DE68910577T2 - Mittel gegen den AIDS-Virus. - Google Patents
Mittel gegen den AIDS-Virus.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Sulfats eines Polysaccharids zur Herstellung eines Mittels gegen das AIDS-Virus.
- AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) ist eine infektiöse Viruserkrankung, die durch HIV (human immunodeficiency Virus) ausgelöst wird. Wenn sie mit dem AIDS- Virus infiziert sind, so werden hauptsächlich T-Helfer- Zellen zerstört. Weiterhin treten bei den gesamten T-Zellen Anomalien auf oder es kommt zu Anomalien bei B-Zellen, was zur Immunschwäche führt. In der Folge treten opportunistische Infektionen, maligne Tumoren wie z.B. das Kaposi- Sarkom oder Zerebrallymphom, Störungen des Zentralnervensystems oder von Organen auf, und es handelt sich um eine gefährliche Krankheit, die zum Tod führen kann.
- Bisher gibt es noch kein Mittel, das imstande ist, AIDS vollständig zu heilen. Es ist bekannt, daß Substanzen wie Azidothymidin (AZT), Dideoxycytidin, Dideoxyadenosin, Suramin, Ribavirin, Antimonwolframat (HPA-23) und Interferon anti-AIDS-Wirkung zeigen. Unter diesen besitzt AZT Wirksamkeit zur Hemmung der Reverstranskriptase des AIDS- Virus, und dessen Verwendung ist in den U.S.A. wegen der nachgewiesenen Wirkung am AIDS-Patienten zugelassen.
- Nucleosid-verwandte Substanzen einschließlich AZT haben jedoch Nebenwirkungen und können zu Erkrankungen des Knochenmarks, makrocytischer Anämie, gastrointestinalen Störungen oder Läsionen führen. Bei Suramin, Ribavirin und HPA-23 konnte keine praktische Anwendbarkeit bestätigt werden.
- Vor kurzem wurde gefunden, daß aus Floridephyceae erhaltener Polysaccharid-Seealgenextrakt (SAE) Inhibitionswirkung auf die Reverstranskriptase des AIDS-Virus aufweist. Weiterhin besitzen aus natürlichen Substanzen wie λ-, κ- oder -Caragenan, Heparin oder Chondroitinsulfat abgeleitete Polysaccharidsulfate ähnliche physiologische Wirkung. Andererseits wird die Wirksamkeit von Sulfaten verschiedener Polysaccharide gegen das AIDS-Virus untersucht, und es wurde gefunden, daß Dextransulfat, Xylofuranansulfat und Ribofuranansulfat, die Sulfate von Polysacchariden ohne anti-AIDS-Virus-Wirksamkeit wie Dextran, Xylofuran und Ribofuranan sind, anti-AIDS-Virus-Aktivität zeigen (siehe JPN. J. CANCER RES. Bd. 78, Seiten 1164 - 68 (1978)). Ein Verfahren, einer Substanz ohne solche Wirksamkeit durch Sulfatierung anti-AIDS-Virus-Eigenschaften zu verleihen, wird als eine Technik zur Entwicklung eines Mittels gegen das AIDS-Virus bereits verwendet (siehe EP-A-240 098).
- Bei der Entwicklung von solchen Polysaccharidsulfaten als Mittel gegen das AIDS-Virus treten folgende Schwierigkeiten auf:
- (1) Es ist normalerweise schwierig, ein Polysaccharid zu reinigen, und es bedarf eines hohen Maßes an Technik, um gleichzeitig entstehende Saccharide, Proteine oder pyrogene Substanzen zu entfernen.
- (2) Die Wirksamkeit gegen das AIDS-Virus verändert sich in Abhängigkeit von Struktur und Molekulargewicht des Polysaccharids und dem Gehalt an Sulfatgruppen.
- (3) Wenn diese Substanzen dem lebenden Körper verabreicht werden, so können sie leicht durch ein körpereigenes Enzym abgebaut werden.
- Es besteht das Bedürfnis, diese Probleme zu lösen.
