TW200902036A - Heparins comprising at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, preparation process therefor and use thereof - Google Patents

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200902036 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於含有至少一個帶有生物素或生物素衍生物 之共價鍵的肝素，且本發明亦係關於用於製備彼等之方 法、含有彼等之醫藥組合物及彼等之治療用途。 【先前技術】 肝素係一種分子量範圍為15000道爾頓（Da)而源自動物

之經硫酸化黏多醣混合物。下文所提及肝素或肝素之結 構、平均分子質量及多賴多分散性實際上會視動物物種 及產生肝素之器官而有所不同（實例：豬黏膜肝素、牛腸 内肝素等）。 肝素會催化（尤其係藉由抗凝血酶ΙΠ (ΑΤΙΠ))兩種參與 凝血反應之酵素（即，因子Xa及因子Ua (或凝企酶））之^ 制作用。鑒於其具有抗凝血及抗血栓形成性質，肝素因此 可用於治療。 然而，肝素具有限制其使用條件 兩抗凝血活性（尤其係其高抗因子na活性）會導致出血 (Seminars in Thr〇mb〇sis _ 以細加5，第 5卷增刊3， 1999)。肝素衍生物已知古 J王初匕知具有該4不為所欲之出血性副作 用0 在>cr療Jk栓形成之領域 _ ^ |小，小々人你里堤或維持血液 流動性，同時避务弓丨恭山 — 避免引1出血。事貫上’衆所周知，由於 ==在接受治療之患者中會引發出血，亦有對接 又抗血㈣成治療之患者實施外科手術之需求。此外，在 128589.doc 200902036 =外科手術過程中，可能會使用高劑量抗凝劑以防止血 液减固，而在手術結束時需要令和該等抗凝劑。因此，在 壬何時點用以中和抗血栓形成劑以終止凝血活性實有苴必 要性。 中和抗血栓形成劑（例如，生物素化合成多醋）已閣述於 專利申請案wo 02/24754及wo _〇 1 〇4中。對上述多酷 之經保護等效物而非對該等多醋自身實施的彼等合成(尤 :包含生物素或生物素衍生物之接枝)不適用於本發明化 合物。其原因在於需對終產物(其係多醣之混合物且因此 為不均勾的產物)實施生物素化，對該等終產物實施如在 上述專射請案巾所述生物素接枝將不可能使接枝位置產 生足夠的區域$擇性’且無法將肝素所有可官能化多聽鍵 施予生物素化。

Osmond等人團隊於分析 Bi〇chemistry, 31 (2〇〇2) 199_斯 中闡述若干用以將豬肝素生物素化之技術，該等技術其中 之一係闡述經由還原胺化反應，隨後與生物素進行偶聯， 以便將生物素偶聯在肝素還原端上。然而，該文獻所述操 作條件無法完全且重複性地獲得生物素化肝素：他們未考 慮肝素之結構多樣性及市售肝素中所存在多醣鏈之真實結 構。後面的肝素包含大量在彼等還原端含有經降解糖基絲 胺酸之多醣鏈，其無法根據〇sm〇nd等人所述步驟將生物 素官能化。因此’該發表文獻發表用以生物素化豬肝素之 操作條件無法完全且重複性地獲得具有期望特性（例如， 足以容許有效地中和之生物素化程度）之經生物素化肝 128589.doc 200902036 素。

Tseng等人團隊於 Bi〇materials，27 (2006), 2627-2636 中 闡述一種藉由將肝素生物素官能化之後與抗生物素蛋白相 互作用，而將肝素固定至膜上之技術。藉由下列對肝素實 施生物素化：用碘進行氧化，隨後形成内酯，且然後與生 物素2_(4_胺基苯基）乙胺衍生物進行偶聯。然而，Tseng等 人所提出操作條件未設想在還原端經生物素化之肝素能夠 完全及重複性生產：具體而言，無證據顯示該氧化步驟對 還原端係具有選擇性，或肝素之生物學活性經此處理後是 經保留的。

Kett等人團隊在Biochimica and別叩吋“⑶^匕，162〇 (2003), 225-234中闡述在抗生物素蛋白與各種葡糖胺聚糖 間之親和性研究，並闡明抗生物素蛋白對肝素具有強親和 性。在此等親和性研究中，肝素係經生物素衍生化，但卻 未指明在肝素多醣鏈中之生物素化位點。 y 因此，本案申請者設定目標係提供新穎肝素，該新穎該 素可與抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素中和，並具有與天 然肝素相當之生物學性質。 【發明内容】 . 本發明係關於新穎經修飾肝素（在下文中稱做”生物素化 肝素Ί，其特徵在於成分多醣在彼等還原端具有結合至基 團-(Rl)i-Biot之共價鍵’且相當於通式⑴結構： 128589.doc 200902036

