EP2120970A1 - Heparines comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine, leur procede de preparation et leur utilisation - Google Patents

Heparines comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine, leur procede de preparation et leur utilisation

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EP2120970A1
EP2120970A1 EP08761872A EP08761872A EP2120970A1 EP 2120970 A1 EP2120970 A1 EP 2120970A1 EP 08761872 A EP08761872 A EP 08761872A EP 08761872 A EP08761872 A EP 08761872A EP 2120970 A1 EP2120970 A1 EP 2120970A1
Authority
EP
European Patent Office
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heparins
heparin
biotin
sub
biotinylated
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08761872A
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German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Hubert
Pierre Mourier
Christian Viskov
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Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi Aventis France
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
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    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to heparins having at least one covalent bond with biotin or a derivative of biotin, as well as their method of preparation, pharmaceutical compositions containing them and their use in therapy.
  • Heparin is a mixture of sulfated mucopolysaccharides of animal origin with a molecular weight of around 15,000 Dalton (Da). Heparin or heparins will be discussed in the following: the structures, average molecular masses and polydispersity of the heparin polysaccharide chains may indeed vary according to the animal species and the organ of origin of the heparin (examples heparin from pork mucus, beef intestine, etc.).
  • Heparin catalyzes, particularly via antithrombin III (ATIII), the inhibition of two enzymes involved in the blood coagulation cascade, namely factor Xa and factor Ma (or thrombin). It is thus used therapeutically for its anticoagulant and anti-thrombotic properties. Heparin, however, has drawbacks that limit the conditions of its use. In particular, its important anticoagulant activity (in particular its high anti-factor IIa activity) can cause haemorrhages (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol 5, sup 3, 1999). Heparins are known for these unwanted hemorrhagic side effects.
  • ATIII antithrombin III
  • the goal is to restore or maintain the fluidity of the blood while avoiding causing haemorrhage. It is well known that, for any accidental cause, hemorrhage may occur in a patient undergoing treatment. It may also be necessary to intervene surgically in a patient under anti-thrombotic treatment.
  • anticoagulants can be used in high doses to prevent blood clotting, and it is desirable to neutralize them at the end of the procedure. The need is therefore felt to have neutralizing antithrombotic agents to stop the anticoagulant activity at any time.
  • Neutralizable antithrombotic agents such as biotinylated synthetic polysaccharides
  • Their synthesis including in particular the grafting of biotin or the biotin derivative carried out on protected equivalents of the polysaccharides mentioned above and not on these polysaccharides themselves, is not applicable to the compounds of the present invention. Indeed, it is desired to carry out the biotinylation on finished products, which are mixtures of polysaccharides and are therefore heterogeneous products, on which the biotin grafting as described in the aforementioned patent applications would not make it possible to induce a regrowth. sufficient selectivity of the grafting position and would not allow the biotinylation of all functionalizable polysaccharide chains of heparins.
  • the latter largely comprise polysaccharide chains which possess at their reducing end a degraded glycoserine, which can not be functionalized with biotin according to the protocol described by Osmond et al.
  • the operating conditions described in this publication for the biotinylation of porcine heparin do not make it possible to obtain a complete and reproducible manner of biotinylated heparins with expected characteristics, such as a biotinylation rate sufficient to allow effective neutralization.
  • the Applicant therefore aims to provide new neutralizable heparins by avidin or streptavidin and have biological properties comparable to native heparins.
  • the present invention relates to novel modified heparins, hereinafter called “biotinylated heparins”, characterized in that the constituent polysaccharides of said heparins have at their reducing end a covalent bond with a group - (R 1) r Biot and meet the general formula (I):
  • i is equal to 0 or 1
  • R1 represents a sequence of formula (a) or (b):
  • j and k which may be identical or different, are integers which can take any value from 1 to 10
  • - Biot represents a biotin group or a biotin derivative
  • n an integer having an average value of the order of 25 for a heparin with an average molecular mass of 15,000 Da
  • X represents H or SO 3 Na
  • Y represents COCH 3 or SO 3 Na
  • the wavy line denotes a bond situated either below or above the plane of the pyranosic ring to which it is attached, as well as their pharmaceutically acceptable salts.
  • biotin or a biotin derivative at the reducing end of the polysaccharide chains does not modify the pharmacological activity of the heparins.
  • novel biotinylated heparins, object of the invention have anti-thrombotic activities comparable to native heparins, that is to say before biotinylation.
  • Biot is a radical derived from hexahydro-2-oxo-1H-thieno [3,4-d] imidazole-4-pentanoic acid.
  • the Biot group in the general formula (I) according to the invention corresponds to formula (c):
  • biotin derivatives are commercially available ("Pierce” Biotin-avidin products catalog, 2005, pp. 7-11) or can be prepared using conventional methods known to those skilled in the art. Mention may in particular be made of the biotin derivatives mentioned in the patent application WO 02/24754.
  • the index i may be equal to 0, in which case the binding with the biotin or the biotin derivative is carried out directly on the amine function carried by the saccharide unit at the level of the reducing end of the polysaccharide chains.
  • i may be equal to 1 and the bond with the biotin or biotin derivative group may consist, for example, of a sequence of formula (a) above in which j is equal to 5, or a sequence of formula (b ) in which j and k are identical and are equal to 5.
  • R1 may for example represent a sequence of formula -CO- (CH 2 ) 5 -NH or - CO- (CH 2 ) 5 -NH-CO- (CH 2 ) 5 -NH-.
  • reducing end is understood to mean the end of the polysaccharide chain in which glucosamine or terminal mannosamine (mannosamine resulting from an epimerization in a basic medium of glucosamine) has a hemi-functional function.
  • cyclic acetal corresponding to formula (II) below:
  • X represents H or SO 3 Na
  • Y represents COCH 3 or SO 3 Na
  • the wavy line denotes a bond located either below or above the plane of the pyranosic ring to which it is attached (below: glucosamine, above: mannosamine) .
  • polysaccharides constitutive of heparin means polysaccharides characterized by the repetition of a disaccharide unit containing a uronic acid residue (D-glucuronic acid or L-iduronic acid) and a D-glucosamine, which can be N-sulfated or N-acetylated.