- Als Ergebnis aufwendiger Forschungsarbeiten zur physiologischen Wirkung von Polysaccharidsulfat haben die Erfinder herausgefunden, daß die Intensität der sogenannten mitogenen Aktivitäten, die nichtspezifische Blastogenese hervorbringen, von der Struktur des Polysaccharidsulfats abhängt.
- Wenn nämlich die mitogenen Aktivitäten von einem Sulfat eines Heteropolysaccharids, das aus unterschiedlichen Typen von Monosacchariden aufgebaut ist, mit denen eines Homopolysaccharids verglichen werden, das aus einem einzigen Monosaccharid aufgebaut ist, so zeigt das letztere Homopolysaccharidsulfat stärkere mitogene Aktivitäten als das erstere Heteropolysaccharidsulfat. Als Ergebnis einer weiteren Untersuchung zur anti-AIDS-Virus-Wirkung wurde gefunden, daß das Homopolysaccharidsulfat stärkere anti-AIDS-Virus-Aktivität als das Heteropolysaccharidsulfat aufweist (The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd.58, Nr.3, Seiten 147-153 (1988)).
- Auf der Grundlage dieser Entdeckungen haben die Erfinder einige Homopolysaccharide sulfatiert und ihre Wirksamkeit gegen das AIDS-Virus verglichen, wobei gefunden wurde, daß Dextransulfat stärkere Wirkung als die Sulfate von z.B. Mannan, Pullulan und Alginsäure zeigt. Die Erfinder haben weitere Experimente zur Wirksamkeit von anderen Homopolysaccharidsulfaten gegen das AIDS-Virus durchgeführt und gefunden, daß Sulfate von aus wiederholten Einheiten der Formel (1) aufgebauten Polysacchariden stärkere Wirksamkeit gegen das AIDS-Virus als selbst Dextransulfat aufweisen. Sie haben weiterhin Tests zum Einfluß des Molekulargewichts und des Sulfatgehalts des Polysaccharids mit der wiederholten Einheit von (1) auf die Wirksamkeit gegen das AIDS-Virus durchgeführt und so die vorliegende Erfindung erarbeitet.
- Die vorliegende Erfindung verwendet ein Sulfat eines Polysaccharids mit wiederholten Einheiten der Formel:
- und einem Molekulargewicht von höchstens 1 000 000 (n≤1544).
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des sulfatierten Polysaccharids von Schizophyllan, Skleroglukan oder Pendulan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10 000 bis höchstens 1 000 000 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des AIDS-Virus in Säugetieren.
- In den anliegenden Abbildungen bedeutet:
- Fig. 1 das Infrarot-Absorptionsspektrum des Polysaccharids.
- Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum des Sulfids des Polysaccharids.
- Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen im Detail beschrieben.
- Als Polysaccharid wird Schizophyllan von Schizophyllum commune Fries, Skleroglukan von Sclerotium glucanicum und Pendulan von Porodisculus nendulus hergestellt. Da diese Homopolysaccharide durch Kultivierung der entsprechenden Stämme extrazellulär hergestellt werden können, sind Abtrennung und Reinigung der Polysaccharide leicht.
- Die durch solche Kulturformen erhaltenen Polysaccharide bilden eine extrem viskose und thixotrope wäßrige Lösung, und deren Reinigung ist normalerweise schwierig. Um diese Polysaccharide in einem so hohen Maße zu reinigen, daß sie erfindungsgemäß als Arzneimittel verwendet werden können, ist es ratsam, das Molekulargewicht durch Depolymerisation des Polysaccharids zu erniedrigen. Diese Depolymerisation kann vorzugsweise durch Bestrahlung der wäßrigen Lösung des Polysaccharids mit Ultraschallwellen oder durch Behandlung der wäßrigen Lösung mit hohen Scherkräften durchgeführt werden. Durch diese Depolymerisation werden nur die aus β- 1,3-Glukosidbindungen des Polysaccharids aufgebauten Hauptketten selektiv gespalten, und die aus β-1,6-Glukosidbindungen aufgebauten Seitenketten bleiben im wesentlichen erhalten.
- Auf diese Weise bleibt die Grundstruktur des Polysaccharids auch nach der Depolymerisation unverändert erhalten.
