WO2005061549A1 - Derives carboxy-reduits du dermatan sulfate, leur preparation, leur application comme medicament et les compositions pharmaceutiques les renfermant - Google Patents

Derives carboxy-reduits du dermatan sulfate, leur preparation, leur application comme medicament et les compositions pharmaceutiques les renfermant Download PDF

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WO2005061549A1
WO2005061549A1 PCT/FR2004/003226 FR2004003226W WO2005061549A1 WO 2005061549 A1 WO2005061549 A1 WO 2005061549A1 FR 2004003226 W FR2004003226 W FR 2004003226W WO 2005061549 A1 WO2005061549 A1 WO 2005061549A1
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dermatan sulfate
carboxy
reduced
derivatives
derivative
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PCT/FR2004/003226
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Wolfgang Ulmer
Christian Viskov
Philippe Hubert
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Aventis Pharma S.A.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to new glycosaminoglycans as well as their pharmaceutically acceptable addition salts and more precisely carboxy-reduced and chemioselectively O-sulfated derivatives of Dermatan Sulfate, isolated or in mixture, their application as a medicament, and pharmaceutical compositions. containing them.
  • Glycoaminoglycans are essentially formed of alternating uronic acid-amino sugar units (or vice versa), of the type encountered in the oligo or polysaccharide chains of biologically active natural GAGs such as heparin, heparan sulfate, dermatan sulfate, chondroitins, chondroitins sulfates or Hyaluronic acid.
  • the uronic acid units more specifically respond to the D-glucoronic or L-iduronic acid structure and the amino sugar units to that of D-galactosamine.
  • Natural GAGs exhibit therapeutic activities as inhibitors of Thrombin. They therefore exhibit antithrombotic and anticoagulant activity and are used in cardiovascular pathologies in which there is a risk of thrombosis.
  • the subject of the present invention is a new process implementing a carboxy-reduction step and a sulfation step making it possible to obtain new carboxy-reduced and chemically O-sulfated derivatives of Dermatan Sulfate having advantageous properties making it possible to treat or to prevent disorders which display increased activity of at least one of the matrix metalloproteinases.
  • the carboxy-reduced and chemoselectively O-sulfated derivatives of Dermatan Sulfate of formula (I) have a very regular polymeric structure with degrees of purity of the order of 90%. This results in reproducible and unexpected biological properties.
  • MMPs The proteolytic activity responsible for this cleavage is called "aggrecanase” and can be attributed to the superfamily of metalloproteinases (MP) or matrix metalloproteinases (MMP). Zinc is an essential element in the catalytically active center of metalloproteinases. MMPs cleave collagen, laminin, proteoglycans, elastin or gelatin under physiological conditions. Therefore, they play an important role in bone and connective tissue. A large number of different MMP inhibitors are known (see, for example, patent applications EP 0 606 046 or WO94 / 28889). However, known inhibitors of MMPs frequently have a significant disadvantage. They lack specificity for any particular class of MMP. In contrast, most MMP inhibitors simultaneously inhibit a plurality of MMPs.
  • a very particular subject of the invention is the carboxy-reduced and sulfated derivatives of the Dermatan Sulfate of formula (I):
  • Ri represents S0 3 M
  • R 2 , R 3 and R 4 identical or different, represent H or S0 3 M, it being understood that at least one of the substituents R 2 , R 3 and R 4 represent a group S0 3 M
  • n is an integer between 0 and 150
  • M is an alkali metal, the said derivatives being under the form of an isolated compound or in the form of mixtures, as well as their diastereoisomers.
  • the subject of the invention is the carboxyreduced derivatives of Dermatan Sulfate according to formula (I) characterized in that the M is chosen from sodium, calcium, magnesium and potassium and in particular Sodium.
  • a more particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Dermatan Sulfate as described above, characterized in that R 2 and R 3 represent S0 3 Na and R 4 represents H.
  • a more particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Dermatan Sulfate as described above, characterized in that R 2 , R 3 and R 4 represent S0 3 Na.
  • a more particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Dermatan Sulfate as described above, characterized in that R 2 and R 4 represent S0 3 Na and R 3 represents H.
  • a more particular subject of the invention is the carboxy-reduced derivatives of Dermatan Sulfate as described above, characterized in that R 2 represents S0 3 Na and R 3 and
  • R 4 represent H.
  • These polysaccharides thus comprise an even number of saccharides.
  • the polysaccharide mixtures according to the invention can be prepared on the one hand by carboxy-reduction of Dermatan sulfate or of its derivatives, followed by chemioselective sulfation or conversely by sulfation followed by carboxy-reduction.
  • the subject of the invention is therefore the carboxy-reduced and sulfated derivatives of Dermatan Sulfate as defined more top implementing successively the following stages: - Trans-salification of Dermatan Sulfate with a quaternary ammonium salt, Sulfation in organic medium, followed by salification, Carboxy-reduction of the persulfated derivative - either a) by means of a carbodiimide derivative (to form an activated adduct) and in the presence of a reducing agent, - either b) by esterification, the persulfated derivative being optionally trans-salified with a quaternary ammonium salt, followed by reduction of the corresponding ester derivative by action a reducing agent If necessary, trans-salification of the carboxy-reduced persulfated derivative with a quaternary ammonium salt then resuifatation followed by salification.
  • the following reaction scheme illustrates the present invention:
  • the carboxy-reduced derivatives of Dermatan Sulfate as defined above can be obtained according to the process using the steps described above but combined in reverse order.
  • the process is then as follows: - Carboxy-reduction of Dermatan Sulfate Sodium salt - Either a) by means of a carbodiimide derivative (to form an activated adduct) and in the presence of a reducing agent, - or b) by esterification, Dermatan Sulfate salt sodium being optionally trans-salified with a quaternary ammonium salt, followed by a reduction of the corresponding ester derivative by action of a reducing agent,
  • the process according to the present invention is characterized by the high chemoselectivity of the carboxy-reduction and sulfation reactions.
  • the resulting products are remarkably homogeneous and lead to true polymers.
  • the carboxy-reduced Dermatan Sulfate derivatives have purities of the order of 90%. This homogeneity is determined by NMR and infrared structural analysis.
  • the persulfation reactions are preferably carried out in an organic medium by means of a sulfuric anhydride complex with an organic base such as pyridine or trimethylamine. They are generally followed by a salification reaction, for example by the action of sodium acetate.
  • the reaction will preferably be carried out at temperatures between -15 and 70 ° C.
  • a more particular subject of the invention is a process for the sulfation of Dermatan Sulfate which is carried out at approximately 0 ° C. when it is desired to obtain the 6, 0-sulfated derivatives of dermatan Sulfate or at approximately 60 ° C.
  • the carboxy-reduction of the Dermatan Sulfate derivatives is carried out in the presence of a carbodiimide derivative.
  • a carbodiimide derivative As an example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride may be used.
  • derivatives of Dermatan Sulfate we mean the sulfated derivatives of Dermatan sulfate, the benzethonium salt of
  • Dermatan Sulfate the persulfated benzethonium salt derivatives of Dermatan Sulfate as well as Dermatan Sulfate sodium salt.
  • the actual reduction is carried out with an alkali metal borohydride.
  • the reaction with the carbodiimide derivative is carried out with sodium borohydride.
  • the reaction for forming the adduct with the carbodiimide derivative preferably puts 5 to 20 equivalents of reagent in the presence of a pH of between 4 and 5.
  • reaction with the carbodiimide derivative is carried out in the presence of 7 to 13 equivalents of reagent and at a pH of between 4.3 and 4.9.
  • the actual reduction of the activated adduct of Dermatan Sulfate derivatives is carried out with 10 to 300 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature between 10 and 70 ° C. More preferably, the reduction of the aforementioned adduct is carried out in the presence of 140 to 250 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature between 10 and 30 ° C.
  • the reduction can be carried out by reduction of an ester of the Dermatan Sulfate derivatives.
  • an ester of the Dermatan Sulfate derivatives For example, it is possible to use a methyl ester derivative.
  • the derivatives of the Dermatan Sulfate previously salified in the form of the benzethonium salt are esterified by the conventional esterification methods known to those skilled in the art using an alkyl halide containing from 1 to 6 carbon atoms such as such as methyl iodide or an arylalkyl halide such as benzyl chloride in organic medium.
  • the actual esterification of Dermatan sulfate, benzethonium salt is carried out in an organic medium in presence, for example, of ethyl iodide.
  • the esterification is carried out in dichloromethane in the presence of 2 to 20 equivalents of methyl iodide and at a temperature in the region of 20 ° C.
  • esterification is carried out in dichloromethane in the presence of 4 to 10 equivalents of methyl iodide for approximately 3 days at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the reduction of the methyl ester of the derivative of the Dermatan Sulfate benzethonium salt is carried out with 10 to 300 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature between 10 and 70 ° C.
  • the reduction of the methyl ester is carried out with sodium borohydride.
  • the reduction of the methyl ester is carried out in the presence of 140 to 250 equivalents of alkali metal borohydride at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the subject of the invention is the following process:
  • the sodium hydrogencarbonate solution is a solution of 0.1 to 1 mol / l. Even more preferably, the separation is carried out at a concentration of 1 mole / 1. Detection is carried out by dreamframe.
  • the polysaccharides of formula (I), isolated or in mixtures, can be used as medicaments.
  • polysaccharides exhibit in particular a strong inhibitory activity of certain matrix metalloproteases. These inhibitors are particularly indicated for the treatment of pathological conditions where a strong increase in the activity of matrix metalloproteinases is observed.
  • the medical conditions to which the present invention refers implies an increase in the activity of at least one of the following matrix metalloproteinases: matrisilyne (MMP-7), the neutrophil elastase, aggrecanase, hADAMTSl and gelatinase A (MMP-2).
