KR20010113435A

KR20010113435A - 암치료제

Info

Publication number: KR20010113435A
Application number: KR1020000040489A
Authority: KR
Inventors: 야기타아키쿠니
Original assignee: 야기타 카즈코; 오리엔트 캔서 세라피 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2001-12-28
Also published as: CA2330217C; US20030064076A1; US6464981B2; KR20030069910A; US6818624B2; US20050084501A1; CA2330217A1; US20020010149A1

Abstract

본 발명은 신규한 면역학적 암치료 수단을 제공하는 것에 관한 것으로, 암의 면역을 담당하는 NKT 세포의 활성화에 관해 NKT 세포가 갖는 2개의 다른 항원수용체 즉, NKR-P1(자연살해P1)과 Vα24Vβ11의 작용이 전혀 다른 것을 발견하여 본 발명을 완성하였으며, NKT 세포의 활성화능에 대한 NKR-P1(자연살해P1)에 대한 작용을 지표로서 사용하는 암치료제를 제공한다.

Description

암치료제 {Cancer therapeutic agent}

본 발명은 NKT 세포의 활성화에 착안한 암치료제, 또는 NKT 세포의 활성화에 착안해서 항암효과를 기대하여 섭취하는, 경구섭취용 건강보조식품제제에 관한 것이다.

암의 예방 또는 치료를 위해 사용하는 물질의 선별은, 종래에는 암세포에 직접적으로 작용하는 것이 중요시되었다. 면역부활제가 암치료에 유용하다는 사실은 확인되어져 있지만, 면역부활제로서 얻어지는 화합물은 어느것도 그 항암효과가 미약하고, 면역요법 단독 또는 화학요법과의 병용치료에 의해서도 암의 충분한 치료효과는 달성되지 않았다.

본 발명자인 의학박사, 야기타(八木田)는 먼저 암치료에 있어서 획기적인 수법으로서 인터루킨-12(이하 IL-12)를 생체내에서 유발하는 물질의 유용성에 착안하여 추용균사체(椎茸菌絲體) 가공물인 AHCC가 그 기능을 갖는 것을 발견하고 신면역요법이라고 하는 암치료법을 확립하였다. 종래 IL-12 자체의 연구에 의하면, 항암효과가 있는 생체내 IL-12 자체를 직접 투여한 경우에는 부작용을 나타내 환자가 치료에 견디어 내지 못한다는 사실이 있어서, IL-12 자체를 항암제로서 사용할 수 없었다. 그러나, 야기타가 보고한 AHCC를 함유하는 제제는 암의 치료에 있어서 현저한 치유·생명연장 효과를 달성하였다. 결국 야기타는 IL-12를 생체내에서 유발하는 유효량의 AHCC를 투여하는 것에 의해 암치료 목적을 달성하였다(일본 특개평 10-139670호 공보).

IL-12는 인터페론γ(IFNγ)의 생산증강작용, 즉 생체내 있어서 세포성 면역을 담당하는 자연살해(Natural Killer, 이하 NK) 세포·LAK 세포(Lymphokine activated killer cell)·살해-T 세포의 활성화 효과 및 증강효과를 나타낸다. IFNγ는, 생체의 면역응답을 T헬퍼-1 세포(Th1)가 작용하는 상태(NKT 세포와 살해T 세포가 효과를 발휘하기 용이한 상태, 즉 인터루킨-2(IL-2), IL-12가 대량으로 생산되어져 있는 상태)에서 유발하는 사이토카인이다. 살해-T 세포 및 LAK 세포는 암의 면역에 관한 세포로서 알려져 있다. NK 세포에 대해서도 생체의 항암작용에 관여한다고 하는 보고가 있지만, NK 세포는 임상적인 항암효과와 그 활성이 서로 관계없고 오히려 IL-12의 생산 유발량과 NK 활성이 완전한 역상관 관계를 나타내는 것을 야기타에 의해 증명되어졌고 사람에 있어서 항암작용에는 NK 세포는 관여하고 있지 않은 것으로 결론이 내려졌다.

현재에는 야기타에 의해, IL-12의 생산 유발능을 갖는 물질이 유망한 암 억제물질이 될 가능성이 있다는 것이 확실시되고 있다.

그러나, 일부 암환자에게 있어서는, AHCC 투여에 의해서도 IL-12의 생산이 충분히 유발되지 않아서 치료효과를 얻지 못하고 또 IL-12의 생산이 유발되어도 치료효과를 얻을 수 없었다. 그 때문에 AHCC가 갖는 항암효과와는 별도의 메카니즘으로 작용하는 새로운 암치료제의 개발이 한층 더 요구되어지고 있다.

암면역의 작용 메카니즘에 있어서, 생체내에서 생산 또는 유발되어진 사이토카인의 양이 중요한 요소인 것은 공지되어 있어 항암효과를 갖게 하는 사이토카인을 투여, 유발 또는 생산하여 암을 치료하는 방법도 시험적으로 행해지고 있다. 그러나, 암과 면역, 암과 사이토카인의 관계가 밝혀져 있는 것으로는, 암의 치유·생명연장효과는 50% 이하의 환자에게서만 확인되어졌다. 최근에 암면역에 관여하는 세포로서는 NKT 세포(Cui J. et al., Science 278, 1623, 1997)가 보고되었다. NKT 세포는 면역계에 관여하는 세포의 하나이고 강력한 사이토카인 생산능, 특히 IFNγ생산능 및 Fas나 퍼포링을 개입시킨 세포상해성 등의 기능을 갖는다. 따라서 이 세포를 활성화시킴으로써 암환자의 치유·생명연장효과를 높이는 것이 기대된다.

