en C5) : 2,0 (3H, s), 3,3 (IH, m), entre 3,4 et 3,55 (5H, m), 3,6 (IH, d, J=7Hz) , entre 3,63 et 3,85 (4H, m), 3,89 (IH, d, J=7Hz) , 4,45 (IH, s), 4,57 (IH, m) .
EXEMPLE a : Préparation de l'acide hyaluronique persulfate carboxy réduit, sel de sodium (Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R ≈ S03Na, RI - H)
Transalification Chlorure de Benzethonium
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Figure imgf000016_0001
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a) Préparation du sel de benzethonium de l'acide hyaluronigue (Trans-salification)
A une solution de 20 g d'acide hyaluronique sel de sodium dans 3,6 1 d'eau, on ajoute en environ 20 minutes une solution de 23,5 g de chlorure de benzethonium dans 200 ml d'eau. Un précipité blanc se forme. Après 1 h d'agitation, on laisse sêdimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité d'eau (2,8 1). Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité d'eau (3 1) . Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité d'eau (3,2 1) Le produit est filtré, lavé avec trois portions de 1 1 d'eau puis séché sur claie. Le produit est ensuite broyé puis séché pendant environ 48 h à une température voisine de 50°C sous pression réduite (6kPa) . On obtient 35,6 g de sel de benzethonium de l'acide hyaluronique. Le rendement de la réaction est quantitatif. b) Préparation de l'acide hyaluronigue persulfate, sel de sodium (Sulfatation)
A une température voisine de 60°C et sous atmosphère inerte, on dissout 3 g d'acide hyaluronique, sel de benzethonium dans 240 ml de diméthylformamide anhydre. A la solution obtenue, on ajoute une solution de 36,24 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 210 ml de diméthylformamide anhydre. Après 3 heures d'agitation à une température voisine de 60°C, le milieu reactionnel est refroidi à une température voisine de - 5°C. On ajoute au milieu reactionnel un mélange de 225 ml d'eau et 1350 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le methanol . Le milieu reactionnel est filtré et le gâteau est lavé par trois portions de 60 ml de methanol. Le solide obtenu est dissout dans l'eau puis est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures (le deuxième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 0, 2N) . Le contenu de la membrane est lyophilisé. On obtient 2,65 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 86 %. Spectre proton dans D20, 400MHz, T=298 K, δ en ppm: 2,1 (3H, s), 3,85 (2H, m), 4,07 (IH, m), 4,17 (2H, m), 4,38 (IH, m), 4,42 (2H, m), 4,55 (IH, d, J=7Hz) , 4,8 (2H, m), 4,88 (IH, m) . c) Préparation de l'acide hyaluronigue persulfate carboxy -réduit, sel de sodium (Carboxy-rêduction)
On prépare une solution de 0,5g d'acide hyaluronique persulfate sel de sodium dans 30 ml d'eau. Le pH est ajusté 4,7 ± 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute 1,11 g de chlorhydrate de l-éthyl-3- (3- diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 ± 0,1. Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute alors par petites portions 4,44 g de borohydrure de sodium. Le milieu reactionnel est agité environ 2 heures à une température voisine de 50°C. Après refroidissement à une température voisine 10°C, le milieu reactionnel est neutralisé à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique concentré (12 N) . La suspension blanche est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures (le deuxième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 0,2N). Le contenu de la membrane est lyophilisé. On obtient 0,36 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 76 %. Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K, δ en ppm: 2,0 (3H, s), entre 3,6 et 3,72 (3H, m), 3,8 (IH, t, J=6Hz) , 4,05 (2H, m), 4,13 (IH, dd, J=7 et 3Hz) , 4,2 (IH, t, J=7Hz) , 4,4 (IH, t, J=3Hz) , 4,48 (IH, d, J=8Hz) , 4,6 (IH, t, J=3Hz) , 4,75 (IH, d, J=7Hz) , 4,82 (IH, d, J=3Hz) . EXEMPLE Préparation de l'acide hyaluronique persulfate carboxy-reduit, sel de sodium
(Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R = S03Na, RI = H)
Figure imgf000019_0001
1- Py- S03 / DtVIF 2- AcONa/ eOH
Figure imgf000019_0003
Figure imgf000019_0004
Figure imgf000019_0002
a) Préparation du sel de benzethonium de l'acide hyaluronique (Trans-salification)
Le sel de benzethonium de 1 ' acide hyaluronique est préparé selon l'exemple 2 a. b) Préparation de l'acide hyaluronique persulfate, sel de sodium (Sulfatation)
L'acide hyaluronique persulfate, sel de sodium est préparé selon l'exemple 2 a. c) Préparation du sel de benzethonium de l'acide hyaluronigue persulfate (Trans-salification)
A une solution de 1,96 g d'acide hyaluronique persulfate sel de sodium dans 115 ml d'eau, on ajoute en environ 5 minutes une solution de 5,6 g de chlorure de benzethonium dans 100 ml d'eau. Un précipité blanc se forme. Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant une nuit. Le produit est filtré, lavé avec deux portions de 80 ml d'eau puis séché en dessiccateur sous vide. On obtient 5,3 g de sel de benzethonium de l'acide hyaluronique persulfate. Le rendement de la réaction est de 80 %. d) Préparation de l'ester mêthyligue de l'acide hyaluronigue persulfate, sel de sodium
A une solution de 2,76 g d'acide hyaluronique persulfate sel de benzethonium dans 14,7 g de dichlorométhane, on ajoute 2,7 g de tamis moléculaire 4 Â. Le mélange est agité pendant 3 h 30. Le tamis moléculaire est séparé de la solution, rincé par 2,3 g de dichlorométhane. On ajoute 2,4 g d' iodure de méthyle à la solution anhydre d'acide hyaluronique persulfate, sel de benzethonium dans le dichlorométhane. Le mélange est agité à une température voisine de 20°C pendant 6 jours. Le mélange est ajouté à 45 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le methanol. Après 1 h d'agitation, on laisse sédimenter pendant environ 1 h et le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de methanol (35 ml) . Après 15 minutes d'agitation, le produit est filtré, lavé par du methanol (2 fois 5 ml) , séché en dessiccateur puis séché à une température voisine de 50°C sous pression réduite (6kPa) . On obtient 0,5 g d'ester methylique de l'acide hyaluronique persulfate, sel de sodium. Le rendement de la réaction est de 78 %.
Spectre proton dans D20, 400 MHz, T = 298 K, δ en ppm: 2,0 (3H, s), 3,68 (IH, m), 3,71 (3H, s), 3,80 (IH, m), 4,05 (2H, m), 4,22 (IH, m), 4,26 (IH, m), 4,35 (IH, m), entre 4,4 et 4,55 (2H, m), 4,70 (2H, m), 4,83 (IH, m). e) Préparation de l'acide hyaluronigue persulfate carboxy -réduit, sel de sodium (Carboxy-rëduction) A une solution de 0,1g d'ester methylique de l'acide hyaluronique persulfate, sel de sodium dans 6 ml d'eau, on ajoute 0,93 g de NaBH4 par petites portions, à une température voisine de 20°C. Le mélange obtenu est agité à une température voisine de 0°C pendant environ 18h. Après refroidissement à une température voisine de 5°C, le milieu reactionnel est neutralisé à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique concentré (12 N) . Le mélange obtenu est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 4 jours. Le contenu de la membrane est lyophilisé. On obtient 44 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 44 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K, δ en ppm: 2,0 (3H, s), entre 3,6 et 3,72 (3H, m), 3,8 (IH, t, J=6Hz) , 4,05 (2H, m), 4,13 (IH, dd, J=7 et 3Hz) , 4,2 (IH, t, J=7Hz) , 4,4 (IH, t, J=3Hz) , 4,48 (IH, d, J=8Hz) , 4,6 (IH, t, J=3Hz) , 4,75 (IH, d, J=7Hz) , 4,82 (IH, d, J=3Hz) .
