KR20090109105A

KR20090109105A - 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 헤파린, 이의 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20090109105A
Application number: KR1020097016909A
Authority: KR
Inventors: 필립 위베르; 피에르 무리에; 크리스티앙 비스코브
Original assignee: 사노피-아벤티스
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2008-02-12
Publication date: 2009-10-19
Also published as: FR2912408A1; AR065328A1; CA2678166A1; TW200902036A; RU2009134160A; IL199880A0; WO2008113918A1; CN101605549A; JP2010518251A; BRPI0808070A2; AU2008228161A1; MX2009008025A; EP2120970A1; US20100075922A1

Abstract

본 발명은 바이오티닐화된 헤파린의 성분을 이루는 다당류가 그의 환원 말단에서 -(R1)_i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖고 하기 화학식 I에 상응하는 것을 특징으로 하는 바이오티닐화된 헤파린에 관한 것이다.

<화학식 I>

상기 식에서,

i는 0 또는 1이고,

R1은 화학식 -CO-(CH₂)_j-NH- 또는 -CO-(CH₂)_jNH-CO-(CH₂)_k-NH의 쇄이고, 여기서의 j 및 k는 1 내지 10의 임의의 값을 갖는 정수이고,

Biot는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체 기이고,

n은 15,000 Da의 평균 분자 질량을 갖는 헤파린에 대한, 약 25의 평균값을 갖는 정수이고,

X는 H 또는 SO₃Na이고,

Y는 COCH₃ 또는 SO₃Na이며,

물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽의 결합을 나타낸다.

본 발명은 또한 상기 바이오티닐화된 헤파린의 제조 방법, 및 치료요법에서의 이의 용도에 관한 것이다.

바이오티닐화된 헤파린, 다당류, 헤파리나제, 바이오틴, 혈전증

Description

바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 헤파린, 이의 제조 방법 및 이의 용도 {HEPARINS INCLUDING AT LEAST ONE COVALENT BOND WITH BIOTIN OR A BIOTIN DERIVATIVE, METHOD FOR PREPARING SAME AND USE THEREOF}

본 발명은 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 함유하는 헤파린, 및 이의 제조 방법, 이를 함유하는 제약 조성물 및 이의 치료 용도에 관한 것이다.

헤파린은 약 15,000 달톤 (Da)의 분자량을 갖는 동물 기원의 황산화 뮤코다당류의 혼합물이다. 헤파린 또는 헤파린들에 대해 다음을 참조할 것이다: 헤파린의 다당류 쇄의 구조, 평균 분자 질량 및 다분산성은 실제로는 헤파린이 유도된 동물 종 및 기관에 따라 달라질 수 있다 (예: 돼지의 점막 헤파린, 소의 장 헤파린 등).

헤파린은, 특히 항-트롬빈 III (ATIII)를 통해, 혈액 응고 연쇄반응에 참여하는 2가지 효소, 즉 인자 Xa 및 인자 IIa (또는 트롬빈)의 억제에 촉매작용을 한다. 따라서, 이것은 그의 항-응고성 및 항-혈전성으로 인해 치료적으로 사용된다.

그러나, 헤파린은 사용 조건에 제약이 있다는 단점이 있다. 특히, 이것의 높은 항-응고 활성 (특히, 이것의 높은 항-인자 IIa 활성)은 출혈을 야기할 수 있다 [Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 5, sup. 3, 1999]. 헤파린 유도체는 이러한 바람직하지 못한 출혈 부작용에 대하여 공지되어 있다.

혈전증 치료의 분야에서는, 출혈의 유도를 피하는 동시에 혈액 유동성을 재확립하거나 유지시키는 것이 목적이다. 사실, 치료를 받고 있는 환자에게서는 임의의 우발적인 이유로 출혈이 유발될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 항-혈전증 치료를 받고 있는 환자에게 외과적 수술을 수행할 필요가 있을 수도 있다. 또한, 특정 외과적 수술 도중에 혈액 응고를 예방하기 위하여 항-응고제가 고용량으로 사용될 수 있고, 수술 종료시에는 이를 중화시는 것이 바람직하다. 따라서, 언제라도 항-응고 활성을 중단시키는 중화가능한 항-혈전제가 필요하다.

중화가능한 항-혈전제, 예컨대 바이오티닐화된 합성 다당류는 특허 출원 WO 02/24754 및 WO 06/030104에 기재되어 있다. 이들의 합성법, 특히 상기 언급한 다당류 자체가 아니라 이들 다당류의 보호된 등가물에 대해 수행되는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체의 접합을 포함하는 합성법은 본 발명의 화합물에 적용가능하지 않다. 그 이유는, 바이오티닐화는 완성된 생성물 상에서 수행하는 것이 바람직한데, 상기 완성된 생성물은 다당류의 혼합물이어서 불균질 생성물이기 때문에, 여기에 상기 언급한 특허 출원서에 기재된 바와 같이 바이오틴을 접합시키는 것은 접합 위치의 충분한 위치선택성을 유도할 수 없게 하고, 헤파린의 모든 관능화가능한 다당류 쇄를 바이오티닐화하는 것을 허용하지 않기 때문이다.