以及其醫藥上可接受之鹽， 其中： -i等於〇或1， -R1表示通式（a)或（b)之結構：

係為取自 其中j及k可相同或不同 整數， (b) 至10間之任一數值的 -Biot表示生物素基團或生物素衍生物，

η表示平均 -對於平均分子量質量為15000 Da之肝素而古 值為約25之整數， σ -X表示Η或S03Na， -Y表示 C0CH3 或 S03Na， -波形線條係指位於其所連接吡喃糖環平面之下方或上方 之鍵結。 令人驚料’多醣鏈還原端引人生物素或生物素衍生物 並不會改變該等肝素之藥理學活性。特定而言，本發明主 題之該等新穎生物素化肝素具有與天然肝素（即，生物素 128589.doc •10- 200902036 化之則的肝素）相當之抗血栓形成活性。 ，相車又天然肝素’彼等具有相當多優點：在緊急情況下， 彼等可用特異性解毒劑迅速中和。該特異性解毒劑係呈四 聚體或單體形式之抗生物素蛋白，或抗生蛋白鏈菌素，各 自之質置等於約66 _、16彻及60 _ Da(The Merck ⑽以，第十二版，1996, M.N. 92〇，第 151-152 頁，Revue

Pierce Avidin-Biotin Handbook)。 彼等亦具有下列優點：可用於需使用更高劑量之治療適 應症’同時降低出血之風險；彼等因此可用於動脈治療領 域。 上文所述生物素（Bi〇t)基團係衍生自A氫-2-氧代基_1H_ 。塞吩并[3,4♦米°坐·4·戊酸之基團。較佳地，本發明通式⑴ 之Biot基團相當於式（c) : fj—(CH2)r ,s、 Η· Η ΗΝ\/ΝΗ τ (C) 生物素衍生物有市售（"Pierce"生物素_抗生物素蛋白產品 目錄’ 2005 ’第7]丨頁）或可使用彼等熟習此項技術者所知 標準方法來㈣。所提及者尤其可以專利申請案w〇 02/24754中所述生物素衍生物者製得。 在本發明生物素化肝素中，下標i可等於〇,在此情形下 與生物素或生物素衍生物之結合可在由多醣鏈還原端之醣 單元產生的胺官能基上直接製造。 128589.doc 200902036 另一選擇為，i可等於丨，且與生物素基團或生物素衍生 物之結合（例如）由上式（a)之結構（其中〗等於5)或由上式（b) 之結構（其中j及k相同且均等於5)構成。因此，在上式⑴ 中，R1 表示（例如）通式-CO-(CH2)5-NH或-CO_(CH2)5_NH-co-(ch2)5-nh-結構。 在本發明中，術語"還原端"意指其中末端葡萄糖胺或甘 露糖胺（由在葡萄糖胺鹼性介質中之差向異構化產生的甘 露糖胺）具有環狀半縮醛功能之多醣鏈末端，相當於下式 (II):

ν-ΛΟΧ )^〇Η NHY (Π) 其中 -X表示Η或S03Na， -Y表示 COCH3 或 S03Na，且 -波形線表示位於其所連接吡喃糖環平面之下方或上方之 鍵結（下方：葡萄糖胺，上方：甘露糖胺）。 術語”肝素之成分多醣”意指特徵在於含有糖醛酸殘基 (D-葡糖醛酸或L_艾杜糖醛酸）及D_葡萄糖胺殘基之雙醣單 凡重複的多醣，其可經N_硫酸化或經N_乙醯化。雙醣單元 亦可在D-葡萄糖胺之C6及/或C3位置及在糖越酸之C2位置 弟工觉 〇-硫酸化（Heparin_binding pr〇teins，H Edward

Conrad，1998，第 1 頁）〇 128589.doc 12 200902036 如前文所述，肝素係—種源自動物經硫酸 合物。天然肝素，即，名士铷主v ^呢之犯 ”肝素,，。 纟生物素化之W的起始肝素，稱作 本發明所用肝素尤其係指源自有牛、羊或豬者；更且體 而吕，該等肝素可源自牛肺、牛腸黏膜、緒腸黏膜或羊腸 黏膜。較佳地’本發明所用肝素具有豬來源，例如 豬腸黏膜。 目