  • the disaccharide unit may also be O-sulfated at the C6 and / or C3 positions of D-glucosamine and at the C2 position of uronic acid (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p.1).
  • heparin is a mixture of sulfated mucopolysaccharides of animal origin.
  • Native heparins ie starting heparins before biotinylation, are referred to as "heparins".
  • the heparins used in the present invention may especially be of bovine, ovine or porcine origin; more specifically, they may be derived from the lungs of oxen, intestinal mucosa of beef, intestinal mucous membranes of pigs or intestinal lining of sheep.
  • the heparins used in the present invention are of porcine origin, for example derived from intestinal pig mucosa.
  • biotinylated heparins according to the present invention are such that at least 60%, advantageously at least 64%, of the constituent polysaccharides of said heparins have at their reducing end a covalent bond with a group - (R 1) r Biot and correspond to the formula (I ) as defined above, and whatever the original structure of heparin; advantageously, at least 80% of the constituent polysaccharides of said heparins have at their reducing end a covalent bond with a - (R 1) -Biot group.
  • the invention encompasses biotinylated heparins in the form of any of their pharmaceutically acceptable salts.
  • the subject of the present invention is also a process for the preparation of the biotinylated heparins mentioned above, characterized in that: a) the heparin is treated with heparinase 3, b) and then a reductive amination is carried out on the product obtained previously in the presence of an amine salt and a reducing agent, at a temperature between 20 and 80 ° C. 1 c) finally acylation is carried out with a - (R 1) - group, activated Biot, where R 1, i and Biot are as defined in relation to formula (I) above, in the presence of a base in an aqueous medium or in an organic medium.
  • the steps of the above preparation process can be controlled by an analytical HPLC monitoring, in particular of the SAX type, and more particularly of the CTA-SAX type, after depolymerization of the constituents of the heparin-derived mixture in the presence of a mixture of heparinases 1, 2 and 3.
  • analytical monitoring may for example be carried out using the method described in the patent application US2005 / 0186679 A1.
  • the overall yield of the process for preparing the biotinylated heparins according to the invention is therefore at least 60%, advantageously at least 64%.
  • this yield is at least 80%.
  • heparinase 1 the enzyme heparin lyase I (EC 4.2.2.7) of Flavobacterium heparinum,
  • heparinase 2 the heparin lyase II enzyme of Flavobacterium heparinum
  • heparinase 3 the heparin lyase III enzyme (EC 4.2.2.8) of Flavobacterium heparinum.
  • Heparinase 3 makes it possible to eliminate the protein binding zone (glycoserine) in the heparin polysaccharide chains and to obtain chains whose reducing ends are free of glycoserine residues.
  • Heparinases 1 and 2 allow the cleavage of polysaccharide chains into low molecular weight fragments (heparin depolymerization reactions).
  • heparins of origin heparins prepared as previously reported in the literature. Reference is made in particular to the book "Heparin, manufacture, structure, properties, analyzes", JP Duclos, Ed. Masson, 1984. Heparins may in particular be prepared according to the process described in patent application US 2005/0215519. A1.
  • the amine salt may be a quaternary amine salt; it is advantageously an ammonium halide salt having the formula NH 4 Z, where Z represents a halogen atom, such as a chlorine, fluorine, bromine or iodine atom.
  • the reducing agent may be a borohydride salt, for example a cyanohydride salt.
  • the temperature is advantageously between 50 and 80 ° C.
  • the base may be a carbonate or hydrogencarbonate salt, especially in the form of a sodium or potassium salt, or any other water-soluble or soluble organic base. in an organic medium known to those skilled in the art.
  • organic medium is understood to mean, for example, dichloromethane or dimethylformamide.
  • the process for preparing the biotinylated heparins advantageously comprises the following steps: a) heparin is treated with heparinase 3, b) and then reductive amination is carried out on the product obtained previously in the presence of a sodium salt; ammonium halide and a borohydride salt, at a temperature between 50 and 80 0 C, c) finally acylation with a - (R1) - Biot group as defined previously in the form of activated ester, in the presence of a base in an aqueous medium.
  • Biotinylated - (R1) - Biot derivatives as defined above can be involved in the acylation reaction directly in the form of activated esters, preformed or generated in situ using conventional coupling conditions known from the Man of the art.
  • activated esters in the form of N-hydroxy-succinimide derivatives or of 3-sulfo-N-hydroxy-succinimide derivatives.
  • heparin is treated with heparinase 3 to remove the remaining protein binding (i.e., native or degraded glycoserines) to obtain a compound 1 having a glycoserine residue-free reducing end.
  • This heparin (compound 1) can then be subjected to a reductive amination to provide compound 2, having a free amine function at the reducing end, in the presence of an amine salt and a reducing agent such as a borohydride salt.
  • This compound can then be acylated to provide the biotinylated compound 3, by reaction with an activated derivative of biotin - (R 1) r Biot, as defined above, in the presence of a base.
  • Scheme 1 it is understood that compounds 1, 2 and 3 are a theoretical representation since they are actually, as
  • Heparin EPB heparin marketed by Bioibérica
  • HPLC "High Performance Liquid Chromatography"
  • SAX "Strong anion exchange chromatography”
  • CTA “Cetyl Trimethyl Ammonium”
  • Sulfo-NHS sodium salt of the 3-sulfosuccinimidyl ester
  • Heparinase 1 heparin lyase I enzyme (EC 4.2.2.7) from Flavobacterium heparinum;
  • Heparinase 2 heparin lyase II enzyme of Flavobacterium heparinum
  • Heparinase 3 heparin lyase III enzyme (EC 4.2.2.8) of Flavobacterium heparinum.
  • the product can be controlled by depolymerization using a mixture of heparinases 1, 2 and 3 and analyzed by HPLC-SAX using the method described in US2005 / 0186679 A1. The results show a disappearance of at least 80% of the glycoserine species present in the starting heparin.
  • heparin purified by heparinase 3 0.5 g are dissolved in a 5 M aqueous ammonium chloride solution. 0.5 g of sodium cyanoborohydride are added to the heparin solution. The mixture is heated at 70 ° C. for 24 hours.