오스몬드(Osmond) 등의 팀은 문헌 [Analytical Biochemistry, 31 (2002) 199-207]에서 돼지 헤파린을 바이오티닐화하는 몇몇 기술을 기재하였고, 이러한 기술 중 하나는 환원적 아미노화에 이은 바이오틴과의 커플링을 통해 바이오틴을 헤파린의 환원 말단에 커플링시키는 것을 포함하는 것으로 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌에 기재된 작업 조건으로는 바이오티닐화된 헤파린을 완전하고 재현가능하게 수득하지 못한다. 이들은 헤파린의 구조적 다양성 및 시판 헤파린에 존재하는 것과 같은 다당류 쇄의 실제 구조를 고려하지 않았다. 시판 헤파린은 그의 환원 말단에, 오스몬드 등에 의해 기재된 프로토콜에 따라서는 바이오틴으로 관능화할 수 없는 분해된 글리코세린을 함유하는 다당류 쇄를 높은 비율로 포함한다. 따라서, 돼지 헤파린의 바이오티닐화에 대하여 상기 문헌에 기재된 작업 조건으로는 효율적인 중화를 허용하기에 충분한 정도의 바이오티닐화와 같은 기대되는 특성을 갖는 바이오티닐화된 헤파린을 완전하고 재현가능하게 수득하지 못한다.

쳉(Tseng) 등의 팀은 문헌 [Biomaterials, 27 (2006), 2627-2636]에서 아비딘과의 상호작용에 의해 헤파린을 필름에 고정시킨 후에 헤파린을 바이오틴으로 관능화하는 기술을 기재하였다. 헤파린의 바이오티닐화는 요오드를 사용한 산화에 이어, 락톤의 형성 및 이후 바이오틴 2-(4-아미노페닐)에틸아민 유도체와의 커플링을 통해 수행된다. 그러나, 쳉 등이 제시한 작업 조건으로는 환원 말단에서 바이오티닐화된 헤파린이 전체적이고 재현가능하게 생성될 것이라고 기대되지 않으며, 특히, 산화 단계가 환원 말단에 선택적일 수 있다거나, 헤파린의 생물학적 활성이 이러한 처리 이후에도 보존된다는 것이 나타나지 않는다.

켓(Kett) 등의 팀은 문헌 [Biochimica and Biophysica Acta, 1620 (2003), 225-234]에서, 아비딘과 다양한 글리코사미노글리칸 사이의 친화성 연구를 기재하였고, 아비딘이 헤파린에 대해 강력한 친화성을 나타냄을 증명하였다. 상기 친화성 연구에서, 헤파린은 바이오틴으로 유도될 수 있지만, 헤파린의 다당류 쇄에서 바이오티닐화 부위에 대한 표시는 존재하지 않았다.

따라서, 본 출원인은 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 중화시킬 수 있고 천연 헤파린에 필적하는 생물학적 성질을 보유하는 신규한 헤파린을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 다당류 성분이 그의 환원 말단에서 -(R1)_i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖고 하기 화학식 I에 상응하는 것을 특징으로 하는, 이하 "바이오티닐화된 헤파린"이라 지칭되는 신규한 변형된 헤파린 및 그의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다.

상기 식에서,

i는 0 또는 1이고,

R1은 화학식

또는

의 배열을 나타내고, 여기서의 j 및 k는 동일하거나 상이할 수 있으며, 1 내지 10의 임의의 값일 수 있는 정수이고,

Biot는 바이오틴기 또는 바이오틴 유도체를 나타내고,

n은 15,000 Da의 평균 분자 질량을 갖는 헤파린에 대한, 약 25의 평균값을 갖는 정수를 나타내고,

X는 H 또는 SO₃Na를 나타내고,

Y는 COCH₃ 또는 SO₃Na를 나타내며,

물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽에 위치하는 결합을 나타낸다.

놀랍게도, 바이오틴 또는 바이오틴 유도체를 다당류 쇄의 환원 말단에 도입하는 것은 헤파린의 약리 활성을 변형시키지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 대상인 신규한 바이오티닐화된 헤파린은 천연 헤파린, 즉 바이오티닐화 이전의 헤파린에 필적하는 항-혈전 활성을 갖는다.

이들은 천연 헤파린에 비해 상당한 이점을 갖는다: 이들은 비상시에 특정 해독제에 의해 신속하게 중화될 수 있다. 이러한 특정 해독제는 사량체 또는 단량체 형태의 아비딘, 또는 스트렙트아비딘으로, 각각의 질량은 약 66,000, 16,400 및 60,000 Da이다 [The Merck Index, Twelfth edition, 1996, M.N. 920, pages 151- 152, Revue Pierce Avidin-Biotin Handbook].