本發月生物素化肝素應為該等肝素之至少州/。(較佳地， 至少64%)之成分多_在彼等還原端具有結合至基團侦）广 Biot之共價鍵4相當於如上文敎義式⑴，與該肝素之 初始㈣無關；較佳地，該等肝素之至少8㈣成分多糖在 彼等還原端具有結合至基團-(Rl)i-Biot之共價鍵。 本發明涵蓋呈任_彼等醫藥上可接受之鹽形式的生物素 化肝素。 ” 本發明主題亦為一種用於製備上文所述生物素化肝素之 方法’其特徵在於： a)肝素經以肝素酶3處理， ^於胺鹽與還原劑存在下、在⑽與贼間之溫度下，對 月il述所獲得之產物實施還原胺化反應， 0最後在水性介質或有機介質中於鹼存在下，用活性基團 (Rl), Biot實施醯化反應，其中R1、丨及Bi〇t係如前述式⑴ 所界定。 於肝素酶1、2及3之混合物存在下，對基於肝素之混合 物的各成分實施解聚後可藉由分析HPlc監測（具體而言， 128589.doc 13 200902036 係SAX型且更具體而言，係CTA_SAX型）控制以上製備方 法之步驟。可使用（例如）在專利申請案美國專利第us 2005/0 1 86 679 A1號中所述方法來實施此分析監測。 在還原胺化步驟b)之後，尤其應確認該等肝素之至少 80%(較佳地，至少90%)之成分多醣在彼等還原端具有 -NH2官能基（經胺基還原之多醣）。 在醯化步驟c)之後，尤其應確認至少8〇%(較佳地，至少 90%)之該等經胺基還原多酶係經生物素化。 因此，用於製備本發明生物素化肝素之方法的總產率應 為至少60%且較佳應為至少64%。較佳地，此產率係至少 80%。 下列術語界定如下： -肝素酶1 :來自肝黃黃桿菌（Flavobacterium肝素um)之酶 肝素裂解酶I(EC 4.2,2.7) -肝素酶2 :來自肝黃黃桿菌之酶肝素裂解酶π， -肝素酶3:來自肝黃黃桿菌之酶肝素裂解酶πι (Ec 4.2.2.8)。 肝素酶3此夠去除結合肝素多醣鏈之蛋白（糖基絲胺酸） 的區域且產生其還原端不含糖基絲胺酸殘基之鏈。肝素酶 1及2能夠將多醣鏈切成低分子量片段（肝素解聚反應 用於製備本發明化合物之方法係使用按照先前在文獻中 所報告製備得肝素作為起始肝素（”天然，，肝素）。尤其可提 及出版物”L，h0parine，fabricati〇n,价⑽㈣，声扣⑽s， lyses ，j.p. Ducl〇s，由 Mass〇n出版，刚4。該等肝素 128589.doc -14· 200902036 US 2005/0 215 519 尤其可按照在專利申請案美國專利第 AH虎中所迷方法來製備。 該胺鹽可為四級 其中Z表示鹵素 還原劑可為硼氫 述製備方法之還原胺化步驟b)中 胺鹽’ &佳為相當於式NH4Z2 _化銨鹽 原子例如，氯、氟、淳或峨原子《 在上述製備方法之還原胺化步驟b)中： 化物鹽’例如’氰基硼氫化物鹽。 在上述製備方 與80°c之間。 法之還原胺化步驟W中，溫度較佳在5〇艺 =述製備方法之驢化步驟〇中’該驗可為碳酸鹽或碳 夂虱二’尤其係、呈納或卸鹽形式，或者為彼等任何熟習此 項技術者所習知之任—水溶性或有機溶劑可溶性有機驗。 在上述製備方法之醯化步驟c)中，術語"有機介質”意指 (例如）二氯甲烷或二甲基甲醯胺。 用於製備本發明之生物素化肝素之方法較佳包含下列步 a) 用肝素酶3處理肝素， b) 於鹵化銨鹽及硼氫化物鹽存在下，在5〇。〇與肋。◦間之溫 度下’對上文所獲得產物實施還原胺化反應， Ο最後在水性介質中於鹼存在下，用如上文所界定呈活性 酉旨形式之基團-(尺1)广趴〇1實施醯化反應。 上文所界定生物素化衍生物_(R1 )rBi〇t可直接以活性酯 形式用於醯化反應，該等活性酯使用彼等熟習此項技術者 所習知之標準偶聯條件於原位預形成或產生。尤其可使用 128589.doc 15 200902036 珀 呈N-羥基琥珀醯亞胺衍生物形式或呈3-硫代_N_羥基號 醯亞胺衍生物形式之活性酯。 【實施方式】 本發明之製備方法闡釋於反應圖1中。 反應圊1