  • Heparin depolymerized with heparinase 3, amino-reduced and biotinylated At a temperature in the region of 20 ° C., 200 mg of amino-reduced depolymerized heparin are dissolved in 2 ml of 0.5M sodium hydrogen carbonate solution. 37 mg of Sulfo-NHS-LC-Biotin are added to the solution obtained. The solution obtained is stirred at a temperature close to 20 ° C. for 1 hour. The solution is diluted with 4 ml of 0.5M sodium hydrogen carbonate solution. 37 mg of Sulfo-NHS-LC-Biotin are added and the mixture is stirred for 2 hours.
  • the product can be controlled by depolymerization using a mixture of heparinases 1, 2 and 3 and analyzed by HPLC-SAX using the method described in US patent application 2005/0186679 A1.
  • the results show a at least 80% disappearance of the glycoserine species present in the starting heparin.
  • heparin according to US 2005/0215519 A1 depolymerized by heparinase 3 and amino-reduced 0.5 g of heparin according to LJS 2005/0215519 A1 treated with heparinase 3 are dissolved in 20 ml of a 5 M aqueous solution of ammonium chloride. 0.5 g of sodium cyanoborohydride are added to the heparin solution. The mixture is heated at 70 ° C. for 24 hours. The solution is brought to a temperature close to 20 0 C, diluted with water (QSP 50 ml), then desalted on a column of Sephadex G10. The harvested fraction is lyophilized. 446 mg of a white lyophilisate are obtained. The yield observed is 89%. The product is engaged as in the next acylation step.
  • Heparin according to US 2005/0215519 A1 depolymerized with heparinase 3, amino-reduced and biotinylated At a temperature in the region of 20 ° C., 200 mg of amino-reduced depolymerized heparin are dissolved in 2 ml of 0.5 M solution. of sodium hydrogencarbonate. 37 mg of Sulfo-NHS-LC-Biotin are added to the solution obtained. The solution is stirred at a temperature close to 20 ° C for 1 hour. The suspension obtained is diluted with 4 ml of 0.5M sodium hydrogen carbonate solution. 37 mg of Sulfo-NHS-LC-Biotin are added and the mixture is stirred for 2 hours.
  • the product can be controlled by depolymerization using a mixture of heparinases 1, 2 and 3 and analyzed by HPLC-SAX using the method described in US patent application 2005/0186679 A1.
  • the compounds according to the invention have been the subject of biochemical and pharmacological studies.
  • anti-factor IIa activity and the anti-factor Xa (anti-FXa) activity in human plasma or a buffer system are analyzed by chromogenic method: the anti-factor IIa activity is tested by means of of anti-factor IIa activity of heparin Actichrome kit (American Diagnostica) containing the chromogenic substrate S-2238, the ⁇ -thrombin and I 1 human ATIII (antithrombin III).
  • the anti-FXa activity is determined with the automated instrument of coagulation ACL 7000 (Instrumentation Laboratory) using the Heparin kit (Instrumentationation
  • 10 ⁇ l of sample or international standards of low molecular weight heparins are diluted 1: 16 with Pantithrombin in human plasma or the buffer system containing 0.05 M Tris HCl, NaCl 0.154M, pH 7.4. 10 ⁇ l of this solution are added to a 96-well microtiter plate. The measurement is reproduced in triplicate (on 3 wells). The microtiter plate is maintained at 37 ° C. with stirring at 300 rpm. 40 ⁇ l of thrombin are added to each of the wells and incubated for exactly 2 minutes. 40 ⁇ l of Spectrozyme are added. After 90 seconds, the reaction is stopped by adding 40 ⁇ l of acetic acid. Absorption is measured at 405 nm using a SpectraMax 340 (Molecular devices).
  • the sample or international standards of low molecular weight heparins are diluted in human plasma or buffer system containing 0.05 M Tris HCl, 0.154 M NaCl, pH 7.4.
  • the samples containing the heparinoids in plasma or buffer were further diluted 1:20 with a working buffer containing I 1 ATIII, and placed in duplicate in the sample rotor.
  • the factor Xa reagent and the chromogenic substrate are poured into the indicated reservoirs of the automated ACL 7000 coagulation instrument.
  • the measurement of the anti-FXa activity is carried out with the "heparin" protocol integrated in the ACL 7000 software.
  • 50 ⁇ l of the sample (diluted with the working buffer) are mixed with 50 ⁇ l. ⁇ l of factor Xa reagent.
  • 50 ⁇ l of chromogenic substrate with a concentration of 1.1 mM are added and the changes in absorption as a function of time are measured at the wavelength of 405 nM.
  • Biotinylated heparins according to the present invention can be used for the preparation of medicaments. They can especially be used as anti-thrombotic drugs.
  • the subject of the invention is medicaments which comprise a biotinylated heparin as defined above.
  • These medicaments find use in therapeutics, in particular in the treatment and prevention of venous thromboses, arterial thrombotic accidents, particularly in the case of myocardial infarction or unstable angina, peripheral arterial thromboses, such as osteoarthritis of the arteries. lower limbs, cerebral arterial thromboses and strokes. They are also useful in the prevention and treatment of smooth muscle cell proliferation, angiogenesis, and as neuroprotective agents of atherosclerosis and arteriosclerosis.
  • the present invention also relates to a method of treatment of the aforementioned pathologies which comprises the administration to a patient of an effective dose of a compound according to the invention, or one of its pharmaceutically acceptable salts.
  • a method of treatment of the aforementioned pathologies which comprises the administration to a patient of an effective dose of a compound according to the invention, or one of its pharmaceutically acceptable salts.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active ingredient, a biotinylated heparin according to the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as well as at least one pharmaceutically acceptable inert excipient .
  • excipients are chosen according to the desired pharmaceutical form and mode of administration, for example the oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, transdermal, transmucosal, local or rectal route.
  • each dosage unit the active ingredient is present in the amounts adapted to the daily doses envisaged in order to obtain the desired prophylactic or therapeutic effect.
  • Each dosage unit may contain from 25 to 150 mg of active ingredient, advantageously from 30 to 100 mg.
  • These doses of anticoagulant compounds may be neutralized by avidin or streptavidin. There may be special cases where higher or lower dosages are appropriate; such dosages are not outside the scope of the invention. According to the usual practice, the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of said patient.
  • the compounds according to the invention may also be used in combination with one or more other active ingredients useful for the desired therapy, such as antithrombotics, anticoagulants or antiplatelet agents.