  • MMP-7 matrisilyne
  • MMP-2 the neutrophil elastase
  • aggrecanase hADAMTSl
  • gelatinase A MMP-2
  • the compounds can therefore be used, for the prevention and treatment of diseases such as degenerative joint disorders (such as osteoarthrosis), spondylosis, chondrolysis associated with Trau a joints or prolonged joint immobilizations (often following an injury to the meniscus or patellar or ruptured ligaments), disorders linked to injuries (healing), periodontic disorders, chronic disorders of the locomotor system (such as chronic or acute inflammatory arthritis, immunological or metabolism ), arthropathies, myalgas or disorders linked to bone metabolism.
  • diseases such as degenerative joint disorders (such as osteoarthrosis), spondylosis, chondrolysis associated with Trau a joints or prolonged joint immobilizations (often following an injury to the meniscus or patellar or ruptured ligaments), disorders linked to injuries (healing), periodontic disorders, chronic disorders of the locomotor system (such as chronic or acute inflammatory arthritis, immunological or metabolism ), arthropathies, myalgas or disorders linked to bone metabolism.
  • diseases such as degenerative joint disorders (such
  • a subject of the invention is also the pharmaceutical compositions containing the compounds of formula (I) isolated or in mixture as well as one or more excipients, vehicle or pharmaceutically acceptable additives.
  • Another aspect of the invention is a process for the preparation of pharmaceutical compositions containing the compounds of formula (I) characterized in that an amount corresponding to a desired dosage of a compound of formula (I) is mixed with one or more pharmaceutically acceptable excipients, vehicle or additives.
  • the compounds of formula (I) can be administered by different routes. They may include but are not limited to subcutaneous, intraarticular, intraperitoneal or intravenous injections.
  • Administration can also be rectal, oral, inhalation, or even transdermally.
  • the doses can range from 5 ⁇ g to approximately 200 mg of compound of formula (I) and preferably from 10 ⁇ g to 40 mg.
  • the daily dosage indicated for the treatment of an adult patient of approximately 70 Kg is from 10 ⁇ g to 500 mg of active ingredients generally from 20 mg to approximately 100 mg. However depending on the circumstances higher or lower daily doses may be appropriate.
  • These doses can be administered once daily as a single dosage unit.
  • the doses may be administered in a plurality of smaller doses given repeatedly at defined intervals over time.
  • the Dermatan Sulfate used for the preparation of the compounds illustrating this invention has a molecular mass of 30 to 40 K Daltons. It is isolated when preparing heparin from pig mucus. From the crude heparin precipitation mother liquors, a mixture of heparinoids / dermatan sulfate can be isolated. To obtain pure dermatan sulfate, the following conditions may for example be used:
  • a solution of 13 g of heparinoid / Dermatan mixture (containing approximately 50% Dermatan) in 130 ml of water is prepared.
  • the pH is then adjusted to pH 3 with concentrated acetic acid and then 0.9 g of sodium nitrite is added at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the reaction medium is cooled to a temperature in the region of 0 ° C., then neutralized to pH 7 with concentrated sodium hydroxide (7.5 N).
  • the reaction medium is adjusted to a content of 10% of sodium chloride and then a volume of methanol is added (ie approximately 130 ml).
  • the precipitate obtained is filtered, washed with 5 ml of methanol, then dried to provide 4.8 g of an off-white solid.
  • the yield obtained is 73%.
  • a solution of 1 g of Dermatan Sulfate, sodium salt in 150 ml of water is prepared.
  • the pH is adjusted to pH 4.7 ⁇ 0.1 with a 0.1N hydrochloric acid solution.
  • 3.6 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride are added and the mixture is then stirred while maintaining the pH at 4.7 + 0.1.
  • 14.7 g of sodium borohydride are then added in small portions.
  • the reaction medium is stirred for approximately 20 hours at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the reaction medium After cooling to a temperature in the region of 15 ° C, the reaction medium is neutralized with concentrated hydrochloric acid at a pH in the region of 7.
  • the reaction medium is loaded into a membrane of cellulose ester PM 1000 and put on dialysis while changing water baths regularly for about 48 hours (the fourth bath is carried out with a 2N sodium chloride solution. The last three baths are carried out with deionized water).
  • the contents of the membranes are freeze-dried. 0.8 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 92%.
  • the carboxy-reduced Dermatan Sulfate, sodium salt is prepared according to Example 1.
  • the carboxy-reduced dermatan sulfate, sodium salt is prepared according to Example 1.
  • the carboxy-reduced Dermatan Sulfate, benzethonium salt is prepared according to Example 2b.
  • the cake is dissolved in 20 ml of water and then re-precipitated with 60 ml of a 10% methanolic solution of sodium acetate.
  • the suspension is filtered.
  • the cake is dissolved again in 50 ml of water then the solution is loaded into a cellulose ester membrane PM 3500 and put on dialysis by changing the water baths regularly for 72 hours.
  • the contents of the membranes are freeze-dried. 83 mg of a white lyophilisate are obtained. The yield obtained is 30%.
  • the solid obtained is dissolved in 200 ml of water and then re-precipitated with 600 ml of a 10% methanolic solution of sodium acetate.
  • the suspension is filtered and the white solid obtained is dissolved in 200 ml of water.
  • the solution obtained is loaded into a PM 1000 cellulose ester membrane and put into dialysis by changing the water baths regularly for 48 hours. The contents of the membranes are freeze-dried. 1.31 g of a white lyophilisate are obtained. The yield obtained is 51.8%.
  • a solution of 1.22 g of dermatan persulfated sodium salt is prepared in 190 ml of water.
  • the pH is adjusted to pH 4.7 ⁇ 0.1 with a 0.1N hydrochloric acid solution.
  • 2.72 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride are added and then the mixture is stirred while maintaining the pH at 4.7 ⁇ 0.1.
  • 11.1 g of sodium borohydride are then added in small portions.
  • the reaction medium is stirred for approximately 20 hours at a temperature in the region of 20 ° C.
  • the reaction medium is neutralized to pH 7 with concentrated hydrochloric acid (10 N).
  • the white suspension is loaded into a PM 1000 cellulose ester membrane and dialyzed by changing the water baths regularly for 20 hours. 1.2 l of a 10% methanolic sodium acetate solution are added to the content of the membranes (400 ml). The suspension is filtered and the cake is washed with 3 portions of 100 ml of methanol. The white solid obtained is dissolved in water. The solution obtained is loaded into a membrane of cellulose ester PM 1000 and put into dialysis by changing the water baths regularly for 72 hours. The contents of the membranes are freeze-dried. 0.464 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 39%.
  • the benzethonium salt of dermatan sulfate used in this example is common to that of Example 4 a).
  • the suspension is filtered and the cake is washed with 30 ml of methanol.
  • the solid obtained is dissolved in 200 ml of water then is precipitated with 600 ml of a 10% methanolic solution of sodium acetate. After approximately 16 h of sedimentation, the mixture is filtered and the cake is washed with 20 ml of methanol.
  • the white solid obtained is dissolved in 150 ml of water.
  • the solution obtained is loaded into a PM 1000 cellulose ester membrane and put into dialysis by changing the water baths regularly for 24 hours. The dialyzed solution is then lyophilized. 0.9 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 47%.
  • a solution of 0.8 g of sulfated 6-0 dermatan sulfate, sodium salt in 75 ml of water is prepared.
  • the pH is adjusted to pH 4.7 ⁇ 0.1 with a 0.1 N hydrochloric acid solution.
  • 2.4 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride are added and then stirred. maintaining the pH at 4.7 ⁇ 0.1.
  • the solution thus prepared is loaded into a membrane of cellulose ester PM 1000 and put into dialysis by changing the water baths regularly for 50 hours. The contents of the membranes are then lyophilized. 0.54 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 72%.
  • the Dermatan derivative illustrating this example can be prepared from the reduced carboxy persulfated sulfate Dermatan, sodium salt from Example 4. - a) Preparation of the reduced carboxy persulfated sulfate Dermatan, benzethonium salt.
  • the suspension is filtered and the cake is washed with 5 ml of methanol.
  • the solid obtained is dissolved in 40 ml of water and then is precipitated with 120 ml of a 10% methanolic solution of sodium acetate.
  • the suspension is filtered and the white solid obtained is dissolved in 20 ml of water.
  • the solution obtained is filtered through a 0.2 ⁇ m membrane then loaded into a membrane of cellulose ester PM 1000 and put into dialysis by changing the water baths regularly for 24 hours. The contents of the membranes are freeze-dried. 0.128 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 50%.
  • the 6-0 carboxy-reduced dermatan sulfate sulfated, sodium salt used for this preparation is derived from 1 example 5.
  • the suspension is filtered and the cake is washed with 10 ml of methanol.
  • the solid obtained is dissolved in 30 ml of water and then precipitated with 90 ml of a 10% methanolic solution of sodium acetate.
  • the suspension is filtered and the white solid obtained is washed with 5 ml of methanol, then dissolved in 10 ml of water.
  • the solution obtained is loaded into a PM 3500 cellulose ester membrane and put into dialysis by changing the water baths regularly for 24 hours. The contents of the membranes are freeze-dried. 0.252 g of a white lyophilisate is obtained. The yield obtained is 72%.
  • a fixed volume of synovial fluid or aggrecanase activity generating a known increase, between 1.0 and 1.4 absorbance units (405 nm) under the conditions of the analysis is mixed with 3 ⁇ l of solution of compound from the respective dilution step.
  • Eagle medium modified by Dulbecco (DMEM) is added to each well to provide a final volume of 300 ⁇ l. Then, the plate is incubated for 1 hour at 37 ° C in a carbon dioxide atmosphere.
