JPH09512822A

JPH09512822A - Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体とその製造法および使用

Info

Publication number: JPH09512822A
Application number: JP7529121A
Authority: JP
Inventors: ホルム，ケビン・アール; シャクリー，パトリック・エヌ; 雅之石原
Original assignee: グリコメド・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 1997-12-22
Also published as: EP0758247A1; CA2189038A1; AU2435795A; WO1995030424A1; EP0758247A4; US5795875A

Abstract

(57)【要約】６−Ｏ脱硫酸化の程度を調節することができる、Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物、好ましくは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物を選択的に製造する方法および組成物。該組成物は癌、血管形成、ショック、虚血再還流傷害、炎症、および再狭窄を含む循環器病を含む種々の疾病を治療するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体とその製造法および使用発明の分野本発明はＯ−脱硫酸化ヘパリン組成物、および６−Ｏ−脱硫酸化の程度を調節することができる、該組成物、好ましくは６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン組成物の製造法に関する。該組成物は、癌、脈管（血管）形成、ショック、虚血再還流傷害、炎症、および再狭窄を含む循環器病を含む種々の疾病を治療するのに有用である。略語単糖類またはオリゴマー中に含まれている単糖残基には以下の略語を使用する。Ｄ−グルクロン酸＝ＧｌｃＡ、Ｌ−イズロン酸＝ＩｄｏＡ、Ｄ−グルコサミン＝ＧｌｃＮＨ₂、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＝ＧｌｃＮＡｃ、Ｄ−グルコサミンＮ−サルフェート＝ＧｌｃＮＳ、２，５−アンヒドロマンノース＝Ａｍａｎ、および２，５−アンヒドロマンニトール＝ＡＭａｎＨ。本明細書中に記載のヘパリン組成物の分析において得られた二糖残基を示すのに使用する略号は以下の通りである。すなわち、ＩＳＭＳはＩｄｏＡ（２−サルフェート）→ＡＭａｎＨ（６−サルフェート）と定義され、ＧＭＳ₂はＧｌｃＡ →ＡＭａｎＨ（３，６−ジサルフェート）と定義され、ＩＳはＩｄｏＡ（２−サルフェート）→ＡＭａｎＨ（６−サルフェート）＋ＩｄｏＡ（２−サルフェート）→ＡＭａｎＨと定義される。各糖残基（以下の適切な略語）を表示する場合、Ｏ−連結サルフェート残基の位置を「Ｓ」と該サルフェート残基がその糖残基の酸素と連結している硫酸化の位置の数字で示す。ヘパリン構造を表示する場合もαおよびβアノマー連結に関与する位置はヘパリンに通常みられる位置、すなわちα（グルコサミン→ウロニック（ウロン酸））およびβ（ウロニック→グルコサミン）であり、ＤまたはＬ立体配置は通常みられる関係である。サルフェートの位置はサルフェートが結合している糖の略号の下に示され、すなわち、例えば、ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ２Ｓ６Ｓは、Ｌ−イズロン酸およびＤ−グルコサミンＮ−サルフェート連結β（１−４）のそれぞれの糖残基の２および６位にサルフェートが結合しているものを示す。背景ヘパリンヘパリン／ヘパラン硫酸は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られる１群の多糖類のメンバーである。これら物質は、硫酸化型に認められ、プロテオグリカンとして合成されるヘキソサミン残基とアルドウロン酸残基が交互に連なるコポリマーである。本発明が目的とするヘパラン硫酸とヘパリンの組成物において、主要なヘキソサミンはＮ−アセチル化もしくはＮ−硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＳ）である。アルドウロン酸は、ヘパリンではほとんどがＬ−イズロン酸であり、ヘパラン硫酸ではほとんどがＤ−グルクロン酸である。ヘパラン硫酸は通常ヘパリンより高い割合のグルクロン酸を有すると考えられる。組織から分離されるヘパラン硫酸またはヘパリンの調製物における不均一性の問題は明確な区別を困難にしている。通常のヘパリン（抗凝固剤として使用される）は分子量５〜２５ｋｄであり、通常の方法によって種々の鎖長の混合物として抽出される。これら方法には、ウシもしくはブタの肺、腸または肝臓のような適切な組織の自己分解ならびに抽出、および非多糖組成物の除去が含まれる。抽出物中の鎖の分子量は組織中で合成されたヘパリンプロテオグリカンの多糖鎖中に存在することが知られている６０〜１００ｋＤより有意に低い。ＧＡＧ部分は、配列Ｄ−ＧｌｃＡ−Ｄ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｘｙｌの四糖連結領域→蛋白を介してセリンまたはトレオニン残基でペプチドマトリックスに結合して合成され、次いでＤ−ＧｌｃＡ残基にＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＡが交互に付加することによって伸長する。該ポリマーはあるＧｌｃＡ残基でエピ化されてＩｄｏＡを生じ、次いで硫酸化される。それらの化学的類似性によって、分離された「ヘパリン」は、別の方法ではヘパラン硫酸に分類されるかも知れないものをかなりの量含んでいてよい。修飾脱硫酸化ヘパリン多くの研究者が脱硫酸化ヘパリンの製造について記載している。これらの脱硫酸化ヘパリンの製造法は（ａ）アルカリＯ−脱硫酸化、（ｂ）酸触媒脱硫酸化、および（ｃ）加溶媒分解脱硫酸化の大きく３つのカテゴリーに分けることができる。（ａ）アルカリＯ−脱硫酸化：種々の条件下でヘパリンをアルカリ処理することによってＯ−サルフェート基が失われることが報告されている。Jasejaら（Ca n.J.Chem.(1989)67:1449）は、ウシ肺ヘパリンの緩やかなアルカリ処理の効果について詳細に記載した。３つの異なる成分置換が記載され、具体的にはそれらはすべて２−Ｏ硫酸化ＩｄｏＡ残基の成分置換を含んでいた。さらに別の報告（Re j,R.N.らの、Carbohydr.Res.（1990）200:437、およびPiani,S.らの、J.Carbohy dr.Chem.(1993)12(4&5):507)）が、ヘパリンのアルカリ処理に関するこれら初期の研究を確認し、発展させてきた。アルカリ処理ヘパリンによって得られるヘパリン誘導体は、この成分置換がイズロン酸残基の２−Ｏ−サルフェート基の周辺に特に集中していることから、本明細書に記載の誘導体とは明らかに異なる。共同所有の米国特許第５２９６４７１号（１９９４年３月２２日発行）は、２ −Ｏ、３−Ｏ脱硫酸化ヘパリンとその誘導体を得るためのヘパリンのアルカリ処理を開示している。アルカリ処理したヘパリンから得られるこのヘパリン硫酸は、この成分置換がＩｄｏＡ残基の２−Ｏ−サルフェートとＧｌｃＮ残基の６−Ｏ −サルフェート基の特に周辺に集中していることから、本明細書に記載の誘導体とは明らかに異なる。（ｂ）酸触媒脱硫酸化：酸触媒条件下におけるサルフェート置換基の加水分解はよく知られている。単糖類におけるサルフェートの加水分解率は、第２級エカトリアル（赤道）ヒドロキシル＞第２級アクシャルヒドロキシル＞第１級ヒドロキシルであることが示された（Rees,D.A.の、Biochem.J.(1963)88:343）。ヘパリンに関して、酸性条件下（７０℃、０．１ＭＨＣｌ）で処理することによってＮ−Ｓ＞＞２−Ｏ−Ｓ＞６−Ｏ−Ｓの順でサルフェーと基の減少が生じるが、その際の２−Ｏ−Ｓの減少率は６−Ｏ−Ｓの５倍である（Shively,J.E.らの、Fe d.Proc.(1977)36:28およびKosakai,M.らの、J.Biochem(1979)86:147）。ヘパリンの酸触媒脱硫酸化は特定条件下で該分子の脱重合ももたらす。（ｃ）加溶媒分解的脱硫酸化：ヘパリンの加溶媒分解的脱硫酸化はヘパリンを選択的にＮ−脱硫酸化する方法として記載された（Inoue Y.らの、Carbohydr．R es.(1976)46:87）。Ｎ−サルフェート基の実質的に完全な加水分解はＯ−サルフェート基の最小限の減少（＜２０％）と最小限の脱重合を伴って達成できたことが明らかにされた。Ｎ−サルフェートを完全に除去すると、抗凝固活性が出発ヘパリンの１％以下に低下したことも示された。続く報告（Nagasawa,K.らの、Car bohydr.Res.(1977)58:47）において、上昇した温度（８０〜１１０℃）の加溶媒分解条件がヘパリンを含むグリコサミノグリカンを脱硫酸化するのに有用であることが示された。これら条件には１〜１０％メタノール−ＤＭＳＯまたは１〜１０％水−ＤＭＳＯ中のヘパリンのピリミジニウム塩を８０〜１００℃に加熱ことが含まれた。別の報告では、反応媒質は、海草由来の硫酸化多糖類を加溶媒分解的脱硫酸化するためにUsovが記載したように２％ピリジン−ＤＭＳＯであった（ UsovA.I.らの、Carbohydr.Res.(1971)18:336）。この研究の結果は、完全なＮ− 脱硫酸化が速やかに達成され、Ｎ−脱硫酸化物質はかなり遅い速度でＯ−デサルフェートに移行したことを証明した。Ｎ−脱硫酸化物質を分離し、Ｎ−再アセチル化し、次いで１００℃で加溶媒分解処理すると、Ｏ−脱硫酸化はより速やかに完結した（〜１ｈ対＞２４ｈ）。これらの結果は、遊離アミン基と硫酸エステル間の相互作用によってＯ−脱硫酸化率が低下することを示唆した。全サルフェート減少量をモニターする経時反応は、１００℃の、１、５および１０％メタノール−ＤＭＳＯならびに８０および１１０℃の、１０％メタノール−ＤＭＳＯ、および１００℃の、１、５および１０％水−ＤＭＳＯならびに８０および１１０℃ の、１０％水−ＤＭＳＯを含む加溶媒分解条件において述べられた。この生成物の組成物や生物活性については特徴づけらておらず、この反応の選択性に関するいかなる考察もなされていない。加溶媒分解Ｎ−脱硫酸化法は日本国特許第５１−２６９８７号にも記載され、ＮおよびＯ−脱硫酸化のための加溶媒分解法は日本国特許第５２−１５５６９０号に記載された。これら特許（特に５２−１５５６９０）は、Ｏ−脱硫酸化における選択性、特定の部分的Ｏ−脱硫酸化産物の組成物、ＮおよびＯ−脱硫酸化産物のＮ−再硫酸化、または加溶媒分解からの完全または部分的にＯ−脱硫酸化された組成物に関する生物活性について考察していないことに注目すべきである。 Yosizawaは、ヘパリンの硫酸化パターンおよびヘパリンの加溶媒分解的脱硫酸化の対象に関する一連の論文を発表している（Kosakai,M.らの、J.Biochem.(197 8)83:1567、Kosakai M.らの、J.Biochem.(1979)86:147、およびKosakai,M.らの、Chemistry and Biology of Heparin(1979)、97-104頁）。ある報告（Kosakai, M.らのJ.Biochem.(1979)86:147）では、ブタヘパリンは１００℃で９時間２％ピリジン−ＤＭＳＯを含む加溶媒分解状態に置かれた。この産物は亜硝酸処理による脱重合、およびペーパー電気泳動とイオン交換クロマトグラフィーによるオリゴ糖分析にによって特徴づけられた（Kosakai,M.らの、J.Biochem.(1978)83:156 7）。この結果は、０．８３モルＯ−サルフェート／グルコサミンが減少し（全Ｏ−サルフェートの約４０％を占める、完全に失われたＮ−サルフェート基を除く）、グルコサミンからの６−Ｏ−サルフェートの相対減少量はＬ−イズロン酸からの２−Ｏ−サルフェートの減少量より大きかった。分離産物のＮ−再硫酸化（Lloydらの、Biochem.Pharmacol.