DE102006036326A1

DE102006036326A1 - Dendritische Polyglycerolsulfate und -sulfonate und deren Verwendung bei entzündlichen Erkrankungen

Info

Publication number: DE102006036326A1
Application number: DE102006036326A
Authority: DE
Inventors: Rainer Prof. Dr. Haag; Jens Dr.rer.nat. Dernedde; Rudolf Prof. Dr. Tauber; Gesche Dr. Bernhard; Heidemarie Weinhart; Holger Dr. Türk; Sven Enders
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2008-02-07
Also published as: EP2046868A2; JP2013166756A; JP2009545545A; US20140363507A1; IL196882A0; US20120328519A1; CN101506272A; WO2008015015A3; CA2659940A1; WO2008015015A2; CN102585202A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Verbindungsklassen der dendritischen Polyglycerolsulfate und -sulfonate sowie deren Herstellung und Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, insbesondere entzündlichen Erkrankungen, und als Selektininhibitoren/-indikatoren. Die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfate und -sulfonate eignen sich des weiteren in der bildgebenden klinischen Diagnostik, insbesondere von entzündlichen Erkrankungen.

Description

Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Verbindungsklassen der dendritischen Polyglycerolsulfate und -sulfonate sowie deren Herstellung und Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, insbesondere entzündlichen Erkrankungen, und als Selektininhibitoren/-indikatoren. Die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfate und -sulfonate eignen sich des weiteren in der bildgebenden klinischen Diagnostik, insbesondere von entzündlichen Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Entzündung ist eine fundamentale Antwort auf die Verletzung von Gewebe und die Invasion von Pathogenen, bei der Leukozyten aufgrund ihrer antimikrobiellen, sekretorischen and Phagozytose-Aktivitäten eine Schlüsselrolle spielen. Bei allen Formen der Entzündungsreaktion werden die Rekrutierung von Leukozyten an das Gefäßendothel und nachfolgendes Auswandern in das umliegende Gewebe beobachtet.
Die Einwanderung von Leukozyten in Gewebe wird durch die Adhärenz von Leukozyten an die Blutgefäßwand eingeleitet. Dies ermöglicht es Leukozyten, sich in Infektionsherden anzusammeln und Abwehrreaktionen durchzuführen. Eine Vielzahl von vaskulären Zelladhäsionsmolekülen auf Leukozyten und auf Endothelzellen vermittelt und kontrolliert die Adhäsion der Blutzellen an die Gefäßwand. Dieser Prozess läuft in einer Kaskade von hintereinander geschalteten molekularen Interaktionen ab. Zunächst vermitteln die Selektine, eine Familie von lektinartigen Adhäsionsmolekülen, das "Andocken" und Rollen der Leukozyten auf der Endotheloberfläche. Dies führt zur Verlangsamung der Leukozyten und ermöglicht den Kontakt mit Signalstoffen auf der Endotheloberfläche, wie z. B. den Chemokinen. Diese stimulieren die Aktivierung von Integrinen auf der Leukozytenoberfläche, die dann die effiziente Bindung dieser Zellen an die Endotheloberfläche vermitteln. Als Liganden der Integrine fungieren Mitglieder der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie. Die nun stabil adhärierenden Leukozyten können sich gezielt fortbewegen und schließlich aktiv durch die Endothelzellschicht hindurchwandern.
Wie bereits gesagt, wird der initiale Kontakt und das Rollen der Leukozyten auf dem Endothel durch transiente Rezeptor-Ligand-Interaktionen zwischen den (drei) Selektinen und ihren Liganden vermittelt [1]. Fester Kontakt der Leukozyten mit dem Endothel wird nachfolgend durch Wechselwirkung von aktivierten Integrinen mit Adhäsionsmolekülen der Immunglobulin-Superfamile gewährleistet [2]. Neben der erwünschten Wirkung der Abwehr und der Reparatur von Gewebedefekten kann das unkontrollierte Auswandern der Leukozyten aus der Blutbahn auch pathologische Bedeutung haben und zur Schädigung des Gewebes führen [3]. Die generelle Beteiligung endothelialer Zelladhäsionsmoleküle an akuten und chronischen Entzündungsprozessen macht sie deshalb zu geeigneten Zielstrukturen für die Diagnostik und Therapie [für eine Übersicht siehe 4].
Selektive sind Kohlenhydrat bindende Adhäsionsmoleküle, die im Prozeß der Immunabwehr zur gesteigerten Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel des entzündeten Gewebes beitragen. Sie werden entsprechend ihrer Ursprungszellen in L-(Leukozyten), E-(Endothel) und P-Selektin (Plättchen und Endothel) eingeteilt. Durch ihre Proteinstruktur und ihre speziellen molekularen Bindungseigenschaften initiieren sie die Leukozytenadhäsion; nach vorübergehender Bindung der korrespondierenden Liganden erfahren die Leukozyten aus dem fließenden Blutstrom eine "rollende Verlangsamung" entlang der Gefäßwand. Anschließend vermitteln andere Adhäsionsmoleküle die feste Bindung der Leukozyten am Endothel sowie deren Extravasation zur Erfüllung ihrer Abwehrfunktion. Die Selektine wurden schon kurz nach ihrer Entdeckung und strukturellen Aufklärung zu Beginn der neunziger Jahre zu attraktiven Zielstrukturen für die pharmazeutische Forschung. Neben ihrer physiologischen Funktion im Immungeschehen wurden auch eine Dysregulation der Selektinexpression bei pathologischen Prozessen wie rheumatoider Arthritis, Asthma, Diabetes mellitus und Ischämie/Reperfusion und eine Beteiligung an der Gewebeinvasion metastasierender Krebszellen beobachtet. Dies motivierte zu einer intensiven Suche nach Selektin-inhibierenden Substanzen.
E- und P-Selektin, und L-Selektinliganden werden entzündungsabhängig auf mikrovaskulärem Gefäßendothel exprimiert, L-Selektin wird von den Leukozyten präsentiert [1,2]. Zu den beschriebenen Selektinen sind nur einzelne hoch affine Liganden bekannt. Prinzipiell sind dies mucinähnliche Strukturen, das heißt lang gestreckte Glykoproteine, an deren Serin- oder Threonin-reichem Proteingrundgerüst viele Kohlenhydrat-Seitenketten als die eigentlichen Bindungsepitope glykosidisch geknüpft sind. Durch schnelle Ausbildung und Dissoziation der Rezeptorbindungen an den hoch flexiblen Liganden wird im Scherstrom der Gefäße das Zellrollen vermittelt. Die für die Bindung essentiellen Kohlenhydrat-Epitope sind N-Acetyllaktosamin-basierende Oligosaccharide in spezieller Verknüpfung mit Fucose und einer terminalen Sialinsäure (N-Acetyl-Neuraminsäure). Herausragende Bedeutung als Bindungsepitop hat das Tetrasaccharid Sialyl LewisX (sLeX). sLeX wird als Standardligand für Struktur-Wirkungs-Beziehungen zur Charakterisierung der Bindungseigenschaften sowie für die Suche nach Selektininhibitoren herangezogen.
Die Befunde, daß sLex ein entscheidender Bindungspartner der Selektine ist, und Befunde, daß Polyvalenz ein Schlüssel in der gezielten Blockade der Leukozytenadhäsion ist, liegen schon länger vor und sind Grundlage für die Entwicklung verschiedenster Selektininibitoren [für eine Übersicht siehe 5]. Bislang hat das Target Selektin jedoch nicht zur Entwicklung marktreifer Therapeutika geführt, obwohl hochaffine Inhibitoren verfügbar sind [5].
Die therapeutsiche Intervention bei rheumatoider Arthritis und Psoriasis wird derzeitig durch Einsatz von Blockern des inflammatorischen Cytokins TNFα (Infliximab, Etanercept, [6,7]) erreicht. Mit Efalizumab [7] ist zudem ein Anti-Integrin-Antikörper auf dem Markt, der zur systemischen Therapie bei Psoriasis zugelassen ist. Weitere Substanzen werden in klinischen Studien getestet, wie der zur Klasse der small molecule drugs gehörende Pan-Selektin-Antagonist Bimosiamose (1,6-bis[3-(3-carboxymethylphenyl)-4-(2-alpha-D-mannopyranosyloxy)phenyl]hexan), der eine Selektin-inhibierende Substanz mit glycosidischer Struktur ist und eine wesentlich höhere Affinität zu den Selektinen als sLeX besitzt (Testung durch Fa. Revotar Hennigsdorf). Bimosiamose soll bei Asthma, Psoriasis, atopischer Dermatitis und Reperfusionsschäden eingesetzt werden [8].
Lineare Neoglycopolymere, die sulfatierte sLex-Strukturen tragen, wurden beschrieben und können IC₅₀ Werte im niedrigen nanomolaren Bereich erreichen [5,9] ebenso dendritische Polyethylenoxid (PEO)-Glycopolymere, die sulfatiert sind [10].
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen und Verbindungsklassen zur Verfügung zu stellen, die synthetisch leicht zugänglich sind und sich für die Behandlung von Erkrankungen, insbesondere von entzündlichen Erkrankungen eignen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von dendritischen Polyglycerolsulfonaten gelöst.
Ein erfindungsgemäßes dendritisches Polyglycerolsulfonat wird gekennzeichnet durch