- Zur Reinigung des Polysaccharids bis zu einem Grad, daß es zur Produktion von Arzeimitteln eingesetzt werden kann, wird das Molekulargewicht des Polysaccharids vorzugsweise auf einen Wert von höchstens 10&supmin;&sup6; (n in der Formel (1) beträgt höchstens 1544), vorzugsweise 5 x 10&sup5; (n in der Formel (1) beträgt höchstens 772) abgesenkt. Wenn das Molekulargewicht des Polysaccharids diese obengenannte Grenze überschreitet, so wird es schwierig, eine Reinigungsoperation wie z.B. Filtration, Ionenaustausch oder Aktivkohlebehandlung durchzuführen, da die wäßrige Lösung eine hohe Viskosität aufweist.
- Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polysaccharid enthält eine β-1,3-gebundene Hauptkette. Deshalb wird es im Gegensatz zu Polysacchariden mit α-Glukosidbindungen wie z.B. Stärke oder Dextran auch kaum durch ein Enzym im lebenden Körper abgebaut und weist auch nur eine sehr geringe Toxizität auf.
- Wenn das Polysaccharid sulfatiert wird, so kann die Sulfatierung mittels jedes bekannten Verfahrens durchgeführt werden. So ist es zum Beispiel möglich, ein Verfahren durchzuführen, bei dem Schwefelsäure verwendet wird, oder ein Verfahren, in dem Chlorsulfonsäure verwendet wird, oder ein Verfahren, in dem Schwefeltrioxid eingesetzt wird. Unter diesen Verfahren sind das Chlorsulfonsäureverfahren und das Schwefeltrioxidverfahren in Kombination mit einer Lewis-Base besonders zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polysaccharidsulfats geeignet, weil die Zersetzung des Polysaccharids dabei geringer als bei dem Verfahren unter Verwendung von Schwefelsäure ist. Als Lewis-Base können Pyridin, Triethylamin, Trimethylamin, Dioxan oder Bis(2- chlorethyl)ether verwendet werden. Weiterhin ist es in einem vereinfachten Verfahren möglich, eine Sulfatierungsmethode zu verwenden, bei der ein Pyridin/Schwefelsäureanhydridkomplex mit dem Polysaccharid in Pyridin oder Dimethylsulfoxid umgesetzt wird.
- Das hergestellte Polysaccharidsulfat wird gewöhnlich in Form eines geeigneten Salzes zur Verhinderung der Hydrolyse aufbewahrt. Als dieses Salz ist zum Beispiel ein Ammoniumsalz oder ein Alkalimetallsalz wie ein Natriumsalz gängig. Es kann jedoch auch ein Erdalkalimetallsalz, ein Metallsalz wie z.B. ein Eisensalz oder ein Salz mit einem tertiären Amin eingesetzt werden.
- Das Polysaccharid und dessen Sulfat besitzen die folgenden Infrarotabsorptionsspektren.
- Der Streckschwingung von O-H zuordenbare Absorption bei ungefähr 3 400 cm&supmin;¹, asymmetrische Streckschwingung von C- O-C bei ungefähr 1 250 cm&supmin;¹, Streckschwingung von C-O bei ungefähr 1 050 cm&supmin;¹ und für β-Glukoside charakteristische Absorption bei ungefähr 890 cm&supmin;¹.
- Der symmetrischen Schwingung von SO&sub2; zuordenbare Absorption bei ungefähr 1 240 cm&supmin;¹ und Streckschwingung von C-O-S bei ungefähr 810 cm&supmin;¹.
- Die Erfinder haben die Abhängigkeit von mitogener oder anti-AIDS-Wirkung von dem durchschnittlichen Molekulargewicht des als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Polysaccharidsulfats verwendeten Polysaccharids oder dem Schwefelgehalt nach der Sulfatierung und der mitogenen Wirkung oder der anti-AIDS-Virus-Wirkung untersucht. Im Ergebnis wurde gefunden, daß diese physiologischen Wirkungen stärker vom Schwefelgehalt nach der Sulfatierung als vom durchschnittlichen Molekulargewicht des Polysaccharids abhängen.