이들은 또한 사용 용량이 보다 높은 치료 적응증에 유용한 동시에 출혈의 위험은 적다는 이점이 있고, 이에 따라 동맥 치료 분야에서 유용할 수 있다.

상기 언급한 바이오틴 (Biot)기는 헥사히드로-2-옥소-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-펜탄산으로부터 유도된 라디칼이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 화학식 I에서의 Biot기는 화학식

에 상응한다.

바이오틴 유도체는 시판되거나 ("피어스(Pierce)" 바이오틴-아비딘 제품 카탈로그, 2005, 제7면 내지 제11면), 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 특히, 특허 출원 WO 02/24754에서 언급된 바이오틴 유도체를 언급할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린에서, 지수 i는 0일 수 있고, 이 경우에는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 결합이 다당류 쇄의 환원 말단 상의 당 단위가 보유하는 아민 관능기에서 직접적으로 이루어진다.

다르게는, i는 1일 수 있고, 바이오틴기 또는 바이오틴 유도체와의 결합은, 예를 들어 상기 화학식 (a)에서 j가 5인 배열 또는 상기 화학식 (b)에서 j 및 k가 동일하게 5인 배열로 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 화학식 I에서 R1은, 예를 들어 화학식 -CO-(CH₂)₅-NH 또는 -CO-(CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₅-NH-의 배열을 나타낼 수 있 다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "환원 말단"은 말단 글루코사민 또는 만노사민 (만노사민은 글루코사민의 염기성 매질 중에서의 에피머화로 인해 생성됨)이 하기 화학식 II에 상응하는 시클릭 헤미아세탈 관능기를 갖는 다당류 쇄의 말단을 의미한다.

상기 식에서,

X는 H 또는 SO₃Na를 나타내고,

Y는 COCH₃ 또는 SO₃Na를 나타내며,

물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽에 위치하는 결합을 나타낸다 (아래: 글루코사민, 위: 만노사민).

용어 "헤파린의 다당류 성분"은 N-황산화 또는 N-아세틸화될 수 있는 유론산 잔기 (D-글루쿠론산 또는 L-이두론산) 및 D-글루코사민 잔기를 함유하는 이당류 단위가 반복되어 있는 것을 특징으로 하는 다당류를 의미한다. 상기 이당류 단위는 또한 D-글루코사민의 위치 C6 및/또는 C3 및 유론산의 위치 C2에서 O-황산화될 수도 있다 [Heparin-binding proteins, H. Edward Conrad, 1998, p. 1].

앞서 나타낸 바와 같이, 헤파린은 동물 기원의 황산화 뮤코다당류의 혼합물 이다. 천연 헤파린, 즉 바이오티닐화 이전의 출발 헤파린을 "헤파린"이라 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 헤파린은 구체적으로 소, 양 또는 돼지 기원의 것일 수 있고; 더욱 구체적으로 이들은 소의 혀, 소의 장 점막, 돼지의 장 점막 또는 양의 장 점막으로부터 유도될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에서 사용되는 헤파린은 돼지 기원의 것, 예를 들어 돼지 장 점막으로부터 유도된 것이다.

본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린은 헤파린의 본래 구조와 상관없이, 상기 헤파린의 다당류 성분 중 60％ 이상, 유리하게는 64％ 이상이 그의 환원 말단에서 -(R1)_i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖고 상기 정의된 바와 같은 화학식 I에 상응하며; 유리하게는 상기 헤파린의 다당류 성분 중 80％ 이상이 그의 환원 말단에서 -(R1)_i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖는다.

본 발명은 임의의 제약상 허용가능한 염 형태의 바이오티닐화된 헤파린을 포함한다.

본 발명의 대상은 또한,

a) 헤파린을 헤파리나제 3으로 처리하고,

b) 이후, 아민 염 및 환원제의 존재하에 20℃ 내지 80℃의 온도에서, 앞서 수득한 생성물에 환원적 아미노화를 수행하고,

c) 끝으로, 수성 매질 또는 유기 매질 중 염기의 존재하에, 활성화된 -(R1)_i-Biot기 (여기서, R1, i 및 Biot는 상기 화학식 I과 관련하여 정의된 바와 같 음)에 의해서 아실화를 수행하는 것

을 특징으로 하는, 상기 언급한 바이오티닐화된 헤파린의 제조 방법이다.

상기 제조 방법의 단계는 헤파리나제 1, 2 및 3의 혼합물 존재하에 헤파린-기재 혼합물의 성분을 탈중합한 후, 분석적 HPLC 모니터링, 특히 SAX 유형, 더욱 특히 CTA-SAX 유형의 분석적 HPLC 모니터링에 의해 제어될 수 있다. 이러한 분석적 모니터링은, 예를 들어 특허 출원 US 2005/0 186 679 A1에 기재된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

특히, 환원적 아미노화 단계 b) 후에, 상기 헤파린의 다당류 성분 중 80％ 이상, 유리하게는 90％ 이상이 그의 환원 말단에 -NH₂ 관능기를 보유한 것이 확인된다 (아미노-환원된 다당류).