/ 化合物2 / su丨F_S<Ri>fBi〇t 鹼

化合物3 孜照夂應圖

…、·Ό 口 ％餘蛋 白（即，天然或降解糖基絲胺酸），並獲得包含不含糖基会 胺酸殘基之還原端的化合物丨。然後在胺鹽及還原劑^ 如，硼氫化物鹽）存在下，對該肝素（化合物丨）實施還原= 化反應以產生在還原端含有游離胺官能基之化合物2。 然後可藉由在鹼存在下，與如上文所界定活性生物素衍 生物-OUVBicn反應來醯化該化合物以提供生物素化化合 物3舉例而吕，該反應可使用酿3_硫代號拍酿亞胺基&生 128589.doc -16- 200902036 物素醯胺基己醯基己酸酯之鈉鹽（當R1表示結構_c〇_ (CH2)5-NH-CO-(CH2)5_NH-時）或使用酯3-硫代琥珀醯亞胺 基6-生物素醯胺基己酸酯之鈉鹽（當R1表示結構_c〇_ (CH2)5_NH-時）或者使用生物素醯基_3_硫代琥珀醯亞胺基 酯之鈉鹽（當R1不存在時（i=〇))實施。 在反應圖1中，應理解：化合物1、2及3係作為多醣鏈混 合物之肝素衍生物的理論代表，此乃因事實如此。 在下文之文本中，詳細闡明合成本發明生物素化肝素及 用於獲得彼等之各種中間體的實例。 使用下述縮寫： EPB肝素.由Bioiberica公司出售之肝素； HPLC :高效液相層析法； S AX :強陰離子交換層析法； CTA :十六烷基三甲基銨； qs :足量； LC :長鏈，相當於6_胺基己醯基結構； 硫代-NHS : 3-硫代琥珀醯亞胺基酯之鈉鹽； 肝素酶1，來自肝黃黃桿菌之肝素裂解酶1酶斤(：4 2 2 7) 肝素酶2 :來自肝黃黃桿菌之肝素裂解酶II酶， 肝素酶3 ·來自肝黃黃桿菌之肝素裂解酶III (EC 4.2.2.8)。 實例1 1.1以肝素酶3藉由解聚作用純化之EPB肝素： 在20 C溫度範圍下’將1克未經處理ePB肝素溶於丨5毫 升5 mM磷酸鈉水溶液（調節至pH 7.0±0.1)、20 mM氯化鈉 128589.doc 17 200902036 及1毫克/ ¾升BSA中。向該肝素溶液中添加〇·5 iu肝素酶 3 °授拌所獲得反應混合物5天。向該反應混合物中添加1 克氣化納及45毫升曱醇。經由0.45 μηι膜過濾所獲得懸浮 液。用甲酵及二乙醚洗滌濾餅且隨後在真空下乾燥。獲得 〇·98克白色固體。所觀測得產率係98%。 / 該產物可利用肝素酶1、2及3之混合物實施解聚作用加 以控制’並利用述於專利申請案美國專利第US 2005/0 186 679 Α1號之方法藉由HpLC_SAX加以分析。結果顯示存於 起始肝素中之至少8〇%的糖基絲胺酸物質會消失不見。 多醣混合物於仏〇中之1HNMR譜（2VC，δ以ppm表示）， 主要信號：2.05 (阳⑺，s)，3.28 (CH, m), 3.65 (CH, m)， 3.77 (CH，°1)，4.05 (CH，m)，4.10 (CH，s)，4,20 (CH, s)， 4.25 (CH, d5 12 Hz), 4.35 (CH, s), 4.42 (CH, m), 4.88 (CH, s)，5.22 (CH，s)，5·42 (CH, s)。 1.2以胺基還原化肝素酶3解聚之肝素： 將5克用肝素酶3純化之肝素溶於$ μ氯化銨水溶液 中向4肝素/谷液中添加〇5克氛基爛氣化納。將該混合 下 '准持24小時。將該溶液冷卻至20。(：之溫度範 圍，用水（足量至5〇毫升、蘇鏗 笔开）稀釋且隨後用交聯葡聚糖G10管 柱實施脫鹽。將所、 將所侍。卩分注射於Q-瓊脂糖凝膠管柱上。先 用水後用高氯酸鈉梯产 币度稀釋§亥產物。用交聯葡聚糖G10管 柱對所得產物實施脫 ，、、、傻~凍乾垛。獲得444耄克白 色低屢康乾物。所觀 "仔產率係89%。產物無須進一步純 化了用於下—醯化步驟。 