EXEMPLE 3 : Préparation de l'acide hyaluronigue carboxy - réduit et persulfate, sel de sodium (Polysaccharide de formule (I) avec n = 0 à 25000, R = RI = S03Na)
Figure imgf000021_0001
a) Préparation de l'acide hyaluronigue persulfate carboxy -réduit, sel de benzethonium (trans-salification)
A une solution de 0,218 g d'acide hyaluronique carboxy - réduit persulfate, sel de sodium tel que décrit à l'exemple 2a ou 2b, dans 15 ml d'eau, on ajoute une solution de 0,507 g de chlorure de benzethonium dans 10 ml d'eau. Le produit est filtré, lavé à l'eau et séché. Après séchage pendant 48 h sous pression réduite (environ 6kPa) à une température voisine de 55°C. On obtient 0,453 g d'un solide blanc. Le rendement obtenu est de 69 %.
b) Préparation de l'acide hyaluronigue carboxy-reduit persulfate, sel de sodium (sulfatation)
On dissout 0,45g d'acide hyaluronique persulfate carboxy réduit, sel de benzethonium dans 35 ml de diméthylformamide anhydre. A une température voisine de 20°C et sous agitation, on ajoute une solution de 0,61 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 28 ml de diméthylformamide anhydre. Après 3 heures d'agitation à une température voisine de 20°C, on ajoute un mélange de 32 ml d'eau et 190 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le methanol. La suspension est filtrée. Le gâteau est lavé avec 4 portions de 50 ml de methanol. Le solide blanc obtenu est dissout dans 10 ml d'eau puis filtré sur membrane 0,45 μm. Le filtrat est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 10000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures . Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,197g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est quantitatif. Spectre proton dans D20, 400MHz, T=303 K, δ en ppm: 2,1 (3H, s), entre 3,8 et 4,0 (3H, m), 4,1 (IH, t, J=7Hz) , entre 4,2 et 4,6 (5H, m), 4,6 (IH, d, J=6Hz) , entre 4,68 et 4,8 (3H, m), 5,18 (IH, s).
Tests pharmacologigues Effet des dérivés carboxyréduits sur l'Aggrecanase des fluides synoviaux ou sur des préparations de protéine recombinante ADAMTS. L'analyse est effectuée sur des plaques 96-puits. Avant l'analyse, des dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans une solution aqueuse
Digestion : Dans chaque puits, un volume fixe de fluide synovial ou d'activité aggrecanase générant une augmentation connue, entre 1,0 et 1,4 unités d'absorbance (405 nm) dans les conditions de l'analyse est mélangé avec 3 μl de solution de composé de l'étape de dilution respective. Le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) est ajouté à chaque puits pour fournir un volume final de 300 μl . Ensuite, la plaque est incubée 1 heure à 37°C dans une atmosphère de dioxyde de carbone. Après un ajout de 5 μl d'une solution de 1 μg/μl de substrat recombinant Agglmut dans le DMEM à chaque puits (substrat tel que décrit par Bartnik E. et al., EP 785274, 1997) , le mélange réactif est incubé pendant 4 heures à 37°C sous atmosphère de dioxyde de carbone.
Préparation de la plaque d'analyse : Lors d'une première étape, la microplaque est enduite au moyen de 100 μl par puits d'un anticorps anti-souris de chèvre IgG du commerce pendant 1 heure à température ambiante (5 μg/ml dans une solution saline de phosphate tamponnée pH 7,4 [Tampon PBS] ) . Après lavage avec le tampon PBS contenant 0,1% de Tween-20 (tampon de lavage), les puits sont bloqués par une étape d'une heure d'incubation au moyen de 100 μl par puits de 5% de sérum d'albumine bovin dans un tampon PBS contenant 0,05 % de Tween-20. A la suite d'un autre rinçage au moyen du tampon de lavage, chaque puits est incubé avec 100 μl d'une solution diluée à 1:1000 d'anticorps BC-3 dans un tampon PBS contenant 0,05 % de T een 20 et 0,5 % d'albumine de sérum bovin à température ambiante pendant une heure. Cet anticorps reconnaît les fragments de clivage typiques de 1 ' aggrecanase (Hughes CE. et al., Biochem. J. 305 (3), 799-804, 1995).