특히, 아실화 단계 c) 후에, 상기 아미노-환원된 다당류 중 80％ 이상, 유리하게는 90％ 이상이 바이오티닐화된 것이 확인된다.

따라서, 본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린 제조 방법의 전체 수율은 60％ 이상이고, 유리하게는 64％ 이상이다. 유리하게는, 상기 수율은 80％ 이상이다.

이하의 용어들은 하기와 같이 정의된다:

- 헤파리나제 1: 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum)으로부터의 효소 헤파린 라이아제 I (EC 4.2.2.7).

- 헤파리나제 2: 플라보박테리움 헤파리눔으로부터의 효소 헤파린 라이아제 II,

- 헤파리나제 3: 플라보박테리움 헤파리눔으로부터의 효소 헤파린 라이아제 III (EC 4.2.2.8).

헤파리나제 3은 헤파린의 다당류 쇄의 단백질 (글리코세린)에 대한 결합 영역을 제거할 수 있어서, 환원 말단에 글리코세린 잔기가 없는 쇄의 생성을 가능하게 한다. 헤파리나제 1 및 2는 다당류 쇄를 저분자량의 단편으로 절단할 수 있다 (헤파린 탈중합 반응).

본 발명에 따른 화합물의 제조 방법은 출발 헤파린 ("천연" 헤파린)으로서 문헌에서 이미 보고된 바와 같이 제조된 헤파린을 사용한다. 구체적으로는, 문헌 ["L'heparine, fabrication, structure, proprietes, analyses", J.P. Duclos, published by Masson, 1984]을 참조할 것이다. 상기 헤파린은 구체적으로는 특허 출원 US 2005/0 215 519 A1에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

상기 제조 방법 중 환원적 아미노화 단계 b)에서, 아민 염은 4급 아민 염일 수 있고; 유리하게는 화학식 NH₄Z (여기서, Z는 할로겐 원자, 예컨대 염소, 불소, 브롬 또는 요오드 원자를 나타냄)에 상응하는 암모늄 할라이드 염이다.

상기 제조 방법 중 환원적 아미노화 단계 b)에서, 환원제는 보로하이드라이드 염, 예를 들어 시아노보로하이드라이드 염일 수 있다.

상기 제조 방법 중 환원적 아미노화 단계 b)에서, 온도는 50℃ 내지 80℃인 것이 유리하다.

상기 제조 방법 중 아실화 단계 c)에서, 염기는 탄산염 또는 탄산수소염, 특히 나트륨염 또는 칼륨염 형태, 또는 다르게는 당업자에게 공지된 임의의 수용성 또는 유기용해성 유기 염기일 수 있다.

상기 제조 방법 중 아실화 단계 c)에서, 용어 "유기 매질"은, 예를 들어 디클로로메탄 또는 디메틸포름아미드를 의미한다.

본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린의 제조 방법은 유리하게는,

a) 헤파린을 헤파리나제 3으로 처리하는 단계,

b) 암모늄 할라이드 염 및 보로하이드라이드 염의 존재하에 50℃ 내지 80℃의 온도에서, 앞서 수득한 생성물에 환원적 아미노화를 수행하는 단계,

c) 끝으로, 수성 매질 중 염기의 존재하에, 활성화된 에스테르 형태의 상기 정의된 바와 같은 -(R1)_i-Biot기에 의해서 아실화를 수행하는 단계

를 포함한다.

상기 정의된 바와 같은 바이오티닐화된 유도체 -(R1)_i-Biot는, 당업자에게 공지된 표준 커플링 반응을 사용하여, 미리 형성되거나 동일계 내에서 생성된 활성화된 에스테르의 형태로 아실화 반응에 직접 사용된다. 특히, N-히드록시숙신이미드 유도체 또는 3-술포-N-히드록시숙신이미드 유도체 형태의 활성화된 에스테르를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 제조 방법은 하기 반응식 1로 예시된다:

반응식 1에 따라, 헤파린을 헤파리나제 3으로 처리하여 잔존한 단백질 결합 (즉, 천연 또는 분해된 글리코세린)을 제거하고 글리코세린 잔기가 없는 환원 말단을 포함하는 화합물 1을 수득한다. 이후, 상기 헤파린 (화합물 1)에 아민 염 및 환원제, 예컨대 보로하이드라이드 염의 존재하에서 환원적 아미노화를 실시하여, 환원 말단에 아민 관능기를 함유하지 않은 화합물 2를 제조할 수 있다.