오야구찌(谷口) 등은 NKT 세포가 갖는 Vα24Vβ11이라고 하는 특이적인 T세포 항원수용체(TCR)가 인식하는 특이적인 당지질 항원을 발견하고, 이 항원이 α갈락토실세라미드인 것을 보고하고 있다. 더구나, α갈락토실세라미드를 투여한 암에 걸린 마우스에서는 NKT 세포가 활성화되어, 암의 소실은 보여지지 않고 대개 전이가 억제되어지는 것을 증명했다.

NKT 세포에는 이미 하나의 수용체로서 NK 세포항원 수용체(NKR-P1; 자연살해-P1)가 있는 것이 보고되어져 있다(특집 NKT 세포의 기초와 임상: 최신의약 55권 4호 2000년 818-823 페이지). NKR-P1도 NKT 세포의 활성화에 관여한다.

따라서, 본 발명의 목적은 NKT 세포의 활성화 메카니즘을 해명하여 신규하고 유용한 NKT 세포의 활성화능을 갖는 암 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 본 발명자가 암의 예방 또는 치료에 있어서, 암면역 캐스케이드(cascade)에 대한 검토를 거듭하여 암면역을 갖는 활성화된 NKT 세포가 관여하는 캐스케이드에 있어서, NKT 세포의 활성화에 관여하는 2개의 다른 항원수용체, 즉 NKR-P1과 Vα24Vβ11의 작용이 완전히 다른 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 NKT 세포의 활성화능에 있어서, NKT 세포가 갖는 NK 세포항원수용체인 NKR-P1(자연살해P1)에 대한 작용을 지표로서 이용하는 암치료제, NKT 세포의 활성화능에 있어서, NKT 세포가 갖는 NK 세포항원수용체인 NKR-P1(자연살해P1)에 대해 선택적으로 작용하는 것을 특징으로 하는 상기의 암치료제, NKR-P1(자연살해-P1)에 대하여 선택적으로 작용한 결과, 인터페론 γ(IFNγ)의 대량생산을 유도하고 동시에 Th1/Th2 비율을 Th1이 주로 작용하는 면역계가 활동하는 방향으로 유도하는 상기 설명한 암치료제중 어느 하나의 암치료제, 세포표면 마커인 CD3 및 CD161을 측정하는 것에 의해 NKR-P1(자연살해P1)의 측정을 행하는 NKT 세포의 활성화능을 검정하는 상기 설명한 암치료제중 어느 하나의 암치료제, 경구섭취용 건강보조식품제제에 있어서 상기 설명한 암치료제중 어느 하나의 암치료제, 상기 설명한 암치료제중 어느 하나의 암치료제에 대해서 정보를 갖고 있는 상업적 매체 및 그 정보를 이용한 상업방법, 동시에 NKT 세포의 활성화능에 있어서 NKT 세포가 갖는 NK 세포항원수용체인 NKR-P1(자연살해P1)에 대한 작용을 지표로 해서 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 암치료제의 스크리닝 방법을 대상으로 한다.

도 1은 각종 사이토카인의 상관성을 나타낸 전체도이다.

도 2는 IFNγ량(IU/mL)에 대한 CD3×CD161과 Vα24Vβ11과의 상관성을 나타낸 도면이다.

도 3은 IL-12(pg/mL)과 CD3×CD161의 상관성을 나타낸 도면이다.

도 4는 IL-12(pg/mL)과 Vα24Vβ11의 상관성을 나타낸 도면이다.

도 5는 Th1/Th2 비율과 IL-12의 상관성을 나타낸 도면이다.

도 6은 Vα24Vβ11과 CD3×CD161의 상관성을 나타낸 도면이다.

도 7은 Vα24Vβ11과 Th1/Th2 비율의 상관성을 나타낸 도면이다.

도 8은 CD3×CD161과 Th1/Th2 비율의 상관성을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 임상에서의 효과와 사이토카인의 상관성을 검토함에 의해 시행하였다. 본 발명자는 37명의 암질환 환자에 용균사체 유래물을 투여하고 각종 사이토카인을 측정하였다(표 1). 그리고, 그 결과를 도 2∼8에 도시한 상관성을 나타내는데이터를 얻고 도 1에 나타낸 사이토카인 상관도를 얻었다.

도 1에 도시한 바와 같이, Th1/Th2 비율과 IL-12, Th1/Th2 비율과 IFNγ, IFNγ와 IL-12, IL-12와 CD3×CD161(NKR-P1) 양성세포(CD3+/CD161+)의 비율, IFNγ와 CD3×CD161(NKR-P1) 양성세포의 비율에는 강한 정상관 관계, IL-12와 Vα24Vβ11양성세포(TCR Vα24+/TCR Vβ11+)의 비율에는 강한 역상관 관계가 있는 것으로 판명되었다.

이리하여 본 발명에 있어서는 Vα24Vβ11 T 세포항원수용체가 자극을 받은 NKT 세포는 IL-12와 강력한 역상관 관계를 나타내고, IFN-γ생산량, Th1/Th2비율과도 약한 역상관 관계를 나타내는 것을 증명하여 Vα24Vβ11로의 자극이 면역기능의 억제에 작용하는 것을 입증하였다. 아마도 Vα24Vβ11로의 자극은 인타루킨4(IL-4)의 대량생산을 유도하여 면역억제에 작용하는 것으로 추정되어졌다. 한편, NKT 세포의 NK 세포항원 수용체인 NKR-P1(자연살해P1)이 자극을 받았을 경우에는 IL-12 및 IFN-γ와 강한 정상관 관계를 나타내고 Th1/Th2 비율과도 약한 정상관 관계를 나타내는 것을 증명하고 NKR-P1(자연살해P1)으로의 자극은 면역기능을 활성화시킴을 입증하였다.

