DE69735810T2

DE69735810T2 - Antiangiogenische verbindungen

Info

Publication number: DE69735810T2
Application number: DE69735810T
Authority: DE
Inventors: Ross Barry Olinda MATTHEWS; George Brighton Holan
Original assignee: Starpharma Pty Ltd
Current assignee: Starpharma Pty Ltd
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2017-07-18
Also published as: EP0927217A4; CN1225654A; EP0927217A1; CA2262862C; JP2000516211A; CA2262862A1; AUPO104496A0; EP0927217B1; WO1998003573A1; KR20000067876A; US6426067B1; PT927217E; AU715761B2; NZ333488A; BR9710375A; ATE325154T1; AU3330297A; DK0927217T3; KR100564714B1; CN1161128C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, die eine Hemmung der Angiogenese bewirken und dementsprechend anstelle von sulfatierten Polysacchariden, wie Heparin, zur Prävention von Restenose, Beschleunigung der Wundheilung und Hemmung der Tumorzellmetastase verwendet werden können.
Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung von sulfatierten Polysacchariden bei der Hemmung der Angiogenese und bei der Behandlung von Störungen und Zuständen, die mit Angiogenese verbunden sind, wurde schon früher offenbart. So diskutiert die Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB 95/00515 (WO 95/24907) die Verwendung von Heparin und anderen sulfatierten Polysacchariden, wie Pentosanpolysulfat und Dextransulfat, bei der Behandlung dieser Störungen und Zustände und offenbart die Verwendung eines anderen sulfatierten Polysaccharids, Laminarinsulfat, das nur etwa 30% der gerinnungshemmenden Wirkung von Heparin aufweist, zur Prävention von Restenose durch die Hemmung der Zellproliferation der glatten Gefäßmuskulatur, zur Beschleunigung der Wundheilung durch Aktivieren der Freisetzung von aktiven Wachstumsfaktoren, die in der extrazellulären Matrix gespeichert sind, und zur Hemmung der Tumorzellmetastase durch Hemmung der Heparanase-Aktivität.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU 95/00350 (WO 95/34595) offenbart eine Klasse von antiviralen Verbindungen, die ein Dendrimer, wie ein Polyamidoamin- oder Polylysin-Dendrimer, mit einer Menge von terminalen Gruppen umfassen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist, insbesondere eine sulfonsäurehaltige, eine carbonsäurehaltige oder eine trimethylammoniumhaltige Struktureinheit.
Die vorliegende Erfindung gibt die Verwendung von polyionischen Materialien, die durch Verknüpfen von ionischen Gruppen mit einem dendritischen Polymer gebildet wurden, bei der Hemmung von Angiogenese und bei der Behandlung von verwandten Störungen und Zuständen an.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Dendrimers mit einer Menge von terminalen Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist, zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische oder therapeutische Hemmung von Angiogenese bei einem menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten angegeben.
Besonders bevorzugte Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Dendrimere mit sulfonsäurehaltigen Struktureinheiten, carbonsäurehaltigen Struktureinheiten, phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten, boronsäurehaltigen Struktureinheiten, neuramin- oder sialinsäurehaltigen Struktureinheiten oder Struktureinheiten, die Neuramin- oder Sialinsäure, die in der 4- oder einer anderen Position modifiziert ist, enthalten, welche mit terminalen Gruppen des Dendrimers verknüpft sind.
Die im Verfahren dieser Erfindung verwendeten Verbindungen werden hier als polyionische Dendrimere bezeichnet, und dieser Ausdruck wird in der gesamten Beschreibung und den folgenden Ansprüchen so verwendet, dass er nicht nur die Dendrimere an sich, sondern auch ihre pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Salze umfasst, zum Beispiel die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, wie die Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zu den bevorzugten Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gehören polyionische Dendrimere der allgemeinen Formel II:
wobei
I ein Initiatorkern ist;
Z eine innere Verzweigungseinheit ist;
n eine ganze Zahl ist, die die Zahl der Generationen des Dendrimers darstellt; und
A eine anionische Struktureinheit ist, die über eine fakultative Verknüpfungsgruppe X mit der inneren Verzweigungseinheit Z verknüpft sein kann.
Dendrimere sind makromolekulare, hochgradig verzweigte Verbindungen, die durch wiederholte Reaktionssequenzen ausgehend von einem anfänglichen Kernmolekül gebildet werden, wobei aufeinanderfolgende Schichten oder Stufen in aufeinanderfolgenden "Generationen" hinzugefügt werden, so dass eine dreidimensionale, hochgeordnete polymere Verbindung aufgebaut wird. Dendrimere sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet: (i) einen Starterkern (I), der eine oder mehrere reaktive Stellen aufweisen und punktartig oder von erheblicher Größe sein kann, so dass er die endgültige Topologie des Dendrimers beeinflusst; (ii) Schichten von verzweigten Repetiereinheiten (Z), die an den Starterkern gebunden sind; (iii) funktionelle terminate Gruppen (wie die anionischen Struktureinheiten A), die an die Oberfläche des Dendrimers gebunden sind, gegebenenfalls über Verknüpfungsgruppen (wie die Verknüpfungsgruppen X), wie unter anderem Ester, Amide, Ether, Thioether, Amine, Harnstoffe, Thioharnstoffe, Carbomate und Carbonate.
Die fakultative Verknüpfungsgruppe X kann auch als Spacer zwischen der Verzweigungseinheit Z und der anionischen Struktureinheit A wirken und kann aus einer Alkylkette (gegebenenfalls substituiert oder verzweigt), einer Alkoxy-, Polyalkoxy-, Alkylthio- oder Polyalkylthiokette (gegebenenfalls substituiert) oder einer Alkenyl-, multiplen Alkenyl-, Alkinyl- oder multiplen Alkinylkette (gegebenenfalls substituiert) bestehen. Zu den geeigneten Spacerketten gehören Gruppen der Formel -(CH₂)_n-Z-(CH₂)_n-, wobei Z = -CH₂-, -CH=CH-, -C=C-, -O- oder -S- ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist.
Die vorliegende Erfindung verwendet dendritische Oberflächen als Gerüste für die Bindung von ionischen Struktureinheiten; die Erfindung ist nicht auf die sphärischen Dendrimere beschränkt, die hier im Einzelnen beschrieben sind, sondern kann auf jeder dendritischen Struktur beruhen. Die Variabilität von Dendrimeren in Bezug sowohl auf Form als auch Konstitution ist dem Fachmann wohlbekannt.
Die Herstellung von Dendrimeren ist wohlbekannt und ist zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 (die Dendrimere auf der Basis von Schichten von Lysineinheiten beschreiben) sowie in den US-Patenten Nr. 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329 (die Dendrimere auf der Basis von anderen Einheiten beschreiben, einschließlich Polyamidoamin- oder PAMAM-Dendrimeren) beschrieben. Die in diesen US-Patenten offenbarten Dendrimere sind als geeignet für Verwendungen wie als Oberflächenmodifizierungsmittel, als Metallchelatoren, als Demulgatoren oder Öl/Wasser-Emulsionen, Nassfestigkeitsmittel bei der Herstellung von Papier und als Mittel zum Modifizieren der Viskosität in wässrigen Zubereitungen, wie Lacken, beschrieben. In den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 wird auch vorgeschlagen, dass die Dendrimere auf der Basis von Lysineinheiten als Substrate für die Herstellung von pharmazeutischen Darreichungsformen verwendet werden können.
Die internationalen Patentschriften Nr. WO 88/01178, WO 88/01179 und WO 88/01180 offenbaren Konjugate, bei denen ein Dendrimer mit einem anderen Material, wie einem pharmazeutischen oder agrikulturellen Material auf einem Träger, konjugiert oder assoziiert ist. Außerdem offenbart das Internationale Patent Veröffentlichungs-Nr. WO 95/24221 dendritische Polymerkonjugate, die aus wenigstens einem Dendrimer in Verbindung mit einem Trägermaterial, bei dem es sich um einen biologischen Reaktionsmodifikator handeln kann, und gegebenenfalls einem Ziellenker bestehen. Diese Patentschriften zusammen mit den oben genannten US-Patenten enthalten eine breite Offenbarung von verschiedenen Dendrimeren und Verfahren zu deren Herstellung, und auf jede dieser Veröffentlichungen wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
Der hier verwendete Ausdruck "Dendrimer" ist in seinem weitesten Sinn zu verstehen und umfasst alle Formen und Zusammensetzungen dieser Dendrimere, wie in den Patentschriften Nr. WO 88/01178, WO 88/01179 und WO 88/01180 offenbart ist. Der Ausdruck umfasst auch miteinander verknüpfte oder verbrückte Dendrimere, wie in diesen Patentschriften offenbart ist.
Die bevorzugten Dendrimere der vorliegenden Erfindung umfassen einen mehrwertigen Kern, der kovalent an wenigstens zwei dendritische Zweige gebunden ist und sich vorzugsweise über wenigstens zwei Generationen erstreckt. Besonders bevorzugte Dendrimere sind Polyamidoamin(PAMAM)-Dendrimere, PAMAM(EDA)-Dendrimere und Polylysin-Dendrimere.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist an wenigstens eine und vorzugsweise an eine erhebliche Zahl der Endgruppen auf der Oberfläche des Dendrimers eine anionische oder kationische Struktureinheit kovalent gebunden. Die Zweige des Dendrimers können in Aminogruppen oder anderen funktionellen reaktiven Gruppen, wie OH, SH oder dergleichen, enden, die anschließend mit den anionischen oder kationischen Struktureinheiten umgesetzt werden können. Wenn die Endgruppen des Dendrimers Amingruppen sind, kann die anionische oder kationische Struktureinheit über eine Vielzahl von funktionellen Gruppen einschließlich Amid- und Thioharnstoff-Bindungen an das Dendrimer gebunden sein. Bevorzugte anionische oder kationische Struktureinheiten, die an die Endgruppen des Dendrimers gebunden sein können, sind sulfonsäurehaltige Struktureinheiten, carbonsäurehaltige Struktureinheiten (einschließlich neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten und modifizierten neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten), boronsäurehaltige Struktureinheiten sowie phosphor- und phosphonsäurehaltige Struktureinheiten (einschließlich veresterten phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten) und trimethylammoniumhaltige Struktureinheiten.