128589.doc 200902036 多醣混合物於D20中之丨H NMR譜（25°c，δ以ppm表示）， 主要信號：2.05 (CH3CO, s)，3.28 (CH，m), 3.65 (CH，m)， 3.77 (CH, m), 4.05 (CH, m), 4.10 (CH, s), 4.20 (CH, s), 4.25 (CH, d, 12 Hz), 4.35 (CH, s), 4.42 (CH, m), 4.88 (CH, s), 5.22 (CH，s)，5.42 (CH, s)。 1.3用肝素酶3解聚之生物素化及胺基還原化肝素 於20°C溫度範圍下，將200毫克胺基還原化之經解聚肝 素溶解於2毫升0.5 Μ碳酸氫鈉溶液中。向所得溶液中添加 37宅克硫代-NHS-LC-生物素。於20°C溫度範圍下，攪拌所 獲得溶液1小時。用4毫升〇.5 Μ碳酸氫鈉溶液稀釋該溶 液。添加37毫克硫代生物素並攪拌所得混合物2 小時。再添加37毫克硫代物素並攪拌反應混合 物16小時。所得反應介質用水（足量至2〇〇毫升）稀釋，用 0.45微米膜過濾且注射於q_瓊脂糖凝膠管柱上。先用水後 用尚氯酸鈉梯度溶洗產物。用交聯葡聚糖G1 〇管柱對所得 產物實施脫鹽，然後經冷凍乾燥。獲得188毫克白色低壓 來乾物。所觀測得產率係9 4 〇/。。 該產物可利用肝素酶丨、2及3之混合物藉由實施解聚作 用加以控制，並利用述於專利申請案美國專利第仍 2005/0 186 679 A1號之方法藉由HPLC_SAX加以分析。 多醣混合物於Da中之iH NMRJf(25<t，δ以表示）， 主要信號：在1，3與1.8之間（Ch2生物素’ m)，2.〇5 (cH3c〇, s)，2.25 (CH2CO生物素，t, 7 Hz)，2 79 (1H，本 12 叫，3 ⑽ (1H，dd，12 及 5 Hz)，3.2〇 (NCH2 生物素 ’ m)，3 3〇 (ch，⑷， 128589.doc -19- 200902036 3.68 (CH, m), 3.80 (CH, m), 4.05 (CH, m), 4.10 (CH, s), 4.20 (CH, s), 4.25 (CH, m), 4.35 (CH, s), 4.45 (CH, m)5 4.63 (NCH生物素，m)，4.85 (CH, s), 5·22 (CH, s)，5.42 (CH，s” 實例2 2.1按照美國專利第US 2005/0 215 519 A1號，用肝素酶3 解聚所獲得肝素： 在20 C溫度範圍下，將1克根據美國專利第us 2005/0 21 5 5 1 9 A1號之肝素溶於1 5毫升5 mM填酸納水溶液（調節 至pH 7.0±0.1)、20 mM氣化鈉及1毫克/毫升BSA中。向該 肝素溶液中添加0.5 IU肝素酶3。攪拌所獲得反應混合物7 天。向δ亥反應混合物中添加1克氯化納及4 5毫升甲醇。經 由0.4 5微米膜過濾所得懸浮液。用甲醇及用二乙醚洗滌濾 餅且然後在真空下乾燥。獲得〇·96克白色固體。所觀測得 產率係96%。 該產物可利用肝素酶丨、2及3之混合物藉由實施解聚作 用加以控制，並利用述於專利申請案美國專利第us 2005/0 186 679 A1號之方法藉由HpLC_SAX加以分析。結 果顯示存於起始肝f中之至少8〇%糖基絲胺酸物質消失不 見。 夕醣此合物於DsO中之丨Η ΝΜΚ^(25<)(：，δ&ρρηι表示）， 主要# 5虎.2.05 (CH3C〇, s)，3 28 (CH，m)，3 65 (CH，m)， 3.77 (CH，m)，4.05 (CH，m)，4 1〇 (CH，s)，4 2〇 (CH，s)， 4.25 (CH，d，12 Hz)，4,35 (CH，s), 4.42 (CH，m), 4.88 (CH, 128589.doc -20. 200902036 S)，5.22 (CH，s)，5.42 (CH，s)。 2,2經肝素酶3解聚且經胺基還原之美國專利第2〇〇5/〇 215 519 A1號之肝素： 將〇·5克經肝素酶3處理之美國專利第US 2005/0 215 519 A1號之肝素溶於2〇毫升5 Μ氯化銨水溶液中。