이 결과, NKT 세포의 활성화능을 갖는 물질을 스크리닝할 때에는 적어도 NKR-P1(자연살해P1)에 대한 작용을 지표로 해서 선별하는 것이 필요하고 더욱이 그 작용이 NKT 세포의 활성화에 있어서 NK 세포항원 수용체인 NKR-P1(자연살해P1)에 대해 선택적인 것을 지표로서 선별한다. 추가로, 그 작용은 Vα24Vβ11에는 영향을 미치지 않는 것이 중요하다. 이 상태로서 선별되어진 물질의 선택적 작용의 결과로서 IFNγ의 대량생산이 유도되고 동시에 면역응답에 있어서, 면역계가 Th1의 활동방향으로 유도되는 것이 가능하여 그 선별되어진 물질을 이용함에 의해 대단히 유용한 암면역요법에 대한 치료제를 제공하는 것이 가능하다. 이 유용한 물질의 선별은 예를들면 그 물질을 생체내에 투여한 때, NKR-P1(자연살해P1)을 보존하고 유지하는 세포, 즉 세포표면 마커인 CD3 × CD161을 갖는 세포를 자극하는 것인지 아닌지 그 활성화능을 검정하는 것이 가능하다. 이 선별되어진 치료제는 예를들면 용균사체 유래성분으로 된 경구섭취용 건강보조식품제제이여도 좋다.

본 발명의 암치료제는 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력을 갖는 물질을 유효량 함유하고 바람직하기로는 경구로 투여된다.

또한 본 발명의 암 치료제는 항암효과를 기대해서 섭취하는 경구섭취용 건강보조식품제제이다.

본 발명의 치료제는, 폐암, 폐선종, 흉선종, 갑상선암, 방광암, 결장암, 직장암, 맹장암, 요관암, 유방암, 자궁경부암, 뇌종양, 설암, 인두암, 비강암, 후두암, 위암, 간암, 단관암, 정소암, 난소암, 자궁체암, 악성흑색종, 지방육종, 식도암, 췌장암, 전립선암 등의 치유에 효과가 있지만 이들 암에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포의 활성화능을 갖는 암치료제는 용균사체 가공물으로부터 선택된 적어도 하나를 활성성분으로 한다. 그 구체적인 예의 하나로는 SPG(sizofiran: 과연제약) (스에히로용균사체 배양로액으로부터 얻어진 다당체), SCP(스에히로용균사 가공물의 경구제제)(유한회사 동서의약연구소) 등의 스에히로 용균사체 유래물(학명: Schizophyllum Commune Fries), PSK(크레스틴) 등의 가와라 용균자체 가공물, AHCC 와 LEM (야전식균공업주식회사) 등의 추용균자체 가공물이 효과가 있다. 스에히로 용균사체 배양로액 유래 다당체의 SPG(sizofiran: 과연제약)는 일부 한정되어진 암에 대해서 제암제로서 사용되어지고 있다(대당주식회사, 과연제약주식회사). PSK(크레스틴)도 동일한 형태이다.

본 발명에서는 생체내 있어서 IL-12 생산유발능 및 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해-1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력을 지표로 해서 이 스에히로 용균사체 가공물, 스에히로 용균사체 배당로액 유래 다당체, PSK(크레스틴) 등의 가와라 용균자체 가공물, AHCC와 LEM 등의 추용균자체 가공물의 유용성을 재발견하고 본 발명을 완성하였다. 즉 본 발명은 SPG 등의 스에히로 용균사체 배양로액 유래 다당체, SCP 등의 스에히로 용균사체 가공물, PSK(크레스틴) 등의 가와라 용균자체 가공물, AHCC와 LEM 등의 추용균자체 가공물로부터 선택된 적어도 하나를 활성성분으로서 함유하는 조성물로 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화시키는 암치료제를 제공하였다.

게다가 본 발명자는 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력을 갖는 용균사체 유래물은 α-1, 3 및/또는 α-1, 4 글루코시드 결합구조, 특히 바람직하게는 적어도 α-1, 3 글루코시드 결합구조를 갖는 당성분인 것을 알아내었다. 그리고 NKT세포의 활성화능을 갖는 물질은 이 구조를 갖는 다당류 및/또는 2∼10개의 올리고당을 함유하는 용균사체 유래물의 조성물이 있어도 좋은 것을 알아내었다. 본 발명자는 각종 용균사체 유래물과 NKT 활성화능의 검토 및 그 성분과의 관계를 검토하여, 상기 당구조의 존재가 용균사체 유래물의 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력의 본질이 있는 것을 알아내었다. 또 균사체의 β-1, 3 및 β-1, 6 글루코시드 결합구조도 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포의 활성화능을 갖는 것을 확인하였다.

이들 용균사체 유래물을 함유하는 조성물 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화시키기 위한 암치료제의 투여량은 1일마다 1∼2000mg/kg 체중정도이고 10일∼12개월은 1∼수회/월로서 꼭 알맞게 경구섭취시킨다. 물론 투여양을 감소시켜 암 치료제를 비경구로 하는 품질로 조제하여 비경구섭취도 가능하다.

본 발명은 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화시키기 위한 암치료제로는, 상기 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력을 갖는 용균사체 가공물 또는 용균사체 유래물을 각각 단독으로 사용하여도 좋고 동시에 조합해서 사용하여도 좋다.

또한, 본 발명은 적어도 IL-12 생산 유발능을 갖는 물질과 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력을 갖는 물질을 배합한 암치료제 또는 항암효과를 기대하여 섭취하는 경구섭취용 건강보조식품제제일 수 있다.