이후, 상기 화합물을 염기의 존재하에 상기 정의된 바와 같은 활성화된 바이오틴 유도체 -(R1)_i-Biot와의 반응을 통해 아실화시켜 바이오티닐화된 화합물 3을 제공할 수 있다. 상기 반응은, 예를 들어 R1이 -CO-(CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₅-NH-의 배열을 나타내는 경우에는 에스테르 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도헥사노일 헥사노에이트의 나트륨염으로 수행시키거나, 또는 R1이 -CO-(CH₂)₅-NH-의 배열을 나타내 는 경우에는 에스테르 3-술포숙신이미딜 6-바이오틴아미도 헥사노에이트의 나트륨염으로 수행시키거나, 또는 다르게는 R1이 존재하지 않는 경우 (i = 0)에는 바이오티노일-3-술포숙신이미딜 에스테르의 나트륨염으로 수행시킬 수 있다.

반응식 1에서, 화합물 1, 2 및 3은 다당류 쇄의 혼합물의 헤파린 유도체로서 단지 이론적으로 도시한 것임을 이해해야 한다.

이하에서는, 본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린 및 이를 수득하는 데 유용한 각종 중간체의 합성예를 예시를 통해 상세히 기술한다.

하기 약어가 사용된다:

EPB 헤파린: 바이오이베리카(Bioiberica)사에서 시판중인 헤파린;

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피;

SAX: 강 음이온 교환 크로마토그래피;

CTA: 세틸 트리메틸 암모늄;

qs: 충분량;

LC: 6-아미노헥사노일 배열에 상응하는 장쇄;

술포-NHS: 3-술포숙신이미딜 에스테르의 나트륨염;

헤파리나제 1: 플라보박테리움 헤파리눔으로부터의 효소 헤파린 라이아제 I (EC 4.2.2.7);

헤파리나제 2: 플라보박테리움 헤파리눔으로부터의 효소 헤파린 라이아제 II;

헤파리나제 3: 플라보박테리움 헤파리눔으로부터의 효소 헤파린 라이아제 III (EC 4.2.2.8).

실시예 1

1.1 헤파리나제 3에 의한 탈중합에 의해 정제된 EPB 헤파린:

약 20℃의 온도에서, 미정제 EPB 헤파린 1 g을 15 ml의 pH 7.0±0.1로 조정된 5 mM 인산나트륨 수용액, 20 mM 염화나트륨 및 1 mg/ml의 BSA에 용해시켰다. 0.5 IU의 헤파리나제 3을 헤파린 용액에 첨가하였다. 수득된 반응 혼합물을 5일 동안 교반하였다. 염화나트륨 1 g 및 메탄올 45 ml를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수득된 현탁액을 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하였다. 케이크를 메탄올 및 디에틸 에테르로 세척한 후, 진공하에 건조시켰다. 백색 고체 0.98 g을 수득하였다. 관찰된 수율은 98％였다.

생성물은 헤파리나제 1, 2 및 3의 혼합물을 사용한 탈중합에 의해 제어되고, 특허 출원 US 2005/0 186 679 A1에 기재된 방법을 사용하여 HPLC-SAX에 의해 분석될 수 있다. 결과는 출발 헤파린에 존재하는 글리코세린 종의 80％ 이상이 소실되었음을 보여주었다.

1.2 헤파리나제 3에 의해 탈중합되고 아미노-환원된 헤파린:

헤파리나제 3에 의해 정제된 헤파린 0.5 g을 5 M 염화암모늄 수용액에 용해 시켰다. 나트륨 시아노보로하이드라이드 0.5 g을 헤파린 용액에 첨가하였다. 혼합물을 70℃에 24시간 동안 유지시켰다. 용액을 약 20℃의 온도로 냉각시키고, 물 (qs 50 ml)로 희석한 후, 세파덱스(Sephadex) G10 칼럼에서 탈염시켰다. 수득된 분획물을 Q-세파로스(Sepharose) 칼럼에 주입하였다. 생성물을 물로 희석한 후에 과염소산나트륨의 구배로 희석하였다. 수득된 생성물을 세파덱스 G10 칼럼에서 탈염시킨 후, 동결건조시켰다. 백색 동결건조물 444 mg을 수득하였다. 관찰된 수율은 89％였다. 생성물을 추가 정제 없이 하기 아실화 단계에서 사용하였다.

1.3 헤파리나제 3에 의해 탈중합되고 아미노-환원되고 바이오티닐화된 헤파린:

아미노-환원된 탈중합 헤파린 200 mg을 약 20℃의 온도에서 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 2 ml에 용해시켰다. 술포-NHS-LC-바이오틴 37 mg을 수득된 용액에 첨가하였다. 수득된 용액을 약 20℃의 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 4 ml로 희석하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 37 mg을 첨가하고, 수득된 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 추가의 술포-NHS-LC-바이오틴 37 mg을 첨가하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 수득된 반응 매질을 물 (qs 200 ml)로 희석하고, 0.45 ㎛ 멤브레인 상에서 여과하고, Q-세파로스 칼럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨의 구배로 용출시켰 다. 수득된 생성물을 세파덱스 G10 칼럼에서 탈염시킨 후, 동결건조시켰다. 백색 동결건조물 188 mg을 수득하였다. 관찰된 수율은 94％였다.

