KR100842053B1

KR100842053B1 - 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선 및면역기능 증진용 조성물

Info

Publication number: KR100842053B1
Application number: KR1020060104224A
Authority: KR
Inventors: 고병섭; 전원경; 김영은; 임신혁; 권호근; 황지선; 권대영
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2008-06-30
Also published as: WO2007049917A1; CN101277712A; US20090317498A1; JP2009510053A; US20110052644A1; KR20070045121A

Abstract

본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 하는 장내 균총 개선 및 면역기능 증진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 장내 유익균인 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스 에스피 (Lacotobacillus sp.)와 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 의 생육을 촉진하고 일반면역계 림프구와 같은 면역 세포를 증식시키는 기능과 함께 장관면역계 면역세포활성 기능을 갖는 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 장내 유익균의 생육을 촉진하여 장내 균총 조성을 바람직하게 변화시키고 면역 세포를 증가시켜 면역 기능을 증진 특히 장면역을 활성 시키므로 변비 또는 장 관련 질환 치료제 및 면역증진제로 이용될 수 있다.

계피, 균총, 유익균, 장면역, 면역조절

Description

계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선 및 면역기능 증진용 조성물{The composition comprising extract of Cinnamomum cassia bark for improving normal flora and enhancing immune response}

도 1은 계피 추출물을 포함한 액체배지에서 장내 유익균의 생육 활성정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2a는 계피 추출물을 경구투여 하였을 때 마우스 장림프절에서 분리한 T 면역세포에 의한 IFN-gamma의 발현양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 계피 추출물을 경구투여 하였을 때 마우스 장림프절에서 분리한 T 면역세포에 의한 TNF-α발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 계피 추출물을 경구투여 하였을 때 마우스 장림프절에서 분리한 B 면역세포에 의한 각종 사이토카인의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 3a는 TNF-α, 도 3b는 IL-10, 도 3c는 IL-4 및 도 3d는 IFN-gamma의 발현량을 측정한 결과를 나타낸다.

도 4는 계피 추출물을 경구투여 하였을 때 마우스 라미나프로프리나에서 분리한 단일핵 세포에 의한 IFN-gamma 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 계피 추출물을 경구투여 한 후 비장과 장림프절에서 CD⁴⁺ T-세포 분리 후 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 자극을 준 후 T-세포 증식력을 측정한 그래프이다.

도 6은 마우스에 계피 추출물을 경구투여 한 후 비장과 장림프절에서 CD⁴⁺ T-세포와 B-세포 분리 후 PMA와 이오노마이신으로 6시간 자극 후 TNFα와 IFN-gamma의 세포내 생성량을 유세포 분석기로 측정한 그래프이다.

도 7은 마우스 림포마 T-세포인 EL4세포에 TNFαlapha 리포터 벡터를 발현시킨 후 계피 추출물 처리했을 때 투여농도에 따라 변화되는 리포터 유전자의 발현정도를 측정한 그래프와 PMA 및 이오노마이신과 계피추출물을 함께 처리한 후 변화되는 리포터 유전자의 발현정도를 측정한 그래프이다.

본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 하는 장내 균총 개선 및 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장내 유익균인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 에스피(Lacotobacillus sp.)와 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 의 생육을 촉진하고 일반면역계림프구와 같은 면역 세포를 증식시키는 기능과 함께 장관면역계의 면역세포 활성 기 능을 갖는 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

사람은 출생과 동시에, 미생물이 장내에 서식하기 시작하여 그 집단이 평형에 도달하면 안정된 장내 균총을 형성한다. 장내 균총은 숙주의 생리적 조건, 음식물, 약물 및 스트레스 등과 같은 여러가지 요인에 따라 변동한다.

정상균총을 구성하는 미생물의 숫자와 활동은 외래성 인자(aloogenic factor)와 내인성 인자(autogenic factor)에 의해서 조절되는데(Yazawa T., Letters in applied Mocrobiology 10: 229-232, 1990), 전자는 숙주의 환경이나 식이 등에서 유발되며 후자는 균총내의 미생물들 사이에서 주로 일어나게 된다.

즉, 정상균총의 균형은 장내의 강한 혐기적 조건, 장의 연동운동, 연속적인 배설 하에서 장관내의 서식처와 영양원에 대하여 경쟁하는 과정에서 이루어지고 일부는 pH, 산화환원 전위, 담즙산, 생산되는 박테리오신(bacteriocin), 지방산, 유화수소 등에 의하여 정상균총의 균형이 이루어지는 것으로 보고되어 있다(Yazawa K. and Tamura Z. Bifidobacteria Microflora 1(1): 39-44, 1982).