  • the subject of the present invention is also a method employing avidin or streptavidin, characterized in that it makes it possible to neutralize the biotinylated heparins according to the invention.
  • avidin or streptavidin may be used for the preparation of medicaments for neutralizing biotinylated heparins according to the present invention.

Abstract

Héparines biotinylées, caractérisées en ce que les polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1),-Biot et répondent à la formule générale (I): dans laquelle i est égal à O ou 1, R1 représente un enchaînement de formule -CO- (CH2)j-NH- ou -CO-(CH2)jNH-CO-(CH2)k-NH, où j et k sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine, n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne d'environ 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da, X représente H ou SO3Na, Y représente COCH3 ou SO3Na, le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée. Leur procédé de préparation et leur utilisation en thérapeutique.

Description

HEPARINES COMPRENANT AU MOINS UNE LIAISON COVALENTE AVEC LA BIOTINE OU UN DERIVE DE LA BIOTINE, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des héparines présentant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un dérivé de la biotine, ainsi que leur procédé de préparation, des compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation en thérapeutique.
L'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, d'un poids moléculaire voisin de 15 000 Daltons (Da). On parlera dans ce qui suit de l'héparine ou des héparines : les structures, masses moléculaires moyennes et polydispersité des chaînes polysaccharidiques de l'héparine peuvent en effet varier selon les espèces animales et l'organe d'origine de l'héparine (exemples: héparine de mucus de porc, d'intestin de bœuf, etc).
L'héparine catalyse, notamment via l'antithrombine III (ATIII), l'inhibition de deux enzymes qui interviennent dans la cascade de la coagulation du sang, à savoir le facteur Xa et le facteur Ma (ou thrombine). Elle est ainsi utilisée en thérapeutique pour ses propriétés anticoagulantes et anti-thrombotiques. L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (notamment son activité anti-facteur lia élevée) peut occasionner des hémorragies (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999). Les héparines sont connues pour ces effets secondaires hémorragiques indésirables.
Dans le domaine du traitement de la thrombose, le but est de rétablir ou maintenir la fluidité du sang tout en évitant de provoquer une hémorragie. Il est en effet bien connu que, pour une cause accidentelle quelconque, une hémorragie peut se déclencher chez un patient sous traitement. On peut également avoir besoin d'intervenir chirurgicalement chez un malade sous traitement anti-thrombotique. De plus, au cours de certains actes chirurgicaux, des anticoagulants peuvent être utilisés à forte dose de façon à empêcher la coagulation du sang, et il est souhaitable de les neutraliser à la fin de l'intervention. Le besoin se fait donc ressentir d'avoir des agents antithrombotiques neutralisables pour stopper l'activité anticoagulante à tout moment. Des agents antithrombotiques neutralisables, tels que des polysaccharides de synthèse biotinylés, ont été décrits dans les demandes de brevet WO 02/24754 et WO 06/030104. Leur synthèse, comprenant notamment le greffage de la biotine ou du dérivé de biotine réalisé sur des équivalents protégés des polysaccharides mentionnés ci-dessus et non sur ces polysaccharides eux-mêmes, n'est pas applicable aux composés de la présente invention. On souhaite en effet effectuer la biotinylation sur des produits finis, qui sont des mélanges de polysaccharides et sont donc des produits hétérogènes, sur lesquels le greffage de biotine tel que décrit dans les demandes de brevets sus-mentionnées ne permettrait pas d'induire une régio-sélectivité suffisante de la position de greffage et ne permettrait pas la biotinylation de l'ensemble des chaînes polysaccharidiques fonctionnalisables des héparines.
L'équipe de Osmond et al. décrit, dans Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207, plusieurs techniques de biotinylation d'une héparine porcine, l'une d'elles étant décrite comme faisant intervenir un couplage de la biotine à l'extrémité réductrice d'une héparine par une amination réductrice suivie d'un couplage avec la biotine. Toutefois, les conditions opératoires décrites dans ce document ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées : elles ne prennent pas en compte la diversité structurelle des héparines et la structure réelle des chaînes polysaccharidiques telles qu'elles sont présentes dans les héparines disponibles commercialement. Ces dernières comportent en grande partie des chaînes polysaccharidiques qui possèdent à leur extrémité réductrice une glycosérine dégradée, non fonctionnalisable par la biotine selon le protocole décrit par Osmond et al. Ainsi, les conditions opératoires décrites dans cette publication pour la biotinylation de l'héparine porcine ne permettent pas l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées avec des caractéristiques attendues, comme un taux de biotinylation suffisant pour permettre une neutralisation efficace.
L'équipe de Tseng et al. décrit, dans Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636, une technique d'immobilisation d'héparine sur des films par interaction avec l'avidine, suite à la fonctionnalisation de l'héparine par la biotine. La biotinylation de l'héparine est effectuée par une oxydation à l'aide d'iode, suivie de la formation d'une lactone, puis du couplage avec un dérivé 2-(4-aminophényl)-éthylamine de biotine. Les conditions opératoires présentées par Tseng et al. ne présument toutefois pas de l'obtention de façon complète et reproductible d'héparines biotinylées au niveau de l'extrémité réductrice : en effet, rien n'indique que l'étape d'oxydation puisse être sélective au niveau de l'extrémité réductrice, ni que l'activité biologique de l'héparine soit conservée après un tel traitement.
L'équipe de Kett ef al. décrit, dans Biochimica et Biophysica Acta, 1620 (2003), 225-234, des études d'affinité entre l'avidine et divers glycosaminoglycanes et démontre que l'avidine présente une forte affinité envers l'héparine. Dans ces études d'affinité, l'héparine peut être dérivatisée par la biotine, mais rien n'indique quel est le site de biotinylation dans les chaînes polysaccharidiques de l'héparine.
La Demanderesse s'est donc donné pour but de pourvoir à de nouvelles héparines neutralisables par l'avidine ou la streptavidine et qui possèdent des propriétés biologiques comparables aux héparines natives.