a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen, bevorzugt 1 bis 4 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 %, bevorzugt 60 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol, bevorzugt 1.000 bis 20.000 g/mol aufweist,
b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfonierung von 1 bis 100 %, bevorzugt 1 bis 30 %, erhalten wird und
c) ein Molekulargewicht von 110 bis 1.500.000 g/mol, bevorzugt 1.100 bis 30.000 g/mol.

Der polymere Polyglycerol-Kern wird unter der Verwendung eines (multi)funktionellen Startermoleküls bzw. Initiators bei der ringöffnenden Polymerisation von Glycidol hergestellt. Bei dem Startermolekül bzw. Initiator handelt es sich um eine Polyhydroxyverbindung, die 1 bis 1.000, bevorzugt 1 bis 100 und weiter bevorzugt 1 bis 4 OH-Gruppen hat. Das Startermolekül hat die allgemeine Formel R-(OH)_x, wobei R jedes beliebige Molekül sein kann, das unter den Bedingungen der anionischen Polymerisation stabil ist, und x 1 bis 1.000, bevorzugt 1 bis 100 und weiter bevorzugt 1 bis 4 ist. Vorzugsweise handelt es sich bei den verwendeten Initiatoren um tris- oder tetrafunktionelle Inititatoren, wie 1,1,1-Trishydroxymethylpropan (TMP) als bevorzugter trisfunktioneller Initiator oder Pentaerythrol (PE) als bevorzugter tetrafunktioneller Initiator. Das Startermolekül bzw. der Initiator kann auch weitere Heterofunktionalitäten tragen, wie insbesondere SH-Gruppen, NH₂-Gruppen. In einer besonderen Ausführungsform enthält das Startermolekül OH-Gruppen und/oder weitere Heterofunktionalitäten (wie SH, NH₂). Weitere geeignete Initiatoren sind dem Fachmann bekannt.
In Abhängigkeit von der Wahl des Initiators und der Polymerisationsbedingungen erreicht der polymere Polyglycerol-Kern einen Grad der Verzweigung und ein beliebig einstellbares molekulares Gewicht mit engen Polydispersitäten. Erfindungsgemäß werden polymere Polyglycerol-Kerne mit einer Verzweigung von 0 bis 100 % verwendet. Vorzugsweise werden hochverzweigte Strukturen verwendet, bevorzugt mit einem Verzweigungsgrad von 30 bis 80 %, besonders bevorzugt mit einem Verzweigungsgrad von 60 %.
Bevorzugt beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht des erfindungsgemäßen polymeren Polyglycerol-Kerns 100 bis 1.000.000 g/mol, weiter bevorzugt 500 bis 100.000 g/mol, dabei werden besonders bevorzugt 1.000 bis 20.000 g/mol.
Die erfindungsgemäßen polymeren Polyglycerol-Kerne werden einer Sulfonierung unterzogen. Als Sulfonierungsreagenz wird bevorzugt Vinylsulfonsäure-Natriumsalz in Gegenwart katalytischer Mengen einer Base, wie Kaliumhydroxid, verwendet. Der erreichte Grad der Sulfonierung beträgt bevorzugt 1 bis 100 %, besonders bevorzugt 10 bis 30 %, weiterhin besonders bevorzugt 30 bis 100%.
„Grad der Sulfonierung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet der Prozentsatz der funktionalisierten OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten des polymeren Polyglycerol-Kerns. Die Funktionalisierung erfolgt entweder durch den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen oder durch Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten.
Der oligomere Spacer hat die allgemeine Formel: -(CH₂)- oder -[(CH₂)_m-O)]_n-, wobei m 1 bis 100, bevorzugt 1 bis 50, weiter bevorzugt 1 bis 10 und noch weiter bevorzugt 2 ist und
n 1 bis 50.000, bevorzugt 1 bis 5.000, weiter bevorzugt 1 bis 100 ist und hat daran -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen gebunden.
Bei einem oligomeren Spacer handelt es sich z.B. um eine Oligoethylenglycol (OEG)-Kette, eine Polyethylenglycol (PEG)-Kette, um aliphatische Kohlenwasserstoff-Ketten oder auch andere lineare Polyether.
In Abhängigkeit von der Wahl der erfindungsgemäßen polymeren Polyglycerol-Kerne und der Sulfonierungsbedingungen, d.h. dem Grad der Sulfonierung, beträgt das Molekulargewicht eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats bevorzugt 110 bis 1.500.000 g/mol, weiter bevorzugt 600 bis 150.000 g/mol und besonders bevorzugt 1.100 bis 30.000 g/mol.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats haben

a) einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (M_n) von 2.500 bis 20.000 g/mol und einem Verzweigungsgrad von 60 %, was einem dendritischen Verzweigungsgrad entspricht, und
b) einen Grad der Sulfonierung von 10 bis 30 %, der durch Sulfonierung mit Vinylsulfonsäure-Natriumsalz erhalten wird.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats hat einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000 g/mol, einen Grad der Sulfonierung von 4 % und ein Molekulargewicht von 5.200 g/mol, wie Verbindung 3b aus Beispiel 2 (siehe Tabelle 2).
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats hat einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 g/mol, einen Grad der Sulfonierung von 8 % und ein Molekulargewicht von 21.800 g/mol, wie Verbindung 3d aus Beispiel 2 (siehe Tabelle 2).
Die Aufgabe wird außerdem erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von dendritischen Polyglycerolsulfaten gelöst.
Ein erfindungsgemäßes dendritisches Polyglycerolsulfat wird gekennzeichnet durch

a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen, bevorzugt 1 bis 4 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 %, bevorzugt 60 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol, bevorzugt 1.000 bis 20.000 g/mol aufweist,
b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfatierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und
c) ein Molekulargewicht von 200 bis 5.000.000 g/mol, bevorzugt 2.000 bis 50.000 g/mol.