(1971)20:637）は１１０Ｕ／ｍｇの抗凝固活性または出発ヘパリンの約６０％の活性を有する部分的にＯ−脱硫酸化されたヘパリンを生じた。この著者らは（１）グルコサミンの６−Ｏ−サルフェート置換基は抗凝固活性に重要な役割を演じず、また（２）イズロン酸の２−Ｏ−サルフェートはその有意な減少が活性低下をもたらすことから抗凝固活性に重要であると結論づけた。彼らはその産物の抗凝固活性の低下を、主に２−Ｏ−サルフェート含有量の少ない減少に関連させ、６−Ｏ−サルフェートのより大量の減少には関連させなかった。グルコサミン残基の選択に対する３−Ｏ−サルフェートの加溶媒分解の影響についての結論は、これらの研究が行われたときにその存在と重要性が知られていなかったために示されなかった。本発明とYosizawa（Yosakai.,M.とYosizawa,Z.の、Chemistry and Biology of Heparin(1989)67:1449）の研究を区別する本発明の鍵となる局面は、出発ヘパリンの抗凝固活性の６０％が維持されたYosizawaの組成物に比べて抗凝固活性がより広範に低下することであった。本発明組成物は出発ヘパリンの抗凝固活性の＜３０％、好ましくは＜１５％を有する。さらに区別するための特徴としては、抗凝固活性が有意に低下するにはイズロン酸残基から２−Ｏ−サルフェート置換基が実質的に失われることが必要であるというYosizawaらの観察結果がある。しかし、本発明において特徴づけられた組成物は６−Ｏ−サルフェート置換基の広範な減少（二糖残基の全６−Ｏ位の＜３４％が硫酸化される）と共に他のＯ−サルフェート基の比較的少ない減少（二糖残基の全２−Ｏ位の６７％までが硫酸化される）は抗凝固活性の実質的な低下をもたらす。Ｎ−脱硫酸化、完全Ｏ−脱硫酸化Ｎ−再硫酸化、またはＮ−再アセチル化誘導体を製造するための多くのヘパリンに関する研究において、加溶媒分解条件が用いられ、報告されている。多くの報告（Eldor,A.らの、Blood(1987),70:551、Ka zatchkine,M.D.らの、J.Clin.Invest(1981)67:223、Ishihara,M.らの、Anal.Bio chem.(1992)202:310、Wright,T.C.Jr.らの、J.Biol.Chem.(1989)264:1534、およびSvahn,C.M.らの、Carbohydr.Polym.(1992)18:9）は、Ｎ−脱硫酸化ヘパリン誘導体のヘパリン様生物活性は有意に低下している傾向があることを示している。Ｎ，Ｏ−脱硫酸化Ｎ−再硫酸化およびＮ，Ｏ−脱硫酸化−Ｎ−再アセチル化ヘパリンはｂＦＧＦ結合活性を欠く。活性に対するＯ−サルフェート基の重要性を検討するため、多くの生物系において完全Ｏ−脱硫酸化化合物が試験されている。これらのデータによって、以前に報告されたＮ，Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体と本出願に記載のそれらとは明確に区別される。最近、Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ−（トリメチルシリル）アセトアミドと関連シリル化剤を用いる種々の単および多糖類の選択的６−Ｏ−脱硫酸化を達成するための方法が報告されている（Matsuo,M.らの、Carbohydr.Res.(1993)241:209）。加溶媒分解では、該化合物はピリジニウム塩型に変換され、次いでシリル化試薬を含むＤＭＳＯ溶液中、８０℃で加熱される。本法を用いて処理した多糖類にはグリコサミノグリカンデルマタン硫酸とコンドロイチン硫酸があった。この著者らは該多糖が単に加溶媒分解的脱硫酸化型でないことを示唆する多くの実験を行っているがそのメカニズムは明らかでない。Takenoら（Takeno,R.らの、Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society(1993)65:(8):No.1836）は、４−（トリメチルシルオキシ）−３−ペンテン−２−オン（ＴＰＥＮＯＮ）をシリル化剤に用いるフノラン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびヘパリンを含む種々の多糖サルフェートのレジオセレクティブな（regioselective）脱硫酸化を報告した。コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸の両方の処理は６−Ｏおよび４ −Ｏ脱硫酸化を生じ、一方、ヘパリン処理は６−Ｏ、２−ＯおよびＮ−脱硫酸化を生じた。この著者らの報告した条件下でヘパリンの非選択的脱硫酸化が観察されたことに注目すべきである。Takashigeら（Takashige,K.らの、Annual Meetin g of the Japanese Biochemical Society(1993)65(8):No.1835）は、硫酸化単糖の選択的脱硫酸化について記載したが、硫酸化多糖類の脱硫酸化は示さなかった。上記引用文献は６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物とそのような組成物の製造法について記載しているが、６−Ｏ脱硫酸化の程度を調節する方法を示しておらず、二糖残基の全６−Ｏ位の＜３４％と全２−Ｏ位の６７％までが硫酸化されている組成物を含む、種々に脱硫酸化され得る組成物の製造法については示しも示唆もしていない。非抗凝固性ヘパリン非抗凝固性（ＮＡＣ）ヘパリンの産生について記載した一連の技術文献がある。ほとんどの刊行物は脱重合したヘパリン／ヘパラン硫酸から生成された抗凝固性ヘパリンと生成物のサイズによる分別について記載している。一般に用いられる方法において、ヘパリン出発物質は、存在しているあらゆるＧｌｃＮＡｃ残基からＮ−アセチル基を除去する前処理を行うかまたは行わずに、亜硝酸の存在下で脱重合される。亜硝酸は、適切な条件下で、ＧｌｃＮＳもしくはＧｌｃＮＨ₂ 残基とウロン酸残基の間の連結を開裂させ、これを介して亜硝酸はグルコサミン α（１−４）ウロン酸連結を介して連結される。ヘパリンがＮ−脱アセチル化されている場合、すべてのグルコサミン→ウロン酸残基は感受性であり、完全な脱重合によって二糖類が生じる。ヘパリンがＮ−脱アセチル化されていない場合は、グルコサミンがアセチル化されているグルコサミン→ウロン酸残基は抵抗性であり、二糖類の両方と四糖類および少量の、抵抗性の連結を含むより高いオリゴ糖が生じる。すべての場合において、二糖または四糖の還元末端のグルコサミン残基は開裂の過程で２，５−アンヒドロマンノースに変換される。この残基はさらに対応する２，５−アンヒドロマンニトールに還元されてもよい。これらの方法はBienkowski,M.J.とConrad,H.E.の、Ｊ Biol Chem(1985)260:356-365、Guo,Y. らの、Anal Biochem(1988)168:54-62、およびGuo,Y.とConrad,H.E.の、Anal Bio chem(1989)176:96-104に記載されている。これらの後者の方法は、ヘパリンの構造を解析し、ヘパリン鎖の種々の処理の結果を評価するのに有用である。さらに、前述の論文に記載の亜硝酸を用いる完全および部分的消化、またはヘパリナーゼ消化やペリオデート酸化、次いでβ−除去からのヘパリンの分解産物を用いる試みがかなりなされている。これらの方法はすべて、治療的に使用する低分子量のヘパリンを生成することができる。非抗凝固性の脱重合された低分子量のヘパリンの例は米国特許第４９９０５０２号に記載されている。該特許はペリオデートによるヘパリン処理、次いで塩基による脱重合、およびペリオデート処理で生成されるアルデヒドの還元を示している。得られる物質は１７−３３残基を含むポリマーと、式：ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃまたはＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ２Ｓ２Ｓ［ここで、グルコサミン残基は任意の方法によって３および／または６位で硫酸化され、ＩｄｏＡ残基のいくつかがペリオデート酸化によって生じる開裂したＩｄｏＡまたはＧｌｃＡ残基で置き代えられていてもよい］で示される複数の残基を含むポリマーの混合物を含むとの記載がある。これらの短縮されたポリマー鎖はＡＴＩＩＩに対する結合部位を欠くが、平滑筋増殖を阻害することができ、組織修復の促進、アテローム性病変の予防、および転移の発生の予防を含む生理活性を有すると記載されている。ペリオデートによるヘパリン／ヘパラン硫酸の処理は他にも報告がある。例えば、Fransson,L.A.とLewis,W.の、FEBS Lett(1979)97:119-123にはペリオデートによるヘパリン／ヘパラン硫酸の処理およびホウ素化水素ナトリウムによる還元やアルカリ媒質中の断片化に関する種々の条件が記載されている。さらに、Fran sson,L.A.ら（Carbohydrate Res(1980)80:131-145）は、ペリオデートを用いて生成された種々の型のヘパリンを化学的に研究した。ある研究において、ペリオデートで処理し、次いで塩基中でβ−除去して断片化を引き起こした。さらに彼らはペリオデートによるヘパリンの処理、次いで鎖の断片化および官能基の部分破壊を生じる部分酸加水分解について報告した。非抗凝固ヘパリンの別の例は、Casu,B.らの、Arzneim Forsch/Drug Res(1986) 36:637-642に記載されている。Casuらは、ヘパリンの抗高脂血症（リポ蛋白リパーゼ放出）活性に対するペリオデート酸化の影響について研究した。この研究のなかで、ヘパリンはペリオデートで酸化され、その産物はボロヒドリドで還元された。ＰＣＴ／ＳＥ９２／００２４３は、ヘパリン出発物質より大きな分子量を有し、ペリオデート酸化、アルカリによる脱重合、次いでボロヒドリド還元によって生成される非抗凝固性ヘパリンを開示している。ＷＯ９３／１９０９６は、オリゴ糖類が、Ｎ−硫酸化グルコサミン残基と２− Ｏ硫酸化イズロン酸残基を含む二糖単位を含む１０−１４二糖単位からなるＦＧＦ成長因子に対する高い特異結合親和性を有するオリゴ糖類を開示している。該オリゴ糖類は、ヘパリチナーゼによる酵素的脱重合によりヒト線維芽細胞ヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸から生成される（ここで、６−ＯＧｌｃＮ位は＜２０％硫酸化されており、２−ＯＩｄｏＡ位は１００％硫酸化されている）。 Maccaranaら（Maccaranaらの、J.of Biol.Chem.(1993)268:23898およびGuimon dらの、J.of Biol.Chem.(1993)268:23906）はｂＦＧＦとヘパリン／ヘパラン誘導オリゴ糖類の相互作用について記載している。このオリゴ糖類はヘパリンを含む天然および部分脱硫酸化ヘパリン／ヘパラン硫酸の断片化によって生成される（ここで、２−Ｏ−サルフェート基の約１／３が失われ、６−Ｏ−サルフェート基全てが失われる）。該６−Ｏ−位は、本出願に記載の、全６−Ｏ位の３４％までと全２−Ｏ位の６７％までが硫酸化されている組成物とは異なり、完全に脱硫酸化されたことに注目すべきである。最後に、Jaseja,M.らの、Can.J.Chem.(1989)中、67:1449-1456に記載の２−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物は抗凝固活性が低下している。非抗凝固性ヘパリンは当該技術分野で知られているが、当該技術分野では、二糖残基の全６−Ｏ位の約＜３４％と全２−Ｏ位の６７％までが硫酸化されている、非抗凝固性ヘパリンの実質的な生成法は開示されていないことに注目することが重要である。非抗凝固性ヘパリンの生物学的特性ＮＡＣヘパリンは、非抗凝固活性の他にある他の新規の生物学的特性を持っている。そのいくつかを下記に示す。ヘパラナーゼの阻害身体全体への腫瘍細胞の転移による拡散は、腫瘍細胞によって分泌され、基底膜成分を分解し、それによって循環を介して腫瘍細胞を転移させる酵素によって促されると考えられる。