이 배합 조성물의 예로는, SCP 등의 스에히로 용균사체 가공물 또는 SPG 등의 스에히로 용균사체 배양로액 유래 다당체, AHCC와 LEM 등의 추용균사체 가공물, MAK(야전식균공업주식회사)와 SM 등의 만년 용균사체 가공물로부터 선택되어진 적어도 2종을 배합한다. 이들 대부분은 지금까지도 면역부활제로서 항암효과를 목적으로 해서 사용되어졌던 일은 널리 알려져 있다. 그러나, 본 발명은 이들의 조합과 IL-12 생산유발능 및 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화하는 능력과의 관계를 알아내어 이들을 조합시킨 것이 지금까지의 일반적인 제암제의 항암효과(20% 유효율)와는 비교할 수 없을 정도의 우위성을 확립하는 것으로 본 발명을 완성하였다.

최적의 조합은 스에히로 용균사체 가공물 또는 스에히로 용균사체 배양로액유래 다당체와, 추용균사체 가공물과, 만년용균사체 가공물의 3종을 배합한 조성물로서, 상세하게는 스에히로 용균사체 가공물 또는 스에히로 용균사체 배양로액 유래 다당체 20∼60중량%, 바람직하게는 30∼50 중량%, 추용균사체 가공물 20∼60중량%, 바람직하게는 30∼50 중량%, 만년용균사체 가공물 5∼40중량%, 바람직하게는 10∼30중량%의 배합 조성물이다. 이 배합조성물은 암치료제 또는 항암효과를 기대해서 섭취하는 경구섭취용 건강보조식품제제로서 효과가 있다.

본 발명의 배합조성물의 경구섭취량은 통상 성인에 대해서 1일 마다, 1∼2000mg/Kg 체중 정도이다. 용법용량은 IL-12의 생산유발량 및/또는 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포의 활성화도에 의해 조정되어진다. 투여기간은 10일∼12개월이고, 투여빈도는 1∼수회/월 이다.

스에히로 용균사체 배양로액으로부터 얻어진 다당체는 이미 SPG(sizofiran)로서 과연제약 및 대당주식회사가 시판하고 있다. 그 제법으로는 특공소 52-4634호 공보, 특공소 52-44634호 공보 등에 기재된 방법이 예시된다.

LEM 등의 추용균사체 가공물과 MAK 등의 영지(만년용) 균사체 가공물은 이미 야전식균공업주식회사가 시판하고 있다. 이들의 제법의 일예는, 바가스(사탕수수의 착즙잔사)에 미당을 펌가하여 잘 배합하고 수분을 조정한 후 소정의 용기에 담아서 개체배양기를 만들어 고압증기멸균을 행한다. 미리 배양한 각각의 균의 균사를 배양기에 접종하고 23℃의 배양실에서 4개월간 균사를 배양한다. 균사가 만연한 배양기를 파쇄하여 자기소화처리를 행한 후, 추용균사체 가공물과 만년용균사체 가공물의 경우는 온수로 15시간 추출한다. 추출액을 맴브레인 필터로 제균 후 여액을 농축하고 건조해서 분말을 얻는다(특공평 7-1435호 공보, 특개평 1-312980호 공보, 특공소 51-19013호 공보, 특공소 53-18591호 공보).

스에히로 용균사체 가공물은 균사체 성분이고 유용성(油溶性)이 있다. 그 때문에 적당한 유기용매, 예를 들면 아세톤 추출처리 등에 의해 추출하고 필터로 제균 후 여액을 농축하고 건조시켜 분말을 얻는다. 본 발명에서는 이 경구제제(SCP:유한회사 동서의약연구소)를 사용하였다. 그외의 용균자체 가공물도 그러한 용해성의 특성(수용성·유용성)에 대응해서 동일한 처리방식으로 조제할 수 있다.

경구제제는, 정제, 가루약, 캡슐제, 시럽제 등으로 조제되어진다. 제제는 물론 이미 알고 있는 부형제, 붕괴제, 결합제, 활택제 등 필요한 첨가물을 배합하고 통상적인 수단을 사용하는 것으로도 제제화할 수 있다. 더우기 필요에 따라 교미제, 착색료, 향료, 안정제, 살균제, 방부제 등을 첨가하는 것도 가능하다.

본 발명의 암치료제는 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화시키기 위한 조성물, 또는 그 조성물에 첨가되어 IL-12 생산유발 조성물을 유효량 함유하고 경구, 정맥내 또는 근육내 투여하고, 바람직하게는 환자의 계속적인 자기관리를 가능케 하는 경구에 투여한다.

또한, NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화시키기 위한 조성물, 또는 그 조성물에 첨가되어 IL-12 생산 유발조성물을 함유하여 이루어진 본 발명의 경구섭취용 건강보조 식품제제는, 섭취결과 항암효과가 기대될 수 있는 경구섭취용 건강보조 식품제제이다.

이상, 설명한 바와 같이 본 발명은 신규한 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포를 활성화시키기 위한 조성물을 제공하고, 또한 IL-12 생산유발능과 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용해서 NKT 세포 활성화 능력과의 관계를 명확히 밝힌 것이기 때문에 그것들이 상업적 매체에 담지 되어지면 그 제품의 가격에 있어서 차별화수단이 된다. 따라서, 이러한 정보를 상업적 매체에 담지한 것은 극히 유용성이 높다. 게다가 이러한 정보를 상업적으로 이용하면 해당 제품의 가격에 있어서 차별화 수단이 되기 때문에, 이러한 정보를 이용한 상업적 방법은 극히 유용성이 높다.

본 발명의 실시예를 나타내어 좀 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이것들에 한정되어지는 것은 아니고 본 발명의 기술적 사상이 벗어나지 않는 범위에서 다양한 응용이 가능하다.