Geeignete anionische und kationische Struktureinheiten, die an die Amino- oder anderen Endgruppen gebunden sein können, sind zum Beispiel die folgenden Gruppen (wobei n = 0 oder eine positive ganze Zahl ist und n besonders bevorzugt = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist):
Außer den obigen können auch verschiedene neuramin- oder sialinsäurehaltige Struktureinheiten oder modifizierte neuramin- oder sialinsäurehaltige Struktureinheiten an die Endgruppen gemäß dieser Erfindung gebunden oder damit verknüpft sein. Zu diesen Struktureinheiten gehören die verschiedenen N- und O-substituierten Derivate von Neuraminsäure, insbesondere N- und O-Acyl-Derivate, wie N-Acetyl-, O-Acetyl- und N-Glycolyl-Derivate, sowie Struktureinheiten, bei denen die Neuraminsäuregruppe, insbesondere durch Substitution in der 4-Position, mit einer Amino-, Amido-, Cyano-, Azido- oder Guanidinogruppe modifiziert ist.
Die anionischen oder kationischen Dendrimere dieser Erfindung können nach chemischen Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Geeignete Verfahren sind beispielhaft in den folgenden Beispielen beschrieben.
Wie bereits beschrieben, hat sich gezeigt, dass die anionischen oder kationischen Dendrimere der vorliegenden Erfindung die Angiogenese hemmen. Dementsprechend beinhaltet das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Hemmung der Angiogenese bei einem Patienten, die Behandlung von Zuständen, bei denen das Wachstum neuer Blutgefäße beteiligt ist, wie chronische Entzündung, diabetische Retinopathie, Psoriasis und rheumatoide Arthritis, sowie die Behandlung von verwandten Störungen und Zuständen; dazu gehören unter anderem die Prävention von Restenose durch die Hemmung der Zellproliferation der glatten Gefäßmuskulatur, die Beschleunigung der Wundheilung durch Aktivieren der Freisetzung von aktiven Wachstumsfaktoren, die in der extrazellulären Matrix gespeichert sind, und die Hemmung der Tumorzellmetastase durch Hemmung der Angiogenese.
Die pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Zusammensetzungen zur prophylaktischen oder therapeutischen Hemmung der Angiogenese bei einem menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein anionisches oder kationisches Dendrimer, wie es oben allgemein beschrieben ist, in Verbindung mit wenigstens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Die Zubereitung solcher Zusammensetzungen ist dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt. Zu den geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Verdünnungsmitteln gehören beliebige und alle herkömmlichen Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Füllstoffe, festen Träger, wässrigen Lösungen, Beschichtungen, antibakteriellen und fungiziden Mittel, isotonischen und resorptionsverzögernden Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt und ist zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben. Die Verwendung von jedem herkömmlichen Medium oder Mittel in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, solange es mit dem Wirkstoff verträglich ist. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Zur leichteren Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung ist es besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen in Form von Darreichungsformen zuzubereiten. "Darreichungsform" bezieht sich hier auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosiseinheiten für die zu behandelnden menschlichen Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die so berechnet ist, dass die gewünschte therapeutische Wirkung erzielt wird, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält. Die genauen Eigenschaften der neuen Darreichungsformen der Erfindung werden bestimmt und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des Wirkstoffs und der besonderen therapeutischen Wirkung, die erzielt werden soll, und (b) den Einschränkungen, die der Technik des Compoundierens eines solchen Wirkstoffs für die besondere Behandlung inhärent sind.
In noch einem anderen Aspekt gibt diese Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines anionischen oder kationischen Dendrimers, wie es oben allgemein beschrieben ist, zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten durch Hemmung der Angiogenese an.
Eine Vielzahl von Verabreichungswegen steht zur Verfügung. Die besondere gewählte Methode wird selbstverständlich von dem besonderen behandelten Zustand und der für therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosierung abhängen. Die Verwendungen dieser Erfindung können allgemein gesagt unter Verwendung einer beliebigen medizinisch annehmbaren Verabreichungsmethode angewendet werden, was jede Methode bedeutet, die therapeutische Konzentrationen der aktiven Komponente der Erfindung erzeugt, ohne klinisch unannehmbare nachteilige Wirkungen zu verursachen. Zu diesen Verabreichungsmethoden gehören die orale, rektale, topische, nasale, inhalatorische, transdermale oder parenterale (z.B. subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung. Zu den Zubereitungen für die orale Verabreichung gehören diskrete Einheiten, wie Kapseln, Tabletten, Pastillen und dergleichen. Andere Wege sind die intrathekale Verabreichung direkt in den Liquor, die direkte Einführung, wie etwa durch verschiedene Katheter- und Ballon-Angioplastie-Vorrichtungen, die dem Fachmann wohlbekannt sind, und die intraparenchymale Injektion in die Zielbereiche.
Die Zusammensetzungen können zweckmäßigerweise in Darreichungsform präsentiert und nach einem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Zu diesen Verfahren gehören der Schritt des Verbindens der aktiven Komponente mit einem Träger, der einen oder mehrere Hilfsbestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem man die aktive Komponente gleichmäßig und innig mit einem flüssigen Träger, einem feinteiligen festen Träger oder beiden in Verbindung bringt und dann gegebenenfalls das Produkt formt.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge der aktiven Komponente enthalten, in Liposomen oder als Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nichtwässrigen Flüssigkeit, wie einem Sirup, einem Elixier oder einer Emulsion, präsentiert werden.
Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen zweckmäßigerweise ein steriles wässriges Präparat der aktiven Komponente, das vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Dieses wässrige Präparat kann nach bekannten Verfahren unter Verwendung solcher geeigneten Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel zubereitet werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, zum Beispiel eine Lösung in Polyethylenglycol, sein. Zu den annehmbaren Trägern und Lösungsmitteln, die eingesetzt werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden herkömmlicherweise sterile fette Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes milde fette Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride eingesetzt werden. Außerdem finden Fettsäuren, wie Oleinsäure, in dem injizierbaren Präparat Verwendung.
Andere Abgabesysteme können Abgabesysteme mit nachhaltiger Freisetzung umfassen. Bevorzugte Abgabesysteme mit nachhaltiger Freisetzung sind solche, die für die Freisetzung der aktiven Komponente der Erfindung in Pellets oder Kapseln mit nachhaltiger Freisetzung sorgen können. Viele Arten von Abgabesystemen mit nachhaltiger Freisetzung sind bekannt. Dazu gehören unter anderem: (a) Erosionssysteme, bei denen die aktive Komponente innerhalb einer Matrix enthalten ist, und (b) Diffusionssysteme, bei denen die aktive Komponente mit einer kontrollierten Geschwindigkeit durch ein Polymer dringt. Außerdem kann ein Abgabegerät auf Pumpenbasis verwendet werden, von denen einige zur Implantation geeignet sind.
Die aktive Komponente wird in prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge bedeutet eine Menge, die notwendig ist, um wenigstens teilweise die gewünschte Wirkung zu erreichen oder das Einsetzen des behandelten Zustands oder dessen Fortschreiten zu verzögern oder dessen Einsetzen oder Fortschreiten ganz zu unterbinden. Diese Menge wird selbstverständlich von dem besonderen behandelten Zustand, der Schwere des Zustands und den individuellen Patientenparametern einschließlich des Alters, der körperlichen Verfassung, der Größe, des Gewichts und der gleichzeitigen Behandlung abhängen. Diese Faktoren sind dem Fachmann wohlbekannt und können mit bloßen Routineversuchen angegangen werden. Im Allgemeinen wird vorzugsweise eine maximale Dosis verwendet, d.h. die höchste, nach zuverlässigem medizinischem Urteil noch unbedenkliche Dosis. Der Fachmann wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass aus medizinischen Gründen, psychologischen Gründen oder aus praktisch beliebigen anderen Gründen auch eine niedrigere Dosis oder tolerierbare Dosis verabreicht werden kann.
Im Allgemeinen betragen die täglichen oralen Dosen der aktiven Komponente etwa 0,01 mg/kg pro Tag bis 1000 mg/kg pro Tag. Anfangs können kleine Dosen (0,01–1 mg) verabreicht werden, gefolgt von steigenden Dosen bis zu etwa 1000 mg/kg pro Tag. Falls ein Patient auf solche Dosen ungenügend anspricht, können noch höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen über einen anderen, besser lokalisierten Verabreichungsweg) eingesetzt werden, soweit der Patient sie verträgt. Mehrere Dosen pro Tag werden in Betracht gezogen, um geeignete systemische Konzentrationen von Verbindungen zu erreichen.
Die aktive Komponente gemäß der Erfindung kann auch zur Verwendung in Form von veterinärmedizinischen Zusammensetzungen vorgestellt werden, die zum Beispiel nach in der Technik herkömmlichen Verfahren hergestellt werden können. Beispiele für solche veterinärmedizinischen Zusammensetzungen sind solche, die geeignet sind für:

(a) orale Verabreichung, externe Verabreichung zum Beispiel Arzneitränke (z.B. wässrige oder nichtwässrige Lösungen oder Suspensionen); Tabletten oder Boli; Pulver, Granulate oder Pellets zum Beimischen ins Futter; Pasten zum Auftragen auf die Zunge;
(b) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, z.B. als sterile Lösung oder Suspension; oder (gegebenenfalls) durch intramammäre Injektion, wobei eine Suspension oder Lösung über die Zitze in den Euter eingeführt wird;
(c) topische Verabreichung, z.B. als Creme, Salbe oder Spray, die bzw. das auf die Haut aufgetragen wird; oder
(d) intravaginal, z.B. als Pessar, Creme oder Schaum.

