DE3851386T2

DE3851386T2 - Verwendung von Glycanen als antivirale Verbindungen.

Info

Publication number: DE3851386T2
Application number: DE19883851386
Authority: DE
Inventors: Yutaro Kaneko; Kei Matsuzaki; Toru Mimura; Hideki Nakashima; Toshiyuki Uryu; Naoki Yamamoto; Takashi Yoshida
Original assignee: Ajinomoto Co Inc; Fujirebio Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc; Fujirebio Inc
Priority date: 1987-07-07
Filing date: 1988-07-06
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2008-07-07
Also published as: EP0298706B1; DE3851386D1; EP0298706A3; EP0298706A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft antivirale Mittel, die Glucane, deren Derivate oder Salze davon enthalten. Diese Mittel können beispielsweise zur Behandlung von menschlichem Immunschwächevirus (HIV- oder AIDS-Virus) eingesetzt werden. Diese antiviralen Mittel sind als Arzneimittel oder deren Komponenten zur Prophylaxe und Behandlung viraler Erkrankungen wirksam.
In Carbohydrate Polymers 2 (1982), 115-121 werden in vitro Untersuchungen beschrieben, bei denen eine Vielzahl von sulfatierten Polysacchariden, wie Alginsäuren, Amylose, Cellulose, Chitosan, Curdlan, Dextran, Guaran, Laminaran und Johannisbrotgummi auf ihre Antikoagulationsaktivität untersucht werden.
In Chemical Abstracts 81 (1974), 150306r wird darauf hingewiesen, daß sulfatierte Polysaccharide aus Zellwänden von Hefe gegen Magengeschwüre und Arteriosklerose wirksam sind.
In Chemical Abstracts 83 (1975), 12692d wird gezeigt, daß sulfatierte Glucane, die β(1→3) glycosidische Bindungsstrukturen aufweisen, wie sulfatierte Glucane aus Fomes macgugorii gegen Blutgerinnung und Entzündungen wirksam sind.
Die US-A-4,590,181 (McCarthy) offenbart, daß Mycodextransulfate und Pustulane mit Molekulargewichten innerhalb bestimmter Bereiche als Adjuvantien bei der Immunisierung gegen virale Erkrankungen nützlich sind.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung einer Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung von erworbenem Immunschwäche-Syndrom zur Verfügung gestellt, welche unter den folgenden Verbindungen oder Gemischen davon ausgewählt ist,
Curdlansulfat oder einem Salz davon,
einem Glucanschwefelsäureester (der nicht Lentinansulfat ist), der mindestens eine Verbindung, die unter Xylose, Ribose, Galactose, Arabinose, Glucose und Oligomeren davon ausgewählt ist als Verzweigungsseitenkette des Stamm-Glucans enthält oder einem Salz davon,
Ribopyranansulfat, Ribofuranansulfat oder einem Salz davon.
Das Glucan ist vorzugsweise ein β(1→3) Glucan oder Cellulose. Vorzugsweise sind die Seitenketten in der 6-Position der Glucoseeinheit in dem Glucan angeordnet. Der Verzweigungsgrad der Seitenkette beträgt vorzugsweise 5 bis 60 pro 100 Glucoseeinheiten.
Die Ribopyranansulfate und Ribofuranansulfate, die erfindungsgemäß als wirksame Komponenten antiviraler Mitteln eingesetzt werden, sind bekannte Substanzen und können unter Verwendung bekannter Techniken leicht hergestellt werden. Siehe beispielsweise K. Hatanaka et al., J. Med. Chem., Bd. 30, Nr. 5 (1987), 810-814, veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldungen Nr. 130310/86 und 130302/86. Derivate, die die Grundstrukturen dieser Verbindungen enthalten, können auch mit Hilfe im Stand der Technik bekannter, herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Ferner können Salze dieser Verbindungen und Derivate davon gemäß bekannter Techniken hergestellt werden. Die Grundstrukturen dieser Verbindungen sind nachstehend gezeigt:
R: OSO&sub3;Na oder OH
Ribofuranansulfate
J. Med. Chemistry 30 (5) (1987), 810-814
R : OSO&sub3;Na oder OH
Ribopyranansulfate (synthetisiert)
Andere Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen eingesetzt werden, können unter Verwendung von Curdlan (von Bakterien abstammend; β-1,3-Glucan) oder bekannten Glucanderivaten (beispielsweise veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldungen Nr. 130301/86 und 130302/86; K. Hatanaka et al., J. med. Chem., vorstehend) hergestellt werden. Beispiele des Glucans umfassen β-1,3-Glucan, wie Curdlan, Pachman, β-(1→3)-Glucan der Hefezellwand oder β-(1→4)-Glucan, wie beispielsweise Cellulose.