Der polymere Polyglycerol-Kern wird unter der Verwendung eines (multi)funktionellen Startermoleküls bzw. Initiators bei der ringöffnenden Polymerisation von Glycidol hergestellt. Bei dem Startermolekül bzw. Initiator handelt es sich um eine Polyhydroxyverbindung, die 1 bis 1.000, bevorzugt 1 bis 100 und weiter bevorzugt 1 bis 4 OH-Gruppen hat. Das Startermolekül hat die allgemeine Formel R-(OH)_x, wobei R jedes beliebige Molekül sein kann, das unter den Bedingungen der anionischen Polymerisation stabil ist, und x 1 bis 1.000, bevorzugt 1 bis 100 und weiter bevorzugt 1 bis 4 ist. Vorzugsweise handelt es sich bei den verwendeten Initiatoren um tris- oder tetrafunktionelle Inititatoren, wie 1,1,1-Trishydroxymethylpropan (TMP) als bevorzugter trisfunktioneller Initiator oder Pentaerythrol (PE) als bevorzugter tetrafunktioneller Initiator. Das Startermolekül bzw. der Initiator kann auch weitere Heterofunktionalitäten tragen, wie insbesondere SH-Gruppen, NH₂-Gruppen. In einer besonderen Ausführungsform enthält das Startermolekül OH-Gruppen und/oder weitere Heterofunktionalitäten (wie SH, NH₂). Weitere geeignete Initiatoren sind dem Fachmann bekannt.
In Abhängigkeit von der Wahl des Initiators und der Polymerisationsbedingungen erreicht der polymere Polyglycerol-Kern einen Grad der Verzweigung und ein beliebig einstellbares molekulares Gewicht mit engen Polydispersitäten. Erfindungsgemäß werden polymere Polyglycerol-Kerne mit einer Verzweigung von 0 bis 100 % verwendet. Vorzugsweise werden hochverzweigte Strukturen verwendet, bevorzugt mit einem Verzweigungsgrad von 30 bis 80 %, besonders bevorzugt mit einem Verzweigungsgrad von 60 %.
Bevorzugt beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht des erfindungsgemäßen polymeren Polyglycerol-Kerns 100 bis 1.000.000 g/mol, 500 bis 100.000 g/mol, dabei werden besonders bevorzugt 1.000 bis 20.000 g/mol.
Die erfindungsgemäßen polymeren Polyglycerol-Kerne werden einer Sulfatierung unterzogen. Als Sulfatierungsreagenz wird bevorzugt ein Komplex aus SO₃ und Pyridin verwendet und in einer Konzentration, die equimolar zu den OH-Gruppen des polymeren Polyglycerol-Kerns ist, verwendet. Über das Verhältnis von SO₃ zu den OH-Gruppen des Polyglycerols kann die resultierende Funktionalisierung, d.h. Sulfatierung, von 0 bis 100 % eingestellt werden. Der erreichte Grad der Sulfatierung beträgt bevorzugt 1 bis 100 %, weiter bevorzugt 70 bis 95 %, besonders bevorzugt 79 bis 92 %.
„Grad der Sulfatierung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet der Prozentsatz der funktionalisierten OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten des polymeren Polyglycerol-Kerns. Die Funktionalisierung erfolgt entweder durch den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder durch Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten.
Der oligomere Spacer hat die allgemeine Formel: -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)_n-, wobei m 1 bis 100, bevorzugt 1 bis 50, weiter bevorzugt 1 bis 10 und noch weiter bevorzugt 2 ist und
n 1 bis 50.000, bevorzugt 1 bis 5.000, weiter bevorzugt 1 bis 100 ist und hat daran -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen gebunden.
Bei einem oligomeren Spacer handelt es sich z.B. um eine Oligoethylenglycol (OEG)-Kette, eine Polyethylenglycol (PEG)-Kette, um aliphatische Kohlenwasserstoff-Ketten oder auch andere lineare Polyether.
In Abhängigkeit von der Wahl der erfindungsgemäßen polymeren Polyglycerol-Kerne und der Sulfatierungsbedingungen, d.h. dem Grad der Sulfatierung, beträgt das Molekulargewicht eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats bevorzugt 200 bis 5.000.000 g/mol, weiter bevorzugt 2.000 bis 50.000 g/mol, besonders bevorzugt 5.500 g/mol oder 11.000 g/mol oder 21.500 g/mol oder 41.000 g/mol.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats hat einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2.500 g/mol, einen Grad der Sulfatierung von 85 % und ein Molekulargewicht von 5.500 g/mol, wie Verbindung 2a aus Beispiel 1 (siehe Tabelle 1).
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats hat einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000 g/mol, einen Grad der Sulfatierung von 79 % und ein Molekulargewicht von 10.500 g/mol, wie Verbindung 2b aus Beispiel 1 (siehe Tabelle 1).
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats hat einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10.000 g/mol, einen Grad der Sulfatierung von 84 % und ein Molekulargewicht von 21.700 g/mol, wie Verbindung 2c aus Beispiel 1 (siehe Tabelle 1).
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats hat einen polymeren Polyglycerol-Kern mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 g/mol, einen Grad der Sulfatierung von 76 % und ein Molekulargewicht von 40.900 g/mol, wie Verbindung 2d aus Beispiel 1 (siehe Tabelle 1).
Die Aufgabe wird weiterhin durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats und/oder eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats als Arzneimittel bei der Behandlung von Erkrankungen gelöst.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können, wenn sie beispielsweise als Arzneimittel verwendet werden, in Form von pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen sowie pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen, zur Verfügung gestellt werden. Bevorzugterweise haben diese pharmazeutische Zusammensetzungen eine Einheits-Dosierungsform, wie Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Granulat, sterile parenterale Lösungen oder Suspensionen. Weitere Dosierungsformen sind dem Fachmann bekannt.
Ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine therapeutisch aktive Menge des Wirkstoffs oder mehrerer Wirkstoffe, d.h. eine therapeutische aktive Menge einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen Verbindungen. Ein Fachmann ist in der Lage anhand der zu behandelnden Erkrankung und unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten die therapeutisch aktive Menge zu ermitteln. Ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung kann geeigneterweise zwischen ungeführ 5 und 1000 mg, bevorzugterweise ungefähr 10 bis 500 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung beinhalten.
Der pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Hilfsstoff kann eine große Vielzahl von Formen in Abhängigkeit von dem gewünschten Weg der Verabreichung (z.B. oral, parenteral) haben. Geeignete Träger und Hilfsstoffe sind im Stand der Technik bekannt und können von einem Fachmann ausgewählt werden. Träger schließen inerte pharmazeutische Arzneistoffträger ein, wie Bindemittel, Suspensionsmittel, Gleitmittel, Geschmacksmittel, Süßstoffe, Konservierungsmittel, Farbstoffe und Beschichtungen.
Bei den Erkrankungen, die durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats und/oder eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats behandelt werden können, handelt es sich bevorzugt um entzündliche Erkrankungen.
Für eine therapeutische Intervention kommen alle entzündlichen Prozesse in Frage, bei denen das Auswandern der Leukozyten aus der Blutbahn pathologische Bedeutung erlangt und zu Gewebsschädigung führt. Neben den chronisch entzündlichen Erkrankungen, wie z.B. rheumatoider Arthritis, Asthma und Psoriasis, ist ein Einsatz der erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonate und/oder der erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfate auch bei Ischämie-Reperfusionsschäden oder Transplantatabstoßung möglich.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden demzufolge bevorzugt zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, Asthma und Psoriasis, sowie zur Behandlung von Ischämie-Reperfusionsschäden oder Transplantatabstoßung verwendet.
Weiter bevorzugt handelt es sich bei den entzündlichen Erkrankungen um Erkrankungen, bei denen die Selektin-vermittelte Leukozytenadhäsion dysreguliert ist.
Bei chronisch entzündlichen Prozessen kommt es nach Gewebezerstörung zur Entstehung von Fibrosen. Zwei Cytokine spielen dabei eine wesentliche Rolle: IFNγ und TNFα. IFNγ wird von einer bestimmten Population von Leukozyten (T- und NK-Zellen) sezerniert und führt zur Aktivierung von Makrophagen, die ihrerseits:

1) hydrolytische Enzyme und reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies produzieren, was zur Zerstörung des umgebenden Gewebes führt, und
2) TNFα freisetzen, das bewirkt, daß Zelladhäsionsmoleküle auf benachbarten Endothelien vermehrt exprimiert und Leukozyten aktiviert werden. Somit beobachtet man in Entzündungsarealen eine vermehrte Rekrutierung von Leukozyten.

Die Aufgabe wird weiterhin durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats und/oder eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats als Selektininhibitor gelöst.
Dabei erfolgt die Verwendung bevorzugt als Inhibitor von L-Selektin und/oder P-Selektin.
Die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonate und/oder die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfate binden L- und P-Selektin mit hoher Affinität (IC₅₀ von 10 nM bzw. 40 nM, siehe Beispiel 3) und blockieren so die Interaktion mit ihren Liganden. Der Leukozyten/Endothel-Kontakt wird reduziert und damit das vermehrte Auswandern der Leukozyten in die Entzündungsherde unterdrückt.
Die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonate und/oder Polyglycerolsulfate eignen sich somit zur Inhibierung der Selektin-vermittelten Leukozytenadhäsion.
Die Aufgabe wird weiterhin durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonats und/oder eines erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfats als Selektinindikator gelöst.
Ein „Selektinindikator" im Sinne dieser Erfindung bindet spezifisch an Selektine oder eines der Selektine, wie L- und/oder P-Selektin, und kann daher zum Targeting, zur Lokalisierung und/oder zur Visualisierung der Selektine verwendet werden, insbesondere in vitro, in Zellen, in Geweben, in Organen, in Gewebeschnitten aber insbesondere auch in vivo. Der Fachmann wird anhand der Lehre dieser Patentanmeldung in der Lage sein, die erfindungsgemäßen Verbindungen als Selektinindikatoren einzusetzen.
Dazu werden die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt mit signalgebenden Molekülen beladen oder es werden signalgebende Moleküle an die erfindungsgemäßen Verbindungen gebunden.
Bevorzugte signalgebende Moleküle sind mit radioaktiven Isotopen, wie ¹²⁴I, ¹²⁵I, oder ¹⁸F-markierte Moleküle, Farbstoffe, insbesondere Fluorophore, wie Aminomethylcoumarin, Fluorescein, Cyanin, Rhodamin und deren Derivate oder andere Chromophore. Bei einem signalgebenden Molekül kann es sich des weiteren um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher handeln, die insbesondere als Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor/-reporter und einem Fluoreszenzakzeptor/-quencher (d.h. als ein FRET-Paar) verwendet werden können.
Die Lokalisierung und Charakterisierung von Entzündungsherden ist mit den verfügbaren Methoden der bildgebenden klinischen Diagnostik noch nicht befriedigend gelöst. Für ein spezifisches Targeting von Entzündungsarealen mit den erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonaten und/oder den erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfaten werden diese mit Signalgebern (Radioisop, NIR-Farbstoff, Magnetit) beladen und für eine Visualisierung eingesetzt. Vorraussetzung ist hierfür eine spezifische Bindung (an L- und P-Selektin) und Akkumulation des Signals am Entzündungsareal.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen demgemäß bei der Diagnose von entzündlichen Erkrankungen verwendet. Dabei erfolgt ein Targeting der Selektine im Bereich der Entzündungen.
Die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonate und/oder die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfate wirken des weiteren als Heparin-Analoga und sind deshalb, ebenso wie Heparin, in der Lage, einige Chemokine spezifisch zu binden. Dabei handelt es sich um proinflammatorische Cytokine, insbesondere TNFα, IL-1, IL-6, sowie IL-8 und MIP-1β.
Bei einer inhibitorischen Bindung der Chemokine, wie INFγ oder TNFα, durch ein erfindungsgemäßes dendritisches Polyglycerolsulfonat und/oder ein erfindungsgemäßes dendritisches Polyglycerolsulfat wird eine Interaktion mit den Rezeptoren der Chemokine verhindert, so daß Gewebeschädigung und Leukozytenextravasation reduziert werden.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen aufgrund ihrer spezifischen Wechselwirkungen mit Proteinen, wie Selektinen, Chemokinen, Gerinnungsfaktoren, insbesondere L- und P-Selektin, auch in weiteren in vitro Applikationen verwendet:

– Die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfonaten und/oder den erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfaten werden (analog zur kommerziell erhältlichen Heparinsepharose) an einer Matrix immobilisiert.

Bevorzugte Matrices bzw. Oberflächen zur Immobilisierung sind anorganische sowie polymere natürliche und synthetische Materialien in Abhängigkeit von der Anwendung, beispielsweise der verwendeten Trenntechnik. Beispiele sind Silicium-basierte Oberflächen (z.B. Glas, Silica) und zahlreiche funktionalisierte und nicht funktionalisierte Polymere (z.B. Dextran, Agarose, Sepharose sowie synthetische hydrophile Polymere).
Die Matrices bzw. Oberflächen zur Immobilisierung sind weiterhin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anorganisch oxidischen Oberflächen, magnetisierbaren oder nichtmagnetisierbaren Oberflächen, siliziumhaltigen Oberflächen, Glas-Oberflächen, Silica-Membranen, Kieselerden, Tonerden und weiteren dem Fachmann bekannten Oberflächen. Bei den Matrices bzw. Oberflächen zur Immobilisierung kann es sich ferner um Partikel, Membranen, Matrices oder Festphasen handeln.