In der gesamten Beschreibung und den folgenden Ansprüchen impliziert das Wort "umfassen" oder Variationen davon, wie "umfasst" oder "umfassend", wenn der Kontext nichts anderes verlangt, den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen, aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen hervor, die zur Veranschaulichung, aber nicht zur Einschränkung der Erfindung aufgenommen sind. In den folgenden Beispielen bezieht sich "PAMAM-Dendrimere auf Polyamidoamin-Dendrimere auf der Basis eines Ammoniakkerns, wie es ausführlich in den US-Patenten Nr. 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329 wiedergegeben ist; "PAMAM(EDA)-Dendrimere" bezieht sich auf Polyamidoamin-Dendrimere auf der Basis eines Ethylendiamin-Kerns; und "BHAlys_xlys_ylys_z-Dendrimere" bezieht sich auf unsymmetrische Polylysin-Dendrimere auf der Basis eines Benzhydrylamin-Kerns und Lysin-Verzweigungseinheiten, wie es in den US-Patenten Nr. 4,289,872 und 4,410,688 beschrieben ist. Die Polyamidoamin-Dendrimere PAMAM 1.0, PAMAM 2.0, PAMAM 3.0, PAMAM 4.0, PAMAM 5.0 oder höhere Generationen, PAMAM 4.0 (EDA) und die Polylysin-Dendrimere BHAlyslys₂, BHAlyslys₂lys₄, BHAlyslys₂lys₄lys₈ und BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆, BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂, BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂lys₆₄ oder höhere Generationen werden so hergestellt, wie es in den US-Patenten Nr. 4,289,872, 4,410,688, 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 und 4,587,329 und in den internationalen Patentschriften WO 88/01178, WO 88/01179, WO 88/01180 und WO 95/24221, auf die oben Bezug genommen wurde, beschrieben ist.
Beispiel 1
Reaktion von dendritischen Polymeren mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure unter Bildung von Dendrimeren mit Sulfonsäure-Endgruppen
A. PAMAM 1.0
Festes Natriumcarbonat (0,13 g; 1,0 mmol) wurde langsam unter Rühren zu einer Lösung von 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (0,41 g; 2,0 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben. Nachdem die Gasentwicklung aufgehört hatte, betrug der pH-Wert der Lösung 8,0. Dann wurde eine Lösung von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in Wasser (1 ml) zu der Lösung gegeben, und dann wurden vier Tropfen einer 40%igen wässrigen Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid hinzugefügt. Dann wurde die Lösung drei Tage lang unter Stickstoff auf 60 °C erhitzt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet, was das sulfonierte PAMAM-1.0-Dendrimer als schmutzigweißen Feststoff (0.51 g) ergab. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-1.0-Dendrimer (ca. 70:30). ¹³C-NMR (D₂O): δ 31,0, 31,1, 37,1, 37,7, 41,3, 48,6, 51,5, 53,1, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5, 178,3, 179,0, 179,8.
B. PAMAM 2.0
PAMAM 2.0 wurde gemäß der obigen Beschreibung mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet, was einen schmutzigweißen Feststoff ergab. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-2.0-Dendrimer (ca. 65:35). ¹³C-NMR (D₂O): δ 31,0, 31,1, 37,1, 37,7, 41,3, 48,7, 51,5, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5, 178,4, 179,0, 179,1, 179,6. Als die obige Reaktion unter Weglassen des Benzyltrimethylammoniumhydroxids wiederholt wurde, wurde ein ähnliches Ergebnis erhalten.
C. PAMAM 3.0; BRI2783
PAMAM 3.0 wurde wie oben mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt, außer dass ein leichter Überschuss an Natriumcarbonat verwendet wurde und das Benzyltrimethylammoniumhydroxid weggelassen wurde. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-3.0-Dendrimer (ca. 50:50). ¹³C-NMR (D₂O): δ 31,0, 31,1, 36,9, 37,4, 41,1, 48,6, 51,5, 53,4, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,2, 178,9, 179,0, 179,8.
D. PAMAM 4.0; BRI2784
PAMAM 4.0 wurde so mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt, wie es für PAMAM 3.0 beschrieben wurde. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-4.0-Dendrimer (ca. 35:65). ¹³C-NMR (D₂O): δ 31,0, 31,1, 36,9, 37,3, 41,1, 48,5, 51,5, 53,5, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,1, 178,9, 179,0, 179,8.
Beispiel 2
Herstellung von Dendrimeren mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen
A. PAMAM 1.0
Eine Lösung von 4-Nitrophenylbromacetat (0,40 g; 1,5 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 1.0 (0,18 g; 0,5 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende gelbe Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test negativ verlief. Die Lösung wurde konzentriert (30 °C/0,1 mm Hg), was, ein gelbes Öl ergab. Dieses Öl wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit Chloroform (2 ×) und schließlich mit Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Lösung wurde konzentriert (35 °C/25 mm Hg), was das bromacetylierte PAMAM-1.0-Dendrimer als gelbes Öl ergab (0,36 g; 100%). ¹³C-NMR (D₂O): δ 32,8, 33,3, 43,0, 43,5, 54,4, 174,5, 176,4.
Eine Lösung von Natriumsulfit (0,2 g; 1,6 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu einer Lösung des oben beschriebenen bromacetylierten PAMAM-1.0-Dendrimers (0,36 g; 0,5 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und die Lösung wurde elf Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die gelbe Lösung wurde konzentriert, was einen gelblichen Feststoff ergab (0,60 g). ¹³C-NMR (D₂O): δ 34,4, 43,1, 43,4, 54,0, 61,7, 171,3, 177,2.
Die obige Reaktionssequenz konnte durchgeführt werden, ohne das bromacetylierte Dendrimer zu isolieren, indem man einfach die Natriumsulfitlösung zu dem aus der ersten Reaktion erhaltenen rohen wässrigen Extrakt gibt.
B. PAMAM 2.0
Verfahren 1:
Eine Lösung von 4-Nitrophenylbromacetat (0,18 g; 0,7 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 2.0 (0,10 g; 0,1 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende gelbe Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test negativ verlief. Die Lösung wurde dann unter Schwenken in Wasser (150 ml) gegeben, und das Gemisch wurde mit Chloroform (3 ×) und Ethylacetat extrahiert. Eine Lösung von Natriumsulfit (0,1 g; 0,8 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu der rohen bromacetylierten Dendrimerlösung gegeben, und das Gemisch wurde drei Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde die gelblich Lösung konzentriert, was einen gelben festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt wurde, was das PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen ergab (103 mg). ¹³C-NMR (D₂O): δ 33,0, 35,7, 36,0, 37,7, 40,3, 43,0, 43,2, 53,4, 53,7, 56,0, 61,6, 171,2, 174,6, 178,5.
Verfahren 2:
Festes Succinimidylacetylthioacetat (67 mg; 0,33 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 2.0 (52 mg; 0,05 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gemisch konzentriert (30 °C/10^–3 mm Hg), was einen öligen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht wurde abgetrennt und konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (117 mg). ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren zeigten, dass das Öl ein Gemisch des acylierten Dendrimers mit N-Hydroxysuccinimid war. Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) ergab eine reine Probe des PAMAM-2.0-Dendrimers mit Acetylthio acetamid-Endgruppen (29 mg). ¹³C-NMR (D₂O): δ 34,0, 34,2, 37,3, 43,0, 43,1, 43,3, 53,5, 54,0, 56,3, 175,4, 177,2, 177,5.
Dann wurde eine Lösung des obigen funktionalisierten Dendrimers in 40%iger wässriger Ameisensäure (7 ml) zu einer eiskalten, frisch hergestellten Lösung von Perameisensäure (1,6 mmol) in Ameisensäure (2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 0 °C und dann 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde eine kleine Menge Aktivkohle hinzugefügt, um überschüssige Persäure zu zersetzen, das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, dann filtriert und konzentriert, was ein viskoses Öl ergab.
Das Rohprodukt wurde in Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit wässrigen Natriumhydrogencarbonat auf 9,0 eingestellt, und das Material wurde entsalzt, indem man es durch eine Säule mit Sephadex G10 leitete. Nach der Lyophilisierung wurde ein weißer Feststoff (20 mg) erhalten, der spektroskopisch im Wesentlichen dasselbe war wie das durch Verfahren 1 erhaltene Material. ¹³C-NMR (D₂O): δ 33,0, 38,7, 42,9, 43,0, 43,1, 53,9, 54,3, 56,5, 61,6, 171,2, 176,4, 177,0.
Beispiel 3
Herstellung von Dendrimeren mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
A. PAMAM 1.0
Festes Maleinsäureanhydrid (0,11 g; 1,1 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben. Das Gemisch wurde etwas warm und bräunlich, als sich das Anhydrid auflöste, und die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung konzentriert (30 °C/10^–4 mm Hg), was ein viskoses Öl ergab. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren (D₂O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 1.0 zum Trisamid zusammen mit etwas Maleinsäure. ¹³C-NMR (D₂O): δ 33,1, 42,8, 43,1, 54,3, 135,0, 137,1, 169,1, 171,9, 173,3.
Dann wurde das rohe Triamid in Wasser (4 ml) gelöst, und festes Natriumsulfit (0,20 g; 1,6 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde vier Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann konzentriert. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren (D₂O) zeigten ein 1:1-Gemisch der regioisomeren PAMAM-1.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt, was eine Probe der PAMAM-1.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen ergab (107 mg). ¹³C-NMR (D₂O): δ 33,3, 39,6, 40,0, 42,9, 43,1, 54,0, 67,9, 69,4, 173,8, 176,3, 177,6, 181,8.
B. PAMAM 2.0
Ein Gemisch der regioisomeren PAMAM-2.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen wurde gemäß der obigen Beschreibung hergestellt. ¹³C-NMR des PAMAM-2.0-Maleamsäure-Derivats (D₂O): δ 32,8, 33,0, 38,7, 42,9, 53,8, 54,3, 56,5, 135,2, 136,8, 169,2, 171,9, 173,5, 174,6. ¹³C-NMR der PAMAM-2.0-Natriumsulfosuccinamsäure-Derivate (D₂O): δ 37,0, 40,1, 41,1, 43,0, 43,2, 43,9, 53,0, 53,3, 55,5, 68,0, 69,4, 173,8, 177,6, 179,1, 179,5, 179,8, 182,3.