La présente invention a pour objet de nouvelles héparines modifiées, ci-après appelées "héparines biotinylées", caractérisées en ce que les polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)rBiot et répondent à la formule générale (I) :
dans laquelle:
- i est égal à 0 ou 1 ,
- R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
(a)
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10, - Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine,
- n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da,
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na, - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
De manière surprenante, l'introduction de biotine ou d'un dérivé de biotine au niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques ne modifie pas l'activité pharmacologique des héparines. En effet, les nouvelles héparines biotinylées, objet de l'invention, ont des activités anti-thrombotiques comparables aux héparines natives, c'est-à-dire avant biotinylation.
Elles possèdent un avantage considérable par rapport aux héparines natives : elles peuvent être rapidement neutralisées par un antidote spécifique, en situation d'urgence. Cet antidote spécifique est l'avidine, sous forme tétramérique ou monomérique, ou la streptavidine, de masses respectives égales à environ 66 000, 16 400 et 60 000 Da (The Merck Index, Twelfth édition, 1996, M.N. 920, pages 151-152; Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook). Elles possèdent également l'avantage de pouvoir être utiles dans des indications thérapeutiques pour lesquelles les doses utilisées sont plus élevées, tout en diminuant le risque hémorragique; elles peuvent ainsi être utiles en thérapeutique dans le domaine artériel.
Le groupe biotine (Biot) mentionné ci-dessus est un radical issu de l'acide hexahydro-2-oxo-1 H-thiéno[3,4-d]imidazole-4-pentanoïque. Avantageusement, le groupe Biot dans la formule générale (I) selon l'invention répond à la formule (c) :
Les dérivés de biotine sont disponibles commercialement (catalogue "Pierce" Biotin-avidin products, 2005, pp. 7-11) ou peuvent être préparés en utilisant des méthodes classiques connues de l'Homme de l'art. On peut citer notamment les dérivés de biotine mentionnés dans la demande de brevet WO 02/24754.
Dans les héparines biotinylées selon l'invention, l'indice i peut être égal à 0, auquel cas la liaison avec la biotine ou le dérivé de biotine s'effectue directement sur la fonction aminé portée par l'unité saccharidique au niveau de l'extrémité réductrice des chaînes polysaccharidiques.
Alternativement, i peut être égal à 1 et la liaison avec le groupe biotine ou dérivé de biotine peut consister par exemple en un enchaînement de formule (a) ci-dessus dans laquelle j est égal à 5, ou en un enchaînement de formule (b) ci-dessus dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5. Ainsi, dans la formule (I) ci-dessus, R1 peut représenter par exemple un enchaînement de formule -CO-(CH2)5-NH ou -CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par "extrémité réductrice" l'extrémité de la chaîne polysaccharidique dans lequelle la glucosamine ou la mannosamine terminale (la mannosamine résultant d'une épimérisation en milieu basique de la glucosamine) possède une fonction hémi-acétale cyclique, répondant à la formule (II) ci-dessous:
(H)
dans laquelle:
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na, et - le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée (au-dessous : glucosamine, au-dessus : mannosamine).
On entend par "polysaccharides constitutifs de l'héparine" des polysaccharides caractérisés par la répétition d'un motif disaccharidique contenant un résidu d'acide uronique (acide D-glucuronique ou acide L-iduronique) et d'une D-glucosamine, qui peut être N-sulfatée ou N-acétylée. L'unité disaccharidique peut également être O-sulfatée en positions C6 et/ou C3 de la D-glucosamine et en position C2 de l'acide uronique (Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1).
Comme indiqué plus haut, l'héparine est un mélange de mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale. Les héparines natives, c'est à dire les héparines de départ avant la biotinylation, sont dénommées "héparines ". Les héparines utilisées dans la présente invention peuvent être notamment d'origine bovine, ovine ou porcine ; plus précisément, elles peuvent être issues de poumons de bœufs, de muqueuses intestinales de bœuf, de muqueuses intestinales de porc ou de muqueuses intestinales de mouton. Avantageusement, les héparines utilisées dans la présente invention sont d'origine porcine, par exemple issues de muqueuses intestinales de porc.
Les héparines biotinylées selon la présente invention sont telles que au moins 60%, avantageusement au moins 64%, des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)rBiot et répondent à la fomule (I) telle que définie précédemment, et ce quelle que soit la structure originelle de l'héparine ; avantageusement, au moins 80% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)-Biot.
L'invention englobe les héparines biotinylées sous la forme de l'un quelconque de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
La présente invention a également pour objet un procédé pour la préparation des héparines biotinylées mentionnées plus haut, caractérisé en ce que : a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'aminé et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 800C1 c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1),-Biot activé, où R1, i et Biot sont tels que définis en rapport avec la formule (I) ci-dessus, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
Les étapes du procédé de préparation ci-dessus peuvent être contrôlées par un suivi analytique HPLC, notamment de type SAX, et plus particulièrement de type CTA-SAX, après dépolymérisation des constituants du mélange dérivé d'héparine en présence d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3. Un tel suivi analytique peut par exemple être effectué en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 A1.
On vérifie notamment, après l'étape d'amination réductrice b), qu'au moins 80%, avantageusement au moins 90%, des polysaccharides constitutifs desdites héparines portent à leur extrémité réductrice une fonction -NH2 (polysaccharides amino-réduits). On vérifie notamment, après l'étape d'acylation c), qu'au moins 80%, avantageusement au moins 90%, desdits polysaccharides amino-réduits sont biotinylés.
Le rendement global du procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention est donc d'au moins 60%, avantageusement d'au moins 64%. Avantageusement, ce rendement est d'au moins 80%. On entend par :
- héparinase 1 : l'enzyme héparine lyase I (EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum,
- héparinase 2 : l'enzyme héparine lyase II de Flavobacterium heparinum, - héparinase 3: l'enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum.
L'héparinase 3 permet d'éliminer la zone de liaison aux protéines (glycosérine) dans les chaînes polysaccharidiques des héparines et d'obtenir des chaînes dont les extrémités réductrices sont exemptes de résidus de glycosérine. Les héparinases 1 et 2 permettent le clivage des chaînes polysaccharidiques en fragments de bas poids moléculaires (réactions de dépolymérisation de l'héparine).