- Deutliche mitogene Wirkungen sind wahrnehmbar bei einem Schwefelgehalt des Polysaccharidsulfats in einem Bereich von 2 bis 17 Gew.-%, und die Wirksamkeit gegen das AIDS- Virus wird bei einem Schwefelgehalt im Bereich von 3 bis 17 Gew.-% erreicht. Wenn der Schwefelgehalt weniger als 3 Gew.-% beträgt, so wird die Wirksamkeit gegen das AIDS- Virus niedrig. Bei Zelltoxizitätstests an Schizophyllansulfat mit einem Schwefelgehalt von 17 Gew.-% wurde bis hinauf zu einer Konzentration von 2 000 ug/ml keine Zelltoxizität beobachtet. Wenn jedoch der Schwefelgehalt höher als auf diesem Niveau liegt, erscheint das Produkt als Arzneimittel ungeeignet.
- Die Wirksamkeit des Polysaccharids gegen das AIDS-Virus besitzt nur geringe Abhängigkeit vom Molekulargewicht des Polysaccharids. So liegt das Molekulargewicht des erfindungsgemäß zu verwendenden Polysaccharids auf einem beliebigen Niveau in dem für eine entsprechende Reinigung geeigneten Bereich und liegt üblicherweise bei höchstens 10&sup6; (n in der Formel (1) beträgt dann höchstens 1 544), vorzugsweise bei höchstens 5 x 10&sup5; (n in der Formel (1) beträgt dann höchstens 772).
- Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die Beispiele in weiteren Details erläutert. Die vorliegende Erfindung ist jedoch keineswegs auf diese speziellen Beispiele beschränkt.
- Ein Sulfat des Polysaccharids wurde mit unterschiedlichen Verfahren hergestellt, und dessen mitogene Wirkung sowie die Wirksamkeit gegen das AIDS-Virus wurden untersucht.
- 0.5 g oder 1 g Schizophyllan wurde in 100 ml Pyridin bei 45ºC 5 Minuten lang suspendiert. Dann wurde ein Pyridin/Schwefelsäureanhydridkomplex (von 2 bis 6 g) dazugegeben. Die Mischung wurde zur Sulfatierung bei einer Temperatur von 60 bis 70ºC unter Rühren umgesetzt.
- Nach der Reaktion wurde der Niederschlag in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und freie Schwefelsäure wurde nach Umwandlung in Bariumsulfat durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde unter reduziertem Druck konzentriert, und ein Überschuß Ethanol unter Erhalt eines Sulfatniederschlages zugegeben. Der Niederschlag wurde in Wasser zur Ionenaustauscherbehandlung aufgelöst und dann mit NaOH neutralisiert. Nach Konzentrierung wurde Ethanol unter Erhalt eines Niederschlags zugegeben. Dieser Niederschlag wurde durch Zentrifugentrennung gesammelt, dann in einer kleinen Wassermenge gelöst und unter Erhalt von Schizophyllansulfat (1) bis (3) und (7) bis (10) gefriergetrocknet.
- 1 g Schizophyllan wurde in 100 ml Dimethylsulfoxid aufgelöst und 3 g, 6 g oder 9 g eines Pyridin/Schwefelsäureanhydridkomplexes wurden dazu gegeben. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang zur Sulfatierung umgesetzt.
- Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit Eiswasser abgekühlt. Nach Entfernen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag unter Zugabe von 50 ml kalten Wassers aufgelöst. Die Lösung wurde durch Zugabe einer gesättigten wäßrigen Bariumhydroxidlösung neutralisiert. Nach dem Entfernen des Niederschlags durch Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit einer Dialyse unterzogen. Das Nicht-Dialysat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Es wurde ein Überschuß Aceton dazugegeben, anschließend wurde zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wurde in 50 ml Wasser zur Ionenaustauscherbehandlung gelöst, durch Zugabe von 1N NaOH neutralisiert und unter Erhalt von Schizophyllansulfat (4) bis (6) gefriergetrocknet.