생성물은 헤파리나제 1, 2 및 3의 혼합물을 사용한 탈중합에 의해 제어되고, 특허 출원 US 2005/0 186 679 A1에 기재된 방법을 사용하여 HPLC-SAX에 의해 분석될 수 있다.

실시예 2

2.1 헤파리나제 3에 의해 탈중합된, US 2005/0 215 519 A1에 따라 수득된 헤파린:

약 20℃의 온도에서, US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린 1 g을 15 ml의 pH 7.0±0.1로 조정된 5 mM 인산나트륨 수용액, 20 mM 염화나트륨 및 1 mg/ml의 BSA에 용해시켰다. 0.5 IU의 헤파리나제 3을 헤파린 용액에 첨가하였다. 수득된 반응 혼합물을 7일 동안 교반하였다. 염화나트륨 1 g 및 메탄올 45 ml를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수득된 현탁액을 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하였다. 케이크를 메탄올 및 디에틸 에테르로 세척한 후, 진공하에 건조시켰다. 백색 고체 0.96 g을 수득하였다. 관찰된 수율은 96％였다.

2.2 헤파리나제 3에 의해 탈중합되고 아미노-환원된, US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린:

헤파리나제 3으로 처리한 US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린 0.5 g을 5 M 염화암모늄 수용액 20 ml에 용해시켰다. 나트륨 시아노보로하이드라이드 0.5 g을 헤파린 용액에 첨가하였다. 혼합물을 70℃에 24시간 동안 유지시켰다. 용액을 약 20℃의 온도로 냉각시키고, 물 (qs 50 ml)로 희석한 후, 세파덱스 G10 칼럼에서 탈염시켰다. 수집한 분획물을 동결건조시켰다. 백색 동결건조물 446 mg을 수득하였다. 관찰된 수율은 89％였다. 생성물을 추가 정제 없이 하기 아실화 단계에서 사용하였다.

2.3 헤파리나제 3에 의해 탈중합되고 아미노-환원되고 바이오티닐화된, US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린:

아미노-환원된 탈중합 헤파린 200 mg을 약 20℃의 온도에서 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 2 ml에 용해시켰다. 술포-NHS-LC-바이오틴 37 mg을 수득된 용액에 첨가하였다. 용액을 약 20℃의 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 0.5 M 탄산수소나트륨 용액 4 ml로 희석하였다. 술포-NHS-LC-바이오틴 37 mg을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 추가의 술포-NHS-LC-바이오틴 37 mg을 첨가하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 수득된 반응 매질을 물 (qs 200 ml)로 희석하고, 0.45 ㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, Q-세파로스 칼럼에 주입하였다. 생성물을 물로 용출시킨 후에 과염소산나트륨의 구배로 용출시켰다. 수득된 생성물을 세파덱스 G10 칼럼에서 탈염시킨 후, 동결건조시켰다. 백색 동결건조물 188 mg을 수득하였다. 관찰된 수율은 94％였다.

본 발명에 따른 화합물로 생화학 및 약리학 연구를 실시하였다.

항-인자 IIa 활성 및 항-인자 Xa 활성의 측정

인간 혈장 또는 완충제 시스템에서의 항-인자 IIa (항-FIIa) 활성 및 항-인자 Xa (항-FXa) 활성을 발색 방법을 통해 분석하였다: 항-인자 IIa 활성은 발색 기질 S-2238, α-트롬빈 및 인간 ATIII (항-트롬빈 III)를 함유하는 악티크롬(Actichrome) 헤파린 항-인자 IIa 키트 (아메리칸 다이아그노스티카(American diagnostica))를 사용하여 시험하였다. 항-FXa 활성은 자동화 응고 장치 ACL 7000 (인스트루멘테이션 래버러토리(Instrumentation Laboratory))에서 ATIII, 인자 Xa 및 발색 기질 S-2765를 함유하는 헤파린 키트 (인스트루먼테이션 래버러토리)를 사용하여 측정하였다. 상기 2가지 분석을 제조업체의 지시에 따라 수행하였다.