そのような酵素の１つが、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンを分解するエンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼ、すなわちヘパラナーゼである。ヘパラン硫酸は実質細胞の基底膜の主要成分である。ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／０１００３は、ある非抗凝固性ヘパリンがヘパラナーゼインヒビターとして作用し、転移性細胞変異体の肺への転移増殖を減らすか予防するのに有効かも知れないことを示している。非抗凝固性ヘパリンはＮ−脱硫酸化、次いでＮ−アセチル化によるか、またはＮ，Ｏ脱硫酸化、次いでＮ−再硫酸化によってヘパリンから製造された。このヘパリン誘導体は、部分的にＯ− 脱硫酸化される本発明の組成物と違って完全にＯ−脱硫酸化されたことに注目すべきである。血管形成の阻害血管形成は、新たな血管が形成される過程である。それは関節炎を含むある疾病や腫瘍の転移・増殖と関連があるかも知れない過程である(MitchellとWilksの、Annual Reports in Medicinal Chemistry(Academic Press 1992)27:139参照) 。血管新生を刺激または阻害する化合物は当該技術分野で知られたいくつかのアッセイを用いて同定することができる。おそらく、使用する最も最初のアッセイは、ニワトリしょう尿膜（ＣＡＭ）アッセイである。このアッセイを用いて、あるヘパリノイドは、ある血管静止（angiostatic）ステロイドと共に投与すると血管形成を阻害することが示されている（FolkmanとIngberの、Ann.Surg.(1987)206: 374およびFolkmanらの、Science(1983)221:719）。ｂＦＧＦの阻害ヘパリンまたはあるＮＡＣヘパリンはｂＦＧＦに結合すると同時にｂＦＧＦの細胞分裂促進活性を調節することが知られている。あるヘパリンまたはヘパリン様分子のｂＦＧＦ結合特性はこの刊行物に記載されている。例えば、５〜１５％の抗凝固活性を有する組成物は十分な２−Ｏ−サルフェート置換イズロン酸残基を保持し、ヘパリンとほぼ同等（ＩＣ₅₀〜１μｇ／ｍＬ）にＲＯ−１２ＵＣ細胞のヘパラン硫酸（ＩＣ₅₀１−２μｇ／ｍＬ）鎖にｂＦＧＦが結合するのを阻害する能力を維持する。ヘパリン様にｂＦＧＦと相互作用するこの能力は、特に５〜１５％の抗凝固活性と少なくとも２８％、好ましくは４９％の２−Ｏ−サルフェート含有量を有する組成物において、ｂＦＧＦ関連ヘパリン活性が実質的に保持されることを示している。より広範に２−Ｏ−サルフェートが失われている組成物は、その細胞増殖阻害と細胞増殖刺激特性に関して独特な傾向を示す。ある組成物は、ヘパリンに比べてｂＦＧＦ依存性細胞増殖を阻害する能力の低下を示すが、実質的に同等のｂＦＧＦ依存性細胞の増殖刺激能を有する。ｂＦＧＦ刺激活性の選択性に対するこの予期しない傾向は、ある組成物が血管形成、血管新生、再血管新生、側副血管の発達、および傷の治癒を刺激する選択的薬剤として有用かも知れない。ｂＦＧＦに対するヘパリノイドの影響を測定するためのアッセイは当該技術分野で知られている。細胞ベースの競合結合アッセイはIshihara,M.らの、Anal Bi ochem(1992)202:310-315に記載されている。血小板阻害ヘパリンの最もよく知られている特性は抗凝固活性であり、これは、ヘパリンの、動物における出血時間を延長する能力によって示される。これは、ヘパリンがその特異的抗トロンビンＩＩＩ結合領域を介してプロテアーゼプロインヒビター抗トロンビンＩＩＩに結合することによって生じる。これによっても最終的に血液凝固カスケードがブロックされる。ヘパリンは抗トロンビン効果を有することも知られており、この少なくとも一部は、ヘパリンの血小板凝集阻害能によるものである。ある患者では、血小板凝集との干渉は有意な出血傾向の原因となる。あるＮＡＣヘパリンは非抗凝固活性を有し、血小板凝集を阻害する（例えば、共同所有の米国特許出願第７５３２９９号（出願日1991年９月３日）またはＰＣＴ特許出願第ＵＳ９２／０２５１６号（出願日1992年３月２７日）参照）。抗血栓症活性ヘパリンおよびヘパリン誘導体の抗Ｘａ活性は発色体アッセイを用いて測定される（Odegard,O.R.らの、Haemostasis(1976)5:265およびWalenga,J.M.らの、CR C Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences(1986)22(4):361）。非分画ヘパリンからの誘導体の活性は出発ヘパリンより実質的に低下している。この活性低下は第Ｘａ因子の主要な阻害経路であるＡＴＩＩＩに対するこれら組成物の親和性の低下を示唆する。ヘパリンおよびヘパリン誘導体の抗ＩＩａ活性はアッセイキットと発色性基質を用いて測定される（Walenga,J.M.らの、CRC Critical Reviews in Clinical L aboratory Sciences(1986)22(4):361）。非分画ヘパリンからの誘導体の活性は出発ヘパリンより実質的に低下している。このことは、これら組成物が第ＩＩａ因子阻害の２つの主要なメカニズムであるＡＴＩＩＩとヘパリン補助因子ＩＩの両方に対する親和性を失っていることを示すものであろう。平滑筋細胞増殖の阻害血管壁における平滑筋細胞の増殖は血管の損傷に反応して、そしてある疾病の状態に関連して生じる（Austin,G.E.らの、J Am Coll Cardiol(1985)6:369-375 ）。この細胞の増殖は、細胞それ自身と共に、例えばアテローム性動脈硬化症、腎性高血圧症、肺性高血圧症、血管炎、および術後血管再狭窄の病理学的病変を形成する、過剰の蛋白または他のマトリックス分子の産生による負の影響を有することがある。すなわち、ヘパリン／ヘパラン硫酸はこれら疾病の治療に適用性がある。ショックの阻害あるＮＡＣヘパリンはある型のショック、循環血液量減少性ショックおよび関連症候群を治療するのにも有用である。一般に、循環血液量減少性ショックは、不十分な有効循環血液量をもたらす血液の再分布または心拍出量もしくは血液量の減少による細胞と組織の広範囲の還流減少と説明することができる。循環血液量減少性ショックおよびこの状態を研究するためのモデルは、Chaudr yとAyalaの、「Immunological Aspects of Hemorrhage」（R.G.Landes Co.,Aust in,Texas,1992）中に記載されている。類似の一連の出来事は、炎症性反応の鍵となるメディエーターが循環血液量減少性ショックを引き起こすそれと同じではないと思われることを除いて（そしてこれが最も重要である）、敗血症性ショックと関連がある。敗血症性ショックにおける初期血液量の減少は、エンドトキシン刺激性の好中球の活性化および炎症に介在するサイトカイン（ＴＮＦ）ＩＬ−１およびＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなど）の放出後の血液の貯留（プーリング）の結果として生じる。循環血液量減少性ショックと敗血症性ショックは異なる疾病であることを念頭におくことが重要である。循環血液量減少性ショックは、循環器系に対するあらゆる外傷を含む多くの出来事（例えば、銃撃による傷、交通事故による傷害、火傷、および刺傷など）によって生じ得る循環器系の全身虚脱である。一方、敗血症性ショックは細菌感染によって生じる。したがって、上記のごとく、これら疾患の原因は大きく違っているようである。虚血／再還流傷害（Ｉ／ＲＩ）は血流量が減少した状態（虚血）の後に炎症介在性の細胞と臓器の損傷が生じる別の例である。循環血液量減少性ショックに関連した血管損傷とそれによって生じる種々の臓器への好中球と白血球の浸潤は、組織損傷と最終的に多臓器不全（ＭＯＦ）および急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を引き起こす。破壊的な物質とメディエーターは数多くあり、サイトカイン、酵素、種々の他の炎症性物質が含まれる。ＭＯＦおよびＡＲＤＳは重篤なショックにおいて生じることがあり、死に至ることが多い。ショックに対して有効な治療剤に関して、該治療剤は微小血管構造および種々の臓器（肝臓、腎臓、心臓、脾臓および腸）を機能不全から防護しなければならない。出血性ショックとＩ／Ｒ傷害において消化管の機能と腸の機能を防護または回復する重要性が報告されてきており、これらは敗血症の合併症の減少および長期の生存と相関がある。本発明の要約本発明は、ヘパリンのＯ−脱硫酸化法、好ましくは６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン組成物の製造方法を１つの目的としている。この方法では６−Ｏ−脱硫酸化の程度を調節することによって、所望の量と分布の硫酸化を有する組成物を生成することができる。本発明の第二の目的は、二糖残基の全６−Ｏ位の約＜３４％が硫酸化されると共に他のＯ−サルフェート基の一部が失われている（二糖残基の全２−Ｏ位の６７％が硫酸化される）実質的に断片化していないヘパリン組成物である。この組成物は、実質的な抗癌作用、実質的に抗凝固活性がないこと、血小板凝集阻害、ｂＦＧＦのヘパラン硫酸への結合の阻害、およびヘパラナーゼと血管形成の阻害という独特の特性を持っている。本発明の第三の目的は、二糖残基の全６−Ｏ位の約１２〜２６％と全２−Ｏ位の約２８〜５０％が硫酸化されている、実質的に断片化していないヘパリン組成物である。本発明の第四の目的は、二糖残基の全６−Ｏ位の＜１３％と全２−Ｏ位の約１４〜２８％が硫酸化される、実質的に断片化していないヘパリン組成物である。本発明の第五の目的は、６−Ｏ−脱硫酸化の程度を調節し、所望の量と分布の硫酸化を有する組成物を製造することができる６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片またはヘパリン断片の製造法である。本発明の第六の目的は、６−Ｏ−脱硫酸化の程度を調節し、所望の量と分布の硫酸化を有する組成物を製造することができる、ヘパリンから実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物の製造法、好ましくはヘパリンのＮ−サルフェート位を実質的かつ完全に、また６−Ｏおよび２−Ｏ位を選択的に脱硫酸化し、次いで該アミノ位をＮ−再硫酸化することからなる方法である。本発明の第七の目的は、６−Ｏ脱硫酸化の程度を調節し、ヘパリンのピリジニウム塩型への変換、次いでＮ−脱硫酸化と６−Ｏ脱硫酸化、次いでＮ−再硫酸化を含む加溶媒分解的脱硫酸化反応を介して所望の量の硫酸化を有する組成物を製造することができる、ヘパリンから６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片組成物を製造する方法を示すことである。本発明の第八の目的は、６−Ｏ脱硫酸化の程度を調節し、加溶媒分解的脱硫酸化反応を介して所望の量の硫酸化を有する組成物を製造することができる、６− Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片組成物の製造法である。本発明の第九の目的は、実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片組成物を動物宿主に投与することによって、再狭窄、癌、血管形成、ショック、虚血再還流傷害、炎症、および循環器病を含む疾病を予防または治療する方法である。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に示す本発明の詳細な説明によってより完全に理解されよう。図の簡単な説明図１は、８５℃と１００℃における生成物の重量平均分子量［ＭＷ］ｗに対する加溶媒分解反応の影響を示す。生成物の重量平均分子量［ＭＷ］ｗは実質的に変化しておらず、実質的に断片化していない生成物を生じている。図２は、同じ条件下でのヘパリンのスペクトルに対する組成物１Ａ（ｉ）、２Ａ（ｉ）および３（ｉｉｉ）のＨ−１およびＨ−５におけるシフトを示す。