Le procédé de préparation des composés selon l'invention utilise comme héparines de départ (héparines "natives") des héparines préparées comme précédemment rapporté dans la littérature. On se référera notamment à l'ouvrage "L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses", J. P. Duclos, Ed. Masson, 1984. Les héparines peuvent notamment être préparées selon le procédé décrit dans la demande de brevet US 2005/0215519 A1.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, le sel d'aminé peut être un sel d'aminé quaternaire; il s'agit avantageusement d'un sel d'halogénure d'ammonium répondant à la formule NH4Z, où Z représente un atome d'halogène, tel qu'un atome de chlore, fluor, brome ou iode.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, l'agent réducteur peut être un sel de borohydrure, par exemple un sel de cyanobohydrure.
Dans l'étape b) d'amination réductrice du procédé de préparation ci-dessus, la température est avantageusement comprise entre 50 et 800C.
Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, la base peut être un sel de carbonate ou d'hydrogénocarbonate, notamment sous forme de sel de sodium ou de potassium, ou encore toute autre base organique hydrosoluble ou soluble en milieu organique connue de l'Homme de l'art. Dans l'étape c) d'acylation du procédé de préparation ci-dessus, on entend par milieu organique par exemple le dichlorométhane ou le diméthylformamide.
Le procédé de préparation des héparines biotinylées selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes : a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 800C, c) enfin on effectue une acylation avec un un groupe -(R1),-Biot tel que défini précédemment sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
Les dérivés biotinylés -(R1),-Biot tels que définis plus haut peuvent être mis en jeu dans la réaction d'acylation directement sous forme d'esters activés, préformés ou générés in situ en utilisant des conditions classiques de couplage connues de l'Homme de l'art. On peut notamment utiliser des esters activés sous forme de dérivés N-hydroxy-succinimide ou de dérivés 3-sulfo-N-hydroxy-succinimide.
Le procédé de préparation selon l'invention est illustré dans le schéma 1.
Schéma 1
Héparinase 3
HEPARINE
Composé 3
Selon le schéma 1 , l'héparine est traitée par l'héparinase 3 pour éliminer la liaison protéique restante (c'est-à-dire les glycosérines, natives ou dégradées) et obtenir un composé 1 comportant une extrémité réductrice exempte de résidu de glycosérine. Cette héparine (composé 1) peut alors être soumise à une amination réductrice pour fournir le composé 2, présentant une fonction aminé libre au niveau de l'extrémité réductrice, en présence d'un sel d'aminé et d'un agent réducteur tel qu'un sel de borohydrure.
Ce composé peut alors être acylé pour fournir le composé biotinylé 3, par réaction avec un dérivé activé de biotine -(R1)rBiot, tel que défini précédemment, en présence d'une base. Cette réaction peut par exemple être effectuée avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)S-NH-CO-(CHZ)5-NI-I-, OU avec le sel de sodium de l'ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 représente l'enchaînement -CO-(CH2)5-NH-, ou encore avec le sel de sodium de l'ester de biotinoyl-3-sulfosuccinimidyl lorsque R1 n'est pas présent (i = O). Dans le schéma 1 , il est entendu que les composés 1, 2 et 3 sont une représentation théorique, puisqu'il s'agit en réalité, en tant que dérivés d'héparine, de mélanges de chaînes polysaccharidiques.
Dans ce qui suit, des exemples de synthèse des héparines biotinylées selon l'invention et de différents intermédiaires utiles à leur obtention sont détaillés à titre d'illustration.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
Héparine EPB : héparine commercialisée par la société Bioibérica ;
HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" ;
SAX : "Strong anion exchange chromatography" ; CTA : "Cetyl Trimethyl Ammonium" ;
Q. S. P. : "Quantité Suffisante Pour" ;
LC : "Long Chain" (correspond à l'enchaînement 6-amino-hexanoyl) ;
Sulfo-NHS : sel de sodium de l'ester 3-sulfo-succinimidyl ;
Héparinase 1 : enzyme héparine lyase I (EC 4.2.2.7) de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 2 : enzyme héparine lyase II de Flavobacterium heparinum ;
Héparinase 3 : enzyme héparine lyase III (EC 4.2.2.8) de Flavobacterium heparinum.
Exemple 1
1.1 Héparine EPB purifiée par dépolymérisation avec l'héparinase 3 : A une température proche de 200C, 1 g d'héparine brute EPB est mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajustée à pH = 7,0 ± 0,1, 20 mM de chlorure de sodium et 1mg/ml de BSA. 0,5 Ul d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel obtenu est agité pendant 5 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de méthanol sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur membrane 0,45 μm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis séché sous vide. On obtient 0,98 g d'un solide blanc. Le rendement observé est de 98 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1 , 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 A1. Les résultats montrent une disparition d'au moins 80% des espèces glycosérines présentes dans l'héparine de départ.
Spectre RMN 1H du mélange de polysaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH1 m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.2 Héparine dépolymérisée par héparinase 3 amino-réduite :
0,5 g d'héparine purifiée par héparinase 3 sont mis en solution dans une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 700C pendant 24 heures.
La solution est ramenée à une température proche de 200C, diluée à l'eau (QSP
50 ml), puis dessalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction obtenue est injectée sur une colonne de Q-sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est dessalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 444 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 1H du mélange de polysaccharides dans D2O (250C, δ en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH1 m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m),
4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42
(CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
1.3 Héparine dépolymérisée par héparinase 3, amino-réduite et biotinylée : A une température voisine de 200C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino- réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution obtenue est agitée à une température proche de 2O0C pendant 1 heure. La solution est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité pendant 2 heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q.S.P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 μm et injecté sur une colonne de Q- Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est dessalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 94 %. Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX, en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US2005/0186679 A1.
Spectre RMN 1H du mélange de polysaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm), principaux signaux: entre 1 ,3 et 1 ,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1 H, dd, 12 et 5Hz), 3,20 (NCH2 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m), 4,85 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH1 s).