장내 균총을 구성하는 개개의 미생물은 물질생산 또는 분해능에 의해 숙주에게 피해 또는 이익을 주기도 하는데 장내 균총 전체적으로 볼 때는 비타민 공급, 감염방지 및 장 기능(연동운동 및 흡수)을 돕는데 관여하고 있고 이로 인해 균총의 조성은 변비, 장 관련 질환 발생 등과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다(Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1(1): 3, 1982).

노인들과 장이 좋지 않은 사람들은 장내에 비정상의 균총(Mitsuoka T, Journal of Industrial Microbiology, 6:263, 1990)이 형성되어 있는데, 보통 소장에서의 균수가 현저히 증가하거나 유익균인 비피도박테리움 SPP(Bifidobacterium spp)이 줄어들거나 없어지는 반면 C. perfringers 등의 clostridium spp.는 현저히 증가한 상태인 경우가 많다. 따라서 건강하게 장수하기 위하여 비피도박테리움 spp 등의 유용세균은 많이, 그리고 c. perfringers 등의 유해세균은 적은 상태로 유지시키는 이상적인 장내 균총을 유지시키는 것이 제안되고 있다(Mitusoka T., Ecology and role of intestinal flora., Japan Scientific Society Press, Tokyo, p.1, 1989).

한편, 계피(Cinnamomum cassia bark)는 녹나무과의 사철푸른 교목의 껍질로 중국의 남부나 월남등지에 자생한다. 계피는 교목의 껍질, 계지는 그 가지, 육계는 두터운 껍질을 말하며, 계심은 오래된 나무의 두터운 껍질을 펴서 말린 것을 의미한다. 계피에는 정유(계피 알데히드75~90%, 신나밀 알데히드 등) 1~3.4%, 탄닌질 2~3%, 점액, 탄수화물 등이 포함되어 있는데 5~6년 자란 나무에서 정유함량이 높다고 한다. 계피는 예로부터 발한제, 해열제, 진통제 뿐 아니라 식료품의 향료 등 다양하게 사용되어 왔다. 또한, 장 연동운동을 촉진하고 장내의 이상발효를 억제하는 방부효과가 있다고 알려져 있으나 구체적인 기작은 알려져 있지 않다.

또한, 계피는 예로부터 체질이 허약하고 기혈이 허한 사람을 위한 한방약재로 쓰여 면역능력을 촉진하는 효과가 있을 것으로 예상되어 왔으나 그 정확한 기작 역시 알려진 바가 없다. 따라서 면역반응에 관여하는 기관인 백혈구계 세포(림프구, 혈장세포, 식세포, 과립구) 또는 림프기관(임파절, 비장, 흉선, 장)에 계피가 어떠한 영향을 미치는지 관찰하면 그 기작을 알아낼 수 있을 것이다. 특히, 장관면역체계는 외부에서 들어오는 많은 음식항원들과 정상 균총들이 함께 공존하는 곳에서 면역관용이 일어나고 있는 것을 보여주는 단적인 예이다. 장관면역체계는 음식이나 정상세균총과 같은 무해한 항원에 대해서는 반응하지 않으면서도 유해균이나 바이러스같은 해로운 항원에 대해서는 선택적으로 반응하는 체계(면역학적 항상성)를 유지하고 있다. 장내의 면역항상성은 정상인 경우 무해한 항원들에 대한 구강면역관용과 해로운 항원들에 대한 면역작용에 의해 유지되나 장내에서 어떤 기작에 의해 구강면역관용이 깨지게 되면 음식에 섞인 항원에 대한 반응이나 정상세균총 및 장벽자체에 대한 면역반응이 발생하는 염증성장염이 유발되어 장의 소화기능 및 배설기능에 큰 장애를 받게 된다. 장관면역은 1차와 2차로 나누어지는 림프조직계 중 2차 림프조직계로 분류되는 생체림프조직의 1/3이상을 차지하는 점막림프기관의 3가지 중에서 장관관련 림프상조직에 속하면서 장관의 점막부위에 존재하고 장관면역계 내 면역글로블린 에이 반응(IgA response)을 비롯하여 생체방어에 대단히 중요한 역할을 담당한다(Bienestock, J. et. al., Immunol., 41, 249∼270(1980)). 장관면역의 주요 역할은 가용성 항원, 세균, 바이러스 등을 세포흡수작용(pinocytosis)이나 식작용(phagocytosis)에 의해 섭취하여 림프세포에 이동시킴으로써 세포의 활성화에 기여한다(Trier, J., Gastroenterol. Clin. North Am., 20, 531∼547(1991).