C. PAMAM 4.0; BRI6038
Festes Maleinsäureanhydrid (60 mg; 0,6 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde anfangs trübe, ergab jedoch bald eine klare Lösung, die über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Dann wurde die Lösung konzentriert (35 °C/10^–4 mm Hg), was ein viskoses Öl ergab. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren (D₂O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 4.0 zum Polyamid zusammen mit etwas Maleinsäure. Dann wurde das rohe Polyamid in Wasser (2 ml) gelöst, und eine Lösung von Natriumsulfit (126 mg; 1,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann konzentriert. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren (D₂O) zeigten ein Gemisch der regioisomeren PAMAM-4.0- Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was eine Probe von PAMAM 4.0 mit 24 regioisomeren Sulfosuccinamsäure-Endgruppen ergab (90 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,4-2,6; 2,7-3,1; 3,2-3,4; 3,9-4,0. ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,2; 39,8; 40,5; 43,0; 43,2; 53,5; 55,8; 68,1; 69,5; 173,8; 177,4; 177,6; 178,7; 182,3.
Beispiel 4
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
a. Herstellung von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure
Festes Bernsteinsäureanhydrid (0,50 g; 5,0 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-2-aminoethylsulfonsäure (1,83 g; 5,0 mmol) in trockenem Dichlormethan (30 ml) gegeben. Das Bernsteinsäureanhydrid löste sich langsam auf, und die resultierende trübe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (2,41 g). Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigte eine vollständige Umsetzung des gewünschten Monoamids zusammen mit einer kleinen Menge Bernsteinsäure. Wiederholte Fällung des Produkts durch tropfenweise erfolgende Zugabe einer Dichlormethan-Lösung zu einem großen Überschuss von Diethylether ergab Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyi)succinamsäure als weißen Feststoff (1,762 g; 76%), Schmp. 125–127 °C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 0,86 (t, 12H, 4x CH₃), 1,28 (m, 8H, 4x CH₂), 1,50 (m, 8H, 4x CH₂), 2,33 (m, 2H, CH₂COOH), 2,44 (m, 2H, CH₂CONH), 2,76 (m, 2H, CH₂NHCO), 3,12 (m, 8H, 4x CH₂N), 3,50 (m, 2H, CH₂SO₃ ^–), 7,53 (br t, 1H, NH). ¹³C-NMR (CDCl₃): δ 13,5, 19,5, 23,8, 30,1, 30,9, 35,6, 50,0, 58,5, 172,0, 174,1.
b. Herstellung von Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamat
Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (45 mg; 0,22 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure (94 mg; 0,20 mmol) und 4-Nitrophenol (28 mg; 0,20 mmol) in Dichlormethan (2 ml) gegeben, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Suspension wurde filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was den rohen aktiven Ester ergab, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
A. Herstellung von PAMAM-Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI2786
Eine Lösung des rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats (0,30 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51,5 mg; 0,01 mmol) in 50%igem wässrigem DMF (3 ml) gegeben, und die resultierende gelbe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gemisch konzentriert (35 °C/10^–5 mm Hg), und der gelbe Rückstand wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit Chloroform (2 ×) und Ethylacetat gewaschen und dann konzentriert, was ein gelbes Öl (134 mg) ergab. Das Rohprodukt wurde in das Natriumsalz umgewandelt, indem man es durch eine Säule mit Amberlite IR-120(Na) leitete, was 85 mg Material ergab. Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen ergab (45 mg). ¹³C-NMR (D₂O): δ 33,2, 33,6, 35,5, 39,0, 39,5, 42,8, 43,2, 53,8, 54,1, 54,4, 56,6, 176,5, 176,9, 177,2, 178,9, 179,4.
Die entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-3.0(BRI2785)-Dendrimere mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
¹³C-NMR PAMAM-3.0-Derivat (D₂O): δ 33,4, 35,5, 39,0, 39,5, 42,9, 43,2, 53,8, 54,1, 54,3, 56,5, 176,4, 176,9, 177,4, 178,9, 179,4. ¹³C-NMR PAMAM-1.0-Derivat (D₂O): δ 34,9, 35,5, 39,5, 42,9, 43,1, 53,7, 54,1, 179,0, 179,1, 179,3.
B. Herstellung von Polylysin-Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆; BRI2789
Trifluoressigsäure (1 ml) wurde zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆ (36,5 mg; 5,0 μmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in trockenem DMSO (2 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde eine Lösung des rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats (ca. 0,2 mmol) in DMSO (1 ml) hinzugetropft, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die gelbe Lösung konzentriert (50 °C/10^–5 mm Hg), und der gelbe Rückstand wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit Chloroform (3x) und Ethylacetat gewaschen und dann konzentriert, was ein Öl (99 mg) ergab. Das Rohprodukt wurde in das Natriumsalz umgewandelt, indem man es durch eine Säule mit Amberlite IR-120(Na) leitete, was 81 mg Material ergab. Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt, was das BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆-Dendrimer mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen ergab (39 mg). ¹³C-NMR (D₂O): δ 27,0, 32,3, 35,2, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,5, 132,0, 133,3, 145,1, 177,8, 178,0, 178,4, 178,8, 178,9, 179,2, 179,7, 179,8.
Die entsprechenden BHAlyslys₂-, BHAlyslys₂lys₄- (BRI2787) und BHAlyslys₂lys₄lys₈(BRI2788)-Dendrimere mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
¹³C-NMR BHAlyslys₂lys₄lys₈-Derivat (D₂O): δ 26,9, 32,3, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,6, 131,9, 132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,2, 177,2, 177,8, 177,9, 178,0, 178,2, 178,3, 178,6, 178,7, 178,8, 178,9, 179,2, 179,3, 179,7, 179,8.
¹³C-NMR BHAlyslys₂lys₄-Derivat (D₂O): δ 26,9, 32,3, 35,1, 35,4, 35,7, 35,8, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 61,8, 131,7, 132,0, 132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,1, 177,3, 178,0, 178,3, 178,4, 178,7, 178,9, 179,0, 179,3, 179,7, 179,8.
¹³C-NMR BHAlyslys₂-Derivat (D₂O): δ 26,9, 27,1, 32,2, 32,3, 34,7, 34,8, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,4, 54,1, 58,6, 61,8, 131,7, 131,9, 132,2, 132,3, 133,3, 144,9, 145,0, 177,7, 178,4, 178,8, 179,0, 179,3, 180,0.
Beispiel 5
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
A. PAMAM 4.0; BRI2791
Festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (500 mg; 1,96 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (300 mg; 0,0582 mmol) in Wasser (10 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der gelbe feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (370 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,28; 2,52; 2,69; 3,15; 3,27; 3,60; 7,32 (d, J=9 Hz); 7,72 (d, J=9 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,9; 41,1; 43,1; 48,3; 53,6; 55,8; 129,0; 131,1; 144,4; 178,5; 179,1; 184,4.
Die entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-2.0- (BRI2790), PAMAM-3.0- und PAMAM-5.0(BRI2991)-Dendrimere mit 3, 6, 12 bzw. 48 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
B. PAMAM 4.0 (EDA); BRI6045
Festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (130 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was PAMAM 4.0 mit 32 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (136 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,30; 2,50; 2,70; 3,18; 3,62; 7,35 (d, J=9 Hz); 7,72 (d, J=9 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,8; 41,0; 43,1; 48,4; 53,6; 55,7; 128,9; 131,0; 144,3; 178,5; 179,0; 184,5.
C. BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆; BRI2792
Trifluoressigsäure (4 ml) wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆ (0,73 g; 0,1 mmol) in trockenem Dichlormethan (4 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer kurzen Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst, die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ als viskoses Öl ergab (0,49 g). Das Öl wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 3 ml) wurde hinzugefügt. Dann wurde festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (1,30 g; 5,1 mmol) hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na) geleitet und gefriergetrocknet, was das BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆-Dendrimer mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (374 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 1,40; 1,72; 3,08; 3,42; 4,24; 4,60; 7,30; 7,40 (d, J=9 Hz); 7,78 (d, J=9 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 27,3; 32,5; 35,9; 43,7; 48,9; 58,6; 63,3; 128,8; 131,0; 143,7; 144,7; 145,1; 177,7; 178,1; 183,8; 185,2.
Die entsprechenden BHAlyslys₂lys₄lys₈-, BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂(BRI2992)- und BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂lys₆₄(BRI2993)-Dendrimere mit 16, 64 bzw. 128 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen wurden in ähnlicher Weise hergestellt.
Beispiel 6
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
A. PAMAM 4.0; BRI2923
Festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (160 mg; 0,41 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der braune feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als bräunlichen Feststoff ergab (73 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,30; 2,60; 2,74; 3,20; 3,57; 7,75; 7,86; 8,28. ¹³C-NMR (D₂O): δ 35,0; 39,9; 43,1; 48,1; 53,8; 56,1; 128,4; 128,6; 129,3; 131,0; 131,3; 136,0; 136,8; 138,2; 145,5; 146,0; 177,2; 177,8; 185,5.
Das entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
B. PAMAM 4.0 (EDA); BRI6046
Festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (220 mg; 0,57 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0 mit 32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als lohfarbenen Feststoff ergab (148 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,30; 2,80; 3,20; 3,54; 7,74; 7,85; 8,25. ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,0; 40,8; 43,1; 48,3; 53,6; 55,9; 128,5; 129,4; 131,0; 131,3; 136,0; 136,8; 138,3; 145,5; 146,0; 178,2; 185,6.
C. BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆; BRI2999
Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆ (73 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer kurzen Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der zurückbleibende Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst, die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ als viskoses Öl ergab. Das Öl wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 3 ml) wurde hinzugefügt. Dann wurde festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (234 mg; 0,60 mmol) hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na) geleitet und gefriergetrocknet, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ mit 32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen schmutzigweißen Feststoff ergab (119 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 1,0-2,0; 3,18; 3,43; 4,31; 7,22; 7,80; 7,89; 8,25. ¹³C-NMR (D₂O): δ 27,2; 32,4; 35,3; 43,7; 49,0; 58,5; 63,6; 128,4; 129,1; 131,4; 136,1; 136,6; 138,6; 139,0; 145,1; 145,6; 178,4; 184,8; 186,7.