– Die erfindungsgemäßen Verbindungen, bevorzugt immobilisiert, werden zur Fraktionierung komplexer Lösungen oder biologischer Proben (z.B. Körperflüssigkeiten, Plasma, Vollblut, Serum, weitere aus Blut abgeleitete Proben, Zellsuspensionen, Überstände von Zellkulturen) und anderer Biomolekül-enthaltender Lösungen sowie zur Reinigung spezifischer Proteine (z. B. L-Selektin, P-Selektin, Chemokine, Gerinnungsfaktoren) aus diesen Lösungen/Proben eingesetzt.
– Die erfindungsgemäßen dendritischeri Polyglycerolsulfonate und/oder die erfindungsgemäßen dendritischen Polyglycerolsulfate werden als Fängermoleküle, z.B. im ELISA, eingesetzt.

Die dendritischen Polyglycerolsulfate und -sulfonate haben ein großes anti-inflammatorisches Potential, da sie die Vorteile beschriebener Inhibitoren in sich vereinigen:

– einfache Synthese (kostengünstig)
– Biokompatibilität (große Ähnlichkeit zum Heparansulfat/Heparin)
– Hohe Affinität zu L- und P-Selektin (IC₅₀ = 10 bzw. 40 nM, Messung in vitro). in vitro Analysen im Biacore zeigen, daß in Abhängigkeit von ihrer Größe, die Wirksamkeit (Bindung an L- und P-Selektin) zunimmt.
– Bindung von Chemokinen, die die Aktivierung der Leukozyten hemmt.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen illustriert.
Figuren
1. Syntheseschema der dendritischen Polyglycerolsulfate.
2. Syntheseschema der dendritischen Polyglycerolsulfonate.
3. Inhibition der L-Selektin-Ligand Bindung durch ausgewählte dendritische Polyglycerinsulfaten.

Die Bindung von L-Selektiv an seinen synthetischen Liganden (sLeX-Tyrosinsulfat) wurde auf 100 % gesetzt (Kontrollwert).
Durchschnittliches Molekulargewicht des Polyglycerol-Kerns [g/mol]: 2a, 2500; 2c, 1000; 2d, 20.000.
Der Grad der Sulfatierung liegt bei allen Polyglycerolsulfaten bei etwa 80% (siehe auch Tabelle 1).
4. Kompetitive Inhibition der Selektine durch das dendritisch Polyglycerolsulfat 2c.

Die Bindung an den synthetischen Liganden (sLeX-Tyrosinsulfat) wurde jeweils auf 100 % gesetzt (Kontrollwert).
5. Sulfatierungsgrad-abhängige, kompetitive Inhibition der L-Selektin-Ligand-Bindung durch Derivate des dendritischen Polyglycerols 2d.

Die Derivate wurden in einer Konzentration von 10 nM eingesetzt. Die Bindung von L-Selektin an seinen synthetischen Liganden (sLeX-Tyrosinsulfat) wurde auf 100 % gesetzt (Kontrollwert).
Beispiele
Beispiel 1: Synthese der dendritischen Polyglycerolsulfate
Die Synthese der dendritischen Polyglycerolsulfate erfolgt, wie im Wesentlichen in [11] beschrieben.
Materialien:
SO₃/Pyridin-Komplex wurde von Fluka (Buchs, Schweiz) gekauft. Das Reagenz wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Das Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid (DMF, p.a. Qualität, gekauft von Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurde über CaH₂ getrocknet und über Molekularsieb 4 A vor der Verwendung gelagert. Dialyse wurde mit Schläuchen aus regenerierter Cellulose (SpectraPore 6/Roth) in destilliertem Wasser in einem 5 1 Becherglas durchgeführt, wobei das Lösungsmittel dreimal über eine Zeitspanne von 48 Stunden gewechselt wurde.
1. Polymere Polyglycerol-Kerne
Polyglycerol 1 ist ein leicht erhältliches, gut definiertes Polymer mit dendritischer (baumartiger) Verzweigung, welches durch kontrollierte anionische Polymerisierung von Glycidol erhalten wird [12-14]. Der Grad der Verzweigung von 1 (60%) ist niedriger als der eines perfekten Glycerol-Dendrimers (100%) [15]. Trotzdem sind die physiko-chemischen Eigenschaften sehr ähnlich [16]. Das Molekulargewicht (1.000-30.000 g/mol) und der Grad der Polymersisierung (DP) können leicht durch das Monomer/Initiator-Verhältnis maßgeschneidert werden und es werden enge Polydispersitäten werden erhalten (typischerweise < 2,0) [14]. Aufgrund der biokompatiblen Eigenschaften des aliphatischen Polyether-Polyols (z.B. Polysaccharide, Poly(ethylenglycol)e) im allgemeinen werden ähnliche Eigenschaften von Polyglycerol erwartet [13]. Zusätzlich wurden Oligoglycerole (mit 2-10 Monomereinheiten) in Bezug auf deren toxikologische Eigenschaften im Detail studiert und wurden als Nahrungs- und Pharma-Additiva genehmigt [16,17]. Das dendritische Polyglycerol 1 sollte daher gut als ein hochfunktionaler Träger für Wirkstoffe und für die Generierung von dendritischen Polyanionen (Polysulfate, Polycarboxylate, Polysulfonate) geeignet sein.
Weiterhin wurden die Polyglycerole (PG) 1a (M_n = 2.500 g/mol, M_w/M_n = 1,6), 1b (M_n 5.000 g/mol, M_w/M_n = 1,6), 1c (M_n = 10.000 g/mol, M_w/M_n = 1,8) und 1d (M_n = 20.000 g/mol, M_w/M_n < 2,0), unter der Verwendung von 1,1,1-Tris(Hydroxymethyl)propan (TMP) als Initiator im Falle von 1a-c und Pentaerythrol (PE) als Initiator im Falle von 1d, wie zuvor beschrieben [14], präpariert.
2. Analyse
1H NMR und ¹³C NMR-Spetkren wurden in D₂O bei Konzentrationen von 100 mg/ml an einem Bruker ARX 300 Spektrometer, das bei 300 bzw. 75,4 MHz operiert, aufgezeichnet. IR-Messungen wurden an einem Bruker IFS 88 FT-IR-Spektrometer unter der Verwendung einer KBr-Scheibe durchgeführt. Der Grad der Sulfatierung (ds) (Tabelle 1) der Verbindungen 2a-d wurde mittels Elementaranalyse bestimmt.
3. Synthese der Polyglycerolsulfate
Die Synthese der Polyglycerol-Sulfate wurde mittels Modifikation einer etablierten Methode für die Sulfatierung von β-1,3-Glukanen, die von Alban et al. beschrieben wurde [18], unter der Verwendung der dendritischen Polyglycerole mit verschiedenen Molekulargewichten (1a-d) als Kern-Polymere und dem SO₃/Pyridin-Komplex als Sulfatierung-Reagenz in trockenem DMF als Lösungsmittel durchgeführt (siehe Schema 1). Die Konzentration des SO₃/Pyridin-Komplexes in DMF sowie sein molares Verhältnis (SO₃ pro OH-Gruppen) wurde in allen Fällen konstant gehalten.
Für ein Syntheseschema siehe 1.
Zu einer gerührten Lösung von 5,0 g Polyglycerol (1a, 1b, 1c, 1d) (67,5 mmol OH-Gruppen) in 25 ml DMF wurde tropfenweise eine Lösung von 10,75 g (67,5 mmol) SO₃/Pyridin-Komplex in 67,5 ml DMF über 4 Stunden bei 60°C unter einer Argon-Atmosphäre addiert. Nachdem die Reaktionsmischung für zusätzliche 2 Stunden bei 60°C und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurden 50 ml destilliertes Wasser addiert. Zu der wäßrigen Lösung wurden sofort 1 M NaOH addiert, bis ein pH-Wert von 11 erreicht wurde. Konzentration im Vakuum ergab das Rohprodukt, welches weiter durch Dialyse in Wasser gereinigt wurde. Nach der Evaporation des Lösungsmittels wurden die Polyglycerolsulfate 2a-d als hellgelbe Feststoffe erhalten, welche weiter über P₂O₂ getrocknet wurden.