向該肝素溶 • 液中添加0乃克氰基硼氫化鈉。將該混合物在7(rc下保持 24小時。將該溶液冷卻至2(rc之溫度範圍且用水（足量至 50毫升）稀釋，隨後用交聯葡聚糖G10管柱實施脫鹽。冷凍 ' 乾燥所收集部分。獲得440毫克白色低壓凍乾物。所觀測 得產率係89%。產物不經進一步純化用於下一醯化步驟。 多醣混合物於DW中之〗H NMR譜（25。(：，δ以ppm表示）， 主要信號：2.05 (CH3CO, s)，3.28 (CH，m)，3.65 (CH，m), 3’77 (CH，m)，4.05 (CH，m)，4.10 (CH，s)，4.20 (CH, s), 4.25 (CH, d, 12 Hz), 4.35 (CH, s), 4.42 (CH, m), 4.88 (CH, s)，5.22 (CH，s)，5.42 (CH，s)。 (J 2·3經肝素酶3解聚之美國專利第20〇5/〇 215 519 A1號之 生物素化及胺基還原肝素： 於20 C溫度範圍下，將200毫克胺基還原經解聚肝素溶 解於2毫升0.5 Μ碳酸氫鈉溶液中。向所得溶液中添加37毫 克硫代-NHS-LC-生物素。於2〇°C範圍溫度下，攪拌該溶液 1小時。所得懸浮液用4毫升0.5 Μ碳酸氫鈉溶液稀釋。添 加37毫克硫代-NHS-LC-生物素並攪拌該混合物2小時。再 添加37毫克硫代-NHS-LC-生物素並攪拌該反應混合物丨6小 時。所得反應介質用水（足量至200毫升）稀釋，經〇.45微米 128589.doc -21 · 200902036 W濾且主射於Q《脂糖凝膠管柱上。先用水後用高氯酸 鈉梯度溶洗產物。用交聯葡聚糖⑽管柱對所得產物實施 脫鹽，然後經冷;東乾释。物貫把 ? ^ 獲付1 88毫克白色低壓凍乾物。 所觀測得產率係94%。 '該產物可利用肝素酶1、2及3之混合物藉由解聚作用加 以控制’並且使用述於專利申請案美國專利第US別〇^〇 186 6N A1唬之方法藉由HpLC_SAX加以分析。 多醣混合物於〇2〇中之1H NMR譜（25°C，δ以ppm表示）， 要仏號.在1.3與1.8之間（ch2生物素，m), 2.05 (CH3CO, s)，2.25 (CH2CO生物素，t，7 HZ)，2.79 (1H, d, 12 Hz)，3 〇〇 (1H，dd，12 and 5 HZ)，3.20 (NCH2生物素，m)，3.30 (CH， m), 3.68 (CH，m), 3.80 (CH，m)，4.05 (CH，m)，4.10 (CH， s)，4.20 (CH，s)，4.25 (CH，m), 4.35 (CH，s), 4.45 (CH, m), 4.63 (NCH生物素 ’ m)，4 85 (CH，s)，5 22 (CH，s), 5 42 (CH，s)。 對本發明之化合物進行生化及藥理學研究。 抗因子Ila活性及抗因子Xa活性之量測 藉由顯色方法分析人類血漿或緩衝系統之抗因子IIa(抗 Flla)活性及抗因子Xa(抗Fxa)活性：藉助含有顯色基質s_ 2238、α-凝血酶及人類ATIII(抗凝血酶III)之Actichrome肝 素抗因子IIa試劑盒（American diagnostica)測試抗因子IIa活 性。藉助自動凝固儀器 ACL 7000(Instrumentation Laboratory) 使用含有ATIII、因子Xa及顯色基質S-2765之肝素試劑盒 (Instrumentation Laboratory)測定抗 FXa活性。根據製造商 128589.doc -22- 200902036 之說明書實施兩次分析。 使用下列標準來建立用於量測人類血漿及緩衝系統中生 物素化肝素部分之活體外活性的標準校準曲線·· -低分子量肝素之第一國際標準（NaU〇nal ―出咖^