図３Ａは加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の影響を示し、データは、特定のＯ−サルフェート基の相対的重要性を対比するために、７０℃における加溶媒分解経時反応に対するパーセントａＰＴＴ、２−Ｏ硫酸化ＩｄｏＡを含む二糖類のパーセント、および６−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮを含む二糖類のパーセントで表している。これらの反応条件下では２−Ｏ−サルフェートの実質的な損失を伴うことなく、選択的な６−Ｏ脱硫酸化が生じる。抗凝固活性は反応時間の経過中に、かなり速やかに出発ヘパリンの約５０％まで低下し、６−Ｏサルフェート基が失われた後、抗凝固活性は約１０％にまで低下した。図３Ｂは、加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の影響を示し、データは、特定のＯ−サルフェート基の相対的重要性を対比するために、１００℃における加溶媒分解経時反応に対するパーセントａＰＴＴ、２−Ｏ硫酸化ＩｄｏＡを含む二糖類のパーセント、および６−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮを含む二糖類のパーセントで表している。生成物組成物の抗凝固活性は非常に急速に４時間後＜１０％まで低下した。図４Ａは、加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の影響を示し、データは、７０℃＋Ｃｕ（ＩＩ）時間経過での硫酸銅（ＩＩ）存在下の加溶媒分解反応に対するパーセントａＰＴＴ、２−Ｏ硫酸化ＩｄｏＡを含む二糖類のパーセント、および６−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮを含む二糖類のパーセントで表している。抗凝固活性は７２時間後に出発活性の３０％にしか達せず、Ｃｕ（ＩＩ）の存在によって顕著な影響を受けた。図４Ｂは、加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の影響を示し、データは、１００℃＋Ｃｕ（ＩＩ）時間経過での硫酸銅（ＩＩ）存在下の加溶媒分解反応に対するパーセントａＰＴＴ、２−Ｏ硫酸化ＩｄｏＡを含む二糖類のパーセント、および６−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮを含む二糖類のパーセントで表している。Ｃｕ（ＩＩ）存在下の１００℃における経時反応の二糖プロフィールは、Ｃｕ（ＩＩ）非存在下の加溶媒分解に比べてわずかな変動しか示さなかった。該プロフィールは、抗凝固活性の全体的に遅い低下を示し、これはおそらくＧＭＳ₂に関連した効果よりＩＳＭＳとＩＳＭの緩徐な変換と関連があるものと思われる。図５は、７０、８５および１００℃の加溶媒分解反応における経時反応からの生成物の抗凝固活性を示す。抗凝固活性の低下は、反応温度によって劇的な影響を受けた。図６Ａは、ＲＯ−１２ＵＣ細胞に対するｂＦＧＦの結合を測定するためのアッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果を示す。組成物１Ａ（ｉｉ）からのヘキサ、オクタ、デカおよびドデカマーはヘパリンオリゴ糖類とほぼ同様にＲＯ−１２ＵＣ細胞に対するｂＦＧＦの結合を阻害した。図６Ｂは、ｂＦＧＦ誘導ＡＣＥ細胞増殖を測定するためのアッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果を示す。組成物１Ａ（ｉｉ）からのヘキサ、オクタ、デカおよびドデカマーは、ヘパリン誘導オリゴ糖類に比べてｂＦＧＦ誘導ＡＣＥ細胞増殖の阻害活性が２倍低かった。図６Ｃは、ｂＦＧＦ誘導ＡＣＥ細胞刺激を測定するためのアッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果を示す。ヘパリンと組成物１Ａ（ｉｉ）のデカマーおよびドデカマーはほぼ同等の活性を示したが、一方、ヘパリンと組成物１Ａ（ｉｉ）のヘキサマーとオクタマーは実質的に不活性であった。図７Ａは、静脈内経路で投与したときの抗再狭窄アッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果（％閉塞でプロット）を示す。組成物１Ａ（ｉｉ）で処理した動物において閉塞の５４％の減少（ｐ＜０．０５）が見られた。図７Ｂは、静脈内経路で投与したときの抗再狭窄アッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果（％新血管内膜でプロット）を示す。組成物１Ａ（ｉｉ）で処理した動物において血管内膜領域の４０％の減少（ｐ＜０．０５）が見られた。図８は、皮下経路で投与したときの抗再狭窄アッセイにおける組成物２Ａ（ｉｉ）の影響の結果を示す。組成物２Ａ（ｉｉ）の投与により、ビークルコントロールに比べて新血管内膜領域の減少が生じた。本発明の実施法本発明は、その最も一般的な形において、実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片からなる組成物と該組成物の製造法に関する。この方法により、二糖残基の全６−Ｏ位の約＜３４％が硫酸化されると共に他のＯ−基の一部が失われる（二糖残基の全２−Ｏ位の６７％までが硫酸化される）ように、６−Ｏ脱硫酸化のパーセントを調節することができる。本明細書を通して、科学刊行物、特許または特許出願を引用した。これらの引用文献は本出願の一部を構成する。本明細書を通して用いる技術用語を簡単に説明することによって本発明の理解が促されるであろう。「ヘパリン／ヘパラン硫酸」または「ヘパリン」は、ヘパリンを抗凝固剤として製造するための通常の方法で組織から得られた調製物、あるいは組織から得られるものに対応する合成された調製物をいう（本明細書の一部を構成する、Conr ad,H.E.の、Heparin and Related Polysaccharides、N.Y.Academy of Sc.,（６月７日、1989）の56巻、18頁参照）。この調製物は、ヘパリンの特徴であるイズロン酸（ＩｄｏＡ）とヘパラン硫酸の特徴であるＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の残基を含んでいてもよい。しかし、ＧｌｃＡとＩｄｏＡはいずれも両者に存在するが、それらは異なった割合の量で存在している。ヘパラン硫酸がよりヘパリン様になるにつれてＩｄｏＡ／ＧｌｃＡ比は上昇する。既述の背景の項に記載のごとく、Ｄ−グルクロン酸のＬ−イズロン酸への変換は、ヘパラン−タイプの中間体のＧｌｃＡ残基の５炭素がエピマー化した結果である。そのようなエピマー化と変換に関するこの一連の工程は、当該技術分野で理解されている。完全な変換が起こっていない程度に、該調製物においてヘパラン硫酸の特性は維持されている。ヘパリン調製物のポリマー鎖の正確な性質は一般に決定されておらず、製造物ごとに異なるため、用語「ヘパリン／ヘパラン硫酸」または「ヘパリン」は、生じた混合物の範囲に及ぶことを意図している。おそらく、ヘパラン硫酸とヘパリンとを区別する主な特徴は後者が抗凝固活性を有することである。ヘパリン断片または低分子量のヘパリンとは、多くの試薬のいずれかおよび平均分子量５〜３０ｋｄのヘパリンを平均分子量２〜６．５ｋｄの組成物に脱重合する方法によって処理されているヘパリンをいう。そのような試薬と方法は当該技術分野で知られており、例として亜硝酸脱重合、ベンジル化に続くアルカリ脱重合、パーオキシダーゼ脱重合、アルカリ処理、およびヘパリナーゼによる酵素的脱重合が含まれる（Hirsh,J.とLevine,M.の、Blood(1992)79:1-17参照）。「ヘパリン／ヘパラン硫酸」または「ヘパリン」調製物は、所望であればヒト組織を含む種々の哺乳動物組織から得ることができる。一般に、ブタまたはウシ起源のものが用いられ、血管新生組織が好ましい。好ましいヘパリン出発材料の供給源は、ブタ腸粘膜であり、この組織供給源から調製した「ヘパリン」と呼ばれる調製物は市販品として利用可能である。一般に、ヘパリン出発物質は、選択した組織を自己分解させ、該組織をアルカリ抽出し、次いで蛋白を凝固させ、次いで酸化により上清からヘパリン−蛋白コンプレックスを沈澱させることによって選択した組織供給源から製造される。該コンプレックスはエタノールやアセトンもしくはその混合物のような極性非水性溶媒を用いて再沈澱させることによって回収され、エタノールのような有機溶媒で抽出して脂肪を除去し、トリプシンのような蛋白分解酵素で処理して蛋白を除去する。ヘパリン出発物質を調製するのに適した方法は、例えはCharles,A.F.らの、Biochem J(1936)30:1927-1933に記載されており、Coyne,E.の、Chemistry and Biology of Heparin(1981)Elsevi er Publishers，North Holland,New York,Lunblad,R.L.ら編中に開示されているようなこの基本的方法を改良したものが知られている。一般に、非修飾ヘパリンにおいて、ＧｌｃＮの６−Ｏ位の８５％が硫酸化され、ＩｄｏＡの２−Ｏ位の７０％が硫酸化される。ヘパリンにおけるサルフェートの含有量と分布は幾分変化しやすいとも理解される。本発明は出発ヘパリン／ヘパラン硫酸または他のＮＡＣ−ヘパリンのＯ−硫酸化のレベルと分布を変化させ、抗凝固活性は低下しているが、他の活性は保持されている組成物を得るのに有用である。「ＮＡＣ−ヘパリン」または「ＮＡＣ」は、利用可能な市販のヘパリンを１またはそれ以上の化学薬品で処理して得られる、実質的に非抗凝固性の、非断片化ヘパリン組成物をいう。アルキルアミンが炭素数１〜６の、塩の形のアルキル基のアミンを表すアルキル−またはサイクリックアミン塩、およびサイクリック−アミン塩類は、窒素がピペリジン、モルホリンおよびピリジンのような複素環の一部をなす塩の形の該アミン、好ましくはピリジニウム塩形を表す。本明細書に記載し、クレームしている組成物の二糖分析法はGuoとConradの、A nal.Biochem.(1988)168:54-62に記載のものであることに注目することが重要である。そのような方法は１〜２％以内の誤差で特定の二糖類を検出することができる。「６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン」は、６−Ｏ位が主に脱硫酸化され、２−Ｏ位の一部が脱硫酸化されている、実質的に非抗凝固性の非断片化ヘパリン組成物をいう。「実質的に断片化していないかまたは非断片化の」とは、生成物の重量平均分子量［ＭＷ］ｗが実質的に変化していない、すなわち、生成物の重量平均分子量「ＭＷ］ｗが出発物質の重量平均分子量［ＭＷ］ｗの７５％またはそれ以上である組成物を示す。本発明の方法はその一般的な形において、断片化していないヘパリンまたはヘパリン断片の６−Ｏ脱硫酸化の程度を調節し、所望のパーセントの脱硫酸化を有する６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片または実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンの組成物を得るのを可能にする。一般に、好ましい組成物は以下のごとく定義される。（ｉ）二糖残基の全６−Ｏ位の＜３４％と全２−Ｏ位の５１〜６７％が硫酸化されている、出発抗凝固活性の＜３０％を有する組成物１および１Ａ。組成物１Ａは、二価のカチオン、好ましくは銅の存在下で、ヘパリンが選択的に加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化された生成物である。組成物１および１Ａの活性には、血管形成と細胞増殖を含むｂＦＧＦ関連活性の阻害が含まれる。（ｉｉ）組成物２および２Ａは、二糖残基の全６−Ｏ位の１２〜２６％と全２ −Ｏ位の２８〜５０％が硫酸化されている、出発抗凝固活性の５〜１５％を有する。組成物２Ａは、二価のカチオン、好ましくは銅の存在下で、ヘパリンが選択的に加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化された生成物である。