Die Polyglycerol-Sulfate (2a-d) wurden in guten Ausbeuten (50-75%) und hohen Reinheiten (> 98% gemäß ¹H NMR) nach der Dialyse in destilliertem Wasser erhalten.
Ausbeuten: 7,49 g (2a); 8,96 g (2b); 7,01 g (2c); 6,86 g (2d).
¹H NMR (300 MHz, D₂O): δ (ppm) 0,98 [t, 3H, CH₃Unter der Verwendung einer SO₃/Pyridin-Konzentration equimolar zu den OH-Gruppen wurden ungefähr 85% aller freier OH-Gruppen sulfatiert (Tabelle 1). Dieser hohe Grad der Sulfatierung zeigt, daß Polyglycerole viel leichter der Sulfatierung zugänglich sind als Polysaccharide (24). Tabelle 1 Charakterisierung der dendritischen Polyglycerolsulfate 2a-c

Polyglycerol-	Polymer-	DP_n	M_n des	Grad der	M_n des
Derivat	Kern		Polymer-	Sulfatierung^b	Polyglycerol-
			Kerns^a	[%]	Derivats^c
			[g/mol]		[g/mol]
Sulfat 2a	1a	32	2.500	85	5.500
Sulfat 2b	1b	66	5.000	79	10.500
Sulfat 2c	1c	133	10.000	84	21.700
Sulfat 2d	1d	269	20.000	76	40.900

^a bestimmt aus NMR und/oder GPC (DMF).
^b Maß der Sulfatierung (ds) erhalten nach Elementaranalyse;
^c Berechnet unter der Verwendung von M_n des Polyclycerol-Kerns und des experimentellen Maßes der Funktionalisierung.
M_n = durchschnittliches Molekulargewicht des Polyglycerol-Kerns;
DP_n = Maß der Polymerisierung des Polyglycerolkerns;

Die detaillierte Analyse aller Ausgangsmaterialien 1a-d und Produkte 2a-d mittels NMR, IR und Elementaranalyse bestätigte die Struktur und den Grad der Funktionalisierung dieser dendritischen Polyglycerolsulfate. Die Molekulargewichte der nichtfunktionalisierten Polyglycerole wurden mittels ¹H NMR-Daten nach der Präzipitation berechnet.
Beispiel 2: Synthese der dendritischen Polyglycerolsulfonate
Materialien
Vinylsulfonsäure-Natriumsalz (25 Gew.-%ige Lösung in Wasser) wurde kommerziell bei der Firma Sigma-Aldrich erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Bei der Dialyse der synthetisierten Sulfonate in Wasser wurde ein Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose der Firma Roth (SpectraPor6) mit einem MWCO von 1000 g/mol verwendet.
1. Polymere Polyglycerol-Kerne
Siehe Beispiel 1.
2. Analytik
NMR-Spektroskopie: ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker ARX 300 Spektrometer bei 300 MHz bzw. 75.4 MHz in D₂O bei Konzentrationen von 100 mg/ml aufgenommen. Der Sulfonierungsgehalt wurde mittels Elementaranalyse bestimmt.
3. Synthese der Polyglycerolsulfonate
Für ein Syntheseschema siehe 2.
10g Polyglycerol 1b, 1d (2,0 mmol; ca. 135 mmol OH-Gruppen) wurden in 20 ml Wasser gelöst und mit einer Lösung von 757 mg (13,5 mmol) Kaliumhydroxid in 1 ml Wasser versetzt, so daß eine 10 %ige Deprotonierung der OH-Gruppen des Polyglycerols vorlag. Die Reaktionslösung wurde mit Hilfe eines Eisbades auf ca. 5°C abgekühlt. Anschließend wurde Vinylsulfonsäure-Natriumsalz (26,347 g; 202,5 mmol) in Form einer 25 Gew.-%igen, wäßrigen Lösung über 4 Stunden langsam über einen Tropftrichter zugetropft. Nach beendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch auf RT erwärmt und weitere 3 Tage gerührt. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde, wurde das erhaltene Rohprodukt zur weiteren Reinigung für 24 Std. in Wasser dialysiert, wobei das Wasser dreimal gewechselt wurde. Anschließend wurde das Rohprodukt im Vakuum eingeengt und zur Entfernung letzter Wasserreste im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Die synthetisierten Polyglycerin-Sulfate 3b, 3d wurden in Form einer schwach gelb gefärbten, hochviskosen Flüssigkeit mit einer Funktionalisierung von 3-10% erhalten.
Ausbeute: 3b 6,58 g, 3d: 5,48 g.
¹H-NMR (D₂O, 300 MHz): δ (ppm) = 0.88 [t, 3H, CH ₃CH₂C(CH₂O)₃-PG-CH₂CH₂SO₃Na], 1.42 [m, 2H, CH₃CH ₂C(CH₂O)₃-PG-CH₂CH₂SO₃Na], 3.21 [t, 2H, CH₃CH₂C(CH₂O)₃-PG-CH₂CH ₂SO₃Na] 3.35-4.05 [m, CH₃CH₂C(CH ₂O)₃-PG-CH ₂CH₂SO₃Na];
¹³C-NMR (D₂O, 75.4 MHz): δ (ppm) = 53.0 [PG-CH₂CH₂SO₃Na], 63.3, 65.1 [PG-CH₂CH₂SO₃Na], 68.2 [PG-CH₂CH₂SO₃Na], 71.4, 72.9, 74.7, 80.5, 82.0 [PG-CH₂CH₂SO₃Na].
Ergebnisse der Elementaranalyse: 3b: 0,58 % S, 3d: 1,30% S.
Mittels ¹H-NMR Spektroskopie konnte keine Degradation des Polyglycerol-Kerns beobachtet werden. Tabelle 2 Charakterisierung der dendritischen Polygylcerolsulfonate 3b und 3d