Beispiel 7
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI2997
Festes Natrium-4-sulfonaphthylisothiocyanat (180 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Das Wasser wurde unter reduziertem Druck von der resultierenden Suspension abdestilliert, und der schmutzigweiße feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff ergab (60 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,20; 2,60; 3,14; 3,48; 7,23; 7,47; 7,56; 7,77; 7,93 (d, J=6 Hz); 8,56 (d, J=6 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 35,8; 40,5; 43,1; 48,4; 53,6; 55,9; 127,6; 128,6; 130,3; 131,9; 132,5; 133,5; 134,7; 140,5; 142,7; 177,8; 178,0; 185,4.
Beispiel 8
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI6039
Festes Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (110 mg; 0,32 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde konzentriert, und der bräunliche feste Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als schmutzigweißen Feststoff ergab (110 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,53; 3,08; 3,36; 3,66; 7,90; 7,95. ¹³C-NMR (D₂O): δ 34,8; 41,0; 43,1; 48,0; 53,7; 56,2; 124,1; 128,6; 143,5; 148,8; 177,6; 185,0.
Beispiel 9
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI2998
Festes Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylisothiocyanat (250 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 1 ml) in Wasser (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, was einen orangefarbenen Feststoff ergab. Der feste Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst und durch eine kurze Säule mit Amberlite IR-120(Na) geleitet. Dann wurde das Filtrat konzentriert, und der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als schmutzigweißen Feststoff ergab (102 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,65; 3,02; 3,30; 3,66; 8,05; 8,42; 8,59; 8,67. ¹³C-NMR (D₂O): δ 33,2; 38,7; 43,2; 43,7; 47,8; 54,0; 54,3; 56,7; 131,0; 131,3; 131,9; 135,9; 138,0; 139,6; 143,8; 144,1; 145,6; 176,2; 176,5; 186,0.
Beispiel 10
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI6040
Festes Natrium-4-nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (200 mg; 0,68 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (70 mg; 0,014 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben, und die resultierende gelbe Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung konzentriert (10^–4 mm Hg; 40 °C), und der Rückstand wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) extrahiert. Der feste Rückstand wurde in DMSO (5 ml) gelöst, und eine Lösung von Natriumsulfit (130 mg; 1 mmol) in Wasser (3 ml) wurde hinzugefügt. Das resultierende leicht trübe Gemisch wurde vier Tage lang stehen gelassen, und danach führte die Zugabe von weiterem Wasser (2 ml) zur Bildung einer klaren homogenen gelben Lösung. Dann wurde die Lösung konzentriert, zuerst bei 25 mm Hg und 40 °C und dann bei 10^–4 mm Hg und 50 °C, was das Rohprodukt ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen ergab (24 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,25; 2,66; 3,08; 3,20; 3,33; 3,38; 4,01; 7,40 (br d); 7,62 (br d). ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,7; 40,9; 43,0; 43,6; 53,5; 55,5; 61,0; 131,6; 135,0; 137,2; 140,4; 174,5; 178,6; 179,2.
Beispiel 11
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Sulfobenzamid-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6116
Festes Kalium-N-hydroxysuccinimidyl-4-sulfobenzoat (100 mg; 0,3 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (35 mg; 0,005 mmol) in 0,1 M Boratpuffer (5 ml) mit pH 8,5 gegeben, und die Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende milchige Lösung hatte in diesem Stadium einen pH-Wert von 4,5. Dann wurde 1 M Natriumcarbonat hinzugefügt, was eine klare Lösung ergab, die konzentriert wurde, was das Rohprodukt als weißen Feststoff ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfobenzamid-Endgruppen ergab (47 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,25; 2,42; 2,63; 3,05; 3,18; 3,31; 3,38; 7,72 (d, J=8 Hz); 7,78 (d, J=8 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,0; 40,4; 43,0; 43,7; 53,7; 55,8; 130,2; 132,2; 140,4; 150,1; 173,6; 178,0; 178,5.
Beispiel 12
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6117
Festes Natrium-N-(4-sulfophenyl)acrylamid (250 mg; 1 mmol) und festes Natriumcarbonat (106 mg; 1 mmol) wurden nacheinander unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (78 mg; 0,011 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde vier Tage lang unter Stickstoff gerührt und dann gefriergetrocknet, was einen flockigen weißen Feststoff ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 64 Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen ergab (206 mg). Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigte eine schwache Spur von vermutlich monoalkylierten terminalen Aminogruppen. ¹H-NMR (D₂O): δ 2,10; 2,48; 2,58; 2,79; 3,20; 7,42 (d, J=7 Hz); 7,65 (d, J=7 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,5; 37,9; 41,1; 53,4; 55,6; 124,8; 130,9; 143,0; 144,2; 177,4; 178,5.
Beispiel 13
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6115
Eine Lösung von Natriumsulfanilsäure (195 mg; 1 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) wurde tropfenweise zu einer Lösung von N,N'-Disuccinimidylcarbonat (530 mg; 2 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben, und die resultierende bräunliche Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (75 mg; 0,011 mmol) in trockenem DMSO (1 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde weitere 18 Stunden lang gerührt. Dann wurde die Lösung unter Hochvakuum (10^–5 mm Hg; 35 °C) konzentriert, was einen gelblichen halbfesten Stoff ergab. Das Rohprodukt wurde in DMSO (4 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter kräftigem Rühren zu 200 ml Ethylacetat gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen und mit Ethylacetat (2 ×) und Ether (2 ×) gewaschen und dann getrocknet, was ein weißes Pulver ergab (275 mg). Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen ergab (106 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,31; 2,55; 2,75; 3,19; 7,32 (d, J=9 Hz); 7,63 (d, J=9 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 36,3; 40,7; 43,3; 43,8; 53,7; 55,7; 123,3; 130,9; 140,9; 146,0; 161,4; 178,2; 178,6.
Beispiel 14
Herstellung von Dendrimeren mit N,N,N-Trimethylglycinamidchlorid-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆; BRI2922
Trifluoressigsäure (4 ml) wurde zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆ (220 mg; 30 μmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in trockenem DMSO (5 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde festes 4-Nitrophenyl-N,N,N-trimethylglycinatchlorid (0,50 g; 1,8 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die trübe Lösung konzentriert (50 °C/10^–5 mm Hg), und der Rückstand wurde mit Wasser und Dichlormethan ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, mit Dichlormethan (3 ×) und Ethylacetat gewaschen und dann konzentriert, was ein Öl (1,128 g) ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was das BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆-Dendrimer mit N,N,N-Trimethylglycinamid-Endgruppen ergab (116 mg). ¹³C-NMR (D₂O): δ 25,5, 30,5, 30,8, 33,4, 42,1, 56,5, 57,1, 67,5, 68,1, 166,7, 167,0, 167,1, 176,0, 176,2.
Beispiel 15
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI6043
1,1'-Carbonyldiimidazol (85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von 4-Trimethylammoniumbenzoesäureiodid (154 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (4 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Während dieser Zeit schied sich ein weißer Feststoff aus der Lösung ab. Dann wurde eine Lösung von PAMAM 4.0 (58 mg; 0,011 mmol) in trockenem DMF (2 ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach hatte sich der größte Teil des Niederschlags aufgelöst, und ein Ninhydrin-Test der Lösung war negativ. Das Gemisch wurde konzentriert (10^–4 mm Hg; 30 °C), was einen weißen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen ergab (89 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 1,96; 2,65-2,85; 3,25-3,55; 3,64; 7,92. ¹³C-NMR (D₂O): δ 25,8; 33,1; 33,5; 38,7; 43,1; 43,5; 53,5; 54,1; 56,4; 61,2; 124,8; 133,6; 139,9; 153,2; 173,2; 176,3; 176,8; 182,6.
Das entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
Beispiel 16
Herstellung von Dendrimeren mit 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI6044
Festes 4-Nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (150 mg; 0,5 mmol) wurde unter Rühren zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (52 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) gegeben. Die resultierende gelbe Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test negativ verlief (pH ca. 8,5). Dann wurde die Lösung konzentriert (10^–5 mm Hg; 40 °C), und der Rückstand wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) ausgeschüttelt. Das unlösliche gelartige Material wurde durch Filtration aufgefangen, mit Wasser (2 ×) und Dichlormethan (2 ×) gewaschen und dann an der Luft getrocknet. Das rohe Dendrimer mit 4-(Chlormethyl)benzamid-Endgruppen wurde in 25%igem wässrigem Trimethylamin (20 ml) gelöst, und die gelbe Lösung wurde über Nacht stehen gelassen. Dann wurde die Lösung konzentriert, der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet. Das farblose Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt wurde, was PAMAM 4.0 mit 24 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen ergab (90 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 1,88; 2,65-2,80; 2,98; 3,10-3,60; 7,52 (br d, J=9 Hz); 7,72 (br d, J=9 Hz). ¹³C-NMR (D₂O): δ 26,6; 33,4; 38,8; 43,2; 43,5; 53,6; 53,6; 54,1; 56,8; 62,8; 73,0; 132,1; 135,3; 137,5; 140,0; 176,4; 176,9; 183,6.
Beispiel 17
Herstellung von Dendrimeren mit N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen
PAMAM 4.0
Festes 1,1'-Carbonyldiimidazol (85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von N-(2-Acetoxyethyl)-N-(carboxymethyl)-N,N-dimethylammoniumbromid (135 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff gerührt. Dann wurde eine Lösung von PAMAM 4.0 (60 mg; 0,012 mmol) in DMF (2 ml) hinzugefügt, was die sofortige Bildung eines flockigen Niederschlags bewirkte, der sich langsam wieder auflöste. Das Gemisch wurde zwei Tage lang gerührt und dann konzentriert (10^–4 mm Hg; 40 °C), was ein viskoses Öl ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen ergab (64 mg).