Mannopyranose, Galactopyranose, Arabinofuranose oder Oligomere davon, wie Dimere oder Trimere sind an die Seitenketten dieser Glucane gebunden. Der Verzweigungsgrad (Anzahl gebundener Verzweigungen pro 100 Glucoseeinheiten) ist zweckmäßig im Bereich zwischen 5 und 60. Zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit ist die Verzweigungskette vorzugsweise an der 6-Position gebunden.
Derivate, die die Grundstrukturen dieser Verbindungen enthalten und Salze der Verbindungen als auch der Derivate können mit Hilfe bekannter Techniken hergestellt werden.
Die Medikamente, die die erfindungsgemäßen antiviralen Mittel enthalten, können beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln, Flüssigkeiten, Pulvern oder Pasten eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen antiviralen Mittel können einem Patienten in einer Dosis im Bereich von 0,01 bis 2000 mg, vorzugsweise 0,02 bis 500 mg pro Person und Tag, im allgemeinen in mehreren Einzeldosen von jeweils bis zu 1000 mg verabreicht werden. Die Dosis wird, abhängig von der Schwere der Erkrankung, dem Körpergewicht des Patienten und anderen Faktoren, die dem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann bekannt sind, variiert. Die antiviralen Mittel oder deren physiologisch verträglichen Salze können mit Vehikeln, Trägern, Exzipienten, Bindemitteln, Antiseptika, Stabilisierungsmitteln, Aromastoffen usw. (hier allgemein als pharmazeutische Träger bezeichnet) zur Herstellung einer pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelzubereitung gemischt werden, welche geeignete Einheitsdosen des antiviralen Mittels liefert. Die aktive Substanz wird in diese Arzneimittelzubereitungen in einer solchen Menge eingebracht, daß eine geeignete Dosis oder Untereinheit davon in dem angegebenen Bereich erhalten wird.
Spezifische Beispiele für pharmazeutische Träger sind:
Bindemittel wie Tragant, Gummiarabicum, Maisstärke oder Gelatine, Exzipienten, wie fein-kristalline Cellulose, Quellmittel, wie Maisstärke, vorgelatinierte Stärke und Alginsäure, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Süßstoffe, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, Aromastoffe, wie Pfefferminz, Akamonoöl oder Kirsche. Liegt die pharmazeutisch geeignete Arzneimittelzubereitung in Form einer Kapsel vor, können auch flüssige Träger, wie Öle und Fette in die vorstehend beschriebenen Materialien eingearbeitet werden. Eine Vielzahl anderer pharmazeutisch verträglicher Träger können als Beschichtungsmittel oder als Mittel zur Änderung der physikalischen Form der pharmazeutischen Arzneimittelzubereitung eingesetzt werden. Beispielsweise können Tabletten mit Schellack und/oder Zucker überzogen werden. Sirup oder Elixier kann Saccharose als Süßstoff, Methyl- und Propylparabene als Antiseptika und Pigmente, sowie Geschmacksstoffe, wie Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Für eine enterische Beschichtung kann eine 8%ige wäßrige Hydroxyphenylmethylcelluloselösung als Überzugs-Vorbehandlungsmittel und anschließend eine 10%ige wäßrige Hydroxypropylmethylcellulosephthalatlösung und 3%ige wäßrige Polyacetinlösung als Überzugsmittel verwendet werden. Diese Lösungen werden gemäß bekannter Techniken eingesetzt. Sterile Arzneimittelzubereitungen zur Injektion können nach herkömmlichen Techniken hergestellt werden, indem das aktive antivirale Mittel zusammen mit natürlich vorkommenden Pflanzenölen, wie Sesamöl, Kokosnußöl, Erdnußöl, Baumwollsamenöl oder Trägern aus synthetischem Fett, wie Ethyloleat in einem Träger, wie Wasser zur Injektion, gelöst oder suspendiert wird. Puffer, Antiseptika und Antioxidantien können wenn nötig zugesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf spezifische Beispiele genauer beschrieben.