계피 추출물을 함유하는 조성물 관련 특허로는 계피 추출물을 함유하는 동맥 경화증 예방 및 치료용 조성물(대한민국 특허 10-1998-0021474), 육계피 추출물을 함유하는 화장료 조성물(대한민국 특허 10-1999-0034707) 및 나노입자화된 계피 추출물을 함유하는 구강위생 증진용 조성물(대한민국 특허 10-2002-0074210)에 관한 것이 있으나, 상기 특허 중 어느 것도 계피의 장내 균총 개선과 면역 증진 활성에 대해서는 기술하고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 계피 추출물을 유효성분으로 하는 조성물이 장내 유익균인 Bifidobacterium longum, Lacotobacillus sp.와 Lactobacillus acidophilus 에 대해 생육 촉진 효과를 나타내고, 비장과 장관 내의 림프구와 같은 면역 세포를 증식시키는 기능이 있어, 변비, 장 관련 질환 치료제 및 면역 증진제, 특히 장관계 면역 증진제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장관계 면역 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강식품 을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장관계 면역 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 장내 균총을 개선할 수 있는 양의 계피추출물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 장내 균총 개선 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 면역증진이 요구되는 환자에게 면역증진에 적합한 양의 계피추출물을 투여하는 단계를 포함하는 면역증진방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약리학적 유효용량의 계피추출물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자의 장관련 질환의 치료방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선용 조성물을 제공한다.

계피 (Cinnamomum cassia bark)는 녹나무과의 사철푸른 교목의 껍질로 중국의 남부나 월남등지에 자생한다. 예로부터 발한제, 해열제, 진통제 뿐 아니라 식료품의 향료 등 다양하게 사용되어 왔고 장 연동운동을 촉진하고 장내의 이상발효를 억제하는 방부효과가 있다고 알려져 있으나 구체적인 기작은 알려져 있지 않다.

한편, 미생물이 장기관내에 서식하기 시작하여 집단이 평형에 도달함으로써 장내 균총을 형성하는데 장내 균총을 구성하는 개개의 미생물은 비타민 공급, 감염방지 및 장 기능 등에 관여하고 이로 인해 균총의 조성은 변비, 장 관련 질환 발생 등과 깊은 관계가 있다고 알려져 있다 (Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1(1): 3, 1982).

본 발명자들은 장 기능 개선효과가 있다고 알려진 계피 추출물이 장내 유익균에 어떠한 활성을 나타내는지 알아보았다. 먼저, 건조한 상태의 계피 (화진유통)를 수득하여 이를 열탕 추출기에서 3시간 추출한 후, 상기 추출액을 여과지로 여과하고 감압 증류장치로 농축하여 동결건조하고 이를 분말로 만들었다. 상기 추출 분말 시료를 실험마다 필요한 농도가 되도록 멸균 증류수에 현탁시킨 후, 여과하여 사용하였다.

본 발명의 계피 추출물은 물, 단일 또는 혼합 에테르, 에탄올, 메탄올 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하고 감압농축함으로써 제조되며, 상기 용매는 물을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 추출은 열탕, 냉침, 환류 또는 초음파 등의 방법에 의할 수 있으며 열탕 추출인 것이 바람직하다.

한편, 다양한 장내 균총 중 장내 유익균의 지표로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum ATCC 15707), 락토바실러스 에스피(Lactobacillus sp. KCTC 3930), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356)를 사용하는데 상기 균주들은 Reinforced Clostridial Media(RCM) 배지에서 37℃ BBL GasPak (Becton Dickinson and Company)에 넣은 혐기적 조건으로 배양시켜 사용하였다.

본 발명자들은 계피 추출물이 비피도박테리움 롱검, 락토바실러스 에스피 및 락토바시러스 아시도필러스 균주의 생육 활성에 미치는 영향을 알아보기로 하였다. 이를 위하여 분말 시료로 제작한 계피 추출물이 여러 가지 농도로 첨가된 배지를 만들고 비피도박테리움 롱검, 락토바실러스 에스피 및 락토바시러스 아시도필러스의 전배양액을 배지에 접종하여 배양한 후, O.D (optical density)를 측정하여 균의 생육상태를 조사하였다. 그 결과, 계피 추출물의 양을 늘릴수록 균주의 생육이 증가하여 O.D. 값이 높아지고 생육 활성비(실험군의 O.D 값/대조군의 O.D. 값)도 증가함을 관찰하였다 (도 1 참조).

또한, 직경 6 mm 디스크 페이퍼에 다양한 농도로 계피 추출물을 적하한 후, 디스크 페이퍼를 굳힌 배지위에 일정 간격을 두고 배치하여 상기 균주를 배양한 후 생육 활성환의 크기를 관찰하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 계피 추출물 10mg/disc를 배치한 고체 배지에서 비피도박테리움 롱검, 락토바실러스 에스피 및 락토바시러스 아시도필러스 균주는 모두 넓은 생육 활성환을 나타내어 본 발명 의 계피 추출물이 장내 유익균에 생육 활성 효능을 갖는 것을 확인하였다 (표 1 참조).