- 25 ml Pyridin wurden in einen Rundkolben gegeben und auf -10ºC gekühlt, dazu wurden 5 ml Chlorsulfonsäure portionsweise unter Rühren bei -10ºC zugegeben. Diese Mischung wurde 15 bis 20 Minuten lang umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde bei einer Temperatur von 60 bis 70ºC aufgelöst. Dann wurde 1 g Schizophyllan zugegeben und die Mischung zur Sulfatierung ein bis zwei Stunden heftig gerührt.
- Nach der Umsetzung wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt, der Niederschlag in 100 ml kaltem Wasser aufgelöst und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat neutralisiert. Dazu wurde ein Überschuß Aceton unter Bildung eines Sulfatniederschlags zugegeben. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren zurückgewonnen, unter Zugabe von Wasser gelöst und einer Ionenaustauscherbehandlung unterzogen. Dann wurde der pH der Lösung mit Natriumcarbonat auf 9 bis 10 eingestellt. Ein Überschuß Aceton wurde dazu unter Erhalt eines Niederschlags zugegeben, der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt, in einer kleinen Menge Wasser gelöst und unter Erhalt des Polysaccharidsulfats (11) und (12) gefriergetrocknet.
- Die in den obengenannten Verfahren erhältlichen Schizophyllansulfate werden in der Tabelle 1 zusammengefaßt.
- In den folgenden Tabellen werden Abkürzungen mit den folgenden Bedeutungen verwendet:
- FCS : "Serum vom Rinderfötus"
- PHA : "Phytohämaglutinin-P
- PBS : "Phosphatgepufferte Salzlösung"
- Con A : "Concanavalin A" Tabelle 1 Zur Umsetzung verwendetes Polysaccharid Ausbeute dessen Sulfats (g) Schwefelgehalt (Gew.-%) Probe Nr. Durchschnittliches Molekulargewicht Gewicht (g)
- Die Milz einer Maus wurde aseptisch herausgenommen und in einem Kulturmedium unter Erhalt einer 3 x 10&sup6; Zellen/ml enthaltenden Zellsuspension dispergiert. Die Zellen wurden so in die Vertiefungen einer 96-Loch-Mikroplatte verteilt, daß die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung 3 x 10&sup5; betrug. Ein Kulturmedium und eine Probe wurden in jede Vertiefung gegeben und 3 Tage kultiviert. Am dritten Tag wurden in jede Vertiefung 0.5 uCi ³H-Thyinidin gegeben und die Kultivierung weitere 7 Stunden fortgesetzt. Dann wurden die Zellen gesammelt und sorgfältig gewaschen und die von den Zellen aufgenommene Menge ³H-Thymidin mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt.
- Schizophyllansulfate zeigten hohe mitogene Wirksamkeit, wie sie im Falle des Schizophyllans nicht zu beobachten war. Tabelle 2: Mitogene Wirkung von Schizophyllansulfaten Zählrate (CPM) Probe Nr. Durchschnittliches Molekulargewicht des Schizophyllans Schwefelgehalt im Schizophyllansulfat (Gew.-%) Kontrolle Keine Verbindung zugegeben 2697±1242 Schizophyllan 1981±184 Con A zugegeben 52659±6316
- Aus Tall-1/HTLV-III erhaltene Viren wurden an Molt- 4/cl. Nr. 8-Zellen adsorbiert. Dann wurden diese Zellen mit einem Kulturmedium zur Entfernung von nicht adsorbierten Viren gewaschen. Die so erhaltenen Zellen wurden den folgenden Tests unterzogen.
- In jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 24 Vertiefungen wurden 1 ml einer Zellsuspension mit 3.5 x 10&sup4; Zellen/ml, 1 ml eines Kulturmediums und eine in PBS gelöste Probe so zugegeben, daß die Endkonzentration der Probe 100 ug/ml betragen würde. Es wurde 8 Tage kultiviert und die zytopathische Wirkung (CPE) des Virus beobachtet. Am achten Tag wurde weiterhin die überstehende Flüssigkeit des Kulturmediums beprobt und einer Messung der Reverstranskriptase-Aktivität unterzogen. Die Zellen wurden zur Bestimmung des Virus-Antigens einem indirekten Immunofluoreszenzassay unterzogen.