Mode opératoire de l 'essai :
Après un autre rinçage de la plaque d'analyse avec le tampon de lavage, le jeu complet des mélanges provenant de la digestion précédente est transféré puits par puits vers cette plaque et incubé à température ambiante pendant une heure. La plaque est à nouveau lavée tel que ci-dessus. Ensuite, 100 μl du second anticorps (anticorps anti-humain IgG, marqué à la peroxydase, 1:1000 dans du PBS contenant 0,5% de ASB et 0,05% de T een-20) sont ajoutés à chaque puits, avec une incubation ultérieure à température ambiante pendant à nouveau une heure. A la suite d'un rinçage final avec le tampon de lavage, le développement de la couleur est initié par ajout de 100 μl de solution de substrat ABTS (2mg/ml, acide 2,2'- azinobis (3 ethylbenzothiazoline) sulfonique )dans 40 mM de citrate de sodium plus 60 mM d'hydrogenophosphate disodique, ajusté à un pH 4,4 par ajout d'acide acétique ; 0,25 μl de peroxyde d'hydrogène à 35 % ajouté par ml immédiatement avant la mesure) . La mesure est effectuée au moyen du mode de tamis à l'aide d'une détection à 405 nm par rapport à un filtre de référence (620 nm) avec des lectures automatiques à des intervalles de 5 secondes. Le développement est arrêté dès que le signal maximum (405 nm) dans la gamme d'absorbance de 1,0 à 1,4 est atteint. Tableau 1
Figure imgf000025_0001
Dans ce test, l'acide hyaluronique de départ ne montre pas d'activité inhibitrice de l' aggrecanase . Effet du dérivé persulfate carboxy-reduit (exemple 2) sur 1' aggrecanase de chondrocytes bovins cultivés dans des billes d'Alginate
Afin de générer une activité de l' aggrecanase, les chondrocytes bovins mis en culture dans des gels de matrice d'alginate sont stimulés avec 10 ng/ml de IL-lα pendant 3 jours conformément au procédé de Hughes CE. et al., J. Biol. Chem. 273, 30576-30582, 1998. Dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire 96 puits, 200 μl de surnageant chondrocyte contenant une activité de l' aggrecanase sont mélangés avec 100 μl de milieu de culture cellulaire DMEM. Aux concentrations à tester, 5 μl d'une solution aqueuse du produit de l'exemple 2 est ajouté pour inhiber l'activité de l' aggrecanase, une heure avant l' ajout de 5 μg de substrat recombinant Agglmut (Bartnik E. et al . , EP 785274, 1997) . Le mélange est incubé à 37°C pendant 17 heures et ensuite transféré dans une plaque ELISA afin de détecter les néoëpitopes générés par l'activité de l' aggrecanase en liant de l'anticorps BC-3 tel que décrit auparavant (Hughes CE. et al., Biochem. J. 305 (3), 799- 804, 1995) .
Tableau 2 (% d'inhibition de la conversion du substrat par activité de l' aggrecanase dans le surnageant)
Figure imgf000026_0001
IC 50 0,0033 mg/ml Inhibition du facteur Xa
Pour la calibration, un échantillon standard d'héparine de bas poids moléculaire (Enoxaparine) a été utilisé comme référence
Les dilutions sérielles du composé de l'essai sont préparées dans un tampon de 0,046 M Tris pH 8,4 contenant 0,15 M NaCl, 0,007 M EDTA, 0,1% de T een 80 et 0,12 IU/ml d'antithrombine humaine III. Les échantillons de 50 μl des dilutions respectives sont incubés avec 50 μl de facteur bovin Xa (13,6 U/ml) à 37°C pendant 80 secondes. Ensuite, 50 μl de substrat chromogênique 1,1 mM S-2765 sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm est mesurée dans un photomètre. L'activité du facteur débloqué Xa est indiquée par l'émission de p-nitroaniline à partir du substrat.