Exemple 2
2.1 Héparine obtenue selon US 2005/0215519 A1, dépolymérisation avec l'héparinase 3 :
A une température proche de 2O0C, 1 g d'héparine selon US 2005/0215519 A1 est mis en solution dans 15 ml de la solution aqueuse de 5 mM de phosphate de sodium ajusté à pH = 7,0 ± 0,1 , 20 mM de chlorure de sodium et 1 mg / ml de BSA. 0,5 Ul d'héparinase 3 sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange réactionnel obtenu est agité pendant 7 jours. 1 g de chlorure de sodium et 45 ml de méthanol sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension obtenue est filtrée sur membrane 0,45 μm. Le gâteau est lavé au méthanol, à l'éther diéthylique, puis séché sous vide. On obtient 0,96 g d'un solide blanc. Le rendement observé est de 96 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1 , 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US 2005/0186679 A1. Les résultats montrent une disparition d'au moins 80 % des espèces glycosérines présentes dans l'héparine de départ.
Spectre RMN 1H du mélange de polysaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH, m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.2 Héparine selon selon US 2005/0215519 A1 dépolymérisée par héparinase 3 et amino-réduite : 0,5 g d'héparine selon LJS 2005/0215519 A1 traitée par héparinase 3 sont mis en solution dans 20 ml d'une solution aqueuse 5 M de chlorure d'ammonium. 0,5 g de cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés à la solution d'héparine. Le mélange est porté à 700C pendant 24 heures. La solution est ramenée à une température proche de 200C, diluée à l'eau (Q. S. P. 50 ml), puis dessalée sur une colonne de Séphadex G10. La fraction récoltée est lyophilisée. On obtient 446 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 89 %. Le produit est engagé tel que dans l'étape suivante d'acylation.
Spectre RMN 1H du mélange de polysaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm), principaux signaux: 2,05 (CH3CO, s), 3,28 (CH1 m), 3,65 (CH, m), 3,77 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, d, 12Hz), 4,35 (CH, s), 4,42 (CH, m), 4,88 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
2.3 Héparine selon US 2005/0215519 A1 dépolymérisée par héparinase 3, amino- réduite et biotinylée : A une température voisine de 20°C, 200 mg d'héparine dépolymérisée amino- réduite sont mis en solution dans 2 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés à la solution obtenue. La solution est agitée à une température proche de 20°C pendant 1 heure. La suspension obtenue est diluée par 4 ml de solution 0,5 M d'hydrogénocarbonate de sodium. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés et le mélange est agité pendant 2 heures. 37 mg de Sulfo-NHS-LC-Biotine sont ajoutés de nouveau et le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Le milieu réactionnel obtenu est dilué à l'eau (Q. S. P. 200 ml), filtré sur membrane 0,45 μm et injecté sur une colonne de Q-Sépharose. Le produit est élue à l'eau, puis avec un gradient en perchlorate de sodium. Le produit obtenu est dessalé sur une colonne de Séphadex G10 puis lyophilisé. On obtient 188 mg d'un lyophilisât blanc. Le rendement observé est de 94 %.
Le produit peut être contrôlé par dépolymérisation à l'aide d'un mélange d'héparinases 1, 2 et 3 et analysé par HPLC-SAX en utilisant la méthode décrite dans la demande de brevet US 2005/0186679 A1.
Spectre RMN 1H du mélange de polysaccharides dans D2O (25°C, δ en ppm), principaux signaux : entre 1,3 et 1,8 (CH2 biotine, m), 2,05 (CH3CO, s), 2,25 (CH2CO biotine, t, 7Hz), 2,79 (1 H, d, 12Hz), 3,00 (1H, dd, 12 et 5Hz), 3,20 (NCH2 biotine, m), 3,30 (CH, m), 3,68 (CH, m), 3,80 (CH, m), 4,05 (CH, m), 4,10 (CH, s), 4,20 (CH, s), 4,25 (CH, m), 4,35 (CH, s), 4,45 (CH, m), 4,63 (NCH biotine, m), 4,85 (CH, s), 5,22 (CH, s), 5,42 (CH, s).
Les composés selon l'invention ont fait l'objet d'études biochimiques et pharmacologiques.
Mesure de l'activité anti-facteur Ha et de l'activité anti-facteur Xa
L'activité anti-facteur lia (anti-Flla) et l'activité anti-facteur Xa (anti-FXa) dans le plasma humain ou un système tampon sont analysés par méthode chromogènique : l'activité anti-facteur lia est testée au moyen du kit d'anti-facteur lia d'héparine d'Actichrome (American diagnostica) contenant le substrat chromogène S-2238, l'α-thrombine et I1ATIII humain (antithrombine III). L'activité anti-FXa est déterminée avec l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000 (Instrumentation Laboratory) employant le kit Héparine (Instrumentation
Laboratory) contenant de I1ATHI1 le facteur Xa et le substrat chromogène S-2765.
Les deux analyses sont réalisées exactement selon les instructions du fabricant.
Les standards suivants sont employés pour établir une courbe d'étalonnage standard pour mesurer l'activité in vitro des fractions d'héparines biotinylées dans le plasma humain et le système tampon :
- 1er standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Contrai, Londres, R-U, établi en 1987, code n° 85/600), - 2ème standard international pour les héparines de bas poids moléculaire (National Institute for Biological Standards and Control, Londres, R-U, établi en 1987, code n° 01/608, utilisé depuis juin 2006),
- l'enoxaparine (Clexane®, sanofi-aventis, France) a été employé comme référence interne.
Pour les déterminations d'activité anti-Flla, 10 μl d'échantillon ou de standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués au 1 :16 avec Pantithrombine dans le plasma humain ou Ie système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, à pH 7,4. 10 μl de cette solution sont ajoutés dans une plaque 96 puits microtitre. La mesure est reproduite en triple (sur 3 puits). La plaque microtitre est maintenue à 37°C en agitant à 300 t/min. 40 μl de thrombine sont ajoutés à chacun des puits et incubés pendant exactement 2 mn. 40 μl de Spectrozyme sont ajoutés. Après 90 secondes, la réaction est arrêtée par ajout de 40 μl d'acide acétique. L'absorption est mesurée à 405 nm en utilisant un SpectraMax 340 (Molecular devices).
Pour des mesures d'activité anti-FXa, l'échantillon ou les standards internationaux des héparines de bas poids moléculaire sont dilués dans le plasma humain ou le système tampon contenant Tris HCI 0,05 M, NaCI 0,154M, pH 7,4. Les échantillons contenant les héparinoïdes dans le plasma ou le tampon sont encore dilués au 1:20 avec un tampon de travail contenant I1ATIII, et placés en double dans le rotor de sondage. Le réactif facteur Xa et le substrat chromogène sont versés dans les réservoirs indiqués de l'instrument automatisé de coagulation ACL 7000.