- Die bei der Bestimmung der Reverstranskriptaseaktivität erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Wirkung von Schizophyllansulfaten gegen das AIDS-Virus (Molt-4/cl. Nr. 8-Zellen) Probenkonzentration für Reverstranskriptaseaktivität (CPM) Probe Nr. Durchschnittliches Molekulargewicht des Schizophyllans Schwefelgehalt im Schizophyllansulfat (Gew.-%) Kontrolle: Keine Verbindung Virus (-) zugegeben Virus (+) Dextransulfat (Schwefelgehalt: 13 %) Prbenkonzentration
- Wie in Tabelle 3 gezeigt, besitzen Schizophyllansulfate starke Wirkung gegen das AIDS-Virus, indem sie die Verbreitung des AIDS-Virus deutlich unterdrücken.
- Diese Schizophyllansulfate unterdrückten die Bildung von Riesenzellen vollständig, die anderenfalls wahrscheinlich durch zytopathische Effekte des AIDS-Virus verursacht worden wäre. Weiterhin wurde auch mit indirektem Immunofluoreszenzassay bei den mit diesen Schizophyllansulfaten zusammen kultivierten Zellen kein Virus-Antigen beobachtet.
- Weiterhin wurde die Wirkung von Schizophyllansulfaten gegen das AIDS-Virus mittels MT-4-Zellen untersucht.
- Die Zellen wurden auf gleiche Weise wie in Beispiel 1(3) präpariert, und es wurde in jede Vertiefung 1 ml einer 14 x 10&sup4; Zellen/ml enthaltenden Zellsuspension, 1 ml eines Kulturmediums und eine Probelösung gegeben und 10 Tage kultiviert.
- Die Wirkung der Schizophyllansulfate gegen das AIDS- Virus wurde durch Beobachtung des zytopathischen Effekts, durch Messung der Aktivität der Reverstranskriptase und durch indirektes Immunofluoreszenzassay studiert.
- Die Ergebnisse der Messung der Reverstranskriptase- Aktivität werden in Tabelle 4 gezeigt.
- Wie in Tabelle 4 gezeigt, zeigen Schizophyllansulfate auch in einer für das AIDS-Virus hochempfindlichen Zell- Linie wie der MT-4-Zelle starke Wirkung gegen das AIDS- Virus.
- Diese Proben (3), (10), (11) und (12) unterdrücken gleichfalls die Bildung von Riesenzellen aufgrund zytopathischer Effekte. In den zusammen mit diesen Sulfaten kultivierten Zellen wurde auch mit indirektem Immunofluoreszenzassay kein oder nur wenig Antigen gefunden. Tabelle 4: Wirkung der Schizophyllansulfate gegen das AIDS- Virus (MT-4 Zellen) Probenkonzentration für Reverstranskriptaseaktivität (CPM) Probe Nr. Durchschnittliches Molekulargewicht des Schizophyllans Schwefelgehalt im Schizophyllansulfat (Gew.-%) Kontrolle: Keine Verbindung zugegeben Virus (-) Virus (+) Dextransulfat (Schwefelgehalt: 13.0 %)
- In den vorhergehenden Beispielen wurde die Wirkung der Schizophyllansulfate gegen das AIDS-Virus in einer Subkultur-Zellinie untersucht. In diesem Beispiel wird ein Test zur Wirkung von Schizophyllansulfaten beim Unterdrücken der Verbreitung des AIDS-Virus im peripheren menschlichen Lymphozytensystem durchgeführt.