Beispiel 1

Untersuchte Glucan-Derivate

Ribofuranansulfat (Molekulargewicht 10 · 10³) hergestellt nach dem von K. Hatanaka et al. beschriebenen Verfahren, J. Med. Chem. 30 (1987), 810

Verwendete Zellen und Viren

MT-4 Zellen (HTLV-I infizierte menschliche T4-Antigen positive Zellinie)
MOLT-4 Zellen
HTLV war ein spezifischer HIV-Stamm, der aus dem Überstand von HIV-infizierten Zellen isoliert wurde.
Der Titer der Virus-Päparation (6 · 10&sup5; Plaque bildende Einheiten/ml) wurde nach dem Plaque-Assay-Verfahren unter Verwendung von MT-4-Zellen bestimmt.

Anti-HIV Aktivität

Die anti-HIV Aktivität der Glucan-Derivate wird als HIV-abgeleiteter zytopathischer Effekt (CPE) und als Expression von Virus-spezifischem Antigen angegeben.
MT-4 Zellen wurden mit HIV in 0,002 MOI (Multiplizität der Infektion) gemischt und dann 60 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Nach Adsorption des Virus wurden die Zellen gewaschen und auf 3 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt (RPMI 1640, das mit 10%igem fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt wurde).
Nach der Infektion wurden Teilmengen der Zell-Suspension in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Proben der Glucanderivate kultiviert. Die Zellen wurden 3 Tage in einem Kohlendioxidgas-Inkubator inkubiert. Das Medium aus jeder Testkultur wurde anschließend durch frisches Medium ersetzt, das die entsprechende Konzentration des Glucanderivats, das getestet wurde, enthielt. Die Zahl überlebender lebensfähiger Zellen und Antigen-positiver Zellen (d. h. Zellen, die das HIV-Antigen exprimieren) wurden durch Pigment-Entfernung (beispielsweise mittels des Trypan-Blau Ausschlußtests) bzw. indirekte Immunfluoreszenz (IF) (bekannte Techniken) bestimmt.
MOLT-4- und HIVHTLV-IIB-infizierte MOLT-4-Zellen wurden in einem Verhältnis von 9 : 1 miteinander vermischt, 1 ml-Anteile auf eine Konzentration von 3 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt und in eine Reihe von Zellkultur-Vertiefungen überführt. Die Anteile der gemischten Zellsuspension wurden dann in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Glucanderivate kultiviert und die Synzitia-Bildung wurde bestimmt.
Inhibierung der Aktivität der reversen Transkriptase Die Inhibierung der reversen Transkriptase (RT) wurde anhand der RT-Aktivität mit (rA)n. (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Matrizen-Primer bestimmt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Untersuchungen über die Inhibierung der Aktivität der reversen Transkriptase sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Beziehung zwischen der Zahl lebensfähiger Zellen und der Konzentration von Glucanderivaten ist in Fig. 1 gezeigt. Die Beziehung zwischen dem Prozentsatz IF-positiver Zellen und der Konzentration von Gluoanderivaten ist in Fig. 2 gezeigt. Tabelle 1 Inhibierender Effekt einer erfindungsgemäßen Verbindung auf die RT-Aktivität von AMV und HIV Konzentration Ribofuranansulfat
Die inhibierende Aktivität ist als Prozentsatz der Inhibierung der RT-Aktivität bei Fehlen der Glucanderivat-Probe angegeben.

Herstellung anderer Sulfate

Beispiel 2

Herstellung von Lentinansulfat

0,100 g Lentinan wurde in 35 ml Dimethylsulfoxid (über einem Molekularsieb getrocknet) gelöst und der Lösung wurden 600 mg Piperidinsulfat zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 850 bis 90ºC gerührt. Anschließend wurden die gebildeten Sulfate mit einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wurde dann 6 Stunden gegen 18 l gesättigte wäßrige Natriumbicarbonatlösung dialysiert und dann 72 Stunden gegen reines Wasser. Im Anschluß daran wurde das Dialysat konzentriert, während die Temperatur bei 35ºC oder weniger gehalten wurde. Das konzentrierte Dialysat wurde anschließend filtriert und die Sulfate gefriergetrocknet. Die Ausbeute betrug 0,094 g.
Gemäß der vorstehend beschriebenen Methode zur Herstellung von Lentinansulfat wurde anstelle von Lentinan 0,100 g Curdlan mit einer β-Galactose als Seitenkettenverzweigung, eingesetzt. Die Bildung des Sulfatesters wurde in der vorstehend beschriebenen Art und Weise wiederholt, wobei 0,087 g des Sulfats erhalten wurde.
Die Verwendung von 0,50 g Curdlan ergab 0,58 g des Sulfats.
Andere Glucansulfate mit Xylose, Ribose, Galactose, Arabinose, Glucose und Oligomeren davon als deren Verzweigungsseitenketten können gemäß der beschriebenen Methoden mit Ausbeuten von etwa 0,1 g hergestellt werden. Untersuchung auf antivirale Aktivität Die anti-HIV Aktivität der vorstehend hergestellten Proben wurde unter Verwendung von MT-4 Zellen untersucht, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit HTLV-III mit einer MOI = 0,002 infiziert worden waren.

Ergebnisse

Die Beziehung zwischen dem Anteil lebensfähiger Zellen und der Konzentration der verschiedenen Sulfate ist in Fig. 3 gezeigt. Die Beziehung zwischen dem Prozentsatz IF-positiver Zellen und der Konzentration der verschiedenen Sulfate ist in Fig. 4 gezeigt.

Claims

1. Verwendung einer Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung von erworbenem Immunschwäche-Syndrom, die unter den folgenden Verbindungen oder Gemischen davon ausgewählt ist:

Curdlansulfat oder einem Salz davon;

Glucanschwefelsäureester (der nicht Lentinansulfate ist) der mindestens eine Verbindung, die unter Xylose, Ribose, Galactose, Arabinose, Glucose und Oligomeren davon ausgewählt ist als Verzweigungsseitenkette des Stamm-Glucans enthält oder einem Salz davon;

Ribopyranansulfat, Ribofuranansulfat oder einem Salz davon.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Glucan ein β-1,3-Glucan oder Cellulose ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Seitenkette in der 6-Position der Glucoseeinheit in dem Glucan angeordnet ist.

4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Verzweigungsgrad der Seitenkette 5 bis 60 pro 100 Glucoseeinheiten ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Substanz ein Curdlansulphat oder ein Salz davon ist.