¹H-NMR (D₂O): δ 1,93; 2,05; 2,70; 3,10-3,60; 3,28; 3,93 (m); 4,14; 4,48 (m).
¹³C-NMR (D₂O): δ 24,6; 26,2; 33,2; 38,7; 42,8; 42,9; 53,9; 57,4; 62,6; 67,3; 67,5; 168,9; 176,4; 176,8; 177,3; 183,2.
Beispiel 18
Herstellung von Dendrimeren mit Guanidino-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI6042
Eine Lösung von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) und Methylthiopseudoharnstoffsulfat (170 mg; 0,61 mmol) in Wasser (5 ml) (pH 10,5) wurde zwei Stunden lang bei 80 °C unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, und der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 Guanidino-Endgruppen als Acetatsalz ergab (107 mg). ¹H-NMR (D₂O): δ 2,00; 2,80 (br t); 3,09 (br t); 3,32; 3,45 (br t); 3,60 (br t). ¹³C-NMR (D₂O): δ 25,2; 33,2; 33,4; 38,7; 41,2; 42,6; 43,4; 44,7; 53,5; 54,0; 56,3; 176,5; 176,7; 176,9; 181,6.
Das entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs Guanidino-Endgruppen wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
Beispiel 19
Herstellung von Dendrimeren mit 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid-Endgruppen
PAMAM 4.0; BRI6041
Eine Lösung von 1-(4-Carboxyphenyl)methyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-Tetrahydrochlorid (120 mg; 0,25 mmol), N-Hydroxysuccinimid (60 mg; 0,52 mmol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (250 mg; 1,3 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml) wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dann wurde eine Lösung von PAMAM 4.0 (32 mg; 0,006 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde zwei Tage lang stehen gelassen und dann konzentriert. Der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit ca. 12 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid-Endgruppen ergab, wie durch ¹H- und ¹³C-NMR bestimmt wurde (80 mg). Dann wurde das Produkt in Wasser gelöst und durch eine Säule mit Amberlite-IRA-401(Cl)-Harz geleitet und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst, konzentrierte HCl (1 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde mit Ethanol (30 ml) verdünnt, so dass ein weißer Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen (68 mg). Erneut zeigten ¹H- und ¹³C-NMR ca. 50% Funktionalisierung der terminalen Aminogruppen. ¹H-NMR (D₂O): δ 2,17; 2,36; 2,50; 2,78; 2,85; 3,25; 3,40; 3,50; 3,60; 3,62; 4,49; 7,63 (br d); 7,78 (br d). ¹³C-NMR (D₂O): δ 22,7; 23,1; 33,2; 38,8; 39,9; 40,2; 40,3; 41,0; 41,2; 42,0; 42,9; 43,2; 43,6; 45,5; 46,1; 49,1; 52,2; 53,9; 54,3; 56,6; 62,7; 132,5; 135,7; 137,1; 139,7; 174,3; 176,2; 176,3; 176,7; 177,0; 178,2; 178,5.
Beispiel 20
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen PAMAM 4.0 (EDA); BRI6119
Natriumcyanoborhydrid (32 mg; 0,5 mmol) wurde zu einem Gemisch von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol), 4-Formyl-2-hydroxybenzoesäure (83 mg; 0,5 mmol) und Natriumhydrogencarbonat (42 mg; 0,5 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Das inhomogene orangefarbene Gemisch wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, und während dieser Zeit wurde es homogen. Dann wurde die orangefarbene Lösung konzentriert, und der Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit ca. 32 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen ergab (91 mg). ¹H- und ¹³C-NMR (D₂O) zeigten größtenteils Monoalkylierung, aber mit einigen Anzeichen der Dialkylierung der terminalen Aminogruppen, und beide Spektren zeigten breite Signale. ¹³C-NMR (D₂O): δ 37,0; 41,1; 50,9; 53,4; 55,5; 55,8; 61,5; 120,9; 122,2; 122,4; 132,3; 132,7; 135,0; 135,8; 163,5; 163,7; 169,0; 178,6; 179,3. ¹H-NMR (D₂O): δ 2,20; 2,35; 2,60; 3,15; 3,30; 3,55; 4,25; 6,68; 7,12; 7,55.
Beispiel 21
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Carboxyphenylamid-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes 4-Carboxyphenylisothiocyanat (86 mg; 0,48 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben. Der pH-Wert der resultierenden trüben Lösung wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung auf 9 eingestellt, und die Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren gelassen. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als weißen flockigen Feststoff ergab (68 mg).
Beispiel 22
Herstellung von Dendrimeren mit 3,5-Dicarboxyphenylamid-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes 3,5-Dicarboxyphenylisothiocyanat (112 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (70 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben. Der pH-Wert der resultierenden trüben Lösung wurde mit 1 M Na₂CO₃-Lösung auf 10 eingestellt, und die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 53 °C unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen bräunlichen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als blassbraunen Feststoff ergab (112 mg).
Beispiel 23
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonooxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes Natrium-4-phosphonooxyphenylisothiocyanat (251 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben. Die resultierende Lösung (pH 9) wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen weißen Feststoff ergab (86 mg).
Beispiel 24
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes Natrium-4-(phosphonomethyl)phenylisothiocyanat (97 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (30 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde 3 Tage lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, wobei der pH-Wert durch regelmäßige Zugabe von gesättigter NaHCO₃-Lösung auf 8 gehalten wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen weißen Feststoff ergab (102 mg).
Beispiel 25
Herstellung von Dendrimeren mit Natriumethyl-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes Natriumethyl-4-(phosphonomethyl)phenylisothiocyanat (109 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in DMF (30 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde 17 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, wobei der pH-Wert durch regelmäßige Zugabe von gesättigter NaHCO₃-Lösung auf 8 gehalten wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen weißen Feststoff ergab (30 mg).
Beispiel 28
Herstellung von Dendrimeren mit C_n-Alkyl-verknüpften 2-Thiosialosid-Endgruppen
Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
Zu einer Lösung von Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-S-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat (Hasegawa et al., 1986) (100 mg) in trockenem Dimethylformamid (1 ml) wurden 8-Bromoctansäure (41 mg) und Diethylamin (280 mg) gegeben, und die Lösung wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und eiskalter 5%iger Salzsäure ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen Rückstand ergab (130 mg). Dieser wurde in Ethylacetat (5 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid (26 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (46 mg) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch Flash-Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit Ethylacetat eluiert wurde. Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden miteinander kombiniert und eingedampft, was einen weißen Schaum ergab (97 mg, 71%).
In ähnlicher Weise wurden hergestellt:
Methyl[(11-undecansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
Methyl[(essigsäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
Methyl[(4-butansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
Methyl[(4-methylbenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
A. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRI6112
Zu einer Lösung des PAMAM [EDA] 4.0 (50 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (4 ml) unter einer inerten Atmosphäre wurde Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat (300 mg) gegeben, und die Lösung wurde 60 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol (2 ml) gelöst. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Methanol eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]₃₂ als weißes Pulver erhalten (182 mg; 93%).
Dieses wurde nach dem folgenden Verfahren in das freie Sialosid umgewandelt:
Zu einer Lösung von PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]₃₂ (182 mg) in trockenem Methanol (3 ml) unter Argon bei 20 °C wurde eine frisch hergestellte 0,19 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (7 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser (10 ml) gelöst, und es wurde 3 Stunden lang gerührt. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ als blass zitronengelbes Pulver erhalten (110 mg; 77%).
Nach einem ähnlichen Verfahren wurden hergestellt:
PAMAM [EDA] 4.0 [(11-Undecanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRI6147
PAMAM [EDA] 4.0 [(Acetamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRI6121 PAMAM [EDA] 4.0 [(4-Methylbenzamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRI6120
B. BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRL6169
Eine Lösung von BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆(t-BOC)₃₂ (20,3 mg) in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (2 ml) und Dichlormethan (2 ml) wurde 2 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in trockenem Dimethylsulfoxid (1 ml) gelöst, und Diisopropylethylamin (25 mg) und Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat (78 mg) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde 60 Stunden lang bei 20 °C unter Argon gerührt, und dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in einer frisch hergestellten 0,1 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (2,5 ml) gelöst, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 20 °C unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst und 17 Stunden lang gerührt. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5- didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ als weißes Pulver erhalten (44 mg; 86%).
Beispiel 29
Herstellung von dendritischen Sialosiden, die in der 4-Position von Sialinsäure modifiziert sind.
Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-S-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Zu einer Lösung von Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-chlor-3,4,5-tridesoxy-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosonat (Sabesan, 1994) (5 g) in trockenem Dichlormethan (150 ml) wurde fein gepulvertes Kaliumthiolacetat (5,8 g) gegeben, und die Suspension wurde 48 Stunden lang bei 20 °C kräftig gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und eingedampft, was einen hellbraunen Schaum ergab (5,2 g). Das erforderliche Produkt wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC [C₁₈, 30% Acetonitril/Wasser] als weißer Schaum isoliert (3,9 g; 72%).
Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
Zu einer Lösung von Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-S-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat (300 mg) in trockenem Dimethylformamid (3,5 ml) wurden 8-Bromoctansäure (155 mg) und Diethylamin (1,26 ml) gegeben, und die Lösung wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat und eiskalter 10%iger Salzsäure ausgeschüttelt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen gelben Schaum ergab (385 mg). Dieser wurde in Ethylacetat (20 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid (95 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (175 mg) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC [C₁₈, 30% Acetonitril/Wasser] gereinigt, was einen weißen Schaum ergab (340 mg; 83%).
A. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRI6146
Zu einer Lösung des PAMAM [EDA] 4.0 (72 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (5 ml) wurde unter einer inerten Atmosphäre Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat (318 mg) gegeben, und die Lösung wurde 60 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol (2 ml) gelöst. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Methanol eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanämido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ als weißer Schaum erhalten (225 mg; 81%).