Biological Standards and Control，London, UK，於 1987年 建立，代號85/600)， -低分子量肝素之第二國際標準（Nati〇nal化…加恍如 Biological Standards and c〇ntr〇1，L〇nd〇n，υκ，於 年 建立，代號01/608 ,自2006年ό月起使用）， .依諾肝素（Clexane®，賽諾菲_安萬特（san〇fi_aventis), France)作為内參比之用。 為測定抗Flla活性，在人類血漿或含有〇 〇5 μ η。 Ηα、ο·154 μ NaC1之緩衝系統（pH 7 4)中用抗凝血酶將⑺ 微升樣品或國際低分子量肝素標準品稀釋至丨：丨6。將丨〇微 升該溶液加入至96孔微量滴定盤中。量測進行三重複（於3 個孔中）。於37 C下維持該微量滴定盤同時以3〇〇卬⑺搖 動。向每個孔中添加40微升凝血酶並準確培養2分鐘。添 加40微升SpeCtr〇zymee在9〇秒鐘後，藉由添加4〇微升乙 酸來終止該反應。於405奈米下使用SpectraMax 34〇 (Molecular Devices)量測吸收光度。 對於抗FXa活性量測而言，在人類血漿或含有〇 〇5 m Tris HC卜（M54 M NaC1(pH 7·4)之緩衝系統中稀釋樣品或 國際低分子量肝素標準品。在血漿或緩衝液中再次用含有 ATm之工作緩衝液將含有類肝素之樣品稀釋至1:2〇並兩重 128589.doc -23- 200902036 複置於探測轉子中。將因子Xa試劑及顯色基質傾注於自動 凝固儀器ACL 7000之標明儲槽中。 使用整合至ACL 7000軟體中之''肝素”方案進行抗FXa活 性量測。在分析期間，將50微升樣品（用工作緩衝液稀釋） 與5 0微升因子Xa試劑混合。於37°C下經60秒鐘培育後，添 加50微升濃度為1.1 mM之顯色基質，並於405奈米波長下 量測隨著時間所得光度變化之函數。 所得結果具體闡述於下表中。 抗FXa活性 (IU/毫克） 肝素 235 經肝素酶3純化之EPB肝素 251 經肝素酶3純化及經胺基還原之EPB肝素 217 經肝素酶3純化、經胺基還原且經生物素化之EPB肝素 218 美國專利第US 2005/0 215 519 A1號之肝素 214 經肝素酶3純化之美國專利第US 2005/0 215 519 A1號之肝素 257 經肝素酶3純化且經胺基還原之美國專利第US 2005/0 215 519 A1號之肝素 203 經肝素酶3純化、經胺基還原且經生物素化之美國專利第US 2005/0 215 519 A1 號之肝素 214 由此可見，經與起始天然肝素比較，本發明生物素化肝 素之抗FXa活性係經保留的。 本發明生物素化肝素可用於製備藥物。該等生物素化肝 素尤其可作為抗血栓形成藥物。因此，根據其另一態樣， 本發明之主題係包含如上文所界定生物素化肝素之藥物。 該等藥物可用於治療，具體而言用於治療及預防靜脈血栓 形成、動脈血栓形成意外事件（尤其係在心肌梗塞或不穩 定心絞痛之狀況下）、周圍動脈血栓形成（例如，下肢動脈 病、腦動脈血栓形成及中風）。該等藥物亦可用於預防及 128589.doc -24- 200902036 治療平滑肌細胞增生、企管生成及作為用於動脈粥樣硬化 及動脈硬化之神經保護劑。 ，根據其另-態樣，本發明亦係關於—種用於治療上述病 狀之方法’該方法包含對患者投予有效劑量之本發明化合 物、或其醫藥上可接受之鹽。因此，如上文所界定生物素 化肝素在治療及預防上述病狀中之用途如同該等生物素化 料在製造用於治療或預防該等病狀之藥物中的用途一 般’係為本發明之一部分。 根據其又-態樣，本發明之主題係—種醫藥組合物，呈 為包^為活性成分之本發明生物素化肝素或其醫藥上可接 及至少—醫藥上可接受之惰性賦形劑。該等賦形 劑可根據期望醫藥形式及(例如)下列給藥方式選擇= L::徑皮下、肌内、靜脈内、經皮、經黏膜、局部或 ί. 广劑量單位中，活性成分係以適於預期曰劑量之量 2，以獲得期望預防或治療效應。每—劑量單位可含有 二:，:5。毫克之間且較佳介於3〇至1〇〇毫克之間的活性 广。“物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素可 凝血化合物。 τ 7此寻抗 可此會發生其令更高或更低劑量亦適宜之特殊情形.此 等劑量並未超出本發明之範^根胃 每一击去夕為丨旦及L v月办况狀’適於 心者之d罝係由醫生根據給藥 反應而定。 书万式及違患者之體重及 本發明化合物亦可斑— 万了與《多種用於期望治療之其他有效 128589.doc -25- 200902036 成分（例如，> ^血栓形成劑、抗凝血劑或抗血小板凝聚劑） 組合使用。 j匙月主題亦係關於一種使用抗生物素蛋白或抗生蛋白 去。之方法’其特徵在於其可能中和本發明生物素化肝 於中Γ Γ柷生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素可用以製備用 於中和本發明生物素化肝素之藥物。 I備用 128589.doc 、26· 200902036 生物素化肝素之醫筚 上可接受之赋形劑Γ 之鹽，以及至少-種醫藥 14. 一種如請求項丨 用生㈣切㈣用途，其 用於I備抗血拴形成藥物。 15. 如請求項14之用途，苴 血栓形成、動rr “… 於治療及預防靜脈 不穩定心絞痛之狀、，η⑭ 肌梗塞或 ^ ^ ψ π ^ :如下肢動脈病、腦動脈血栓 化成或中風等周圍動脈血栓形成，用於治療及預二 硬化之神經保護劑。丨為用於動脈粥樣硬化及動脈 16. -種使用抗生物素蛋白或 徵在於該方法能夠中和如請求項=素之方法’其特 化肝素。 中任一項之生物素 17. 一種抗生物素蛋白或抗生蛋 備用於中和如請求項1至9中 物。 白鍵菌音、么 闯畜之用途，其用以製 任—項之生物素化肝素之藥 128589.doc