- Aus dem peripheren Blut eines AIDS-Patienten wurden mittels der Ficoll-Paque-Separation Lymphozyten abgetrennt, dreimal mit einem serumfreien Kulturmedium gewaschen und in einem 10 % FCS enthaltendem Kulturmedium suspendiert. Adsorbierbare Zellen wurden entfernt, suspendierte Zellen wurden gesammelt und in einem Kulturmedium suspendiert. Dann wurde PHA und IL-2 dazugegeben. Gesunde menschliche Lymphozyten waren drei Tage vorher mit dem obengenannten Verfahren hergestellt worden. In jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 24 Vertiefungen wurden 10&sup6;/1 ml der Lymphozyten des Patienten, ein Kulturmedium, 10&sup6;/1 ml gesunder menschlicher Lymphozyten und eine Schizophyllansulfatlösung gegeben, gemischt und kultiviert. Am siebten und elften Tag nach dem Beginn der Kultivierung wurde die überstehende Flüssigkeit gesammelt und einer Messung der Reverstranskriptase-Aktivität unterzogen. In jede Vertiefung wurde eine Probe überstehender Flüssigkeit und die gleiche Menge eines Kulturmediums gegeben und die Kultivierung fortgesetzt.
- Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5: Wirkung der Schizophyllansulfate gegen das AIDS- Virus im menschlichen peripheren Blut-Lymphozytensystem Reverstranskriptase-Aktivität (CPM) Fall Konzentration (ug/ml) Probe (9) Kontrolle (keine Zugabe) Dextransulfat (Schwefelg.: 13.0%)
- Wie man der vorstehenden Tabelle entnehmen kann, wird die Wirksamkeit von Schizophyllansulfat gegen das AIDS- Virus auch bei menschlichen peripheren Lymphozyten bestätigt.
- Schizophyllan ist ein Polysaccharid mit Antitumorwirkung. Diese Wirkung kann auch nach der Sulfatierung erhalten bleiben und so ein Merkmal bedeuten, das bei anderen Mitteln gegen das AIDS-Virus nicht zu finden ist.
- 2 x 10&sup6; Sarkom-180-Zellen wurden subkutan in die Leisten von Mäusen transplantiert. 24 Stunden später wurden 0.05 ml einer 0.5%igen PBS-Lösung von Schizophyllan in einen rückwärtigen Schenkelmuskel verabreicht. Nach 30 Tagen wurden die Mäuse getötet und seziert, und die Tumoren wurden herausgenommen und gewogen. Die Tumorunterdrückungsrate wurde mittels der folgenden Gleichung errechnet. Tumorunterdrückungsrate (%)
- worin A und B die durchschnittlichen Tumorgewichte der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe in g bedeuten.
- Jede Gruppe bestand aus 6 Mäusen. Der Kontrollgruppe wurde PBS in der gleichen Menge wie der Testgruppe verabreicht.
- Die Ergebnisse werden in der Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6: Anti-Tumor-Wirkung von Schizophyllansulfaten Probe Schwefelgehalt (%) Durchschnittliches Tumorgewicht (g) (wt±S.E.) Kontrollrate (%) Schizophyllan Schizophyllansulfat
- Wie aus den obigen Ergebnissen zu ersehen ist, werden bei einigen Schizophyllansulfaten starke Antitumorwirkungen erhalten, was als eine wichtige Eigenschaft anzusehen ist.
- Im vorangegangenen ist die Verwendbarkeit von Schizophyllansulfaten als Mittel gegen das AIDS-Virus anhand einiger spezieller Beispiele beschrieben worden.
- Die Ergebnisse eines Tests der akuten Toxizität werden in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7: Test der akuten Toxizität von Schizophyllansulfaten Molekulargewicht des Schizophyllans: Schwefelgehalt: Orale Verabreichung Subkutane Injektion Intramuskuläre Injektion Intravenöse Injektion
- Wäßrige Lösungen von Skleroglukan und Pendulan, welche wie Schizophyllan aus sich wiederholenden Einheiten der Formel (1) aufgebaute Polysaccharide sind, wurden mit Ultraschall bestrahlt, um die entsprechenden Molekulargewichte in den Bereich von 400 000 zu bringen. Dann wurden sie nach dem Verfahren A des Beispiels 1 (Polysaccharid: 0.5 g; Pyridin/Schwefelsäureanhydridkomplex: 5 g; Reaktionszeit: 5 Stunden) unter Erhalt des Polysaccharidsulfats sulfatiert.