  • the microplate is coated with 100 ⁇ l per well of a commercial IgG goat anti-mouse antibody for 1 hour at room temperature (5 ⁇ g / ml in a phosphate buffered saline solution pH 7 , 4 [PBS buffer]). After washing with the PBS buffer containing 0.1% of T een-20 (washing buffer), the wells are blocked by a one hour incubation step using 100 ⁇ l per well of 5% serum. bovine albumin in PBS buffer containing 0.05% T een-20.
  • each well is incubated with 100 ⁇ l of a solution diluted to 1: 1000 of BC-3 antibody in a PBS buffer containing 0.05% of T een 20 and 0.5% bovine serum albumin at room temperature for one hour.
  • This antibody recognizes the cleavage fragments typical of aggrecanase (Hughes CE. Et al., Biochem. J. 305 (3), 799-804, 1995).
  • Test operating mode After another rinsing of the analysis plate with the washing buffer, the complete set of mixtures from the previous digestion is transferred well by well to this plate and incubated at room temperature for one hour. The plate is again washed as above. Then, 100 ⁇ l of the second antibody (anti-human IgG antibody, labeled with peroxidase, 1: 1000 in PBS containing 0.5% ASB and 0.05% Tween-20) are added to each well, with a subsequent incubation at room temperature for another hour.
  • the second antibody anti-human IgG antibody, labeled with peroxidase, 1: 1000 in PBS containing 0.5% ASB and 0.05% Tween-20
  • color development is initiated by adding 100 ⁇ l of ABTS substrate solution (2 mg / ml, 2,2 '-azinobis (3 ethylbenzthiazoline sulfonic acid in 40 mM) sodium citrate plus 60 mM disodium hydrogen phosphate, adjusted to pH 4.4 by adding acetic acid; 0.25 ⁇ l of 35% hydrogen peroxide added per ml immediately before measurement).
  • ABTS substrate solution 2 mg / ml, 2,2 '-azinobis (3 ethylbenzthiazoline sulfonic acid in 40 mM) sodium citrate plus 60 mM disodium hydrogen phosphate, adjusted to pH 4.4 by adding acetic acid; 0.25 ⁇ l of 35% hydrogen peroxide added per ml immediately before measurement.
  • ABTS substrate solution 2 mg / ml, 2,2 '-azinobis (3 ethylbenzthiazoline sulfonic acid in 40 mM) sodium citrate plus 60 mM dis
  • the estimated IC 50 of the product of Example 1 (carboxy-reduced derivative only) is of the order of 7.9 ⁇ g / ml Effect of the carboxy-reduced persulfated derivative (Example 3) on the aggrecanase of bovine chondrocytes cultivated in Alginate beads
  • bovine chondrocytes cultured in alginate matrix gels are stimulated with 10 ng / ml of IL-1 ⁇ for 3 days according to the method of Hughes CE. et al., J. Biol. Chem. 273, 30576-30582, 1998.
  • 200 ⁇ l of chondrocyte supernatant containing aggrecanase activity are mixed with 100 ⁇ l of DMEM cell culture medium.
  • Serial dilutions of the test compound are prepared in a 0.046 M Tris pH 8.4 buffer containing 0.15 M NaCl, 0.007 M EDTA, 0.1% Tween 80 and 0.12 I ⁇ / ml of antithrombin human III.
  • the 50 ⁇ l samples of the respective dilutions are incubated with 50 ⁇ l of bovine factor Xa (13.6 U / ml) at 37 ° C for 80 seconds.
  • 50 ⁇ l of 1.1 mM chromogenic substrate S-2765 are added.
  • the absorbance at 405 nm is measured in a photometer.
  • the activity of the unlocked factor Xa is indicated by the emission of p-nitroaniline from the substrate.
  • the glycosamonoglycans exhibit a much lower factor Xa of inhibitory activity:
  • kits such as those supplied for example by the company Amersham Biosciences, kits RPN2617 and RPN 2620 were used respectively for the determination of the inhibitory activity of the enzymes MMP-2 and MMP-7.
  • the enzyme concentrations are 800 ng / ml for MMP-2 and 300 ng / ml for MMP-7, respectively.
  • the tests were carried out in accordance with the manufacturer's recommendations by carrying out a series of dilutions of the compound to be studied in a PBS pH 7.5 buffer.
  • the enzymes MMP-2 and MMP-7 were both inhibited in a concentration-dependent manner.
  • IC 50 0.6 ⁇ g / ml (effect on MMP-2) 0.04 ⁇ g / ml (effect on MMP-7)
  • a commercially available enzyme e.g., human neutrophil elastase, Sigma # E8140
  • a commercially available enzyme e.g., human neutrophil elastase, Sigma # E8140
  • the substrate solution is prepared by dissolving 118 mg of Methoxy-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p-nitroanilide in 1 ml of DMSO (stock solution, for example, Sigma No. M4765 ). For application in the analysis, 9 ⁇ l of stock solution are then diluted in 1.19 ml of H 2 0.
  • DMSO Methoxy-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p-nitroanilide
  • test compounds are prepared in 100 mM HEPES buffer containing 500 mM NaCl.
  • the analysis is carried out on colorless 96-well polystyrene microplates (for example, Corning Costar, no. 3695).
  • test enzyme solution 10 ⁇ l of test enzyme solution are mixed with 10 ⁇ l of the respective diluted compound solution and 10 ⁇ l of the substrate solution. After 15 min of incubation, the cleavage of the substrate is read as an increase in absorbance at 405 nm

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Abstract

La présente invention concerne les dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate de formule (I) : dans laquelle R1, R2, R3 ou R4 représentent H ou SO3M, n est un entier compris entre 0 et 150, M est un métal alcalin, isolés ou en mélanges, leurs diastéréoisomères, leur procédé de préparation, leurs applications à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les contenant.

Description

DERIVES CARBOXY-REDUITS DU DERMATAN SULFATE, LEUR PREPARATION, LEUR APPLICATION COMME MEDICAMENT ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES RENFERMANT
La présente invention concerne de nouveaux Glycosaminoglycanes ainsi que leurs sels d'addition pharmaceutique ent acceptables et plus précisemment des dérivés carboxy-réduits et chemiosélectivement O-sulfatés du Dermatan Sulfate, isolés ou en mélange, leur application à titre de médicament, et les compositions pharmaceutiques les contenant .
Les Glycoaminoglycanes (GAGs) sont essentiellement formés de motifs alternés acide uronique-sucre aminé (ou l'inverse), du type de ceux rencontrés dans les chaînes oligo ou polysaccharidiques de GAGs naturels biologiquement actifs comme l'héparine, l'heparane- sulfate, le dermatan-sulfate, les chondroitines, les chondroïtines sulfates ou l'acide Hyaluronique .
Les motifs acides uronique répondent plus spécialement à la structure acide D-glucoronique ou L-iduronique et les motifs sucres aminés à celle de la D-galactosamine.
Les GAGs naturels présentent des activités thérapeutiques en tant qu'inhibiteurs de la Thrombine. Ils présentent donc une activité antithrombotique et anticoagulante et sont utilisés .dans les pathologies cardiovasculaires dans lesquelles il y a un risque de thrombose.
Des dérivés O-persulfatés du Dermatan Sulfate ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés anticoagulantes dans la demande de brevet FR FR2584728.
Par ailleurs, des dérivés O-persulfatés du Dermatan Sulfate ont été décrits et étudiés pour leurs propriétés dans l'arthrite rhumatoide dans la demande internationale WO 9213541-A1.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé mettant en œuvre une étape de carboxy-réduction et une étape de sulfatation permettant d'obtenir de nouveaux dérivés carboxy-réduits et che ioselectivement O-sulfatés du Dermatan Sulfate présentant des propriétés avantageuses permettant de traiter ou de prévenir des désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice.
Les dérivés carboxy-réduits et chemioselectivement O- sulfatés du Dermatan Sulfate de formule (I) possèdent une structure polymérique très régulière avec des degrés de pureté de l'ordre de 90%. Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues.
Dans l'état pathologique de l'ostéoarthrose, la dégradation de l' aggrecan, le protëoglycane principal du cartilage articulaire, représente un événement très précoce et crucial . La perte pathologique de l' aggrecan est provoquée par des clivages protéolytiques dans son domaine interglobulaire. Les analyses de séquences d'acides aminés des métabolites de protéoglycanes isolés à partir du liquide synovial des patients souffrant de dommages articulaires, d'ostêoarthrose ou de désordre inflammatoire des articulations, ont montré qu'il existe un clivage protéolytique entre les acides aminés Glu373 et Ala374 dans le domaine interglobulaire de l' aggrecan humain (Lohmander, et al . , Arthritis Rheum. , 36 : 1214- 1222 (1993)). L'activité protéolytique responsable de ce clivage est dénommée "aggrécanase" et peut être attribuée à la superfamille des métalloprotéinases (MP) ou métalloprotéinases de matrice (MMP) . Le zinc est un élément essentiel dans le centre catalytiquement actif des métalloprotéinases. Les MMP clivent le collagène, la laminine, les protêoglycanes, l'élastine ou la gélatine dans des conditions physiologiques. Donc, elles jouent un rôle important dans le tissu osseux et conjonctif. Un grand nombre de différents inhibiteurs des MMP sont connus (voir, par exemple les demandes de brevet EP 0 606 046 ou W094/28889) . Toutefois, les inhibiteurs connus des MMP ont fréquemment un désavantage significatif. Ils manquent de spécificité pour toute classe particulière de MMP. Au contraire, la plupart des inhibiteurs de MMP inhibent simultanément une pluralité de MMP.
Par conséquent, il existe un besoin d'inhibiteurs de MMP ayant des spécificités plus étroitement définies afin de mieux traiter ou de prévenir des désordres spécifiques. L'invention a tout particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits et sulfatés du Dermatan Sulfate de formule (I) :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle Ri représente S03M, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent H ou S03M, étant entendu que l'un au moins des substituants R2, R3 et R4 représentent un groupement S03M, n est un entier compris entre 0 et 150, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastéréoisomères .
En particulier, l'invention a pour objet les dérivés carboxy-rêduits du Dermatan Sulfate selon la formule (I) caractérisé en ce que le M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium et en particulier Sodium.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R2 et R3 représentent S03Na et R4 représente H.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R2, R3 et R4 représentent S03Na.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R2 et R4 représentent S03Na et R3 représente H.
L'invention a plus particulièrement pour objet les dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate tels que décrits plus haut caractérisés en ce que R2 représente S03Na et R3 et
R4 représentent H.
Ces polysaccharides comportent ainsi un nombre pair de saccharides.
De manière générale, les mélanges de polysaccharides selon l'invention peuvent être préparés d'une part par carboxy-réduction du Dermatan sulfate ou de ses dérivés, suivie d'une sulfatation chemiosélective ou inversement par sulfatation suivie d'une carboxy-réduction.
L'invention a donc pour objet les dérivés carboxy-réduits et sulfatés du Dermatan Sulfate tels que définis plus haut mettant en oeuvre successivement les étapes suivantes : - Trans-salification du Dermatan Sulfate par un sel d'ammonium quaternaire, Sulfatation en milieu organique, suivie d'une salification, Carboxy-réduction du dérivé persulfaté - soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur , - soit b) par estérification, le dérivé persulfaté étant le cas échéant préalablement trans- salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action un agent réducteur Le cas échéant, trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resuifatation suivie d'une salification. Le schéma reactionnel suivant illustre la présente invention :
Figure imgf000008_0001
Sel de sodium
Figure imgf000008_0002
Soit
Figure imgf000008_0003
Soit
Figure imgf000008_0004
Figure imgf000008_0005
Le cas échéant, les dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate tels que définis plus haut peuvent être obtenus selon le procédé mettant en oeuvre les étapes sus décrites mais combinées dans un ordre inverse. Le procédé est alors le suivant : - Carboxy-réduction du Dermatan Sulfate sel de Sodium - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur, - soit b) par estérification, le Dermatan Sulfate sel de sodium étant le cas échéant préalablement trans- salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action un agent réducteur,
- Trans-salification du dérivé carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire,
- Sulfatation en milieu organique suivie d'une salification.
Le schéma reactionnel suivant illustre la présente invention : Soit
Figure imgf000009_0001
Dermatan sulfate selde sodium Soit
Figure imgf000009_0002
Dermatan sulfate selde sodium
Figure imgf000009_0003
Le procédé selon la présente invention est caractérisé par la forte chemiosélectivité des réactions de carboxy- réduction et de sulfatation. Les produits qui en résultent sont remarquablement homogènes et conduisent à des polymères vrais. Les dérivés du Dermatan Sulfate carboxy-réduit possèdent des puretés de l'ordre de 90 %. Cette homogénéité est déterminée par analyse structurale RMN et Infrarouge.
Il en résulte des propriétés biologiques reproductibles et inattendues .
Les réactions de persulfatation s'effectuent de préférence en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine . Elles sont suivies en général par une réaction de salification par exemple par action d'acétate de sodium.
Pour une chemiosélectivité optimale des réactions de persulfatation, il est préférable de mettre en oeuvre le sel de benzethonium du Dermatan Sulfate, carboxy-réduit ou non, en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater. De même, la réaction sera effectuée préférentiellement à des températures comprises entre -15 et 70°C. l'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de sulfatation du Dermatan Sulfate qui s'effectue à environ 0°C lorsqu'on désire obtenir les dérivés 6, 0- sulfatés du dermatan Sulfate ou à environ 60°C lorsqu'on désire obtenir les dérivés persulfatés du Dermatan Sulfate. Ceci est illustré respectivement aux exemples 4 et 5. Pour une chemiosélectivité optimale de la 6,6'-0 sulfatation du Dermatan sulfate carboxy-réduit, sel de benzethonium (Obtention des composés de formule (I) avec R2=R3 =S03Na et R4 = H à partir des Composés de formule (I) avec R2=R3=R4=H) , on opère préférentiellement en présence de 5 à 15 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5°C et en particulier à environ 0°C. Ceci est illustré à 1' exemple 2.
Lors de la persulfatation du sel de benzethonium du Dermatan carboxy-réduit (Obtention des composés de formule (I) avec R2=R3=R4=S03Na à partir des composés de formule (I) avec R2=R3= 4=H) , on opère de façon préférentielle entre 50 et 70°C. Ceci est illustré à l'exemple 3.
Par conséquent l'invention a également pour objet un procédé de sulfatation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit qui s'effectue à environ 0°C lorsqu'on désire obtenir les composés 6 , 6 ' O-sulfatés tels que définis plus haut (R2=R3=S03Na et R4=H) ou à environ 60°C lorsqu'on désire obtenir les composés persulfatës tels que définis plus haut (R2=R3=R4=S03Na) .
Lors de la deuxième sulfatation du dérivé persulfaté carboxy- réduit , sel de benzethonium (Composés de formule (I) avec R2=R4=S03Na et R3=H) , afin d'obtenir les composés de formule (I) avec (R2=R3=R4=S03Na) on opère préférentiellement en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures voisines de 0°C. Ceci est illustré à 1' exemple 6.
Par conséquent, l'invention a également pour objet le procédé tel que défini plus haut caractérisé en ce que la sulfatation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit transsalifié sulfaté (Composés de formule (I) avec R2=R4=S03Na et R3=H) s'effectue à environ 20°C lorsqu'on désire obtenir les composés persulfatés (Composés de formule (I)
Figure imgf000012_0001
De même, Pour une chemiosélectivité optimale de la 6'-0 sulfatation du Dermatan 6-0 sulfaté carboxy-réduit, sel de benzethonium (Composés de formule (I) avec R2=S03Na et R3=R4=H) afin d'obtenir les composés de formule (I) avec R2=R3=S03Na et R4=H, on opère préférentiellement en présence de 5 à 15 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique, à des températures comprises entre -15 et 5°C. Encore plus préférentiellement, on utilise environ 10 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique à une température voisine de -10°C . Ceci est illustré à l'exemple 7.
L'invention a donc pour objet le Procédé tel que défini plus haut caractérisé en ce que la 6'-0 sulfatation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit trans-salifié 6,0-sulfaté (composés de formule (I) avec R2=S03Na et R3=R4=H) s'effectue à environ -10°C lorsqu'on désire obtenir les composés 6, 6'0-sulfatés (composés de formule (I) avec R2=R3=S03Na et R4=H) .
La carboxy-réduction des dérivés du Dermatan Sulfate est réalisée en présence d'un dérivé carbodiimide. A titre d'exemple, on pourra utiliser le chlorhydrate de 1-éthyl- 3- (3-diméthylaminopropyl) -carbodiimide.
Par dérivés du Dermatan Sulfate, on entend les dérivés sulfatés du Dermatan sulfate, le sel de benzethonium du
Dermatan Sulfate, les dérivés persulfatés sels de benzethonium du Dermatan Sulfate ainsi que le Dermatan Sulfate sel de sodium. La réduction proprement dite est réalisée avec un borohydrure de métal alcalin. A titre d'exemple, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée avec le borohydrure de sodium.
La réaction de formation de l'adduit avec le dérivé carbodiimide met préférentiellement en présence 5 à 20 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4 et 5.
Encore plus préférentiellement, la réaction avec le dérivé carbodiimide est réalisée en présence de 7 à 13 équivalents de réactif et à un pH compris entre 4,3 et 4,9.
La réduction proprement dite de l'adduit activé des dérivés du Dermatan Sulfate est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70°C. Plus préférentiellement, la réduction de l'adduit sus mentionné est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 30°C.
Selon un autre mode de la présente invention, la carboxy- reduction peut être réalisée par réduction d'un ester des dérivés du Dermatan Sulfate. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser un dérivé ester méthylique.
On estérifie les dérivés du Dermatan Sulfate préalablement salifié sous forme de sel de benzethonium, par les méthodes classiques d'esterification connues de l'homme du métier en mettant en œuvre un halogënure d'alkyle renfermant de 1 à 6 atomes de carbone tel que tel que l'iodure de méthyle ou un halogénure d'arylalkyle tel que le chlorure de benzyle en milieu organique. L'estërification proprement dite du Dermatan sulfate, sel de benzethonium est réalisée en milieu organique en présence par exemple d'iodure de éthyle. De façon préférentielle, l'estërification est réalisée dans le dichlorométhane en présence de 2 à 20 équivalents d'iodure de méthyle et a une température voisine de 20°C.
En particulier, l'estérification est réalisée dans le dichlorométhane en présence de 4 à 10 équivalents d'iodure de méthyle pendant environ 3 jours à une température voisine de 20°C.
De même, la réduction de l'ester mêthylique du dérivé du Dermatan Sulfate sel de benzethonium est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 70°C. A titre d'exemple, la réduction de l'ester mêthylique est réalisée avec le borohydrure de sodium.
Plus préférentiellement, la réduction de l'ester mêthylique est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température voisine de 20°C.
En particulier, l'invention a pour objet le procédé suivant :
- Trans-salification du Dermatan Sulfate par le chlorure de Benzethonium
- Sulfatation du sel de benzethonium du Dermatan Sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la trimethylamine suivie d'une salification avec l'acétate de sodium. - Soit Carboxy-réduction au moyen du chlorhydrate de 1- (3-diméthyl aminopropyl) -3-ëthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium, - soit estërification par action du iodure de méthyle sur le dérivé Dermatan Sulfate préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzethonium puis réduction du dérivé ester mêthylique par le borohydrure de sodium, puis le cas échéant trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par le chlorure de Benzethonium, puis resulfatation par le complexe d'anhydride sulfurique - pyridine suivies d'une salification par l'acétate de sodium.