Das freie Sialosid wurde nach dem folgenden Verfahren erhalten:
Zu einer Lösung von PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ (215 mg) in trockenem Methanol (1 ml) unter Argon bei 20 °C wurde eine frisch hergestellte 1 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (1 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst, und es wurde 17 Stunden lang gerührt. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ als flockiges weißes Pulver erhalten (160 mg; 90%).
B. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂; BRI6149
Ein langsamer Strom von Schwefelwasserstoffgas wurde 5 Tage lang bei 20 °C in eine Lösung von PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ (25 mg) in einem Gemisch von Pyridin (40 ml) und Wasser (20 ml) geleitet. Dann wurde 2 Tage lang Stickstoff durch die Lösung perlen gelassen, um überschüssigen Schwefelwasserstoff zu entfernen. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in Wasser (5 ml) aufgenommen und durch einen 0,45-μm-Membranfilter filtriert, um Schwefel zu entfernen. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]₃₂ als flockiges weißes Pulver erhalten (23 mg; 96%).
Beispiel 30
Herstellung von Dendrimeren mit Boronsäure-Endgruppen
4-Carboxyphenylboronsäure-N-hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von 4-Carboxyphenylboronsäure (500 mg) in trockenem Dimethylformamid (5 ml) wurden N-Hydroxysuccinimid (380 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (680 mg) gegeben. Das Gemisch wurde 64 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen weißen Feststoff ergab, der aus Acetonitril/Wasser in Form von feinen Nadeln kristallisiert wurde (730 mg; 92%).
PAMAM [EDA] 4.0 [4-Benzamidoboronsäure]₃₂; BRI6160
Zu einer Lösung des PAMAM [EDA] 4.0 (69 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (5 ml) unter einer inerten Atmosphäre wurde 4-Carboxyphenylboronsäure-N- hydroxysuccinimidester (130 mg) gegeben, und die Lösung wurde 65 Stunden lang bei 20 °C gerührt. Zu der dicken Aufschlämmung wurde 1 M Natriumcarbonatlösung (1 ml) gegeben, und die klare Lösung wurde noch weitere 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 10% Ammoniaklösung (5 ml) gelöst. Diese Lösung wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen, wobei mit einer 10%igen Ammoniaklösung eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [4-Benzamidoboronsäure]₃₂ als flockiger weißer Feststoff erhalten (110 mg; 94%).
Beispiel 31
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂
Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂ (147 mg) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und dann wurde festes 3,6-Disulfonaphthylisothiocyanat (400 mg) hinzugefügt. Dann wurde der pH-Wert des Gemischs durch Zugabe von 1 M Natriumcarbonat auf 9,5 eingestellt, und die Lösung wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, und der Rückstand wurde in Wasser wieder aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR-120(Na) passiert. Das Filtrat wurde konzentriert, was das Rohprodukt ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt wurde, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ mit 64 Natrium-3,6-disulfonaphthylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab (175 mg).
Beispiel 32
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂
Trifluoressigsäure (3 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂ (300 mg; 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 401 (OH) passiert, und das Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (187 mg). Das Öl wurde in einem 1:1-Gemisch von Pyridin/Wasser (8 ml) gelöst, und festes Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (680 mg; 2 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ mit 64 Natrium-3,6-disulfophenylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab.
Beispiel 33
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-dicarboxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂
Trifluoressigsäure (3 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂ (300 mg; 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan (3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 401 (OH) passiert, und das Filtrat wurde konzentriert, was ein viskoses Öl ergab (186 mg). Das Öl wurde in einem 1:1-Gemisch von Pyridin/Wasser (8 ml) gelöst, und Natrium-3,5-dicarboxyphenylisothiocyanat (450 mg; 2 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde 13 Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ mit 64 Natrium-3,6-dicarboxyphenylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab.
Beispiel 34
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonooxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂
Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂ (147 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert, was ein viskoses Öl ergab. Das Öl wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und festes 4-Phosphonooxyphenylisothiocyanat (250 mg) wurde hinzugefügt. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde mit 1 M Natriumcarbonat auf 10 eingestellt, und das Gemisch wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde in Wasser wieder aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 120 (Na) passiert, und das Filtrat wurde konzentriert. Dann wurde der Rückstand durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ mit 64 Natrium-4-phosphonooxyphenylharnstoff-Gruppen als weißen flockigen Feststoff ergab (150 mg).
Beispiel 35
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonophenylthioharnstoff-Endgruppen
BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂
Trifluoressigsäure (2 ml) wurde unter Rühren zu einer Suspension von BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂ (147 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert, was ein viskoses Öl ergab. Das Öl wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und festes 4-Phosphonophenylisothiocyanat (250 mg) wurde hinzugefügt. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung auf 9 eingestellt, und das Gemisch wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was einen weißen festen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde in Wasser wieder aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule mit Amberlite IR 120 (Na) passiert, und das Filtrat wurde konzentriert. Dann wurde der Rückstand durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂ mit 64 Natrium-4-phosphonophenylharnstoff-Gruppen (BRI6196) als weißen flockigen Feststoff ergab (152 mg).
Beispiel 36
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4,6-diphosphononaphthylthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0
Eine Lösung von Natrium-4,6-diphosphononaphthylisothiocyanat (165 mg) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (2 ml) gegeben. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung auf 9,5 eingestellt, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur kräftig gerührt und dann drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen braunen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4,6-diphosphononaphthylthioharnstoff-Endgruppen als braunen Feststoff ergab (81 mg).
Beispiel 37
Herstellung von Dendrimeren mit Fluoresceinthioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes Fluoresceinisothiocyanat (188 mg) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben. Gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung wurde hinzugefügt, um den pH-Wert auf 9 einzustellen, und die resultierende homogene Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann konzentriert. Der orangefarbene Rückstand wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 (EDA) mit 21 Fluoresceinthioharnstoff-Endgruppen als flockigen orangefarbenen Feststoff ergab (193 mg).
Beispiel 38
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium(phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-Endgruppen
PAMAM 4.0 (EDA)
Festes (Phenyl-3-boronsäure)isothiocyanat (100 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben. Zu dem gelösten Isothiocyanat wurde 1 M Natriumcarbonat gegeben (pH ca. 10). Dann wurde das Gemisch zwei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt und dann filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert, was einen bräunli chen festen Rückstand ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium(phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-Endgruppen als weißen flockigen Feststoff ergab (87 mg).
Beispiel 43
I. Chorioallantoismembran(CAM)-Assay
Das in-vivo-CAM-Angiogenese-Modell, das zuerst von Folkman (1985) beschrieben und von Maragoudakis et al. (1988) modifiziert wurde, wurde verwendet. Kurz gesagt, frisch befruchtete Eier wurden 4 Tage lang bei 37 °C inkubiert, und dann wurde in der Eierschale ein Fenster geöffnet, das die CAM freilegte. Das Fenster wurde mit Cellophanband abgedeckt, und die Eier wurden bis zum Tag 9 in den Inkubator zurückgelegt, und dann wurden die Testverbindungen aufgetragen. Die Testverbindungen wurden auf sterile Kunststoffscheiben (10 mm) aufgebracht und unter sterilen Bedingungen trocknen gelassen. Kontrollscheiben (die PBS enthalten) wurden 1 cm von den das Testmaterial enthaltenden Scheiben entfernt auf die CAM gelegt. Eine sterile Lösung von Cortisonacetat (100 μg/Scheibe, Sigma) wurde in alle Scheibeneingearbeitet, um eine Entzündungsreaktion zu verhindern. Die beladenen und getrockneten Scheiben wurden umgedreht und auf die CAM gelegt, die Fenster wurden abgedeckt, und die Eier wurden bis zum Tag 11 inkubiert, und dann wurde die Angiogenese bewertet.
Morphologische Bewertung der Angiogenese im CAM-Assay
Für die morphologische Bewertung wurden die Eier wie oben behandelt. Am Tag 11 wurden die Eier mit 10%igem gepuffertem Formalin (Janssen Chimica, Geel, Belgien) geflutet, die Kunststoffscheiben wurden entfernt, und die Eier wurden wenigstens 4 Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten. Eine große Fläche um die Scheibe herum wurde abgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt, und der Gefäßdichteindex (ausgedrückt als Zahl der Blutgefäße) wurde nach dem Verfahren von Harris-Hooker et al. (1983) gemessen.
II. Rattenaorta-Assay
Das Rattenaorta-Ringmodell, das zuerst von Nicosia et al. (1990) beschrieben wurde, wurde verwendet. Kurz gesagt, eine sterile 1,5%ige Lösung von Agarose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) wurde in Kulturschalen gegossen und gelieren gelassen. Agaroseringe wurden erhalten, indem man zwei konzentrische Kreise mit einem Durchmesser von 10 bzw. 17 mm in das Agarose-Gel stanzte. Die überschüssige Agarose innerhalb und außerhalb der Ringe wurde entfernt. Die Ringe wurden auf eine 6-Napf-Platte (Nuncion, Roskilde, Dänemark) übertragen, wobei jeder Napf drei Ringe enthielt. Thorax-Aortas wurden von 3 Monate alten männlichen Wistar-Ratten erhalten. Die Aortas wurden sofort in eine Kulturschale mit serumfreiem minimalessentiellem Medium (MEM) übergeführt. Das fibroadipöse Gewebe um die Aorta herum wurde sorgfältig entfernt, um die Aortawand nicht zu beschädigen. Dünne Schnitte (0,5 mm dick) von Aortaringen wurden angefertigt und in 12 aufeinanderfolgenden Waschvorgängen gründlich mit serumfreiem Medium gespült. Vor der Übertragung der Aortaringe zu den Kulturringen in der Kulturplatte wurde die Unterseite jedes Agarose-Napfes mit 150 μl Fibrinogen zur Gerinnung beschichtet. Nachdem sich das Fibrin-Gel gebildet hatte, wurde der Aortaring in den Agarosenapf übergeführt und in der Mitte des Agarosenapfes positioniert. Dann wurden die Agarosenäpfe vollständig mit Fibrinogen zur Gerinnung gefüllt. Partiell gereinigtes Rinderfibrinogen (Sigma) wurde in serumfreiem Medium gelöst, so dass man eine Konzentration von 3 mg/ml erhielt. Eine Gerinnung wurde erhalten, indem man 20 μl einer 50 μl/ml Rinderthrombinlösung (Sigma) zu 1 ml Fibrinogenlösung gab. Das Fibrin-Gel bildete sich bei Raumtemperatur innerhalb von 30 Sekunden. Nach der Fibrin-Gelierung wurden 6 ml MEM-Medium, ergänzt mit 20% FCS (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco) und 1 mM L-Glutamin (Gibco), in jeden Napf der 6-Napf-Platte gegeben, und die Testverbindung wurde in der richtigen Konzentration zu dem Medium gegeben.