組成物２および２Ａの活性には、血管形成と細胞増殖を含むｂＦＧＦ関連活性の阻害が含まれる。（ｉｉｉ）二糖残基の全６−Ｏ位の＜１３％と全２−Ｏ位の１４〜２８％が硫酸化されている、＜５％の抗凝固活性を有する組成物３および３Ａ。組成物３Ａは、二価のカチオン、好ましくは銅の存在下で、ヘパリンが選択的に加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化された生成物である。組成物３および３Ａの活性には、ヘパリンと同等の選択的なｂＦＧＦ関連細胞増殖刺激特性が含まれる。簡単には、この方法は市販品として利用可能なヘパリン、好ましくはMing Han ヘパリン、１６５Ｕ／ｍｇ、または低分子量ヘパリン（ＬＭＷヘパリン）とも呼ばれるヘパリン断片を塩の形に変換し、次いで、ほぼ完全なＮ−脱硫酸化をもたらす加溶媒分解脱硫酸化および最も重要には部分的Ｏ−脱硫酸化を生じさせることからなる。次に、反応物質をＮ−再硫酸化し、上記組成物を得る。本明細書に開示されている組成物中のＯ−脱硫酸化の程度は、反応温度、反応時間、加溶媒分解溶媒組成物、ヘパリン塩型の溶液濃縮物、および反応溶液中の他の逆のイオンの存在に依存する。これらの反応パラメータを調節し、最適な選択的６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物を得る。好ましくは、この方法は市販品として利用可能なヘパリン、好ましくはMing H anヘパリン、１６５Ｕ／ｍｇ、または低分子量ヘパリン（ＬＭＷヘパリン）とも呼ばれるヘパリン断片をアルキル−またはサイクリック−アミン塩、好ましくはピリジニウム塩型に変換し、６０〜１１０℃で、適切な長さの時間１〜１０％水（またはメタノール）を含むＤＭＳＯ中のピリジニウムヘパリン溶液を加熱することからなる。分離された生成物は、ほぼ完全にＮ−脱硫酸化され、Ｏ−サルフェート含有量および特に６−Ｏ−サルフェート含有量が減少する。これら中間体は、続く、論文（Lloydらの、Biochem．Pharmacol.(1971)20,637-648）に記載の適切な条件（典型的にはアルカリ水性媒質（ｐＨ９）中のトリメチルアミン−３酸化硫黄コンプレックス（または同等の試薬）による処理を含む）を用いる続くＮ−再硫酸化によって本発明の最終産物に変換される。これにより、出発ヘパリンのＯ−サルフェート含有量だけが減少している生成物をもたらす実質的に完全なＮ−再硫酸化が達成される。ヘパリンの酸触媒脱硫酸化によって得られたヘパリン誘導体は、酸触媒反応におけるＯ−脱硫酸化の順序（２−Ｏ−Ｓ＞６−Ｏ−Ｓ）が本明細書に開示の組成物のＯ−脱硫酸化の順序（６−Ｏ−Ｓ＞２−Ｏ−Ｓ）と反対であるため、本明細書に記載の誘導体とは明らかに異なる。ヘパリン中の６−Ｏ−サルフェート基が抗凝固活性に決定的であることは報告されていない。しかし、本発明において特徴づけられる組成物において、６−Ｏ −サルフェート置換体の広範な減少（二糖残基の全６−Ｏ位の＜３４％が酸化されている）と他のＯ−サルフェート基の部分的な減少（二糖残基の全Ｏ−位の６７％までが硫酸化されている）は抗凝固活性の実質的な低下をもたらすことが確証されている。標識型の本発明の非抗凝固性組成物本発明の組成物には、所望により蛍光、放射性同位元素、または酵素標識を施すことができる。炭水化物または関連部分に標識をカップリングするための通常の技術を用いることができる。そのような技術は当該技術分野でよく確立されている（例えば、米国特許第４６１３６６５号参照）。本発明の標識混合物は、疾病部位の同定や競合イムノアッセイ、およびin vivoでの該組成物の薬物動態の追跡手段として用いてもよい。この目的に適した放射性同位元素標識には、水素³ 、ヨウ素¹³¹、インジウム¹¹¹、テクネチウム⁹⁹、およびリン³²が含まれる。適切な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ −デヒドロゲナーゼ、および西洋ワサビパーオキシダーゼが含まれる。特に好ましい蛍光標識には、フルオレセインとダンシルが含まれる。３タイプすべての種々の標識が当該技術分野で知られている。投与および使用本発明の非抗凝固性ヘパリン組成物は、再狭窄、癌、血管形成、ショック、虚血再還流傷害、炎症、循環器病、および血小板凝集、ヘパラナーゼまたは血管形成活性によって発生もしくは悪化する疾病を含む種々の病気を治療または予防するための治療的応用に有用である。本発明の６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物は、その抗凝固活性によって、血管形成が基礎となる疾病の有益な治療に好ましく応用されよう。そのようなクラスの疾病の１つに網膜症がある。このクラスの１つに、本発明の組成物によって好ましく治療される糖尿病性網膜症がある。本発明の組成物の別の応用は、癌、特に転移性および侵襲性癌の、好ましくは患者の身体全体への癌の拡散と増殖を促すかまたはそのために必要な血管形成を阻害する治療または予防である。本発明の組成物のさらに別の応用は、例えば、循環血液量減少性ショックおよび敗血症性ショックを含むショックの治療または予防である。循環血液量減少性ショックのような多くの疾病のメカニズムは複雑であり、多くの原因の結果である。したがって、本明細書で用いている「治療」は、１またはそれ以上の原因もしくは結果と干渉することによって治療される個体に有益な影響を与える方法論を示す。循環血液量減少性ショックの「治療」には、おそらく、ショックの原因を完全かつ実質的に除去することなく、症状の発現を予防、遅延またはいくぶん減少させることが含まれることが理解される。したがって、本発明の組成物による治療は、治療される個体が最終的にショックで死亡したとして寿命を延ばし、そして／または治療の質を改善するかもしれない。本発明の組成物は、該疾病を発現するリスクの高い患者におけるそのようなショックを予防するのに応用することもできる。例えば、ある容態では、出血、外傷、火傷、多尿症、嘔吐、および下痢を含む循環血液量減少性ショックを発生するリスクが高い（Circulatory Shock,(1992)91:7参照）。すなわち、これら容態の１つによって入院している患者には、循環血液量減少性ショックの発現を予防するために本発明の組成物を投与してよい。その結果、本出願全体の内容は、循環血液量減少性ショックを治療する方法についてなされているが、そのような用語がショックの予防を含むことも当業者なら理解しよう。好ましい治療的組成物は１、１Ａ、２、２Ａ、３および３Ａの断片からなることに注目すべきである。それらのサイズの減少によって、そのような断片は好ましい生物学的利用能（バイオアベイラビリティ）と薬物動態特性を示す（Hirsh, J.とLevine,M.の、Blood(1992)79:1-17参照）。実質的に断片化されていない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片の投与は、通常、グリコサミノグリカン組成物に適した経路によってなされ、一般的には、注射によるような全身投与が含まれる。長期間にわたる連続注射を容易に続けることができることから、静脈注射が特に好ましい。腔内投与によるかまたは浸透圧ポンプや埋め込み物（インプラント）を用いる外膜投与による血管系内への導入も好ましい。通常のインプラントは、コラーゲン、ポリラクテート、およびポリラクテート／ポリグリコシド混合物などのような生物分解性物質が含まれる。これらはパッチまたはビーズとして製剤化してもよい。通常の用量範囲は、５〜３０、好ましくは７〜１４日の期間にわたって、一定に０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時の範囲である。特に好ましい用量は約０．３ｍｇ／ｋｇ／時または７０ｋｇの成人に対して２１ｍｇ／時もしくは約５００ｍｇ／日である。他の投与法はあまり好ましくないが、より便利かもしれない。低濃度の皮下投与または静脈投与よりわずかに高用量の経口投与、または局所的傷害に対する経膜もしくは経皮または他の局所投与も有効かも知れない。おそらく血管移殖物質に含まれる支持マトリックスのような連続的放出用具を介した局所投与は外傷の位置に近づきやすく、特に有用である。前記の投与法に適した製剤は、当該技術分野で知られており、製剤の適切な概要はRemington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company,Easton, PA、最新版に記載されている。本発明の組成物は、放射性標識、蛍光標識、クロモホア、または酵素のような通常の方法を用いて標識してもよく、そのような組成物を投与した後の生物試料中の該組成物の量をアッセイするのに用いてもよい。生物試料中の分析物の競合アッセイの適切なプロトコールは当該技術分野でよく知られており、標識競合物との混合物中、通常、免疫グロブリンやその断片のような分析物と反応する特定の結合パートナーで試料を処理することを含む。下記のごとく本発明に従って製造される抗体は、この目的に有用である。抗体に対する分析物と競合物の結合は、結合コンプレックスを除去し、このコンプレックスまたは上清のいずれかの標識物をアッセイすることによって測定することができる。分別は、特定の結合パートナーを固体支持体とあらかじめ結合させることによってより容易に行うことができる。そのような技術は当該技術分野でよく知られており、そのような競合アッセイに利用できるプロトコールは本明細書に詳細に記載するにはあまりに数が多く、よく知られて過ぎている。抗体の作製は、６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片を適当な動物宿主に直接注射するか、または該組成物を適切な担体とカップリングさせ、カップリングさせた物質を適切なアジュバントと共に標準的免疫プロトコールにより哺乳動物または他の脊椎対象に投与することによって行ってよい。適切な免疫原性担体には、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような種々の血清アルブミン、およびロタウイルスＶＰ６蛋白のようなあるウイルス蛋白が含まれる。次いで、これらカップリングした物質を、ウサギ、ラット、またはマウスのような対象に反復注射により投与し、標準的イムノアッセイ法によって抗体価をモニターする。得られる抗血清はそれ自体を使用してもよく、また免疫によって生じた抗体分泌細胞を標準的技術を用いて不死化し、６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６− Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片と免疫反応性であるモノクローナル調製物の供給源として使用してもよい。６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片と担体を結合する方法は当該技術分野で知られている。該組成物は、例えば、Pierce Chemical Co mpany,Rockford,IL.から市販されているようなホモ−またはヘテロニ機能性リンカーによって、担体と結合してもよい。あるコバレントなリンカーは米国特許第４９５４６３７号に記載されている。ネズミまたはヒトモノクローナル調製物はKohlerとMillsteinの、Nature(1975 )256:495およびFendlyらの、Hybridoma(1987)6:359に記載の不死化細胞との融合のような当該技術分野でよく知られている方法を用いる動物の末梢血リンパ球やは牌細胞をin vivoまたはin vitroで不死化することによって得ることができる。in vitro法は一般に、Luben,R.とMohler,M.の、Molecular Immunology(1980)1 7:635、Reading,C.の、Methods in Enzymology(1986)121:18（パート１）、またはVoss,B.の、Methods in Enzymology(1986)121:27に記載されている。