인간 혈장 및 완충제 시스템에서의 바이오티닐화된 헤파린 분획물의 시험관내 활성을 측정하기 위한 표준 보정 곡선을 수립하는 데 하기 표준물을 사용하였다:

- 저분자량 헤파린에 대한 첫 번째 국제 표준물 (영국 런던 소재의 국립 생물학 표준 및 통제 연구소(National Institute for Biological Standards and Control), 1987년 수립, 코드 번호 85/600),

- 저분자량 헤파린에 대한 두번째 국제 표준물 (영국 런던 소재의 국립 생물학 표준 및 통제 연구소, 1987년 수립, 코드 번호 01/608, 2006년 6월 이후 사용),

- 에녹사파린 (클렉산(Clexane)^®, 프랑스 소재의 사노피-아벤티스(sanofi-aventis))을 내부 기준물로서 사용하였다.

항-FIIa 활성의 측정을 위해서, 샘플 또는 국제 저분자량 헤파린 표준물 10 ㎕를 인간 혈장, 또는 0.05 M 트리스 HCl, 0.154 M NaCl을 함유하는 완충제 시스템 (pH 7.4) 중 항-트롬빈을 사용하여 1:16으로 희석하였다. 상기 용액 10 ㎕를 96-웰 미량적정 플레이트에 첨가하였다. 측정은 3벌로 (3개 웰에서) 반복하였다. 상기 미량적정 플레이트를 37℃로 유지시키면서 300 rpm으로 교반하였다. 트롬빈 40 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 정확하게 2분 동안 인큐베이션하였다. 스펙트로자임(Spectrozyme) 40 ㎕를 첨가하였다. 90초 후에, 아세트산 40 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 340 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))을 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

항-FXa 활성 측정을 위해서, 샘플 또는 국제 저분자량 헤파린 표준물을 인간 혈장, 또는 0.05 M 트리스 HCl, 0.154 M NaCl을 함유하는 완충제 시스템 (pH 7.4)에 희석하였다. 혈장 또는 완충제 중에 헤파리노이드를 함유하는 샘플을, ATIII를 함유하는 작동 완충제를 사용하여 1:20으로 다시 희석하고, 프로브 로터에 2벌로 넣었다. 인자 Xa 시약 및 발색 기질을 자동화 응고 장치 ACL 7000의 정해진 저장고에 넣었다.

항-FXa 활성 측정은 ACL 7000 소프트웨어에 통합된 "헤파린" 프로토콜로 수행하였다. 분석하는 동안에 샘플 (작동 완충제로 희석한 것) 50 ㎕를 인자 Xa 시약 50 ㎕와 혼합하였다. 37℃에서 60초 동안의 인큐베이션 시간이 지난 후에, 1.1 mM 농도의 발색 기질 50 ㎕를 첨가하고, 시간의 함수로서의 흡광도 변화를 405 nm의 파장에서 측정하였다.

얻어진 결과를 구체적으로 하기 표에 기재하였다.

	항-FXa 활성 (IU/mg)
EPB 헤파린	235
헤파리나제 3에 의해 정제된 EPB 헤파린	251
헤파리나제 3에 의해 정제되고 아미노-환원된 EPB 헤파린	217
헤파리나제 3에 의해 정제되고 아미노-환원되고 바이오티닐화된 EPB 헤파린	218
US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린	214
헤파리나제 3에 의해 정제된, US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린	257
헤파리나제 3에 의해 정제되고 아미노-환원된, US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린	203
헤파리나제 3에 의해 정제되고 아미노-환원되고 바이오티닐화된, US 2005/0 215 519 A1에 따른 헤파린	214

이에 따라, 출발 천연 헤파린과의 비교에 의해, 본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린의 항-FXa 활성이 보존됨을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린은 약제의 제조에 사용될 수 있다. 이들은 특히 항-혈전성 약제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 대상은 상기 정의된 바와 같은 바이오티닐화된 헤파린을 포함하는 약제이다. 이들 약제는 치료제로서, 특히 정맥 혈전증, 동맥 혈전증 사고, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증, 말초 동맥 혈전증, 예컨대 하지 동맥병증, 대뇌 동맥 혈전증 및 뇌졸중의 경우에서의 치료 및 예방에 사용된다. 이들은 또한 평활근 세포의 증식 또는 혈관신생의 예방 및 치료, 및 아테롬성 동맥경화증 및 동맥경화증에 대한 신경보호제로서도 유용하다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명은 또한 유효 용량의 본 발명에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 언급한 병상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 상기 언급한 병상의 치료 및 예방에서의 상기 정의된 바와 같은 바이오티닐화된 헤파린의 용도는 본 발명의 일부를 구성하며, 이들 병상의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 상기 바이오티닐화된 헤파린의 용도 역시 본 발명의 일부를 구성한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 대상은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염, 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 불활성 부형제를 포함하는 제약 조성물이다. 상기 부형제는 원하는 제약 형태 및 투여 방식, 예를 들어 경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 경점막, 국소 또는 직장 경로에 따라 선택된다.

각각의 투여량 단위에서, 활성 성분은 원하는 예방 또는 치료 효과를 얻기 위해 예상되는 1일 용량에 적합한 양으로 존재한다. 각각의 투여량 단위는 25 내지 150 mg, 유리하게는 30 내지 100 mg의 활성 성분을 함유할 수 있다. 이들 항-응고제 화합물은 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 중화될 수 있다.