La mesure de l'activité anti-FXa est réalisée avec le protocole "héparine" intégrée dans le logiciel de l'ACL 7000. Pendant l'analyse, 50 μl de l'échantillon (dilué avec le tampon de travail) sont mélangés à 50 μl du réactif facteur Xa. Après un temps d'incubation de 60 secondes à 370C, 50 μl de substrat chromogène de concentration 1 ,1 mM sont ajoutés et les changements de l'absorption en fonction du temps sont mesurés à la longueur d'onde de 405 nM.
Les résultats obtenus sont décrits notamment dans le tableau ci-dessous.
II apparaît ainsi que l'activité anti-FXa des héparines biotinylées selon l'invention est conservée par comparaison avec les héparines natives de départ.
Les héparines biotinylées selon la présente invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments. Elles peuvent notamment être utilisées comme médicaments anti-thrombotiques. Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet des médicaments qui comprennent une héparine biotinylée telle que définie ci-avant. Ces médicaments trouvent leur emploi en thérapeutique, en particulier dans le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales et des accidents vasculaires cérébraux. Ils sont également utiles dans la prévention et le traitement de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agents neuroprotecteurs de l'athérosclérose et de l'artériosclérose. La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une méthode de traitement des pathologies sus-mentionnées qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un composé selon l'invention, ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. L'utilisation des héparines biotinylées telles que définies précédemment pour le traitement et la prévention des pathologies sus-mentionnées fait donc partie de l'invention, ainsi que l'utilisation desdites héparines biotinylées pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir ces pathologies.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique conprenant, en tant que principe actif, une héparine biotinylée selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, ainsi qu'au moins un excipient inerte, pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités, par exemple la voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, transmuqueux, locale ou rectale.
Dans chaque unité de dosage, le principe actif est présent dans les quantités adaptées aux doses journalières envisagées afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Chaque unité de dosage peut contenir de 25 à 150 mg de principe actif, avantageusement de 30 à 100 mg. Ces doses de composés anticoagulants peuvent être neutralisées par l'avidine ou la streptavidine. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
Les composés selon l'invention peuvent également être utilisés en association avec un ou plusieurs autres principes actifs utiles pour la thérapeutique souhaitée, tels que des anti-thrombotiques, des anticoagulants ou des antiagrégants plaquettaires.
La présente invention a également pour objet un procédé mettant en oeuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines biotinylées selon l'invention. Ainsi, l'avidine ou la streptavidine peuvent être utilisés pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines biotinylées selon la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Héparines biotinylées, caractérisées en ce que les polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1),-Biot et répondent à la formule générale (I) :
dans laquelle: - i est égal à O ou 1 ,
- R1 représente un enchaînement de formule (a) ou (b) :
dans lesquelles j et k, identiques ou différents, sont des entiers pouvant prendre toute valeur de 1 à 10,
- Biot représente un groupe biotine ou dérivé de biotine,
- n représente un nombre entier ayant une valeur moyenne de l'ordre de 25 pour une héparine de masse moléculaire moyenne de 15 000 Da,
- X représente H ou SO3Na,
- Y représente COCH3 ou SO3Na,
- le trait ondulé désigne une liaison située soit au-dessous, soit au-dessus du plan du cycle pyranosique auquel elle est rattachée, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
2. Héparines selon la revendication 1 , caractérisées en ce que i est égal à 0, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
3. Héparines selon la revendication 1 , caractérisées en ce que i est égal à 1 et R1 représente un enchaînement de formule (a) dans laquelle j est égal à 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
4. Héparines selon la revendication 1 , caractérisées en ce que i est égal à 1 et R1 représente un enchaînement de formule (b) dans laquelle j et k sont identiques et sont égaux à 5, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
5. Héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que Biot représente le groupe biotine de formule (c) :
ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
6. Héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'au moins 64% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(R1)rBiot, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
7. Héparines selon la revendication 6, caractérisées en ce qu'au moins 80% des polysaccharides constitutifs desdites héparines possèdent à leur extrémité réductrice une liaison covalente avec un groupe -(RI)1-BiOt, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
8. Héparines selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que lesdites héparines sont d'origine porcine. θ. Héparines selon la revendication 8, caractérisées en ce que lesdites héparines sont issues de muqueuses intestinales de porc.
10. Procédé pour la préparation des héparines biotiπylées telles que définies dans l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'aminé et d'un agent réducteur, à une température comprise entre 20 et 800C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(R1),-Biot activé, où R1, i et Biot sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, en présence d'une base en milieu aqueux ou en milieu organique.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on traite l'héparine avec l'héparinase 3, b) puis on effectue une amination réductrice sur le produit précédemment obtenu en présence d'un sel d'halogénure d'ammonium et d'un sel de borohydrure, à une température comprise entre 50 et 80°C, c) enfin on effectue une acylation avec un groupe -(RI)1-BiOt sous forme d'ester activé, en présence d'une base en milieu aqueux.
12. Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une héparine biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou un sel pharmaceutiquement acceptable desdites héparines biotinylées.
13. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que principe actif, une héparine biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ou un sel pharmaceutiquement acceptable desdites héparines biotinylées, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
14. Utilisation d'une héparine biotinylée selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 en tant que médicament antithrombotique.
15. Utilisation selon la revendication 14 pour le traitement et la prévention des thromboses veineuses, des accidents thrombotiques artériels, notamment dans le cas d'infarctus du myocarde ou d'angor instable, des thromboses artérielles périphériques, telles que les arthériopathies des membres inférieurs, des thromboses artérielles cérébrales, des accidents vasculaires cérébraux, pour le traitement et la prévention de la prolifération des cellules musculaires lisses, de l'angiogénèse, et comme agent neuroprotecteur de l'athérosclérose et de l'artériosclérose.
16. Procédé mettant en œuvre l'avidine ou la streptavidine, caractérisé en ce qu'il permet de neutraliser les héparines biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
17. Utilisation d'avidine ou de streptavidine pour la préparation de médicaments destinés à neutraliser les héparines biotinylées selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
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