실시예 1

스에히로 용균사체 가공물(SCP:유한회사 동서의약연구소)를 40중량%, 추용균사체 가공물[LEM (등록상표): 야전식균공업주식회사)를 40중량%, 영지(만년용) 균사체 가공물(MAK: 야전식균공업주식회사)을 20중량%로 된 배합조성물(IL-X) 1Kg을 균일하게 배합하고 스프레이드라이방식에 의한 유동조립법에 의해, 3종배합 분말제제를 얻었다. 이 분말제제를 6g/일/신체로 경구섭취시켰다. 섭취기간은 3개월이였다. 처치개시전, 개시 1개월 후, 3개월후에 NKT 세포 및 IL-12를 측정하고 효과를 확인하였다. NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)에 선택적으로 작용한 NKT 세포활성화와 IL-12의 생산유발이 확인된 환자가 약 85%로, 유의성 있는 암퇴치 효과가 보였고, 약 20%가 완전한 암퇴치되었다는 결과를 얻었다.

실시예 2

스에히로 용균사체 가공물(SCP)을 40중량%, 추용균사체 가공물(LEM: 야전식균공업주식회사)를 40중량%, 영지(만년용) 균사체 가공물(MAK: 야전식균공업주식회사) 20중량%로 된 배합조성물(IL-X) 1Kg을 균일하게 배합하고 배합분말을 습식조립법에 의해 미세입자화하고 하드젤라틴 캡슐에 3g씩 충진해서 캡슐제를 제조하였다. 이 캡슐제를 2개/일/신체로 경구섭취시켰다. 섭취기간은 3개월이였다. 효과는 실시예 1과 동일한 유용성이 확인되었다.

임상예 1

본 발명자는, 암환자(37증상예)의 각종 사이토카인의 동태를 파악하여 IFNγ, CD3×CD161, Vα24Vβ11, IL-12, Th1/Th2 비율 등을 측정하고 각 사이토카인의 상관 관계를 분석하였다. 환자는 어느 것이나 용균사체성분(다당체), 또는 이들에 가해진 DK432(피시바니루: 중외제약주식회사)을 투여하였다. 투여한 용균사체 성분(다당체)은 어느 것이나 IL-12 생산유발능 및 NKT 세포활성화능을 보존하고 유지하는 용균사체 성분이다. 표 1은 각종 암질환의 환자에 각종 용균사체 유래 물질을 투여한 후 각각의 사이토카인 값을 나타낸 것이다. 표 2는 표 1의 각 환자에 투여한 약제를 나타낸 것이고 표 1의 환자들과의 상관 관계를 나타낸 것이다. 투여량은 1일 마다 3∼6g을 경구투여하고 투여기간은 표에 나타낸 기간으로 하였다. 37증상예중 6증상예가 완전치료(CR), 14증상예가 부분치유(PR), 14증상예가 무반응(암의 진전없음: NC), 3증상예가 효과 없음(PD)이였다.

질 환 명	효과판정	투여기간(월)	TCR·Vα24/Vβ11+(%)	CD3+/CD161+(%)	Th1/Th2(%)	IL-12(pg/mL)	IFNγ(IU/mL)	IL-10(pg/mL)
좌유방암, 간전이	CR	31	0.05	10.9	9.4	7.8	2.4	97
좌유방암	CR	10	0.03	20.3	8.3	34.1	57.4	226
위암, 림프전이	CR	12	0.04	25.7	3.5	7.8	23.4	723
맹장암	CR	24	0.06	13.5	12.0	15.6	46.3	276
좌유방암	CR	6	0.31	19.1	12.2	10.9	13.5	631
S상 결장암	CR	22	0.10	8.9	6.3	17.5	37.0	373
하인두암, 국소재발	PR	9	0.07	9.1	4.3	7.8	5.6	551
위암	PR	9	0.05	11.4	4.5	7.8	3.1	329
위암	PR	28	0.05	9.8	2.7	7.8	10.8	169
우유방암	PR	25	0.02	21.2	9.4	43.7	69.7	426
좌유방암, 골전이	PR		0.08	49.3	7.3	41.8	91.7	209
좌유방암,우유방암전이	PR	3	0.02	14.8	1.8	7.8	4.0	598
소장육종, 간전이	PR	5	0.00	15.6	10.2	8.9	73.3	599
식도암	PR	2	0.40	33.4	6.0	8.1	48.5	994
자궁체암	PR	3	0.25	163.4	14.2	7.8	3.5	103
난소암	PR	16	0.44	13.5	4.3	7.8	30.0	246
전립선암, 다발골전이	PR	8	0.05	16.1	11.5	7.8	47.8	383
직장암	PR	10	0.02	20.5	3.5	7.8	3.2	410
간암	PR	3	0.08	15.3	17.8	53.5	93.6	99
S상 결장암, 간전이,골전이	PR	6	0.96	16.4	7.2	13.2	47.8	284
우유방암, 폐전이	NC	9	0.05	14.5	5.6	14.9	36.6	305
직장암 폐전이	NC	7	0.68	14.5	5.7	7.8	4.0	154
좌폐암에서 우폐암	NC	16	0.06	9.8	10.6	7.8	4.6	198
위암	NC	5	0.04	9.1	7.1	7.8	6.9	180
우폐선암	NC	2	0.30	13.4	8.4	7.8	10.8	211
S상 결장암	NC	25	0.02	11.8	4.7	18.8	44.5	295
유방암, 폐전이	NC	3	0.12	20.8	4.8	7.8	17.4	565
폐암	NC	3	0.03	16.2	3.9	7.8	1.5	359
췌장암	NC	3	0.04	14.6	15.5	23.0	31.6	320
간암	NC	18	0.06	17.2	12.7	236.0	136.0	253
우유방암	NC	9	0.09	13.0	4.6	7.8	4.4	443
위암	NC	10	0.12	17.7	16.1	7.8	49.6	338
좌폐편평상피암	NC	9	0.05	16.5	3.6	7.8	17.6	519
위암, 간전이	NC	10	0.04	12.8	8.4	122.0	120.0	246
난소암	PD	4	0.04	15.4	8.0	7.8	11.5	115
자궁체암	PD	10	0.24	10.6	5.1	7.8	2.0	401
전립선암, 다발골전이	PD	6	0.04	12.9	3.9	19.6	14.7	961