Polyglycerol- M_n M_n (theoret.) Grad der M_n (exp.)

sulfonat des PG-Kerns bei f = 100 % Sulfonierung [g/mol]

[g/mol] [g/mol] [%]

3b 5.000 13.900 4 5.200

3d 20.000 55.300 8 21.800

^b Maß der Sulfonierung erhalten nach Elementaranalyse;
M_n = durchschnittliches Molekulargewicht des Polyglycerol-Kerns;

Beispiel 3: Bindung der dendritischen Polyglycerolsulfate an Selektin
In einem kompetitiven Bindungstest wurden die Bindung der Polyglycerolsulfate an L-, P- und E-Seletin über Oberflächen-Plasmonresonanz im Biacore X analysiert. Bei diesem Ansatz werden die Selektine zunächst auf kolloidalen Goldbeads immobilisiert. Gemessen wird dann Bindung des Analyten an den auf dem Sensor-Chip gekoppelten Selektin-Liganden sLeX-Tyrosinsulfat. Bei Präinkubation des Analyten mit den Polyglycerolsulfaten wird bei einer spezifischen Wechselwirkung der Polyglycerolsulfate mit der Ligandenbindungsdomäne der Selektine die Bindung des Analyten an die Chip-gekoppelten Liganden konzentrationsabhängig vermindert. In diesem Fall beobachtet man eine Abnahme des Bindungssignals.
3 zeigt die konzentrationsabhängige Inhibition der L-Selektin-Ligand Bindung durch ausgewählte Polyglycerolsulfate. Mit zunehmendem Molekulargewicht zeigt sich bei vergleichbarem Sulfatierungsgrad ein steigendes inhibitorisches Potential der Polyglycerolsulfate. Wie aus 3 ersichtlich, läßt sich für die Substanz 2d ein IC₅₀ Wert von etwa 10 nM ablesen.
Zur weiteren Charakterisierung der Selektin-spezifischen Bindung wurden Inhibitionskurven von L-, P- und E-Selektin nach Präinkubation mit dem Polyglycerolderivat 2c aufgenommen (siehe 4). Dabei zeigt sich, daß L-Selektin von dem Derivat 2c am besten inhibiert wird (IC₅₀ = 10 nM), für P-Selektin weist die Substanz einen IC₅₀ von 30 nM auf, während E-Selektin nicht gehemmt wird.
Der Einfluß des Sulfatierungsgrades der dendritischen Polyglycerole auf die L-Selektin-Bindung wurde am Beispiel des Derivates 2d (M_n des PG-Kerns = 20.000 [g/mol]) untersucht. Eingesetzt wurde das Derivat 2d in einer Konzentration von 10 nM und den Sulfatierungsgraden 10 %, 38 % und 76 %. Gemessen wurde wiederum der Einfluß der Polyglycerolsulfate auf die Interaktion zwischen dem Analyten L-Sektin und dem immobilisierten Liganden sLeX-Tyrosinsulfat (kompetitiver Bindungsassay, siehe oben). Der Kontrollwert wurde auf 100 % gesetzt, dieser entspricht dem Bindungssignal, daß durch die Interaktion zwischen L-Selektin und dem Chip-gekoppelten Liganden sLeX-Tyrosin generiert wird. Wird der Analyt L-Selektin mit 10 nM der unterschiedlich sulfatierten Polyglycerolderivate präinkubiert, ergibt sich bei zunehmendem Sulfatierungsgrad eine Reduktion des L-Selektin-Bindungsignals, das in 5 prozentual zum Kontrollwert dargestellt ist. Die 10 %-ige Sulfatierung von 2d scheint offensichtlich nicht auszureichen, um während der Präinkubationsphase mit L-Selektin zu Wechselwirken, das Bindungssignal entspricht dem Kontrollwert. Die 38 %-ige Sulfatierung von 2d reduziert die L-Selektin-Ligandbindung auf etwa 60 % des Bindungssignals der Kontrolle und die 76 %-ige Sulfatierung von 2d auf etwa 45 % des Kontrollwertes. Diese Messungen zeigen, daß Sulfatierungsgrad und Bindungsaffinität positiv korrelieren. Weiterhin scheint ein bestimmter Schwellenwert an Sulfatierung notwenig zu sein, damit es zur Wechselwirkung mit L-Selektin kommt.
Referenzen

1. Ley, K. (2003) The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol Med., 9(6): 263 8.
2. Springer, T.A. (1990) Adhesion receptors of the immune system. Nature, 346: 425-434.
3. Lefer, D.F. (2000) Annu Rev. Pharmacol. Toxicol., 40: 283-294.
4. Boehncke, WH et al. (2005) Exp. Dermatol., 14(1): 70-80.
5. Simanek et al., (1998) Selectin-carbohydrate interactions: From natural ligands to designed mimics. Chem. Rev., 98(2): 833-862.
6. Boehncke WH et al., (2006) Biologic therapies for psoriasis. A systematic review. J. Rheumatol., 33: 1447-1451.
7. Willburger et al., (2006) Zertifizierte medizinische Fortbildung: Pharmakologische Therapie der rheumatoiden Arthritis. Dtsch Arztebl; 103(1-2): A 48-57
8. Ulbrich H., et al. (2003) Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease. Trends Pharmacol ScL, 12: 640-647.
9. Mowery, P et al. (2004) Synthetic glycoprotein mimics inhibit L-selectin-mediated rolling and promote L-selectin shedding. Chem. Biol. 11: 752-732.
10. Rele, SM et al. (2005) Dendrimer-like PEO glycopolymers exhibit anti-inflammatory properties. J. Am. Chem. Soc., 127: 10132-10133.
11. Türk, H.; Haag, R. and Alban, S. (2004) Dendritic Polygylcerol Sulfates as New Heparin Analogues and Potent Inhibitors of the Complement System. Bioconjugate Chem. 15: 162-167.
12. Sunder, A., Mülhaupt, R., Haag, R., and Frey, H. (2000) Hyperbranched Polyether Polyols: A Modular Approach to Complex Polymer Architectures. Adv. Mater. 12,: 235-239.
13. Frey, H., and Haag, R. (2002) Dendritic polyglycerol: a new versatile biocompatible material. Rev. Mol. Biotech. 90: 257-267.
14. Sunder, A., Hanselmann, R., Frey, H., and Mülhaupt, R. (1999) Controlled Synthesis of Hyperbranched Polyglycerols by Ring-Opening Multibranching Polymerization. Marcromolecules 32: 4240-4246.
15. Haag, R., Sunder, A., and Stumbé, J.-F. (2000) An Approach to Glycerol Dendrimers and Pseudo-Dendritic Polyglycerols. J. Am. Chem. Soc. 122, 2954-2955.
16. Wilson, R., Van Schie, B.J., and Howes, D. (1998) Overview of the Preparation, Use and Biological Studies on Polyglycerol Polyricinoleate (PGPR). Food Chem. Toxicol. 36: 711-718.
17. Howes, D., Wilson, R., and James, C.T. (1998) The Fate of Ingested Glyceran Esters of Condensed Castor Oil Fatty Acids [Polyglycerol, Polyricinoleate (PGPR)] in Rat. Food Chem. Toxicol. 36: 719-738.
18. Alban, S., Kraus, J., und Franz, G. (1992) Synthesis of Laminarin Sulfates with Anticoagulant Activity. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 42:1005-1008.