De manière alternative, l'invention a également pour objet le procédé tel que défini précédemment mettant en oeuvre les étapes suivantes : soit Carboxy-réduction du Dermatan sulfate sel de sodium au moyen du chlorhydrate de 1- (3-dimëthyl aminopropyl) -3-éthylcarbodiimide en présence de borohydrure de sodium,
- soit estërification par action du iodure de méthyle sur le dérivé Dermatan Sulfate préalablement trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire puis réduction du dérivé ester mêthylique par le borohydrure de sodium, puis trans-salification du dérivé carboxy-réduit par le chlorure de Benzethonium sulfatation par le complexe anhydride sulfurique - pyridine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
Au cas où l'on désire obtenir des dérivés isolés à partir du mélange de dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate tels qu'obtenus selon le procédé décrit plus haut, le procédé suivant doit ensuite être appliqué au mélange :
- Fractionnement du mélange par chromatographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide. Le mélange est élue par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium.
De préférence, la solution d'hydrogénocarbonate de sodium est une solution de 0,1 à 1 mole/1. Encore plus préférentiellement, la séparation est réalisée à une concentration de 1 mole/1. La détection est réalisée par rêfracto etrie .
L'invention a également pour objet les dérivés carboxy- réduits et chemioselectivement O-sulfatés du Dermatan Sulfate, isolés ou en mélange tels que définis plus haut susceptibles d'être obtenus selon le ou les procédés tels que définis précédemment.
Les polysaccharides de formule (I) , isolés ou en mélanges sont utilisables à titre de médicaments.
Ces polysaccharides présentent en particulier une forte activité inhibitrice de certaines métalloproteases de matrice. Ces inhibiteurs sont particulièrement indiqués pour le traitement d'états pathologiques où une forte augmentation de l'activité des métalloprotéinases de matrice est constatée.
Les états pathologiques auxquels la présente invention fait référence implique une augmentation de l'activité d'au moins une des métalloprotéinases de matrice suivante : la matrisilyne (MMP-7) , la neutrophile elastase, l' aggrecanase, l'hADAMTSl et la gélatinase A (MMP-2) .
Les composés peuvent donc être utilisés, pour la prévention et le traitement de maladies telles que les désordres joint dégénérâtifs (tels que l'ostéoarthrose) , les spondyloses, les chondrolyse associéees avec les joint Trau a ou les immobilisations prolongées jointes (souvent suite à une blessure du ménisque ou patellar ou les ruptures de ligaments) , les désordres liés à des blessures (healing) , les désordres periodontique, les désordres chronique du système locomoteur ( tels que arthritides chronique ou aiguës inflammatoires, immunologique ou du métabolisme) , les arthropathies, myalgas ou les désordres liés au métabolisme osseux.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) isolés ou en mélange ainsi qu'un ou plusieurs excipients, véhicule ou additifs pharmaceutiquement acceptable.
Un autre aspect de l'invention est un procédé de préparation des compositions pharmaceutiques renfermant les composés de formule (I) caractérisés en ce qu'on mélange une quantité correspondant à un dosage désiré d'un composé de formule (I) avec un ou plusieurs excipients, véhicule ou additifs pharmaceutiquement acceptable.
Les composés de formule (I) peuvent être administrés par différente voie. Elles peuvent inclure sans être limité aux injections par voie subcutanée, intraarticulaire, intrapéritonêe ou intraveineuse.
L'administration peut également être rectale, orale, par inhalation, ou encore par voie transdermique.
Dans le cas de solutions pour injection (par exemple sous forme d'ampoule), les doses peuvent s'échelonner de 5 μg à environ 200 mg de composé de formule (I) et de préférence de 10 μg à 40 mg.
Le dosage quotidien indiqué pour le traitement d'un patient adulte d'environ 70 Kg est de 10 μg à 500 mg d' ingrédients actifs généralement de 20 mg à environ 100 mg. Cependant selon les circonstances des doses quotidiennes plus hautes ou plus basses peuvent être appropriées .
Ces doses peuvent être administrées une fois par jour sous la forme d'une seule unité de dosage.
Alternativement, les doses peuvent être administrées dans une pluralité de doses plus petites données de manière répétées à des intervalles définis au cours du temps .
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Dermatan Sulfate
Le Dermatan Sulfate utilisé pour la préparation des composés illustrant cette invention présente une masse moléculaire de 30 à 40 K Daltons. Il est isolé lors de la préparation d'héparine de mucus de porc. A partir des eaux-mères de précipitation de l'héparine brute, on peut isoler un mélange d'héparinoides / dermatan sulfate. Pour obtenir du dermatan sulfate pur, on peut par exemple utiliser les conditions suivantes :
On prépare une solution de 13 g de mélange héparinoides / Dermatan (contenant environ 50 % de Dermatan) dans 130 ml d'eau. Le pH est ensuite ajusté à pH 3 avec de l'acide acétique concentré puis on ajoute 0,9g de nitrite de sodium à une température voisine de 20°C. Après 18 heures d'agitation, le milieu reactionnel est refroidi à une température voisine de 0°C, puis neutralisé à pH 7 avec de la soude concentrée (7,5 N) . On ajuste le milieu reactionnel à une teneur de 10% en chlorure de sodium puis on ajoute un volume de mëthanol (soit environ 130 ml) . Le précipité obtenu est filtré, lavé par 5 ml de mêthanol, puis séché pour fournir 4,8 g d'un solide blanc cassé. Le rendement obtenu est de 73 %.
Exemple 1 : Préparation du Dermatan Sulfate carboxy- rêduit, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R2 ≈ R3 ≈ Ri
≈ H)
Figure imgf000019_0001
A une température voisine de 20°C, on prépare une solution de 1 g de Dermatan Sulfate, sel de sodium dans 150 ml d'eau. Le pH est ajusté à pH 4,7 ± 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1N. On ajoute 3,6 g de chlorhydrate de l-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 + 0,1. Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute alors par petites portions 14,7g de borohydrure de sodium. Le milieu reactionnel est agité environ 20 heures à une température voisine de 20°C. Après refroidissement à une température voisine de 15°C, le milieu reactionnel est neutralisé par de l'acide chlorhydrique concentré à un pH voisin de 7. Le milieu reactionnel est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant environ 48 heures (le quatrième bain est réalisé avec une solution de chlorure de sodium 2N. Les trois derniers bains sont réalisées à l'eau desionisée) . Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,8 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 92 %. Spectre proton dans D20, 400MHz, T=323 K (δ en ppm - Mélange des épimérisés en C5) : 2,0 (3H, s), 3,5 (1H, m), 3,6 (2H, s), entre 3,67 et 3,8 (5H, m), 3,94 (1H, t, J=6Hz) , 3,98 (1H, d, J=6Hz) , 4,32 (1H, s) , 4,54 (1H, d, J=5Hz) , 4,7 (1H, s), 4,76 (1H, s).
EXEMPLE 2 : Préparation du Dermatan Sulfate carbox - reduit 6, 6 ' -O sulfaté, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R2 = R3 = S03Na et R4 ≈ H)
Figure imgf000020_0001
- a) Préparation du dermatan sulfate carboxy-réduit, sel de sodium
Le Dermatan Sulfate carboxy-réduit, sel de sodium est préparé selon l' exemple 1.
- b) Préparation du dermatan sulfate carboxy-réduit, sel de benzethonium
A une solution de 0,4 g de Dermatan Sulfate carboxy- réduit, sel de sodium dans 6 ml d'eau, on ajoute une solution de 1 g de chlorure de benzethonium dans 7 ml d'eau. La suspension blanche est filtrée. Le gâteau est lavé avec 3 portions de 15 ml d'eau, puis séché à environ 40°C sous pression réduite (6 kPa) . On obtient 0,73 g d'un solide jaunâtre translucide. Le rendement obtenu est quantitatif.
- c) Préparation Dermatan Sulfate carboxy-réduit 6,6' -O sulfaté, sel de sodium A une température voisine de 20°C et sous atmosphère inerte, on dissout 0,73 g de Dermatan Sulfate carboxy- réduit, sel de benzethonium dans 20 ml de diméthylformamide anhydre. La solution obtenue est refroidie à environ 0°C puis on coule une solution de 1,23 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 10 ml de diméthylformamide anhydre. Après 1 heure 30 d'agitation à une température voisine de 0°C, on ajoute 15 ml d'eau au milieu reactionnel. On coule ensuite 150 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension obtenue est filtrée puis le gâteau est lavé avec 10 ml de méthanol . Le solide obtenu est dissous dans 50 ml d'eau puis re-prëcipitê avec 150 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée puis le gâteau est lavé avec 10 ml de méthanol. Le solide blanc obtenu est dissous dans 10 ml d'eau puis la solution est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 55 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 10 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K, δ en ppm: 2,0 (3H, s), 3,49 (1H, m), 3,8 (1H, m), entre 3,9 et 4,25 (8H, m), 4,45 (1H, m), 4,57 (1H, s large), 4,75 (1H, s), 4, 4,80 (1H, s) .
EXEMPLE 3 : Préparation du Dermatan Sulfate carboxy- réduit et persulfaté, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R2 = R3 = R4 = S03Na)
Figure imgf000022_0001
- a) Préparation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit, sel de sodium
Le dermatan sulfate carboxy-réduit, sel de sodium est préparé selon l'exemple 1.
- b) Préparation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit, sel de benzethonium
Le Dermatan Sulfate carboxy-réduit, sel de benzethonium est préparé selon l'exemple 2b.