질 환 명	투여약제 (다당류, 당지질)
좌유방암, 간전이	AHCC, IL-X
좌유방암	AHCC, IL-X, PSK
위암, 림프전이	AHCC, IL-X
맹장암	AHCC, SCP, SPG
좌유방암	AHCC, PSK
S상 결장암	AHCC, PSK
하인두암, 국소재발	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
위암	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432
위암	AHCC, PSK
우유방암	AHCC, IL-X
좌유방암, 골전이	IL-X, PSK
좌유방암,우유방암전이	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
소장육종, 간전이	AHCC, PSK, SPG, OK432
식도암	AHCC, PSK
자궁체암	AHCC, PSK, SCP
난소암	AHCC, PSK, SPG, OK432
전립선암, 다발골전이	AHCC, PSK
직장암	AHCC, PSK
간암	AHCC, PSK
S상 결장암, 간전이, 골전이	AHCC, PSK
우유방암, 폐전이	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
직장암 폐전이	AHCC, IL-X, PSK, SCP
좌폐암에서 우폐암	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
위암	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
우폐선암	IL-X, PSK
S상 결장암	AHCC, IL-X
유방암, 폐전이	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
폐암	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432, SCP
췌장암	AHCC, PSK, SPG
간암	AHCC, PSK
우유방암	AHCC, PSK, SPG, OK432, SCP
위암	AHCC, PSK
좌폐편평상피암	AHCC, PSK, SPG, OK432
위암, 간전이	AHCC, PSK
난소암	AHCC, IL-X, PSK, SPG, OK432
자궁체암	AHCC, PSK, SPG, OK432
전립선암, 다발골전이	AHCC, PSK, SPG, OK432

Vα24+/Vβ11+과 Vα24Vβ11은 양성세포, 즉 세포표면상에 세포표면마커로서 Vα24 및 Vβ11을 갖고 있는 세포를 의미한다. CD3+/CD161+은 CD3×CD161 양성세포, 즉 세포표면상에 세포표면 마커인 CD3 및 CD161을 갖고 있는 세포를 의미한다. 상기 표에서 CR은 완전치유(암이 소실되어 4주이상 경과하는 것), PR은 부분치유(암이 50% 이상 축소한 것), NC는 무반응(암의 증식이 50% 이하로 억제되어져 있든가 25% 이내의 증식에서 억제되어져 있는 것), PD는 효과가 없는 것(암의 증식이 25% 이상 관찰되는 것)을 나타낸다.

세포 및 각종 사이토카인의 측정방법은 이하에 나타낸다.

(NKT 세포 및 측정)

NKT 세포의 활성화 동안, NKR-P1으로의 작용에 의한 활성화 측정은, NKT 세포의 세포표면에 특이적으로 존재하는 세포표면항원(CD3 및 CD161)의 측정에 의해, NKT 세포수의 증가를 조절하는 것이 가능하다. 구체적으로는 말초혈관중의 단핵구에 있어서, CD3 양성세포에서 또한 CD161 양성세포의 세포를 검정한다. 결국, NKT 세포의 세포표면항원인 CD3 및 CD161을, 모노클론 항체를 이용하여 프로사이토메트리를 사용하는 2색(two color) 검사에 의해 측정하였다. NKT 세포가 활성화되어진다는 것은 단핵구 내에서 NKT 세포의 비율이 10% 이상으로 되는 것을 말한다. NKT 세포의 활성화능은, NKT 세포의 비율을 10% 이상으로 증가시키기 위한 기능, 또는 어떤 물질을 투여하기 전 NKT 세포의 비율보다 좀 더 증강시키기 위한 기능을 의미한다.

암환자의 혈액을 이용하여, 혈중세포에 있어서, 세포표면항원인 CD3 및 CD161이 양성인 세포의 비율을 프로사이토메트리를 사용하여 2색검사에 의해 통상의 방법으로 측정하였다. CD3 및 CD161에 대한 모노클론 항체는 각각 코루타사 제품인 CD3-PC5 및 벡톤디킨슨사 제품인 CD161을 사용하였다.

NKT 세포의 활성화 동안, Vα24Vβ11로의 작용에 의한 활성화 측정은, NKT 세포의 세포표면에 특이적으로 존재하는 세포표면항원(Vα24 및 Vβ11)의 측정에 의해, NKT 세포수의 증가를 조절하는 것이 가능하다. 구체적으로는 말초혈관중의 단핵구에 있어서 Vα24양성세포에서 또한 Vβ11 양성세포의 세포를 검정하였다. 결국, NKT 세포의 세포표면항원인 Vα24 및 Vβ11을, 모노클론 항체(TCR-Vα24PE, TCR-Vβ11FITC; Beckman Coulter사)를 이용하여 프로사이토메트리를 사용하는 2색검사에 의해 측정하였다.