Claims

Dendritisches Polyglycerolsulfonat, gekennzeichnet durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO–CH₂)₂CH–OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -SO₃H oder -SO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfonierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und c) ein Molekulargewicht von 110 bis 1.500.000 g/mol.
Verbindung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der auf einem multifunktionellen Startermolekül, das 1 bis 4 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der auf einem multifunktionellen Startermolekül aufgebaut ist, das weitere Heterofunktionalitäten enthält, insbesondere SH-Gruppen, NH₂-Gruppen.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der eine Verzweigung von 60 % aufweist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der ein durchschnittliches Molekulargewicht von 1.000 bis 20.000 g/mol aufweist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch b) einen Grad der Sulfonierung von 30 %.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch b) einen Grad der Sulfonierung von 30 % bis 100 %.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch c) ein Molekulargewicht von 1.100 bis 30.000 g/mol.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, die mit signalgebenden Molekülen beladen sind oder signalgebende Moleküle gebunden haben.
Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei die signalgebenden Molekülen aus der Gruppe radioaktiv-markierter Derivate oder der Gruppe der Farbstoffe, insbesondere Fluorophore und Chromophore, ausgewählt sind.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, die an eine Matrix immobilisiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 11, wobei die Matrix anorganischer oder polymerer Natur sein kann.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend die Verwendung eines multifunktionellen Startermoleküls und eines Sulfonierungsreagenz.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 als Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 als Arzneimittel zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei den entzündlichen Erkrankungen um chronisch entzündliche Erkrankungen, insbesondere rheumatoide Arthritis, Asthma und Psoriasis handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei den entzündlichen Erkrankungen um Ischämie-Reperfusionsschäden oder Transplantatabstoßung handelt.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 als Selektininhibitor.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 als Selektinindikator.
Verwendung gemäß Anspruch 18 oder 19 als Inhibitor oder Indikator von L-Selektin und/oder P-Selektin.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Bindung von Proteinen.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei es sich bei den Proteinen um Selektine, Chemokine oder Gerinnungsfaktoren handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Chemokine ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus proinflammatorischen Cytokinen, insbesondere TNFα, IL-1, IL-6, sowie aus IL-8 und MIP-1β.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23 zur Reinigung von Proteinen aus biologischen Proben, insbesondere Körperflüssigkeiten, Vollblut, Serum, Zellsuspensionen und Überständen von Zellkulturen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24 als Fängermolekül.
Verwendung eines dendritischen Polyglycerolsulfats, das gekennzeichnet ist durch: a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol aufweist, b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfatierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und c) ein Molekulargewicht von 200 bis 5.000.000 g/mol, als Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen.
Verwendung eines dendritischen Polyglycerolsulfats, das gekennzeichnet ist durch: a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol aufweist, b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfatierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und c) ein Molekulargewicht von 200 bis 5.000.000 g/mol, als Arzneimittel zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei es sich bei den entzündlichen Erkrankungen um chronisch entzündliche Erkrankungen, insbesondere rheumatoide Arthritis, Asthma und Psoriasis handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei es sich bei den entzündlichen Erkrankungen um Ischämie-Reperfusionsschäden oder Transplantatabstoßung handelt.
Verwendung eines dendritischen Polyglycerolsulfats, das gekennzeichnet ist durch: a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol aufweist, b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfatierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und c) ein Molekulargewicht von 200 bis 5.000.000 g/mol, als Selektininhibitor.
Verwendung eines dendritischen Polyglycerolsulfats, das gekennzeichnet ist durch: a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol aufweist, b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfatierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und c) ein Molekulargewicht von 200 bis 5.000.000 g/mol, als Selektinindikator.
Verwendung gemäß Anspruch 30 oder 31 als Inhibitor oder Indikator von L-Selektin und/oder P-Selektin.
Verwendung eines dendritischen Polyglycerolsulfats, das gekennzeichnet ist durch: a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH₂)₂CH-OR, wobei R = H oder weitere Glycerin-Einheiten sind, auf einem multifunktionellen Startermolekül, das eine Polyhydroxyverbindung ist und 1 bis 1.000 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist, und der eine Verzweigung von 0 bis 100 % und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol aufweist, b) den Ersatz von einer oder von mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen oder Bindung eines oligomeren Spacers an einer oder an mehreren OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten, wobei der oligomere Spacer die allgemeine Formel -(CH₂)_n- oder -[(CH₂)_m-O)]_n- hat, wobei m 1 bis 100 und n 1 bis 50.000 ist, und daran -OSO₃H oder -OSO₃Na-Gruppen gebunden sind, so daß ein Grad der Sulfatierung von 1 bis 100 % erhalten wird, und c) ein Molekulargewicht von 200 bis 5.000.000 g/mol, zur Bindung von Proteinen.
Verwendung gemäß Anspruch 33, wobei es sich bei den Proteinen um Selektine, Chemokine oder Gerinnungsfaktoren handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 34, wobei die Chemokine ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus proinflammatorischen Cytokinen, insbesondere TNFα, IL-1, IL-6, sowie aus IL-8 und MIP-1β.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 34 und 35 zur Reinigung von Proteinen aus biologischen Proben, insbesondere Körperflüssigkeiten, Vollblut, Serum, Zellsuspensionen und Überständen von Zellkulturen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36 als Fängermolekül.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 37, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate gekennzeichnet sind durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der auf einem multifunktionellen Startermolekül, das 1 bis 4 OH-Gruppen hat, aufgebaut ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 38, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate gekennzeichnet sind durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der auf einem multifunktionellen Startermolekül aufgebaut ist, das weitere Heterofunktionalitäten enthält, insbesondere SH-Gruppen, NH₂-Gruppen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 39, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate gekennzeichnet sind durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der eine Verzweigung von 60 % aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 40, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate gekennzeichnet sind durch a) einen polymeren Polyglycerol-Kern, der ein durchschnittliches Molekulargewicht von 1.000 bis 20.000 g/mol aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 41, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate gekennzeichnet sind durch c) ein Molekulargewicht von 2.000 bis 50.000 g/mol.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 42, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate mit signalgebenden Molekülen beladen sind oder signalgebende Moleküle gebunden haben.
Verwendung gemäß Anspruch 43, wobei die signalgebenden Molekülen aus der Gruppe radioaktiv-markierter Derivate oder der Gruppe der Farbstoffe, insbesondere Fluorophore und Chromophore, ausgewählt sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 30 bis 44, wobei die dendritischen Polyglycerolsulfate an eine Matrix immobilisiert sind.
Verwendung gemäß Anspruch 45, wobei die Matrix anorganischer oder polymerer Natur sein kann.