- c) Préparation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit et persulfaté, sel de sodium
A une température voisine de 60°C et sous atmosphère inerte, on dissout 0,24 g de Dermatan Sulfate carboxy- réduit, sel de benzethonium dans 5 ml de diméthylformamide anhydre. Lorsque la dissolution est complète, on coule une solution de 2,94 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 12 ml de diméthylformamide anhydre. Le mélange est agité 2 heures 30 à une température voisine de 60°C, puis refroidit à une température voisine de 10 °C. On ajoute 6 ml d'eau au milieu reactionnel, puis 60 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension obtenue est laissée à sëdimenter une nuit, puis filtrée. Le gâteau est dissous dans 20 ml d'eau puis re-précipitê avec 60 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée. Le gâteau est dissous de nouveau dans 50 ml d'eau puis la solution est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 83 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 30 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=313 K, δ en ppm : 2,0 (3H, s), entre 3,8 et 3,98 (4H, m), 4,03 (2H, m), 4,13 (1H, m), 4,18 (1H, m), 4,3 (1H, m), 4,6 (1H, s large),
4,68 (1H, m), 4,8 (2H, m), 5,04 (1H, s).
EXEMPLE 4 ; Préparation du Dermatan Sulfate persulfaté carboxy-réduit, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R2 = R4 = S03Na et R3 ≈ H)
Transalification Chlorure de Benzethonium
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0003
Figure imgf000023_0004
- a) Préparation du Dermatan Sulfate, sel de benzethonium
A une solution de 5 g de dermatan sulfate, sel de sodium dans 75 ml d'eau, on ajoute une solution de 11,6 g de chlorure de benzethonium dans 85 ml d'eau . La suspension blanche est filtrée. Le gâteau est lavé avec 6 portions de 150 ml d'eau, puis séché à 60°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 72 h. On obtient 12 g d'un solide crème . Le rendement obtenu est de 94 % .
- b) Préparation du Dermatan Sulfate persulfaté, sel de sodium
A une température voisine de 60°C et sous atmosphère inerte, on dissout 4 g de Dermatan Sulfate, sel de benzethonium dans 80 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution, on coule en environ 45 minutes une solution de 22,35 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 200 ml de diméthylformamide anhydre. Après l heure 30 d'agitation, le milieu reactionnel est refroidi à une température voisine de 15°C puis on ajoute 50 ml d'eau. L'addition terminée, on ajoute 990 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée. Le solide obtenu est dissout dans 200 ml d'eau puis re-précipitë avec 600 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée puis le solide blanc obtenu est dissout dans 200 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 48 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 1,31 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 51,8 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=303 K, δ en ppm : 2,02 (3H, s), 3,98 (3H, m), 4,21 (3H, m), 4,3 (1H, m), 4,67 (1H, m), 4,81 (1H, S), 4,9 (2H, m), 5,15 (1H, s) .
- c) Préparation du dermatan sulfate persulfaté carboxy- réduit, sel de sodium
A une température voisine de 20°C, on prépare une solution de 1,22g de dermatan persulfaté sel de sodium dans 190 ml d'eau. Le pH est ajusté à pH 4,7 ± 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1N. On ajoute 2,72 g de chlorhydrate de l-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 ± 0,1. Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute alors par petites portions 11,1 g de borohydrure de sodium. Le milieu reactionnel est agité environ 20 heures à une température voisine de 20°C. Après refroidissement à une température voisine 4°C, le milieu reactionnel est neutralisé à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique concentré (10 N) . La suspension blanche est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 20 heures. On ajoute au contenu des membranes (400 ml) 1,2 1 d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée puis le gâteau est lavé avec 3 portions de 100 ml de méthanol. Le solide blanc obtenu est dissous dans l'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 72 heures . Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,464 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 39 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=333 K, δ en ppm : 2,0 (3H, s), 3,59 (2H, d, J=4Hz) , 3,8 (1H, s), entre 3,85 et
4,02 (3H, m), 4,18 (2H, m), 4,27 (1H, m), 4,55 (1H, s),
4,65 (1H, S large), 4,8 (1H, s), 4,88 (1H, S), 5,05 (1H, S).
EXEMPLE 5 : Préparation du Dermatan Sulfate 6-0 sulfaté carboxy-réduit, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R2 ≈ S03Na et R3 = R4 = H)
Transalification Chlorure de Benzethonium
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000026_0001
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Figure imgf000026_0004
Figure imgf000026_0005
- a) Préparation du Dermatan Sulfate, sel de benzethonium
Le sel de benzethonium du dermatan sulfate utilisé dans cet exemple est commun à celui de l'exemple 4 a) .
- b) Préparation du Dermatan Sulfate 6-0 sulfaté, sel de sodium
A une température voisine de 20°C et sous atmosphère inerte, on dissout 4 g de dermatan sulfate, sel de benzethonium dans 80 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution, on refroidit à une température voisine de 0°C et on ajoute une solution de 4,4 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 40 ml de diméthylformamide anhydre. Après 2 heures 30 d'agitation à une température voisine de 0°C, on ajoute au milieu reactionnel 60 ml d'eau. L'addition terminée, on ajoute 600 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée et le gâteau est lavé avec 30 ml de méthanol. Le solide obtenu est dissous dans 200 ml d'eau puis est précipité avec 600 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. Après environ 16 h de sédimentation, le mélange est filtré et le gâteau est lavé avec 20 ml de méthanol. Le solide blanc obtenu est dissous dans 150 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. La solution dialysée est ensuite lyophilisée. On obtient 0,9 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 47 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=328 K, δ en ppm : 2,0 (3H, s), 3,48 (1H, m), entre 3,85 et 4,1 (5H, m), 4,18 (2H, m), 4,65 (3H, m), 4,8 (1H, s).
- c) Préparation du Dermatan Sulfate 6-0 sulfaté carboxy -réduit, sel de sodium
A une température voisine de 20°C, on prépare une solution de 0,8 g de dermatan sulfate 6-0 sulfaté, sel de sodium dans 75 ml d'eau. Le pH est ajusté à pH 4,7 ± 0,1 avec une solution d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute 2,4 g de chlorhydrate de l-éthyl-3- (3- diméthylaminopropyl) carbodiimide puis on agite en maintenant le pH à 4,7 ± 0,1.
Lorsque le pH n'évolue plus, on ajoute par petites portions 9,7 g de borohydrure de sodium. Le milieu reactionnel est agité environ 20 heures à une température voisine de 20°C. Après refroidissement à une température voisine de 15°C, le milieu reactionnel est neutralisé à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique concentré (10 N) . Le mélange reactionnel est chargé dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mis en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. On ajoute au contenu des membranes (300 ml) 900 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée et le gâteau est dissous dans 50 ml d'eau. La solution ainsi préparée est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 50 heures. Le contenu des membranes est ensuite lyophilisé. On obtient 0,54 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 72 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=328 K, δ en ppm : 2,0 (3H, S), 3,5 (1H, m), 3,55 (2H, s), 3,7 (1H, s) , 3,76 (1H, s), entre 3,87 et 4,05 (3H, m), entre 4,07 et 4,21 (2H, m), 4,3 (1H, m), 4,55 (1H, s large), 4,72 (2H, m).
EXEMPLE 6 : Préparation du Dermatan Sulfate carboxy- réduit et persulfaté, sel de sodium (Composés de formule (I) avec les groupements R2 = R3 = R4 = S03Na)
Figure imgf000028_0001
Le dérivé du Dermatan illustrant cet exemple peut être préparé à partir du Dermatan Sulfate persulfaté carboxy réduit, sel de sodium issu de l'exemple 4. - a) Préparation du Dermatan Sulfate persulfaté carboxy- réduit, sel de benzethonium.
A une solution de 0,28 g de dermatan sulfate persulfaté carboxy-réduit, sel de sodium dans 10 ml d'eau, on ajoute une solution de 0,65 g de chlorure de benzethonium dans 10 ml d'eau. La suspension blanche est filtrée. Le gâteau est lavé avec 5 portions de 40 ml d'eau, puis séché à 60°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 48 heures. On obtient 0,685 g d'un solide crème. Le rendement obtenu est de 81 %. b) Préparation du dermatan sulfate carboxy-réduit et persulfaté, sel de sodium
A une température voisine de 20°C et sous atmosphère inerte, on dissout 0,685 g de dermatan sulfate persulfaté carboxy-réduit, sel de benzethonium dans 8 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution, on ajoute une solution de 0,936 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 4 ml de diméthylformamide anhydre. Après 2 heures 30 d'agitation à une température voisine de 20°C, le milieu reactionnel est refroidi à une température voisine de 10°C puis on ajoute 6 ml d'eau. L'addition terminée, on ajoute 120 ml d'une solution à 10% d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension est filtrée et le gâteau est lavé avec 5 ml de méthanol. Le solide obtenu est dissous dans 40 ml d'eau puis est précipité avec 120 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée et le solide blanc obtenu est dissous dans 20 ml d'eau. La solution obtenue est filtrée sur membrane 0,2 μm puis chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 1000 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,128 g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 50 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=313 K, δ en ppm : 2,0 (3H, s), entre 3,8 et 3,98 (4H, m), 4,03 (2H, m), 4,13 (1H, m) , 4,18 (1H, m) , 4,3 (1H, m) , 4,6 (1H, s large) , 4,68 (1H, m) , 4,8 (2H, m) , 5,04 (1H, s) .
EXEMPLE 7 : Préparation du Dermatan Sulfate carboxy réduit 6,6' -O sulfaté, sel de sodium
(Composés de formule (I) avec les groupements R2 = R3 = S03Na et R4 = H)
Figure imgf000030_0001
Le dermatan sulfate carboxy-réduit 6-0 sulfaté, sel de sodium utilisé pour cette préparation est issu de 1' exemple 5.