(사이토카인을 측정하기 위한 시료의 조제)

먼저, 암환자의 혈액으로부터 단핵구세포를 분리조제하였다. 암환자로부터 얻은 헤파린을 가한 말초혈액을 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered Saline; PBS)로 2배 희석해서 혼화한 후, Fico11-Conray 액(비중 1.077) 상에 중층하고 400G로 20분 원심분리하여 침전시킨 후 단핵구층을 채취하였다. 세정 후 10% 우태아혈청(FBS)를 가한 RPMI-1640 배지를 가하고 단핵구 수가 1×10⁶개 되도록 조제하였다. 이로부터 얻은 세포부유액 200㎕에 피토헤마글루티닌(Photohemagglutinin; 이하, PHA로 약칭한다)(DIFCO사 제품)을 20㎍/mL 농도가 되도록 첨가하고 96웰 마이크로플레이트에서 5% CO₂존재하에 37℃에서 24시간 배양하고 상기 배양한 세포용액중 사이토카인을 측정하는 시료로 하였다.

(IL-12의 측정)

IL-12는 R＆D SYSTEMS 사의 키트를 이용한 ELISA법으로 측정하였다. 실제로 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 측정용 희석액 Assay Diluent RD1F를 50㎕, 표준액(standard) 또는 실시예 1에서 조제한 시료를 200㎕씩 나누어 주입한 후 실온에서 방치해서 2시간 반응시켰다. 그후 호스 래디쉬 페록시다아제(horse radish peroxidase; 이하 HRP로 약칭한다) 표지 항IL-12항체를 200㎕씩 나누어 주입하고 2시간 실온에서 방치하였다. 각 웰의 반응액을 제거하고 3회 세정한 후 발색기질용액을 200㎕씩 나누어 주입하고 20분 실온에서 방치 후 효소반응정지용액을 50㎕ 씩 나누어 주입하였다. 550nm를 대조로해서 450nm에 대해 각 웰의 흡광도를 Emax(화광순약주식회사)에서 측정하였다. IL-12의 양은 pg/mL로 해서 나타냈다. IL-12의 생산유발능으로는 말초혈관의 단핵구가 자극에 의해 생산하는 IL-12양을 7.8pg/mL 이상(7.8은 측정한계치)으로 증강시키기 위한 기능, 또는 어떤 물질을 투여하기 전의 IL-12 생산량보다 증강시키기 위한 기능을 의미한다.

(IFNγ의 측정)

IFNγ의 측정은 BioSource Europs S. 사의 IFNγ EASIA 키트를 이용하여 효소면역측정법(EIA법)으로 측정하였다. 실제로는 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 표준액 또는 상기 조제한 시료를 2배 희석한 것을 50㎕ 씩 나누어 주입하고 HRP 표지 항IFN-γ 항체를 50㎕ 씩 나누어 주입하여 다시 진탕하면서 2시간 실온에서 반응시켰다. 각 웰의 반응액을 제거하고 3회 세정한 후 발색기질용액을 200㎕씩 나누어 주입하고 진탕하면서 15분 실온에서 반응시키고 효소반응정지용액을 50㎕씩 나누어 주입하였다. 630nm을 대조로 해서 450nm 및 490nm에 대한 각 웰의 흡광도를 Emax(화광순약)에서 측정하였다. IFNγ양은 IU/mL로 해서 나타내어진다.

(IL-10의 측정)

IL-10의 측정은 Biosource Europe S. 사의 IL-10 EASIA 키트를 이용하여 고상효소 면역측정법(ELISA법)으로 측정하였다. 방법은 항IL-10 항체를 채택한 이외에는 IFNγ의 측정방법에 준하여 실시하였다. IL-10양은 pg/mL로 나타냈다.

(Th1/Th2 세포비율의 측정)

Th1/Th2 세포비율은 프로사이토메트리에 의한 헬퍼 T(Th) 세포계통 3색(Three color) 해석검사에 의해 통상의 방법으로 검정하였다. Th1/Th2 는 세포표면항원 CD4를 갖는 헬퍼 T 세포 중에서 IFNγ를 생산하는 세포(Th1)와 IL-4를 생산하는 세포(Th2)의 비율을 나타내는 것인데, CD4×IFNγ/IL-4로 기재하였다.

먼저 암환자의 혈액을 포볼 12-미리스테이트 13 아세테이트(phorbol 12-Myristate 13 Acetate)와 이오노마이신(Ionomycin)에 의해 37℃에서 4시간 처리하고 혈액중 세포를 자극해서 사이토카인을 생산시켰다. 그 다음, 브레페르딘 A(Breferdin A)를 첨가해서 생산반응을 정지시키고 항CD4 항체인 CD4-PC5(Beckman Coulter 사)를 채택하여 세포표면 마커인 CD4를 염색하고 세포를 고정한 후 FACS Lysing Solution(일본 벡톤디킨슨사)을 이용하여 용혈처리하였다. 그후 FACSPermeabilizing Solution(일본 벡톤디킨슨사)으로 세포막 투과처리를 수행하고, 다시 항 IFNγ 항체/항 IL-4 항체(FASTIMMUNE IFNγ FITC/IL-4 PE, 일본 벡톤디킨슨사)에서 세포내의 사이토카인을 염색해서 프로사이토미터(FACS Calibur, Becton Dickinson 사)에서 측정 및 해석을 행하였다.

이상의 측정결과 데이터를 토대로 이하 각 사이토카인의 상관성을 분석하였다.

도 1은 각종 사이토카인의 상관성을 설명하는 전체도이다. 도 1은, Th1/Th2 비율과 IL-12, Th1/Th2 비율과 IFNγ, IFNγ와 IL-12, IL-12와 CD3×CD161(NKR-P1), IFNγ와 CD3×CD161(NKR-P1)에는 강력한 정상관 관계, IL-12와 Vα24Vβ11 (TCR Vα24+/TCR Vβ11+)에는 강력한 역상관 관계를 나타냈고 각항원수용체와 사이토카인의 관계를 나타내고 있다.