組換えおよび／またはヒト化抗体は当該技術分野で知られた方法を用いて作製してもよい。６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片の特性上記のごとく、ヘパリンおよび非抗凝固性ヘパリンは生物学的に活性である。本発明の組成物の生物学的特性を決定し、これらをヘパリンまたは既知の非抗凝固性ヘパリンの該特性と比較するためにあるアッセイを実施した。６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンの特に顕著な特性はin vivoの毒性が低いことである。試験した特性と使用したアッセイは下記の実施例に詳細に記載されている。以下の実施例は例示であって本発明を限定しようとするものではない。例えば、当業者は下記のものと置き換えることができ、実施例に記載の範囲内に入る物質および方法があることを知るであろう。実施例１６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンの製造表１は組成物１、１Ａ、２、２Ａ、３および３Ａを合成するのに用いる反応条件を挙げている。組成物に対する反応温度と時間の影響および加溶媒分解の推移からの生成物の抗凝固活性に関する詳細な実験は、銅の非存在下（各図３Ａおよび３Ｂ）と銅の存在化（各図４Ａおよび４Ｂ）の両方で、７０および１００℃で実施した。全ての他の反応パラメーターは、結果を適切に比較できるように一定に保った。一般に、ピリジニウムヘパリン２．０ｇを水１０ｍＬに溶解し、次いでＤＭＳＯ９０ｍＬで希釈した。この溶液を温度調節した油浴中で一定に撹拌しながら加熱した。部分標本（１０ｍＬ）を示した時間間隔で回収し、５％重炭酸ナトリウム５ｍＬを含むチューブに移して冷却した。すべての部分標本を１２時間０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液１０倍容で２回、次いで蒸留水で徹底的に透析した。Ｎ−再硫酸化：ヘパリン誘導体中の遊離アミン機能性の緩やかかつ選択的なＮ −硫酸化を達成するための反応条件は、Lloydら（Biochem.Pharmacol.,(1971)20 ,637-648）が報告しているものと同様であった。該ヘパリン誘導体または加溶媒分解生成物は、５０〜６０℃で２４時間、０．１Ｍ水性炭酸ナトリウム中、過剰の（３〜５モル等量）ＴＭＡ／ＳＯ₃またはピリジン／ＳＯ₃で処理された。過剰の硫酸化試薬は完全な反応を保証するために、通常、反応の時間経過にわたって３回に分けて加えられる。反応後、溶液を蒸留水で徹底的に透析し、濾過し、凍結乾燥した。一般に、目的とする組成物は以下のごとく定義される。（ｉ）二糖残基の全６−Ｏ位の＜３４％および全２−Ｏ位の５１〜６７％が硫酸化されている、出発抗凝固活性の＜３０％を有する組成物１および１Ａ。組成物１Ａは、二価カチオン、好ましくは銅の存在下における、ヘパリンの選択的な加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の産物である。組成物１および１Ａの活性には、血管形成および細胞増殖を含むｂＦＧＦ関連活性の阻害が含まれる。（ｉｉ）二糖残基の全６−Ｏ位の１２〜２６％および全２−Ｏ位の２８〜５０％が硫酸化されている、出発抗凝固活性の５〜１５％を有する組成物２および２Ａ。組成物２Ａは、二価カチオン、好ましくは銅の存在下における、ヘパリンの選択的な加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の産物である。組成物２および２Ａの活性には、血管形成および細胞増殖を含むｂＦＧＦ関連活性の阻害が含まれる。（ｉｉｉ）二糖残基の全６−Ｏ位の＜１３％および全２−Ｏ位の１４〜２８％が硫酸化されている、出発抗凝固活性の＜５％を有する組成物３および３Ａ。組成物３Ａは、二価カチオン、好ましくは銅の存在下における、ヘパリンの選択的な加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の産物である。組成物３および３Ａの活性には、ヘパリンと同様の選択的ｂＦＧＦ関連細胞増殖刺激特性が含まれる。構造的特性：反応の時間経過から分離されたすべての試料は種々の方法を用いて分析された。分析は通常、Ｎ−再硫酸化産物について行われた。図１は８５℃ および１００℃における該産物の重量平均分子量［ＭＷ］ｗに対する加溶媒分解反応の影響を示す。該産物の重量平均分子量［ＭＷ］ｗは実質的に変化せず、実質的に断片化していない産物を生じる。 ¹Ｈ−ｎｍｒ分光光度法：Ｎａ₂ＣＯ₃を添加してｐＨ＞９０に補正したＤ₂Ｏ中の溶液のＮ−再硫酸化生成物について行ったとき、部分Ｏ−脱硫酸化産物の３００ＭＨｚ ¹Ｈ−ｎｍｒ特性が最も有効であった。最も有益なこれらのスペクトルの２つの性状はＩｄｏＡからの２−Ｏ−サルフェートの損失の結果、ＩｄｏＡＨ −１およびＩｄｏＡＨ−５のシフトが生じることである。これらの共鳴は６− Ｏ−サルフェートの減少にはあまり比較的反応しない。同じ条件下でヘパリンのスペクトルに比べて＞９０％ＧｌｃＮ６−Ｏ−サルフェートおよび＜２０％２ −Ｏ−サルフェートが失われている組成物３に関する¹Ｈ−１および¹Ｈ−５のシフトを図２に示す。二糖組成物：この産物の組成物分析は、Guo,Y.とConrad,H.E.のAnal.Biochem. (1989)176:96およびGuo,Y.とConrad,H.E.の、Anal.Biochem.(1988)168:54に記載の二糖分析法を用いて達成された。簡単には、試料をヒドラジンで処理してこの物質を完全に脱Ｎ−アセチル化し、次いでこれを順次ｐＨ１．５および４．０で亜硝酸処理した。これらの条件はヘパリン様ポリマーの、ＧｌｃＮ残基がそれぞれのアンヒドロマンノース残基に変換されている構成二糖類への完全な変換をもたらした。この二糖混合物のＮａＢ³Ｈ₄による還元により親ポリマーの構成物を完全に分析するのに適した標識二糖類を得た。逆相イオン−ペアリングＨＰＬＣ（Guo,Y.とConrad,H.E.の、Anal.Biochem.(1 989)176:96）を用いて、試料中のモノ（ＩＳＭ、ＩＭＳおよびＧＭＳ）および脱硫酸化二糖類（ＩＳＭＳおよびＧＭＳ₂）を定量した。非硫酸化二糖類はこれらの産物にも存在しており、ペーパー電気泳動（Shively,J.E..とConrad,H.E.の、 Biochem.(1976)15:3943）を用いて定量された。非−、モノ−および脱硫酸化二糖類の相対量は、ＨＰＬＣおよびペーパー電気泳動のデータから計算した。抗凝固活性：活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）は、化学的または粒状アクチベーターのいずれかを用い、第ＸＩＩ因子を介する固有の系の活性化に基づくクエン酸化血しょうベースの凝固アッセイを用いて決定された。ＡＰＴＴアッセイはJ.M.Walengaらの、「In Vitro Evaluation of Heparin Fraction s:Old vs．New Methods」CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Syste ms 22,362に詳述されており、この内容は本明細書の一部を構成する。ＡＰＴＴ値はヘパリンに対する値を１００％とするヘパリンのパーセントで計算した。図３Ａは、加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の影響を示し、データは特定のＯ− サルフェート基の相対的重要性を対比するために、７０℃の加溶媒分解経時反応におけるパーセントａＰＴＴ、パーセント２−Ｏ−硫酸化二糖含有量、およびパーセント６−Ｏ−硫酸化二糖含有量で表す。ここでみられる傾向は、６−Ｏ脱硫酸化が２−Ｏ−サルフェートの実質的な減少を伴うことなく選択的に生じるという観察結果を支持する。この抗凝固活性は、反応の時間経過にわたって、出発ヘパリンの約５０％までかなり急速に低下し、おおよそ６−Ｏサルフェート基の減少傾向がみられた後に、より徐々に約１０％に低下した。１００℃で実施例１の記載に従って実施した加溶媒分解反応からの生成物の抗凝固活性（図３Ｂ）は、４時間後に＜１０％まで非常に速やかに低下した。１２時間までに、最初の２−Ｏ−サルフェート含有量の〜４０％がＩＳＭ二糖単位の形を有するにも関わらず、この活性は最初の活性の＜１％となった。加溶媒分解反応に対する銅の影響：７０℃および１００℃の、硫酸銅（ＩＩ）存在下における加溶媒分解反応に対するパーセントａＰＴＴ、パーセント２−Ｏ硫酸化二糖含有量、およびパーセント６−Ｏ硫酸化二糖含有量に対する加溶媒分解Ｏ−脱硫酸化の経過時間の影響は、それぞれ図４Ａおよび４Ｂにグラフで示す。７０℃＋Ｃｕ（ＩＩ）の経過時間（図４Ａ）において、抗凝固活性は、７２時間後出発活性の３０％にしか達せず、Ｃｕ（ＩＩ）の存在によって著しい影響を受けた。より後の時点における抗凝固活性の保持は、ＩＳＭＳが約５％上昇したことによるか、Ｃｕ（ＩＩ）が存在しないときのようにＧＭＳ₂が完全には失われないことによるかも知れない。図４Ａにみられる傾向は、６−Ｏ脱硫酸化が、２−Ｏ−サルフェートの実質的な減少を伴うことなく選択的に生じるという観察結果を支持する。Ｃｕ（ＩＩ）存在下における１００℃の経時反応の二糖プロフィールはＣｕ（ＩＩ）非存在下における加溶媒分解に比べてわずかな変化しか示さなかった（図４Ｂ）。抗凝固活性プロフィールは、おそらくＧＭＳ₂に関連するいかなる影響よりも遅いＩＳＭＳおよびＩＳＭの変換と相関する、活性のより遅い全体的な低下を示した。Ｃｕ（ＩＩ）存在下における８５℃の加溶媒分解経時反応を実施し、初期データはＣｕ（ＩＩ）存在下における７０および１００℃での反応に基づいて予想された傾向を支持した。７０、８５および１００℃におけるすべての経時反応からの産物の抗凝固活性は図５にグラフで示す。明らかに、抗凝固活性の低下は、反応温度による劇的な影響を受けた。Ｃｕ（ＩＩ）イオンの存在は、より低温でより有効なａＰＴＴに対する保護効果を示した。１００℃の加溶媒分解は、いくらかの２−Ｏ脱硫酸化を伴う６−Ｏ−サルフェートの減少率の劇的な増加をもたらすと、図３Ｂから結論することができる。＜２５％の６−Ｏ−サルフェート含有量と＞９０％の２−Ｏ−サルフェート含有量を有する組成物が４時間の反応時間で得られ、出発ヘパリンの抗凝固活性の＜１０％を有していた。上記のごとくＣｕ（ＩＩ）存在下で加溶媒分解を行うと８時間後に同様の組成物が得られた（図４Ｂ）。これらの結果は、２−Ｏ−サルフェートの有意な減少は抗凝固活性の有意な低下にとって必要ではないことも示している。実施例２抗血管形成活性血管形成を刺激または阻害する化合物は当該技術分野で知られた種々の方法を用いて確認することができる。上記実施例１に記載のごとく生成された組成物２Ａ（ｉ）および３（ｉｉｉ）はニワトリしょう尿膜（ＣＡＭ）アッセイを用いて試験された。このアッセイは、試料の血管新生阻害効果を評価した以外は、Cast ellotらの、J.of Cellular Physiology(1986)127:323-329の記載に従って実施した。ハイドロコーチゾン５０μｇまたはハイドロコーチゾンと種々の量の６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンを含有するアガロースペレットをＣＡＭ上で３〜４日間インキュベーションした後、結果をスコアにつけた。表２はその結果を示す。組成物２Ａ（ｉ）は血管形成活性を有することが明らかである。より広範なＯ脱硫酸化産物である組成物３（ｉｉｉ）はより弱い活性を示した。血管静止活性は該ペレット周囲の部分的にクリアーなゾーン、または無血管ゾーンで定義される。すべての場合において、各ヘパリノイド濃度におけるペレットはハイドロコーチゾン５０μｇを含んでいた。表２の括弧内の数字は、無効、部分的クリアリング（clearing）、もしくは非脈管ゾーンを示すとスコアづけした全胎児のパーセントである。例えば、組成物２Ａ（ｉ）５０μｇ／ｍＬは５胎児で効果がなく、８胎児で部分的クリアリングを示した。したがって、これらの条件下では胎児の３８．５％で効果がなく、６１．５％が部分的クリアリングを示した。