- a) Préparation du dermatan sulfate carboxy-réduit 6-0 sulfaté, sel de benzethonium
A une solution de 0,35 g de dermatan sulfate carboxy- réduit 6-0 sulfaté, sel de sodium dans 10 ml d'eau, on ajoute une solution de 0,552 g de chlorure de benzethonium dans 10 ml d'eau. La suspension blanche est filtrée. Le gâteau est lavé avec 6 portions de 10 ml d'eau, puis séché à température ambiante sous pression réduite (6 kPa) et sur potasse pendant environ 48 heures. On obtient 0,7 g d'un solide crème. Le rendement obtenu est de 84 %. b) Préparation du dermatan sulfate carboxy-réduit 6, 6'-0 sulfaté, sel de sodium A une température voisine de 20°C et sous atmosphère inerte, on dissout 0,7 g de dermatan sulfate 6-0 sulfaté carboxy-réduit, sel de benzethonium dans 11 ml de diméthylformamide anhydre. Après dissolution, on ajoute une solution de 0,745 g de complexe pyridine - anhydride sulfurique dans 5,5 ml de diméthylformamide anhydre, à une température voisine de -10°C. Le milieu reactionnel est agité 2 heures 30 à une température voisine de -10°C. On ajoute 7 ml d'eau. L'addition terminée, on ajoute 90 ml d'une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol. La suspension est filtrée et le gâteau est lavé avec 10 ml de méthanol. Le solide obtenu est dissous dans 30 ml d'eau puis est précipité avec 90 ml d'une solution méthanolique à 10 % d'acétate de sodium. La suspension est filtrée et le solide blanc obtenu est lavé par 5 ml de méthanol, puis dissous dans 10 ml d'eau. La solution obtenue est chargée dans une membrane en ester de cellulose PM 3500 et mise en dialyse en changeant les bains d'eau régulièrement pendant 24 heures. Le contenu des membranes est lyophilisé. On obtient 0,252g d'un lyophilisât blanc. Le rendement obtenu est de 72 %.
Spectre proton dans D20, 400MHz, T=323 K, δ en ppm : 2,0 (3H, s), 3,49 (1H, m), 3,8 (1H, m), entre 3,9 et 4,25 (8H, m), 4,45 (1H, m), 4,57 (1H, s large), 4,75 (1H, s), 4, 4,80 (1H, s) .
Test pharmacologique
Effet des dérivés carboxy-réduits selon l'invention sur l'Aggrecanase des fluides synoviaux ou sur des préparations de protéine recombinante ADAMTS.
L'analyse est effectuée sur des plaques 96-puits. Avant l'analyse, des dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans une solution aqueuse Digestion :
Dans chaque puits, un volume fixe de fluide synovial ou d'activité aggrecanase générant une augmentation connue, entre 1,0 et 1,4 unités d'absorbance (405 nm) dans les conditions de l'analyse est mélangé avec 3 μl de solution de composé de l'étape de dilution respective. Le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) est ajouté à chaque puits pour fournir un volume final de 300 μl . Ensuite, la plaque est incubée 1 heure à 37°C dans une atmosphère de dioxyde de carbone.
Après un ajout de 5 μl d'une solution de 1 μg/μl de substrat recombinant Agglmut dans le DMEM à chaque puits (substrat tel que décrit par Bartnik E. et al., EP 785274, 1997) , le mélange réactif est incubé pendant 4 heures à 37°C sous atmosphère de dioxyde de carbone.
Préparation de la plaque d'analyse :
Lors d'une première étape, la microplaque est enduite au moyen de 100 μl par puits d'un anticorps anti-souris de chèvre IgG du commerce pendant 1 heure à température ambiante (5 μg/ml dans une solution saline de phosphate tamponnée pH 7,4 [Tampon PBS] ) . Après lavage avec le tampon PBS contenant 0,1 % de T een-20 (tampon de lavage) , les puits sont bloqués par une étape d'une heure d'incubation au moyen de 100 μl par puits de 5 % de sérum d'albumine bovin dans un tampon PBS contenant 0,05 % de T een-20. A la suite d'un autre rinçage au moyen du tampon de lavage, chaque puits est incubé avec 100 μl d'une solution diluée à 1:1000 d'anticorps BC-3 dans un tampon PBS contenant 0,05 % de T een 20 et 0,5 % d'albumine de sérum bovin à température ambiante pendant une heure. Cet anticorps reconnaît les fragments de clivage typiques de l' aggrecanase (Hughes CE. et al., Biochem. J. 305 (3), 799-804, 1995).
Mode Opératoire du test : Après un autre rinçage de la plaque d'analyse avec le tampon de lavage, le jeu complet des mélanges provenant de la digestion précédente est transféré puits par puits vers cette plaque et incubé à température ambiante pendant une heure. La plaque est à nouveau lavée tel que ci-dessus. Ensuite, 100 μl du second anticorps (anticorps anti-humain IgG, marqué à la peroxydase, 1:1000 dans du PBS contenant 0,5 % de ASB et 0,05 % de Tween-20) sont ajoutés à chaque puits, avec une incubation ultérieure à température ambiante pendant à nouveau une heure. A la suite d'un rinçage final avec le tampon de lavage, le développement de la couleur est initié par ajout de 100 μl de solution de substrat ABTS (2mg/ml, 2,2' -azinobis (3 ethylbenzthiazoline sulfonic acid dans 40 mM de citrate de sodium plus 60 mM d'hydrogenophosphate disodique, ajusté à un pH 4,4 par ajout d'acide acétique ; 0,25 μl de peroxyde d'hydrogène à 35 % ajouté par ml immédiatement avant la mesure) . La mesure est effectuée au moyen du mode de tamis à l'aide d'une détection à 405 nm par rapport à un filtre de référence (620 nm) avec des lectures automatiques à des intervalles de 5 secondes. Le développement est arrêté dès que le signal maximum (405 nm) dans la gamme d'absorbance de 1,0 à 1,4 est atteint. Tableau 1
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
L' IC50 estimée du produit de l'exemple 1 (dérivé uniquement carboxy-réduit) est de l'ordre de 7.9 μg/ml Effet du dérivé persulfaté carboxy-réduit (exemple 3) sur l' aggrecanase de chondrocytes bovins cultivés dans des billes d'Alginate
Afin de générer une activité de l' aggrecanase, les chondrocytes bovins mis en culture dans des gels de matrice d'alginate sont stimulés avec 10 ng/ml de IL-lα pendant 3 jours conformément au procédé de Hughes CE. et al., J. Biol. Chem. 273, 30576-30582, 1998. Dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire 96 puits, 200 μl de surnageant chondrocyte contenant une activité de l' aggrecanase sont mélangés avec 100 μl de milieu de culture cellulaire DMEM. Aux concentrations à tester, 5 μl d'une solution aqueuse du produit de l'exemple 2 est ajouté pour inhiber l'activité de l' aggrecanase, une heure avant l'ajout de 5 μg de substrat recombinant Agglmut (Bartnik E. et al., EP 785274, 1997) . Le mélange est incubé à 37°C pendant 17 heures et ensuite transféré dans une plaque ELISA afin de détecter les néoëpitopes générés par l'activité de 1' aggrecanase en liant de l'anticorps BC-3 tel que décrit auparavant (Hughes CE. et al., Biochem. J. 305 (3), 799- 804, 1995) . Tableau 2 (% d'inhibition de la conversion du substrat par activité de l'aggrecanase dans le surnageant)
Figure imgf000035_0001
IC5o : 0,0059 g/ml Inhibition du facteur Xa Pour la calibration, un échantillon standard d'héparine de bas poids moléculaire (Enoxaparin) a été utilisé comme référence
Les dilutions sérielles du composé de l'essai sont préparées dans un tampon de 0,046 M Tris pH 8,4 contenant 0,15 M NaCl, 0,007 M EDTA, 0,1% de Tween 80 et 0,12 Iϋ/ml d'antithrombine humaine III. Les échantillons de 50 μl des dilutions respectives sont incubés avec 50 μl de facteur bovin Xa (13,6 U/ml) à 37°C pendant 80 secondes. Ensuite, 50 μl de substrat chromogënique 1,1 mM S-2765 sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm est mesurée dans un photomètre. L'activité du facteur débloqué Xa est indiquée par l'émission de p-nitroaniline à partir du substrat . Lorsque comparés au composé d'héparine de bas poids moléculaire de référence (100 U/mg) , les glycosamonoglycanes présentent un facteur Xa d'activité inhibitrice bien inférieur :
Figure imgf000036_0001
Effet du dérivé persulfaté carboxy-réduit (exemple 3) des métalloproteases humaines MMP-2 (gelatinase-A) et MMP7
Des Kit ELISA commerciaux (comme ceux fournis par exemple par la société Amersham Biosciences, kits RPN2617 and RPN 2620) ont été respectivement utilisés pour la détermination de l'activité inhibitrice des enzymes MMP-2 et MMP-7. Les concentrations des enzymes sont respectivement de 800 ng/ml pour MMP-2 et 300 ng/ml pour MMP-7. Les tests ont été réalisés en accord avec les recommandations du fabricant en réalisant une série de dilutions du composé à étudier dans un tampon PBS pH 7.5. Les enzymes MMP-2 et MMP-7 ont été toutes deux inhibées de façon concentration -dépendante.
Dérivé obtenu selon l'exemple 3
IC50 : 0.6 μg/ml (effect on MMP-2) 0.04 μg/ml (effect on MMP-7)
Effets des dérivés carboxy-réduits selon l'invention sur l'Elastase de Neutrophiles humains
Une enzyme disponible dans le commerce (par exemple, de l'élastase neutrophile humaine, Sigma n° E8140) est reconstituée en aliquots de 0,1 mg par fiole à l'aide de 0,276 ml de tampon d'acétate de sodium à 50 mM pH 5,5 contenant 200 mM NaCl (solution mère de l'enzyme) ; 11 μl de cette solution mère sont dilués avec 1,1 ml du tampon HEPES ci-dessus (solution d'essai de l'enzyme) .