Claims (1)

1. 200902036 十、申請專利範圍： 1. 一種生物素化肝素，其特徵在於該等肝素之成分多醣在 彼等還原端具有結合至基團-(RUrBiot之共價鍵，且相 當於通式（I)結構：

   -i等於0或1， -R1表示式U)或（b)之結構：

   其 數

   中j及k可相同或不同，係取自間之任 一數值的整 -Biot表示生物素基團或生物素衍生物， Da之肝素而言，n表示平 -對於平均分子量質量為15000 均值為約2 5之整數， -X表示Η或S03Na， -Y表示 C0CH3 或 S03Na， 之下方或上 -波形線條係指位於其所連接吼π南糖環平面 方之鍵結， 128589.doc 200902036 以及其醫藥上可接受之鹽。 2·如請求項1之肝素，其特徵在於丨等於〇, 以及其醫藥上可接受之鹽。 3.如請求項1之肝素，其特徵在於丨等於丄 等於5之通式（a)結構， 且R1表示其中j 以及其醫藥上可接受之鹽。 4.如請求項1之肝素，其特徵在於丨等於卜 及k相同且均等於5之通式（b)結構， 以及其醫藥上可接受之鹽。 且R1表示其中j 5.如請求項1至4中任一項之肝素 (c)之生物素基團： 其特徵在於Biot表示式

   以及其醫藥上可接受之鹽。 &如請求項⑴中任—項之肝素’其特徵在於該等肝素之 至少64%成分多醣在彼等還原端具有結合至基團-则广 Biot之共價鍵， 以及其醫藥上可接受之鹽。 7.如。月求項6之肝素，其特徵在於該等肝素之至少嶋成分 夕醣在彼等還原端具有結合至基團之共價 鍵， 以及其醫藥上可接受之鹽。 128589.doc 200902036 8·如請求項1至4中任一馆★肛主 為緒來源。 Μ之肝素，其特徵在於該等肝素係 豬腸黏 膜 9.如請求項8之肝素，其特徵在於該等肝素係源自 10·: = :製備如請求項1至9中任-項所界定生物素化肝 、 …其特徵在於該方法包含下列步驟： a)肝素經以肝素酶3處理， ⑽後在胺鹽與還原劑存在τ、在听㈣。c間之溫 度下’ «述所獲之產物實施還原胺化反應， c)最後在水性介質或有機介質中於驗存在下，用活性 基團-(叫-Biot實施醯化反應，其中Ri、认心係 如請求項1至5中任一項所界定。 η.如請求物之^ ’其特徵在於該方法包含下列步驟： a) 肝素經以肝素酶3處理， b) 然後在i切鹽及硼氫化物鹽存在下，在抓㈣ ]之μ度下，對y述所獲得之產物實施還原胺化 反應， 0最後在水性介質中於驗存在了，用活性酿形式之基 團-(Rl)rBiot實施醯化反應。 12. —種藥物，其特徵在於該藥物包含如請求項1至9中任一 項之生物素化肝素或該等生物素化肝素之醫藥上可接受 之鹽。 13. -種醫藥組合4勿，其特徵在於該醫藥 性成分之如請求項1至”任-項之生物素化肝素：：： 128589.doc 200902036 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   〆

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