実施例３組成物２Ａ（ｉｉｉ）および３（ｉｉ）のヘパラナーゼ阻害活性ラット肝癌細胞系からのヘパラナーゼを用いて組成物２Ａ（ｉｉｉ）および３（ｉｉ）のヘパラナーゼ阻害活性を試験した。この細胞系はGerschensonらの、S cience(1970)170:859-861に記載されている。肝癌細胞からのヘパラナーゼの分離法と該酵素活性のアッセイ法は当業者に知られている。以下の方法と物質を使用した。コンフルエントのラット肝癌細胞培養を標準的細胞培養フラスコに増殖させ、０．２５Ｍショ糖と０．１４ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭヘペス溶液（ｐＨ７．４）１０ｍＬで３回洗浄した。次に、０．１４ＭＮａＣｌ、６ｍＭアジ化ナトリウムおよびあるプロテアーゼインヒビターを含む５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２）１ｍＬを加え、ディスポーザブルの細胞スクレイパーを用いてフラスコから細胞を回収した。ＭＥＳ緩衝液には以下のプロテアーゼインヒビターが存在した：０．２μｇ／ｍＬアプロチニン、０．５μｇ／ｍＬロイペプチン、１００μ ｇ／ｍＬダイズトリプシンインヒビター、１ｍＭＰＭＳＦ、２ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、および１５ｍＭＤ−糖酸１，４ラクトン（エクソグルクロニダーゼインヒビター）。７ｍＬ Dounceホモゲナイザーに細胞を加えてエタノール／ドライアイス浴中で３回凍結／融解し、きっちりした乳棒を用い１５ストロークによりホモゲナイズした。得られる細胞溶解物を２ｍＬ遠心管に入れ、４℃、16000×ｇで３０分間遠心した。上清を取り出し、上清の蛋白濃度をMacro BCA蛋白アッセイを用いて測定した。ＢＳＡを標準品に用いた。セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）沈澱により非開裂Ｎ−³Ｈアセチル化すい臓ヘパラン硫酸から誘導した可溶性Ｎ−³Ｈアセチル化すい臓ヘパラン硫酸断片を測定することによってヘパラナーゼ活性を定量した。Ｎ−³Ｈアセチル化すい臓ヘパラン硫酸は約12000の重量平均分子量またはＭｗを持っていた。以下の手順を用いた。上記のごとく分離した、蛋白１０μｇを含むラット肝癌細胞上清を、上記のプロテアーゼインヒビター、０．１４ＭＮａＣｌおよび６ｍＭアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２）で３０μＬとし、これをシリコン化１．５ｍＬ微量遠心管（チューブ）に加えた。次いで、０．１４ＭＮａＣｌを含む２００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２）１０μＬ中の³Ｈ−アセチル化すい臓ヘパラン硫酸（９３ｎｇ、30000cpm）をラット肝癌細胞上清を含むチューブに加えた。種々の濃度の組成物２Ａ（ｉｉｉ）および３（ｉｉ）を含む蒸留水１０μＬを加えた。アッセイは各インヒビター濃度につきトリプリケートで行った。３つの「０」タイムポイント（時）を、インヒビターを添加していないコントロールとして設けた。最高濃度のインヒビターが完全な放射性標識ヘパラン硫酸基質の沈澱に影響しないことが以前に知られていた。この酵素基質インヒビター混合物を微量遠心器で遠心し、次いでチューブを３７℃で３０分間インキュベーションした。「０」時を氷上で維持した。適当な時間の後、反応チューブに以下のものを加えて反応を止めた。１）水性ヘパリン溶液（０．３３ｍｇ／ｍＬ）１５０μＬ２）１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）２００μＬ３）ＣＰＣ（水中、０．６％）１００μＬ次に、このチューブを渦巻状に撹拌し（vortexed）、室温で６０分間インキュベーションし、次いで５４１５Ｃエッペンドルフ遠心器にて4000×ｇ、１０分間遠心した。上清を取り出し、液体シンチレーションカウンターで³Ｈをアッセイした。組成物２Ａ（ｉｉｉ）は、ヘパリンとほぼ同様の、ラット肝細胞からのヘパラナーゼの阻害効果を示した。デュプリケートの実験において、相対ＩＣ₅₀１．０ ±０．１が得られた。わずかにより脱硫酸化された類似体である組成物３（ｉｉ）はわずかに低い活性を示し、相対ＩＣ₅₀は０．９±０．１であった。したがって、これらの結果は、本発明の６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン組成物がペパリナーゼインヒビターであることを立証している。実施例４ｂＦＧＦ結合アッセイにおける組成物１Ａ、２Ａ、３および３Ａの活性経時反応からの選択的産物の相互作用は、Ishihara,M.らの、Analytical Bioc hemistry(1992)202:310およびIshihara,M.らの、J.Biol.Chem.(1993)268:4675に記載のin vitroの細胞ベースのアッセイにおいてｂＦＧＦと相互作用する能力を評価した。表３は、組成物１Ａ（ｉ）と（ｉｉ）、２Ａ（ｉ）、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）、３（ｉ）、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）、および３Ａ（ｉｉ）のｂＦＧＦ関連特性を支持するデータを含む。組成物１Ａおよび２Ａは、ヘパリンと同様に阻害および刺激し、一方、組成物３および３Ａは阻害特性は低いが、刺激特性は維持していることに注目することが重要である。これらｂＦＧＦ関連特性は、さらに選択的６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン誘導体由来のオリゴ糖の研究から得られたデータによって裏づけられる。組成物１Ａ（ｉｉ）をヒドラジン分解し、該ポリマーをＮ−脱アセチル化し、次いでサイズと構造が限定されたオリゴ糖類を調製した。次に、この試料をｐＨ４で１０分間亜硝酸にて処理し、Ｎ−硫酸化グルコサミン残基を有する断片の混合物を得た。次いでこの反応混合物をｐＨ３でインキュベーションし、さらに脱重合を完結させた。得られるオリゴ糖類は、アルカリ条件で、ホウ化水素ナトリウムを用いて還元された。オリゴ糖類はBio-Gel P-10（BioRad）カラム（３×２００ｃｍ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって分別された。カラムを０．５Ｍ重炭酸アンモニウムで平衡化および溶出し、分画のウロン酸をカルバゾール法でアッセイした。次にオリゴ糖プールをＰ−１０カラムを用いて再度クロマトグラフィーにかけ、さらにサイズの均一性を確実なものとした。次いで、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．３）中の０．２Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したＱ−セファロース（Pharmacia）カラム（１×５ｃｍ）で各オリゴ糖を分画化した。ローディングした後、結合していないオリゴ糖を緩衝液２０ｍＬで洗浄除去し、残るオリゴ糖類を塩化ナトリウムの線形グラジエント（０．２〜２．０ＭＮａＣｌ）で洗浄除去した。生じた各イリゴ糖類プールをＱ−セファロースに対する親和性の異なる６つの異なるサブプールに分け、このサブプールを最高濃度のＮａＣｌで溶出し、次いで1000 ＭＷＣＯ透析膜（Spectrum）を用いて蒸留水で透析した。カタバゾールアッセイを用いてすべてのカラム分画の物質をモニターした。既述の二糖分析法を用いて各オリゴ糖プールの組成物の分析を行った。これらオリゴマーは主に構造（ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ）からなることを特徴とするが、一方、ヘパリンからの対応するオリゴマーは（ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ）であろう。組成物１Ａ（ｉｉ）からのヘキサ、オクタ、デカ、およびドデカマーは、ヘパリンオリゴ糖類とほぼ同様にＲＯ−１２ＵＣ細胞に結合するｂＦＧＦを阻害した（図６Ａ）が、ｂＦＧＦ誘導ＡＣＥ細胞増殖の阻害活性は二倍低かった（図６Ｂ）。ヘパリンと組成物１Ａ（ｉｉ）のデカマーとドデカマーは、ｂＦＧＦ誘導ＡＣＥ細胞刺激アッセイのほぼ同等の活性を示したが、一方両者のヘキサマーとオクタマーは実質的に不活性であった（図６Ｃ）。実施例５リストセチン誘導血小板凝集に対する組成物２Ａ（ｉ）の影響 Sobelらの、J.Clin.Invest.(1992)87:1787-1793およびKeltonらの、Tromb Res (1980)18:477-483の記載に従ってｖＷＦの存在下でリストセチン誘導血小板凝集に対する組成物２Ａ（ｉ）の影響を測定した。実験は以下のごとく行った。血小板の豊富な血しょうは、３００〜５００ｇの雄のモルモットのクエン酸化全血を低速遠心し、赤血球細胞を沈澱させて調製した。モルモットをメトキシフルランで麻酔した。上層を回収し、これを用いて血小板凝集に対するヘパリノイドの影響を測定した。残りの赤血球細胞が豊富な血しょうを高速遠心して血小板プール血しょう分画を調製し、これをアグレゴメーターのブランクに用いた。血小板の豊富な血しょう２００μＬと血小板の乏しい血しょう２００μＬからなる試料４００μＬをデュアル凝固モジュール（Payton ）２チャンネルアグレゴメーターの光路に置き、３７℃で１０分間種々の濃度のヘパリノイド被験物質またはＰＢＳ緩衝液コントロールとプレインキュベーションした。試料を1000rpmで連続的に撹拌した。リストセチン（ストック溶液、125 ｍｇ／ｍＬ０．９％無菌生理食塩水中）６μＬを加えて凝集を誘発し、血小板プール血しょうをブランクに用い、凝集を光通過量の変化で記録した。組成物２Ａ（ｉ）およびヘパリンは最高濃度を1000μｇ／ｍＬとし、残りは二倍連続希釈とする種々の濃度で試験した。結果はＥＣ₇₀濃度、すなわち７０％凝集を阻害するのに有効な濃度で表した。組成物２Ａ（ｉ）のＥＣ₇₀濃度はヘパリンを１として、それとの比で表した。組成物２Ａ（ｉ）のＥＣ₇₀濃度は０．５であった。したがって、組成物２Ａ（ｉ）はヘパリンより少ない程度（５０％）で血小板凝集を阻害し、これはおそらく出血の可能性の減少を示す。実施例６抗血栓症活性に対する組成物２Ａ（ｉｉｉ）および３（ｉｉ）の影響発色体アッセイを用いて測定した組成物２Ａ（ｉｉｉ）および２（ｉｉ）の抗Ｘａ活性はヘパリンに比べて劇的に低下した。通常、分画化していないヘパリンからの誘導体は出発ヘパリンの＜１５％の活性を示した。この活性の低下は、第Ｘａ因子の主な阻害経路である、ＡＴＩＩＩに対するこれら組成物の親和性の減少を示唆する。アッセイキットと発色体基質を用いて測定した組成物２Ａ（ｉｉｉ）および３（ｉｉ）の抗ＩＩａ活性はヘパリンに比べて劇的に低下した。通常、分画化していないヘパリンからの種々の誘導体は出発ヘパリンの＜５％の活性を示した。これらの結果は、これらの組成物が第ＩＩａ因子の主な２つの阻害メカニズムであるＡＴＩＩＩおよびヘパリンコファクターＩＩの両方に対する親和性が低下したことを示している。実施例７組成物１Ａ（ｉｉ）の抗再狭窄活性静脈内（ＩＶ）投与法を用い、以下のアッセイ法によって組成物１Ａ（ｉｉ）の抗再狭窄活性を試験した。 Sprague Dawley雄ラット（体重350〜375ｇ、ｎ＝８）をすべてのバルーン傷害実験に用いた。無菌０．２μｍ濾紙ディスクであらかじめ濾過した薬剤またはビークル（乳酸化リンゲル）を満たして浸透圧ミニポンプを準備した。ポンプの調節器を一本のシラスティックチューブ（０．０２５”×０．０４７”ｉ．ｄ．）に接続した。この方法はラットに移植する前の２４時間と、バルーン傷害前の４８時間実施した。移植前にポンプを３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした。化合物の用量はポンプ速度４．９９μＬ／時で０．３ｍｇ／ｋｇ／時に調節した。バルーン傷害の前日に、動物にメトキシフルランを吸入させ、次いでキシラジン１．４ｍｇ／ｋｇ、アセプロマジン０．