Lorsque comparés au composé d'héparine de bas poids moléculaire de référence (100 U/mg) , les glycosamonoglycanes présentent un facteur Xa d'activité inhibitrice bien inférieur : Produit exemple 2 : 0,485 U/mg Produit exemple 3 : 1,75 U/mg Effet du dérivé persulfate carboxy-reduit (exemple 2) des métalloproteases humaines MMP-2 (gelatinase-A) et MMP7
Des Kit ELISA commerciaux (comme ceux fournis par exemple par la société Amersham Biosciences, kits RPN2617 and RPN 2620) ont été respectivement utilisés pour la détermination de l'activité inhibitrice des enzymes MMP-2 et MMP-7. Les concentrations des enzymes sont respectivement de 800 ng/ml pour MMP-2 et 300 ng/ml pour MMP-7. Les tests ont été réalisés en accord avec les recommandations du fabricant en réalisant une série de dilutions du composé à étudier dans un tampon PBS pH 7.5. Les enzymes MMP-2 et MMP-7 ont été toutes deux inhibées de façon concentration -dépendante.
Dérivé obtenu selon l'exemple 2
IC50 : 0.8 μg/ml (effect on MMP-2) 0.2 μg/ml (effect on MMP-7)
Effets des dérivés carboxy-réduits selon l'invention sur l'Elastase de Neutrophiles humains
Une enzyme disponible dans le commerce (par exemple, de l'élastase neutrophile humaine, Sigma n° E8140) est reconstituée en aliquots de 0,1 mg par fiole à l'aide de 0,276 ml de tampon d'acétate de sodium à 50 mM pH 5,5 contenant 200 mM NaCl (solution mère de l'enzyme); 11 μl de cette solution mère sont dilués avec 1,1 ml du tampon HEPES ci-dessus (solution d'essai de l'enzyme) . La solution de substrat est préparée en dissolvant 118 mg de Methoxy-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p- nitroanilide dans 1 ml de DMSO (solution mère, par exemple, Sigma n° M4765) . En vue de l'application dans l'analyse, 9 μl de solution mère sont ensuite dilués dans 1,19 ml d'eau.
Les dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans 100 mM de tampon HEPES contenant 500 mM NaCl . L'analyse est effectuée sur des microplaques en polystyrène 96 puits incolores (par exemple, Corning Costar, n° 3695) .
10 μl de solution d'enzyme d'essai sont mélangés avec 10 μl de la solution respective de composé dilué et 10 μl de la solution de substrat. Au bout de 15 min d'incubation, le clivage du substrat est lu en tant qu'augmentation de l'absorbance à 405 nm Le produit de l'exemple 2 inhibe l'elastase de neutrophile humain avec une IC50 de 0,15 μg/ml.
L'inhibition par le produit de l'exemple 3 est significativement inférieure avec une IC50 de 7,0 μg/ml.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O- sulfatés de l'acide hyaluronique, isolés ou en mélange, ainsi que leurs sels.
2. Dérivés carboxy-réduits de l'acide hyaluronique selon la revendication 1 de formule (I) :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle R représente S03M et Rx représentent H ou S03M, n est un entier compris entre 0 et 25000, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastëréoisomères .
3. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium.
4. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que M est un atome de sodium.
5. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R et Rx représentent S03Na.
6. Dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que R représente S03Na et Rx représente H.
7. Procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits de l'acide Hyaluronique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on met en œuvre successivement les étapes suivantes : - trans-salification de l'acide Hyaluronique par un sel d'ammonium quaternaire, - Sulfatation en milieu organique de l'acide Hyaluronique transalifiée suivie d'une salification, - carboxy-réduction du dérivé persulfate - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur, - Soit b) par estérification, le dérivé persulfate étant le cas échéant préalablement trans- salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action d'un agent réducteur puis, le cas échéant, trans-salification du dérivé persulfate carboxy-reduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resuifatation suivie d'une salification.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine .
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue à partir d'un sel de benzethonium de l'acide hyaluronique, en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater, et à une température comprise entre 10 et 70 °C et notamment entre 50 et 70°C
10. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la carboxy-réduction s'effectue au moyen de chlorhydrate de 1- (3-diméthyl aminopropyl) -3- êthylcarbodiimide en présence du borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'on utilise préférentiellement 5 à 20 équivalents de chlorhydrate de 1- (3-dimëthyl aminopropyl) -3- éthylcarbodiimide et à un pH compris entre 4 et 5. 12. Procédé selon la revendication 10 à 11 caractérisé en ce qu'on utilise encore plus préférentiellement 7 à 13 équivalents de chlorhydrate de 1- (3-diméthyl aminopropyl) -3-éthylcarbodiimide et à un pH compris entre 4,3 et 4,9. 13. Procédé selon la revendication 10 à 12 caractérisé en ce que la réduction de l'adduit activé du dérivé de l'acide hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70 °C 1 . Procédé selon la revendication 10 à 12 caractérisé en ce que la réduction de l'adduit activé est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 20 et 50 °C
15. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la carboxy-réduction s'effectue par réduction d'un ester methylique en présence de borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'on prépare l'ester methylique à partir d'un dérivé de l'acide Hyaluronique, sel de benzethonium, en solution dans le dichlorométhane en présence de 2 à 20 équivalents et en particulier de 4 à 10 équivalents d' iodure de méthyle .
17. Procédé selon la revendication 15 à 16 caractérisé en ce que la réduction de l'ester du dérivé de l'acide Hyaluronique est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 50°C
18. Procédé selon la revendication 15 à 17 caractérisé en ce que la réduction de l'ester est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température voisine de 20°C
19. Procédé selon la revendication 7 pour l'obtention des dérivés de formule (I) tels que définis à la revendication 5 caractérisé en ce que la sulfatation du dérivé persulfate carboxy-reduit, sel de benzethonium tel que défini à la revendication 6, s'effectue en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine à environ 20°C 20. procédé selon la revendication 7 mettant en oeuvre les étapes suivantes : - Trans-salification de l'Acide Hyaluronique par le chlorure de Benzethonium Sulfatation d'un sel d'ammonium quaternaire de l'acide Hyaluronique en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec la pyridine ou la triméthylamine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium, - Soit a) Carboxy-réduction au moyen du chlorhydrate de 1- (3-dimëthyl aminopropyl) -3-éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, - soit b) estérification par action de iodure de méthyle sur le dérivé de l'Acide Hyaluronique préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzethonium puis réduction de l' ester methylique correspondant par le borohydrure de sodium. - le cas échéant trans-salification du dérivé sulfaté carboxy-reduit par le chlorure de Benzethonium puis resuifatation par le complexe d'anhydride sulfurique - base organique, suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
21. Procédé d'obtention des dérivés isolés de l'acide hyaluronique carboxy-réduits et chemiosélectivement O- sulfatés selon la revendication 1 à 6 à partir du mélange de dérivés carboxyréduits de l'acide Hyaluronique tels qu'obtenus selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 20, caractérisé en ce qu'on fractionne le mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide, le mélange étant élue par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium, notamment de 0,1 à 1 mole/1.
22. A titre de médicaments les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 6.
23. A titre de médicaments selon la revendication 22, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour traiter ou prévenir les désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice, telle que l'elastase neutrophile, la matrilysine (MMP-7) , 1' aggrecanase hADAMTSl et la gélatinase A (MMP-2) .
24. A titre de médicaments selon la revendication 22 ou 23, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour traiter ou prévenir des désordres tels que la dégénérescence articulaire, la spondylose, la chondrolyse, associée à un traumatisme de l'articulation ou une immobilisation prolongée de l'articulation, les désordres des tissus conjonctifs, les troubles de la cicatrisation de plaie, les désordres parodontaux, les désordres chroniques du système locomoteur, les arthropathies, les myalgies, ou les désordres du métabolisme osseux. 25. les compositions pharmaceutiques renfermant un médicament tel que défini à l'une quelconque des revendications 22 à 24 et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables .
26. Dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O- sulfatés de l'acide hyaluronique, isolés ou en mélange tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, susceptibles d'être obtenus selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 21.
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