더 높거나 더 낮은 투여량이 적절한 특수한 경우가 있을 수 있으며; 이러한 투여량이 본 발명의 맥락에서 벗어나는 것은 아니다. 통상의 관행에 따라, 각 환자에게 적합한 투여량은 투여 방식 및 상기 환자의 체중 및 반응에 따라 담당 의사가 결정한다.

본 발명에 따른 화합물은 원하는 치료요법에 유용한 1종 이상의 다른 활성 성분, 예컨대 항-혈전제, 항-응고제 또는 항-혈소판 응집제와 조합되어 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 대상은 본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린을 중화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 사용 방법이다. 따라서, 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 본 발명에 따른 바이오티닐화된 헤파린을 중화시키기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

Claims

바이오티닐화된 헤파린의 다당류 성분이 그의 환원 말단에서 -(R1)i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖고 하기 화학식 I에 상응하는 것을 특징으로 하는, 바이오티닐화된 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.

<화학식 I>

상기 식에서,

i는 0 또는 1이고,

R1은 화학식
또는
의 배열을 나타내고, 여기서의 j 및 k는 동일하거나 상이할 수 있으며, 1 내지 10의 임의의 값일 수 있는 정수이고,

Biot는 바이오틴기 또는 바이오틴 유도체를 나타내고,

n은 15,000 Da의 평균 분자 질량을 갖는 헤파린에 대한, 약 25의 평균값을 갖는 정수를 나타내고,

X는 H 또는 SO₃Na를 나타내고,

Y는 COCH₃ 또는 SO₃Na를 나타내며,

물결모양의 선은 이것이 부착된 피라노스 고리의 평면 아래쪽 또는 위쪽에 위치하는 결합을 나타낸다.
제1항에 있어서, i가 0인 것을 특징으로 하는, 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항에 있어서, i가 1이고, R1이 화학식 (a)에서 j가 5인 배열을 나타내는 것을 특징으로 하는, 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항에 있어서, i가 1이고 R1이 화학식 (b)에서 j 및 k가 동일하게 5인 배열을 나타내는 것을 특징으로 하는, 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Biot가

화학식
의 바이오틴기를 나타내는 것을 특징으로 하는, 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 헤파린의 다당류 성분 중 64％ 이상이 그의 환원 말단에 -(R1)_i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖는 것을 특징으로 하는, 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제6항에 있어서, 헤파린의 다당류 성분 중 80％ 이상이 그의 환원 말단에 -(R1)_i-Biot기에 대한 공유 결합을 갖는 것을 특징으로 하는, 헤파린 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 기원의 헤파린.
제8항에 있어서, 돼지의 장 점막으로부터 유도된 헤파린.
a) 헤파린을 헤파리나제 3으로 처리하는 단계,

b) 이후, 아민 염 및 환원제의 존재하에 20℃ 내지 80℃의 온도에서, 앞서 수득한 생성물에 환원적 아미노화를 수행하는 단계,

c) 끝으로, 수성 매질 또는 유기 매질 중 염기의 존재하에, 활성화된 -(R1)_i-Biot기 (여기서, R1, i 및 Biot는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같음)에 의해서 아실화를 수행하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의 된 바와 같은 바이오티닐화된 헤파린의 제조 방법.
제10항에 있어서,

a) 헤파린을 헤파리나제 3으로 처리하는 단계,

b) 이후, 암모늄 할라이드 염 및 보로하이드라이드 염의 존재하에 50℃ 내지 80℃의 온도에서, 앞서 수득한 생성물에 환원적 아미노화를 수행하는 단계,

c) 끝으로, 수성 매질 중 염기의 존재하에, 활성화된 에스테르 형태의 -(R1)_i-Biot기에 의해서 아실화를 수행하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 바이오티닐화된 헤파린 또는 상기 바이오티닐화된 헤파린의 제약상 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제.
활성 성분으로서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 바이오티닐화된 헤파린 또는 상기 바이오티닐화된 헤파린의 제약상 허용가능한 염, 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 바이오티닐화된 헤파린의 항-혈전성 약제로서의 용도.
제14항에 있어서, 정맥 혈전증, 동맥 혈전증 사고, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증, 말초 동맥 혈전증, 예컨대 하지 동맥병증, 대뇌 동맥 혈전증 및 뇌졸중의 경우에서의 치료 및 예방용, 평활근 세포의 증식 또는 혈관신생의 치료 및 예방용, 및 아테롬성 동맥경화증 및 동맥경화증에 대한 신경보호제로서의 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 바이오티닐화된 헤파린을 중화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 사용 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 바이오티닐화된 헤파린을 중화시키기 위한 약제의 제조에서의 아비딘 또는 스트렙트아비딘의 용도.