７ｍｇ／ｋｇ、およびケタミン３６ｍｇ／ｋｇを容量０．７ｍＬ／ｋｇで筋肉内注射することによって麻酔した。頚部および腰背部領域を剃毛した。無菌的方法を用いて、左総頚動脈および左外側頚動脈を分離した。バルーンカテーテルに生理食塩水を満たし、左外側総頚動脈を介して左総頚動脈内に挿入した。このカテーテルを大動脈弓（約４ｃｍ）まで通した。カテーテルを膨張させ（０．１〜０．３ｍＬ）、膨張させたまま徐々に引き抜いた。この工程を左総頚動脈で合計３回繰り返した。右総頚動脈をコントロール側とし、膨らませない（傷害を与えない）かまたは化合物で処理した。まず、左浅咬筋の位置を確認し、長い先の丸いはさみを用いて背部につながるトンネルを設けた。そのトンネル内に浸透圧ポンプを置いた。左頚静脈を分離し、ポンプからのカテーテルを左頚静脈内に挿入した。縫合糸を用いてカテーテルと頚静脈を適所に固定した。最初に頭端、次いで尾端をこま結びした。頚静脈とカテーテルが共に確実に適所にあるように十字結び縫合を行った。外科手術後は外科用ステイプルを用いて閉じた。動物を麻酔し、ヘパリン８０ｍｇ／ｋｇ（濃度８０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水中）をボーラス静脈内注射してヘパリン化した。心臓を切断して動物を安楽死させ、血管を摘出した。左および右総頚動脈を摘出し、小ペトリ皿（６×１．５ｃｍ）に入れ、Tyrode溶液１ｍＬでフラッシュした。Tyrode溶液を３７℃の水浴に入れた。外部の結合組織をかん子ですいて注意深く除去した。あらかじめラベルを付けた、３７％ホルマリン１〜２ｍＬを含む１５ｍＬ遠心管に血管を移した。血管をセンチメートル単位で測定し、動物と血管の種類に従って写真撮影した。術後４日目に試験グループ（組成物１Ａ（ｉｉ）処理動物）中の１頭が、ポンプのチューブの挿入部位周囲の出血によって死亡した。さらなるデータポイントはテクニカルエラーによって失われた。図７Ａは、％閉塞でプロットした、静脈内投与経路を用いた抗再狭窄アッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果を示す。組成物１Ａ（ｉｉ）で処理した動物において、閉塞の５４％の減少（ｐ＜０．０５）が観察された。図７Ｂは、％新血管内膜でプロットした、静脈内投与経路を用いた抗再狭窄アッセイにおける組成物１Ａ（ｉｉ）の影響の結果を示す。組成物１Ａ（ｉｉ）で処理した動物において、血管内膜領域（面積）の４０％の減少（ｐ＜０．０５）が観察された。実施例８組成物２Ａ（ｉｉ）の抗再狭窄活性２週間毎日皮下投与したときの、再狭窄アッセイにおける組成物２Ａ（ｉｉ）の有効性の測定。 Harlan Laboratoriesから得た雄のSprague Dawleyラット（体重３５０〜３７５ｇ）を以下の実験に用いた。乳酸化リンゲル溶液中の製剤化された組成物２Ａ（ｉｉ）の用量２０ｍｇ／ｋｇ／日を頚背部に皮下投与した。コントロール動物にはビークルのみを投与した。その翌日に、実施例９に記載に従ってすべての動物にバルーン傷害を与えた。動物には、１４日間毎日ビークルまたは組成物２Ａ（ｉｉ）の皮下注射を行った。バルーン傷害後１４日目に動物を屠殺し、すべての動物から左頚動脈を取り出し、次いで組織学的薄切を行い、形態分析を行った。外膜、内側、新血管内膜、および内腔領域を直接測定した。他の測定値は実施例９の記載に従って計算した。組成物２Ａ（ｉｉ）で処理した後のバルーン傷害後１４日目の頚動脈の新血管内膜サイズの測定値は、新血管内膜領域が２０％減少していることを示した（図８および表５）。組成物２Ａ（ｉｉ）処理動物において、パーセント新血管内膜およびパーセント閉塞の同様の減少が認められた（表５）。これら実験動物において、注射部位の皮内出血や動脈の閉塞といった組成物２Ａ（ｉｉ）の皮下投与の副作用の徴候はみられなかった。実施例９組成物２Ａ（ｉｉ）の抗再狭窄活性組成物２Ａ（ｉｉ）の有効性は、実施例９に記載のＩＶ投与法を用いる抗再狭窄活性を治療または予防するのに有用であることを示すであろう。 Sprague Dawley雄ラット（体重３５０〜３７５ｇ）がバルーン傷害実験に用いられよう。浸透圧ミニポンプは、無菌０．２μｍ濾紙ディスクであらかじめ濾過した薬剤またはビークル（乳酸化リンゲル）を満たして準備する。ポンプの調節器を一本のシラスティックチューブ（０．０２５”×０．０４７”ｉ．ｄ．）に接続する。この方法はラットに移植する前の２４時間と、バルーン傷害前の４８時間実施する。移植前にポンプを３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした。化合物の用量はポンプ速度４．９９μＬ／時で０．３ｍｇ／ｋｇ／時に調節した。バルーン傷害の前日に、動物にメトキシフルランを吸入し、次いでキシラジン１．４ｍｇ／ｋｇ、アセプロマジン０．７ｍｇ／ｋｇ、およびケタミン３６ｍｇ／ｋｇを容量０．７ｍＬ／ｋｇで筋肉内注射することによって麻酔した。頚部および腰背部領域を剃毛した。無菌的方法を用いて、左総頚動脈および左外側頚動脈を分離した。バルーンカテーテルに生理食塩水を満たし、左外側総頚動脈を介して左総頚動脈内に挿入した。このカテーテルを大動脈弓（約４ｃｍ）まで通した。カテーテルを膨張させ（０．１〜０．３ｍＬ）、膨張させたまま徐々に引き抜いた。この工程を左総頚動脈で合計３回繰り返した。右総頚動脈をコントロール側とし、膨らませない（傷害を与えない）かまたは化合物で処理した。まず、左浅咬筋の位置を確認し、長い先の丸いはさみを用いて背部につながるトンネルを設けた。そのトンネル内に浸透圧ポンプを置いた。左頚静脈を分離し、ポンプからのカテーテルを左頚静脈内に挿入した。縫合糸を用いてカテーテルと頚静脈を適所に固定した。最初に頭端、次いで尾端をこま結びした。頚静脈とカテーテルが共に確実に適所にあるように十字結び縫合を行った。外科手術後は外科用ステイプルを用いて閉じた。動物を麻酔し、ヘパリン８０ｍｇ／ｋｇ（濃度８０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水中）をボーラス静脈内注射してヘパリン化した。心臓を切断して動物を安楽死させ、血管を摘出した。左および右総頚動脈を摘出し、小ペトリ皿（６×１．５ｃｍ）に入れ、Tyrode溶液１ｍＬでフラッシュした。Tyrode溶液を３７℃の水浴に入れた。外部の結合組織をかん子ですいて注意深く除去した。あらかじめラベルを付けた、３７％ホルマリン１〜２ｍＬを含む１５ｍＬ遠心管に血管を移した。血管をセンチメートル単位で測定し、動物と血管の種類に応じて写真撮影した。組成物２Ａ（ｉｉ）で処理した動物において、閉塞および脈管内膜領域の有意な減少が観察されよう。組成物２Ａ（ｉｉ）はＩＶ投与法を用いる抗再狭窄活性を治療または予防するのにかなり有用であろう。これらの知見は、既述の実施例の知見を支持するであろうし、本発明の化合物には種々の投与法があることを強調する。本出願人が本出願人の発明であると考えるものについて記載してきたが、当業者は本発明が添付したクレームの範囲以外のものに限定されるものと解釈すべきでない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者石原雅之東京都東大和市立野３丁目1253 生化学工業株式会社東京研究所内

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片を含む組成物。２．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約＜３４％６−Ｏ硫酸化され、約６７％まで２−Ｏ硫酸化されている請求項１に記載の組成物。３．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約１２〜２６％６−Ｏ硫酸化され、約２８〜５０％２−Ｏ硫酸化されている請求項２に記載の組成物。４．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約＜１３％６−Ｏ硫酸化され、約１４〜２８％２−Ｏ硫酸化されている請求項２に記載の組成物。５．該ヘパリン断片が２〜６．５ｋｄの範囲の平均分子量を有するものである請求項２に記載のヘパリン断片を含む組成物。６．該ヘパリン断片が約５ｋｄの平均分子量を有するものである請求項２に記載のヘパリン断片を含む組成物。７．実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片と医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。８．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約＜３４％６−Ｏ硫酸化され、約６７％まで２−Ｏ硫酸化されている請求項７に記載の医薬組成物。９．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約１２〜２６％６−Ｏ硫酸化され、約２８〜５０％２−Ｏ硫酸化されている請求項８に記載の医薬組成物。１０．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約＜１３％６−Ｏ硫酸化され、約１４〜２８％２−Ｏ硫酸化されている請求項８に記載の医薬組成物。１１．該ヘパリン断片が２〜６．５ｋｄの範囲の平均分子量を有するものである請求項８に記載のヘパリン断片を含む医薬組成物。１２．該ヘパリン断片が約５ｋｄの平均分子量を有するものである請求項８に記載のヘパリン断片を含む医薬組成物。１３．実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片を含む有効量の組成物を動物宿主に投与することを含む動物宿主の疾病を治療または予防する方法。１４．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約＜３４％６−Ｏ硫酸化され、約６７％まで２−Ｏ硫酸化されている請求項１３に記載の疾病を治療または予防する方法。１５．疾病が癌、血管形成、ショック、虚血再還流傷害、炎症、および再狭窄を含む循環器病からなる群から選ばれるものである請求項１４に記載の方法。１６．実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたは６−Ｏ脱硫酸化ヘパリン断片を経口、皮下、または静脈内投与するものである請求項１５に記載の方法。１７．（ａ）塩型のヘパリン溶液を加溶媒分解処理し、（ｂ）その加溶媒分解処理した溶液を凍結および融解してＮ−脱硫酸化、６−Ｏ脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化ヘパリン誘導体を得、（ｃ）該ヘパリン誘導体をＮ−再硫酸化し、（ｅ）該６−Ｏ脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化ヘパリン誘導体を回収する工程を含むヘパリンから実質的に断片化していない６−Ｏ脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化ヘパリンを含む組成物の製造法。１８．該６−Ｏ脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化ヘパリン誘導体が＜３４％６−Ｏ硫酸化され、約６７％まで２−Ｏ硫酸化されているものである請求項１７に記載の方法。１９．有効量の６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたはヘパリン断片組成物をヘパラナーゼと接触させることを含むヘパラナーゼを阻害する方法。２０．該ヘパリンまたはヘパリン断片が＜３４％６−Ｏ硫酸化され、約６７％が２−Ｏ硫酸化されているものである請求項１９に記載の方法。２１．好ましくない血管形成をきたしている動物に有効量の６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンまたはヘパリン断片組成物を投与することを含む該動物の血管形成を阻害する方法。２２．該ヘパリンまたはヘパリン断片が約＜３４％６−Ｏ硫酸化され、約６７％まで２−Ｏ硫酸化されている請求項２１に記載の方法。