- Die Wirkung der so erhaltenen Sulfate von Skleroglukan und Pendulan gegen das AIDS-Virus wurden gemäß dem Verfahren des Beispiels 1(3) untersucht.
- Zur Kontrolle wurden Schizophyllansulfat (Probe (3)) in Beispiel 1 und Dextransulfat verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8: Wirkung der Sulfate von Skleroglukan und Pendulan gegen das AIDS-Virus Reverstranskriptase-Aktivität (CPM) Probenkonzentration Probe Skleroglukansulfat Pendulansulfat Schizophyllansulfat Dextransulfat Kontrolle: Virus (-) Virus (+)
- Wie in der Tabelle 8 gezeigt, weisen die Sulfate von Skleroglukan und Pendulan eine stärkere Wirkung bezüglich der Unterdrückung der Verbreitung des AIDS-Virus als Dextransulfat auf, wie auch Schizophyllansulfat. Weiterhin unterdrücken diese Sulfate die Bildung von Riesenzellen, die sonst möglicherweise durch zytopathische Effekte ausgelöst werden würde.
- Weiterhin wurde auch mit indirektem Immunofluoreszenzassay in den mit diesen Sulfaten zusammen kultivierten Zellen kein Virus-Antigen beobachtet.
- Schizophyllane mit verschiedenen Molekulargewichten wurden nach dem Verfahren A des Beispiels 1 (Polysaccharid: 0.5 g; Pyridin/Schwefelsäureanhydrid-Komplex: 5 g; Reaktionszeit: 5 Stunden) sulfatiert. Bei den so erhaltenen Polysaccharidsulfaten wurde die Wirkung gegen das AIDS- Virus mittels der in Beispiel 1 (3) beschriebenen Methode untersucht. Zur Kontrolle wurde Dextransulfat verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9: Abhängigkeit der Wirkung gegen das AIDS-Virus vom Molekulargewicht des Polysaccharids Reverstranskriptase-Aktivität (CPM) Probenkonzentration Molekulargewicht des Schizophyllans Schwefelgehalt (Gew.-%) Dextransulfat Kontrolle: Virus (-) Virus (+)
- Das Mittel gegen das AIDS-Virus gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Polysaccharidsulfat, welches durch Sulfatierung aus einem Homopolysaccharid hergestellt wurde, das nur aus Glukose besteht, woraus sowohl dessen starke Wirkung gegen das AIDS-Virus wie auch die im Vergleich zu anderen sulfatierten Polysacchariden starke mitogene Wirkung resultiert. Weiterhin hat das Polysaccharid gemäß der vorliegenden Erfindung einen Schwefelgehalt von 3 bis 17 %, wodurch es niedrige Toxizität bei einer starken Wirkung gegen das AIDS-Virus aufweist.
- Es hat sich erwiesen, daß das erfindungsgemäße Mittel gegen das AIDS-Virus diese Wirkung nicht nur in einer subkultivierten Zellinie wie Molt-4/cl. No. 8-Zellen oder MT- 4-Zellen, sondern auch in peripheren menschlichen Lymphozyten zeigt. Dies deutet darauf hin, daß das Polysaccharidsulfat gemäß der vorliegenden Erfindung ein exzellentes Mittel gegen das AIDS-Virus sein kann.
- Außerdem wird das durchschnittliche Molekulargewicht des Polysaccharids gemäß der vorliegenden Erfindung von 10 000 bis 500 000 eingestellt, wodurch verschiedene im Herstellungsprozeß auftretende Probleme wie Filtration und Reinigung gelöst werden und ein hochreines Produkt erhalten werden kann. Dementsprechend kann das erfindungsgemäße Mittel gegen das AIDS-Virus ein Arzneimittel von hoher Qualität sein.
Claims (2)
1. Verwendung des sulfatierten Polysaccharids von
Schizophyllan, Skleroglukan oder Pendulan mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht von 10 000 bis
höchstens 1 000 000 für die Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung des AIDS-Virus in Säugetieren.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Gehalt an
Sulfatgruppen im sulfatierten Polysaccharid von 3 bis 17
Gewichts-% als Schwefelgehalt beträgt.
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