Quantifizierung der Angiogenese für den Rattenaorta-Ringassay
Kulturen wurden täglich untersucht und unter einem inversen Mikroskop bewertet. Das Wachstum von Mikrogefäßen wird mittels einer mikrovaskulären Wachstumskurve dargestellt. Die Bildung von mehr als 200 bis 250 Mikrogefäßen ist aufgrund der dreidimensionalen Komplexität des mikrovaskulären Netzwerks üblich (Nicosia et al., 1990). Die Fehlerspanne für den Beobachter, der die Mikrogefäße zählt, ist hoch: Daher wurden die gebildeten Mikrogefäße auf einer Skala von 0 (keine Gefäße) bis 10 (maximale Gefäßzahl) bewertet.
Ergebnisse I. CAM-Assay

• Es wurden höhere Konzentrationen (50 μg/cam) von BRI2995 und BRI6112 bewertet: BRI2995 verursachen den Tod von 50% der Embryonen. Die überlebenden Eier zeigten 73% Hemmung der Gefäßdichte. Bei dieser Konzentration wurde für BRI6112 keine Toxizität gefunden. Es wurde jedoch nur eine leichte Hemmung der Gefäßdichte (–16%) beobachtet.

TNP-470 (50 μg/cam) und Pentosanpolysulfat (PPS) (50 μg), zwei Verbindungen, die klinisch getestet werden, wurden als Referenzverbindungen mitverwendet. Sie reduzierten die Gefäßdichte um 21% ± 16 bzw. 42% ± 28. PPS verursachte bei dieser Konzentration jedoch den Tod von 80% der Embryonen.
II. Rattenaorta-Assay

BRI2995, BRI2996 und BRI2999 hemmten die Bildung von Mikrogefäßen bei Konzentrationen von 20 μg/ml und 100 μg/ml (fast) vollständig.
BRI6196 ergab bei 20 μg/ml und 100 μg/ml eine fast vollständige Hemmung und ergab auch bei 4 μg/ml eine Hemmung.
BRI2923 und BRI6039 reduzierten das Mikrogefäßwachstum bei einer Konzentration von 100 μg/ml.

Literatur:

1. Folkman J. (1985) J. Biol. Chem. 267: 10931–10934.
2. Harris-Hooker S.A. et al (1983) J. Cell. Physiol. 114: 302–310.
3. Hasegawa A. et al (1986) J. Carbohydrate Chemistry. 5(1): 11–19.
4. Maragoudakis M.E. et al (1988) Tissue Cell. 20: 531–539.
5. Nicosia R.F. and Ottinetti A. (1990) Cell Dev. Bio. 26: 119–128.
6. Sabesan S. (1994) Bio-Organic and Medicinal Chemistry Letters. 4 (20): 2457–2460.

Claims

Verwendung eines Dendrimers mit einer Menge von terminalen Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist, zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische oder therapeutische Hemmung von Angiogenese bei einem menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Dendrimer einen mehrwertigen Kern umfasst, der kovalent an wenigstens zwei dendritische Äste gebunden ist und sich über wenigstens zwei Generationen erstreckt.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polyamidoamin-Dendrimer auf der Basis eines Ammoniakkerns ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polyamidoamin-Dendrimer auf der Basis eines Ethylendiaminkerns ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein Polylysin-Dendrimer auf der Basis eines Benzhydrylamin- oder anderen geeigneten Kerns ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Dendrimer ein polyionisches Dendrimer der allgemeinen Formel II ist:
wobei I ein Initiatorkern ist; Z eine innere Verzweigungseinheit ist; n eine ganze Zahl ist, die die Zahl der Generationen des Dendrimers darstellt; und A eine anionische Struktureinheit ist, die über eine fakultative Verknüpfungsgruppe X mit der inneren Verzweigungseinheit Z verknüpft sein kann.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die anionische oder kationische Struktureinheit oder die anionischen oder kationischen Struktureinheiten in dem Dendrimer über Amid- oder Thioharnstoffbindungen an Amin-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder andere reaktive funktionelle terminale Gruppen des Dendrimers gebunden sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die anionischen Struktureinheiten in dem Dendrimer aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus sulfonsäurehaltigen Struktureinheiten, carbonsäurehaltigen Struktureinheiten (einschließlich neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten und modifizierten neuramin- und sialinsäurehaltigen Struktureinheiten), boronsäurehaltigen Struktureinheiten sowie phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten (einschließlich veresterten phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten) besteht.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Struktureinheit oder Struktureinheiten in dem Dendrimer, die an Amin- oder andere reaktive funktionelle terminale Gruppen des Dendrimers gebunden sind, aus den folgenden Gruppen ausgewählt sind, wobei n = 0 oder eine positive ganze Zahl ist:
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: i. Alkylsulfonsäure-terminierte Dendrimere; ii. Sulfoacetamid-terminierte Dendrimere; iii. Sulfosuccinamsäure-terminierte Dendrimere; iv. N-(2-Sulfoethyl)succinamid-terminierte Dendrimere; v. 4-Sulfophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; vi. 3,6-Disulfonaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; vii. 4-Sulfonaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; viii. 3,5-Disulfophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; ix. 3,6,8-Trisulfonaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; x. 4-(Sulfomethyl)benzamid-terminierte Dendrimere; xi. 4-Sulfobenzamid-terminierte Dendrimere; xii. N-(4-Sulfophenyl)propanamid-terminierte Dendrimere; xiii. 4-Sulfophenylharnstoff-terminierte Dendrimere; xiv. N,N,N-Trimethylglycinamid-terminierte Dendrimere; xv. 4-Trimethylammoniumbenzamid-terminierte Dendrimere; xvi. 4-(Trimethylammoniummethyl)benzamid-terminierte Dendrimere; xvii. N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-terminierte Dendrimere; xviii. Guanidino-terminierte Dendrimere; xix. 4-([1,4,8,11-TetraazacyclotetradecanJmethyl)benzamid-terminierte Dendrimere; xx. 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-terminierte Dendrimere; xxi. 4-Carboxyphenylamid-terminierte Dendrimere; xxii. 3,5-Dicarboxyphenylamid-terminierte Dendrimere; xxiii. 4-Phosphonooxyphenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxiv. 4-(Phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxv. Ethyl-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxvi. (8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxvii. (11-Undecanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxviii. (Acetamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxix. (4-Butanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxx. (4-Methylbenzamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxxi. (8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid säure-terminierte Dendrimere; xxxii. (8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xxxiii. 4-Benzamidoboronsäure-terminierte Dendrimere; xxxiv. 3,5-Dicarboxyphenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxv. 4-Phosphonophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxvi. 4,6-Diphosphononaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xxxvii. Fluoresceinthioharnstoff-terminierte Dendrimere; und xxxviii. (Phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-terminierte Dendrimere.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Medikament zur Behandlung von chronischer Entzündung, diabetischer Retinopathie, Psoriasis und rheumatoider Arthritis sowie anderen Zuständen, die mit dem Wachstum neuer Blutgefäße einhergehen, zur Prävention von Restenose durch Hemmung der Proliferation von Zellen der glatten Gefäßmuskulatur, zur Beschleunigung der Wundheilung durch Aktivierung der Freisetzung von aktiven Wachstumsfaktoren, die in der extrazellulären Matrix gespeichert werden, und zur Hemmung von Tumorzellmetastasierung durch Hemmung der Angiogenese dient.
Verbindung, die ein Dendrimer mit einer Menge von terminalen Gruppen umfasst, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist, wobei die anionische Struktureinheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: i. sialinsäurehaltigen und modifizierten sialinsäurehaltigen Struktureinheiten außer 2-Thiosialinsäure und deren Methylester und dem Methylester von peracylierter 2-Thiosialinsäure; ii. neuraminsäurehaltigen und modifizierten neuraminsäurehaltigen Struktureinheiten; iii. boronsäurehaltigen Struktureinheiten; und iv. phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten einschließlich veresterten phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten.
Verbindung gemäß Anspruch 12, wobei das Dendrimer einen mehrwertigen Kern umfasst, der kovalent an wenigstens zwei dendritische Äste gebunden ist und sich über wenigstens zwei Generationen erstreckt.
Verbindung gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Dendrimer ein Polyamidoamin-Dendrimer auf der Basis eines Ammoniakkerns ist.
Verbindung gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Dendrimer ein Polyamidoamin-Dendrimer auf der Basis eines Ethylendiaminkerns ist.
Verbindung gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Dendrimer ein Polylysin-Dendrimer auf der Basis eines Benzhydrylamin- oder anderen geeigneten Kerns ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die anionische Struktureinheit über Amid- oder Thioharnstoffbindungen an Amin-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder andere reaktive funktionelle terminale Gruppen des Dendrimers gebunden ist.
Verbindung gemäß Anspruch 12, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: i. 4-Phosphonooxyphenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; ii. 4-(Phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; iii. Ethyl-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; iv. (8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; v. (11-Undecanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; vi. (Acetamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; vii. (4-Butanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; viii. (4-Methylbenzamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; ix. (8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; x. (8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure-terminierte Dendrimere; xi. 4-Benzamidoboronsäure-terminierte Dendrimere; xii. 4-Phosphonophenylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; xiii. 4,6-Diphosphononaphthylthioharnstoff-terminierte Dendrimere; und xiv. (Phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-terminierte Dendrimere.