도 2는 IFNγ의 양(IU/mL)에 대해 CD3×CD161과 Vα24Vβ11와의 상관 관계를 나타내는 것으로, 전자(도 2A)에는 강력한 정상관 관계가 존재하지만 후자(도 2B)에는 약한 역상관 관계가 있는 것으로 판명되었다. 이것은 NKT 세포의 NKR-P1(자연살해-P1)으로의 자극은 INF-γ의 유발과 강력한 정상관 관계가 있는 것을 시사하였다.

도 3은 IL-12(pg/mL)와 CD3×161의 상관 관계를 나타내는 것으로, NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)으로의 자극은 IL-12의 유발과 강한 정상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다.

도 4는 IL-12와 Vα24Vβ11의 상관 관계를 나타내는 것으로, NKT 세포의Vα24Vβ11으로의 자극은 IL-12의 유발과는 강력한 역상관 관계가 있음을 알았다.

도 5는 Th1/Th2비율과 IL-12의 상관 관계를 나타내는 것으로, 강한 정상관성을 나타내기 때문에 IL-12가 NKT 세포에 직접 작용해서 INF-γ의 생산증강과 면역응답을 Th1이 작용하는 방항으로 기울어지는 것을 시사하였다.

도 6은 Vα24Vβ11과 CD3×CD161의 상관 관계를 나타내는 것으로 양자에는 상관성이 없다는 것이 판명되었다.

도 7은 Vα24Vβ11과 Th1/Th2비율의 상관 관계를 나타내는 것으로, 약한 역상관 관계를 나타내고 있다.

도 8은 CD3×CD161과 Th1/Th2비율의 상관 관계를 나타내는 것으로 약한 정 상관성을 나타냈다.

이상과 같이, Vα24Vβ11의 T 세포항원수용체가 자극을 받은 NKT 세포는, IL-12와 강한 역상관 관계, IFN-γ, Th1/Th2와도 약한 역상관 관계를 나타내는 것을 증명하였다. 이로부터, Vα24Vβ11로의 자극은 면역기능의 억제에 작용하는 것이 입증되었다. 한편, NKT 세포의 NKR-P1(자연살해P1)이 자극을 받은 경우는 IL-12 및 IFN-γ와 강력한 정상관 관계를 나타내고, Th1/Th2와도 약한 정상관 관계를 나타내는 것을 증명하고 NKR-P1(자연살해P1)으로의 자극은 면역기능의 활성화에 작용하는 것으로 입증되었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 암의 예방 또는치료에 있어서, 암면역 캐스캐이드에 대한 검토를 거듭하여, 암면역을 담당하는 활성화된 NKT 세포가 관여하는 캐스캐이드에 있어서, NKT 세포의 항원수용체로의 작용효과가 NKR-P1(자연살해P1)과 Vα24Vβ11에서는 완전히 달리하는 것을 발견하고 NKR-P1에 선택적으로 작용하는 물질 및 Vα24Vβ11에 선택적으로 작용하는 물질의 유용성을 발견하고 암면역치료에 있어, 혁명적인 효과를 달성한 것이다.

Claims

자연살해-T (NKT) 세포의 활성화능에 있어서 NKT세포가 갖는 자연살해 (NK) 세포항원수용체인 NKR-P1 (자연살해P1) 에 대한 작용을 지표로서 이용하는 암치료제.
자연살해-T(NKT) 세포의 활성화능에 있어서 NKT 세포가 갖는 자연살해 (NK) 세포항원수용체인 NKR-P1 (자연살해P1)에 대한 작용을 지표로서 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 암치료제의 스크리닝방법.
제 1항에 있어서, 자연살해-T(NKT) 세포의 활성화능에 있어서 NKT 세포가 갖는 자연살해(NK) 세포항원수용체인 NKR-P1 (자연살해P1)에 선택적으로 작용하는 것을 특징으로 하는 암치료제.
제 3항에 있어서, NKR-P1 (자연살해P1)에 대해 선택적으로 작용한 결과로서,인터페론 γ(IFNγ)의 대량생산을 유도하고, 동시에 T헬퍼-1 세포/T헬퍼-2 세포(Th1/Th2) 비율을 Th1이 주로 작용하는 면역계가 작용하는 방향으로 유도하는것을 특징으로 하는 암치료제.
제 1항, 제 3항 및 제 4항중 어느 한항에 있어서, 세포표면 마커인 CD3 및 CD161을 측정함에 의해 NKR-P1(자연살해P1)의 측정을 행하는 자연살해T(NKT) 세포의 활성화능을 검정하는 것을 특징으로 하는 암치료제.
제 1항, 제 3항 내지 제 4항중 어느 한항에 있어서, 경구섭취용 건강보조식품제제인 것을 특징으로 하는 암치료제.
제 6항에 있어서, 경구섭취용 건강보조식품제제인 것을 특징으로 하는 암치료제.
제 1항, 제 3항 내지 제 4항중 어느 한항에 기재된 정보를 담지한 상업적 매체.
제 5항에 기재된 정보를 담지한 상업적 매체.
제 6항에 기재된 정보를 담지한 상업적 매체.
제 7항에 기재된 정보를 담지한 상업적 매체.
제 1항, 제 3항 내지 제 4항중 어느 한항에 기재된 정보를 이용한 상업방법.
제 5항에 기재된 정보를 이용한 상업방법.
제 6항에 기재된 정보를 이용한 상업방법.
제 7항에 기재된 정보를 이용한 상업방법.