La solution de substrat est préparée en dissolvant 118 mg de Methoxy-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-p- nitroanilide dans 1 ml de DMSO (solution mère, par exemple, Sigma n° M4765) . En vue de l'application dans l'analyse, 9 μl de solution mère sont ensuite dilués dans 1,19 ml d'H20.
Les dilutions sérielles des composés de l'essai sont préparées dans 100 mM de tampon HEPES contenant 500 mM NaCl. L'analyse est effectuée sur des microplaques en polystyrène 96 puits incolores (par exemple, Corning Costar, n° 3695) .
10 μl de solution d'enzyme d'essai sont mélangés avec 10 μl de la solution respective de composé dilué et 10 μl de la solution de substrat. Au bout de 15 min d'incubation, le clivage du substrat est lu en tant qu'augmentation de l'absorbance à 405 nm
Tableau 4 Activité d'inhibition de l'élastase de neutrophile humain
Figure imgf000037_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivés carboxy-réduits et chemioselectivement O- sulfatés du Dermatan Sulfate, isolés ou en mélange, ainsi que leurs sels .
2. Dérivés carboxy-réduits et sulfatés du Dermatan Sulfate selon la revendication 1 de formule (I) :
Figure imgf000038_0001
dans laquelle Rx représente S03M, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent H ou S03M, étant entendu que l'un au moins des substituants R2/ R3 et R4 représentent un groupement S03M, n est un entier compris entre 0 et 150, M est un métal alcalin, les dits dérivés étant sous la forme d'un composé isolé ou sous forme de mélanges, ainsi que leurs diastéréoisomères .
3. Dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le M est choisi parmi sodium, calcium, magnésium et potassium.
4. Dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que M est un atome de sodium.
5. Dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisés en ce que R2 et R3 représentent S03Na et R4 représente H.
6. Dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisés en ce que R2, R3 et R4 représentent S03Na.
7. Dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisés en ce que R2 et R4 représentent S03Na et R3 représente H.
8. Dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisés en ce que R2 représente S03Na et R3 et R4 représentent H.
9. Procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on met en œuvre successivement les étapes suivantes :
- trans-salification du Dermatan Sulfate par un sel d'ammonium quaternaire, Sulfatation en milieu organique, suivie d'une salification, Carboxyréduction du Dermatan Sulfate persulfaté - soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide (pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur , - soit b) par estërification, le dérivé persulfaté étant le cas échéant préalablement trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action un agent réducteur Le cas échéant, trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire puis resuifatation suivie d'une salification.
10. Procédé de préparation des dérivés carboxy-réduits du Dermatan Sulfate selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on met en œuvre successivement les étapes suivantes :
- Carboxyréduction du Dermatan Sulfate sel de sodium, - Soit a) au moyen d'un dérivé de carbodiimide ( pour former un adduit activé) et en présence d'un agent réducteur , - soit b) par estërification, le Dermatan Sulfate sel de sodium étant le cas échéant préalablement trans- salifié par un sel d'ammonium quaternaire, suivie d'une réduction du dérivé ester correspondant par action un agent réducteur
- Trans-salification du dérivé carboxy-réduit par un sel d'ammonium quaternaire, Sulfatation en milieu organique suivie d'une salification.
11. Procédé selon les revendications 9 et 10 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine .
12. Procédé selon les revendications 9 à 11 caractérisé en ce que la sulfatation s'effectue à partir d'un sel de benzethonium, en présence de 10 à 30 équivalents de complexe pyridine - anhydride sulfurique par fonction hydroxyle à sulfater, et à une température comprise entre -15 et 70 °C
13. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la sulfatation du Dermatan Sulfate trans-salifié s'effectue à environ 0°C lorsqu'on désire obtenir les composés 6,0-sulfatés du Dermatan Sulfate ou à environ 60°C lorsqu'on désire obtenir les composés persulfatés du Dermatan Sulfate.
14. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la sulfatation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit trans-salifié s'effectue à environ 0°C lorsqu'on désire obtenir les composés 6,6' O-sulfatês tels que définis à la revendication 5 (R2=R3=S03Na et R4=H) ou à environ 60°C lorsqu'on désire obtenir les composés persulfatés tels que définis à la revendication 6 (R2=R3=R4=S03Na) .
15. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la (re) sulfatation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit trans-salifié sulfaté (Composés de formule (I) avec R2=R4=S03Na et R3=H) tels que définis à la revendication 7 s'effectue à environ 20°C lorsqu'on désire obtenir les composés persulfatés (Composés de formule (I) avec R2=R3=R4=S03Na) tels que définis à la revendication 6.
16. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la (re) sulfatation du Dermatan Sulfate carboxy-réduit trans-salifié 6,0-sulfaté (composés de formule (I) avec R2=S03Na et R3=R4=H) s'effectue à environ -10°C lorsqu'on désire obtenir les composés 6, 6'0-sulfatés (composés de formule (I) avec R2=R3=S03Na et R4=H) tels que définis à la revendication 5.
17. Procédé selon les revendications 9 et 10 caractérisé en ce que la carboxy-réduction s'effectue au moyen de chlorhydrate de 1- (3-diméthyl aminopropyl) -3- éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium.
18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'on utilise 5 à 20 équivalents de chlorhydrate de l-(3- diméthyl aminopropyl) -3-éthylcarbodiimide et à un pH compris entre 4 et 5 et en particulier entre 4,3 et 4,9.
19. Procédé selon les revendications 9 et 10 caractérisé en ce que la réduction de l'adduit activé du dérivé du Dermatan Sulfate est réalisée avec 10 à 300 équivalents et en particulier de 140 à 250 équivalents de borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium à une température comprise entre 10 et70 °C et en particulier entre 20 et 50°C
20. Procédé selon les revendications 9 et 10 caractérisé en ce que la carboxy-réduction s'effectue par réduction d'un ester tel que l'ester mêthylique ou benzylique en présence de borohydrure de métal alcalin tel que le borohydrure de sodium.
21. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'on prépare l'ester mêthylique à partir d'un dérivé du Dermatan Sulfate, sel de benzethonium, en solution dans le dichlorométhane en présence de 2 à 20 équivalents et en particulier de 4 à 10 équivalents d'iodure de méthyle.
22. Procédé selon les revendications 20 à 21 caractérisé en ce que la réduction de l'ester du dérivé du dermatan sulfate est réalisée avec 10 à 300 équivalents de borohydrure de métal alcalin à une température comprise entre 10 et 50°C
23. Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que la réduction de l'ester est réalisée en présence de 140 à 250 équivalents de borohydrure de sodium à une température voisine de 20°C
24. procédé selon la revendication 9 mettant en oeuvre les étapes suivantes :
- Trans-salification du Dermatan Sulfate par le chlorure de Benzethonium
- Sulfatation du sel de benzethonium du Dermatan Sulfate en milieu organique au moyen d'un complexe d'anhydride sulfurique avec une base organique telle que la pyridine ou la triméthylamine suivie d'une salification avec l'acétate de sodium.
- Soit Carboxyréduction au moyen du chlorhydrate de 1- (3- dimêthyl aminopropyl) -3-éthylcarbodiimide en présence du borohydrure de sodium,
- soit estërification par action du iodure de méthyle sur le dérivé Dermatan Sulfate préalablement trans-salifié par le chlorure de Benzethonium puis réduction du dérivé ester mêthylique par le borohydrure de sodium, puis le cas échéant trans-salification du dérivé persulfaté carboxy-réduit par le chlorure de Benzethonium, puis resulfatation par le complexe d'anhydride sulfurique - pyridine suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
25. procédé selon la revendication 10 mettant en oeuvre les étapes suivantes : Soit Carboxy-réduction du Dermatan sulfate sel de sodium au moyen du chlorhydrate de 1- (3-dimêthyl aminopropyl) -3-éthylcarbodiimide en présence de borohydrure de sodium,
- soit estërification par action du iodure de méthyle sur le dérivé Dermatan Sulfate préalablement trans-salifié par un sel d'ammonium quaternaire puis réduction du dérivé ester mêthylique par le borohydrure de sodium, puis trans-salification du dérivé carboxy-réduit par le chlorure de Benzethonium
- Sulfatation par le complexe anhydride sulfurique - pyridine, suivie d'une salification par l'acétate de sodium.
26. Procédé d'obtention des dérivés isolés du Dermatan sulfate carboxy-réduits et chemioselectivement O-sulfatés selon la revendication 1 à 8 à partir du mélange de dérivés carboxy-réduits du Dermatan sulfate tels qu'obtenus selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 25, caractérisé en ce qu'on fractionne le mélange par chromâtographie sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide, le mélange étant élue par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium, notamment de 0,1 à 1 mole/1.
27. A titre de médicaments les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 8.
28. A titre de médicaments selon la revendication 27, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour traiter ou prévenir des désordres qui affichent une activité accrue d'au moins une des métalloprotéinases de matrice, telle que la matrilysine (MMP-7) , l'élastase neutrophile, 1' aggrecanase hADAMTSl et la gélatinase A (MMP-2) .
29. A titre de médicament selon la revendication 27 ou 28, les composés tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour traiter ou prévenir des désordres tels que la dégénérescence articulaire, la spondylose, la chondrolyse, associée à un traumatisme de l'articulation ou une immobilisation prolongée de l'articulation, les désordres des tissus conjonctifs, les troubles de la cicatrisation de plaie, les désordres parodontaux, les désordres chroniques du système locomoteur, les arthropathies, les myalgies, ou les désordres du métabolisme osseux.
30. les compositions pharmaceutiques renfermant un médicament tel que défini à l'une quelconque des revendications 27 à 29 et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables .
31. Dérivés carboxy-réduits et chemioselectivement O- sulfatés du Dermatan Sulfate, isolés ou en mélange tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 6 susceptibles d'être obtenus selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 9 à 26.
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