또한, 계피 추출물을 마우스에 경구투여 하여 마우스의 혈액 구성 성분이 어떻게 변화하는지도 관찰하기로 하였는데 이를 위하여, 15일 동안 500mg/kg/일의 양으로 계피 추출물을 경구투여 하고 그 결과를 관찰하였다. 15일 후 혈액 구성 성분은 대조군과 비교하여 유의적으로 차이를 나타내지 않았다 (표 2 참조).

본 발명자들은 기혈보충을 위한 한약재로 사용되어온 계피 추출물이 실제로 생육 활성 효능 뿐 아니라 면역 세포 증식능을 갖는지 관찰하기로 하였다. 이를 위하여, 계피추출물을 투여한 마우스의 비장에서 T세포를 분리하여 분열능력을 측정한 결과과 높은 분열능력을 나타내었다 (도 5).

또한, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장관계 면역 증진용 조성물을 제공한다. 장관계 면역은 일반 체액성 면역과 그 작용영역 및 기작에 있어서 큰 차이가 존재하므로, 특정 물질이 체액성 면역증진작용이 있다고 하여, 당해 물질이 곧바로 장관계 면역증진작용이 있다고 볼 수는 없다. 본 발명자들은 계피 추출물을 마우스에 경구투여 하여 장관면역계와 일반면역계 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 마우스에 계피 추출물을 경구투여한 후, 장내 면역반응의 지표가 되 는 장면역세포 (장림프절 T 세포와 B 세포, 라미나프로프리아 단일핵 세포)의 사이토카인 발현량을 관찰하였다. 그 결과, 놀랍게도 계피 추출물을 투여시, 대조군에 비해 면역반응을 촉진 및 제어하는 사이토카인의 분비제어를 통해 장내 면역 활성이 조절되어짐을 확인하였다(도 2, 3, 4 및 6 참조).

본 발명의 장내 균총 개선 및 면역 기능 증진용 약학 조성물은 상기 계피 추출물을 유효성분으로 함유하고 상기 계피 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 장내 균총 개선 및 면역 기능 증진용 약학 조성물에서, 계피 추출물의 투여용량은 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 1g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 계피 추출물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

본 발명의 계피 추출물의 원료인 계피는 천연약재로서 안전성이 확보되어 있으며, 특히 본 발명의 계피 추출물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량 (LD₅₀)은 적어도 계피 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

아울러, 본 발명은 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선 및 면역 기능 증진용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 계피 추출물을 식품으로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 계피 추출물을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 40 내지 70 중량%, 바람직하게는 50 내지 60 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 건강식품의 계피 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 계피 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되지는 않는다.

<실시예 1> 실험재료

<1-1> 계피 추출물의 제조

화진유통에서 구입한 건조 계피를 분쇄한 후, 열수 추출기에서 3시간 추출하였다. 계피 열수추출물은 여과지로 여과하여 상층액은 회전식 진공 농축 증발기로 농축한 후 동결 건조기(일신)를 이용하여 동결건조하여 추출 분말 시료를 만들었다. 상기 추출 분말 시료를 필요한 농도가 되도록 멸균 증류수에 현탁시킨 후, 여과하여 사용하였다.

<1-2> 장내 세균 준비

장내 유익균의 지표로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum ATCC 15707), 락토바실러스 에스피(Lactobacillus sp. KCTC 3930), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356)를 사용하였다. 균주들은 Reinforced Clostridial Media(RCM, Difco, USA) 배지에서 37℃ BBL GasPak(Becton Dickinson and Company, USA)에 넣은 혐기적 조건으로 배양하여 사용하였다.

<실시예 2> 계피 추출물이 장내 유익균의 생육 활성에 미치는 영향 확인

본 발명의 계피 추출물이 장내 유익균 중 비피도박테리움 롱검, 락토바실러스 에스피 및 락토바실러스 아시도필러스 균주의 생육 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 계피 추출물이 장내 유익균의 생육 활성에 미치는 영향에 대한 실험은 3번 반복하여 실시하였고, 실험결과는 물로 처리한 대조군에 대해 계피 추출물을 처리한 실험군의 O.D. 값에 대한 비로 나타내었다.

<2-1> 액체 배양에 의한 생육 활성 실험

계피 추출물이 장내 세균의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위해 계피 추출물을 동결건조 시켜 만든 엑기스 기질을 100ug, 1mg, 10mg/ml 농도로 첨가한 변형된 EG(Eggerth Gagnon) 배지(beef extract 2g, proteose peptone No.3 10g, yeast extract 5g, Na₂HPO₄ 4g, soluble starch 0.5g, glucose 1.5g, L-cysteine 0.4g, silicon antifoamer 0.25ml, Tween 80 0.5g, D.W 1,000ml)를 만들었다. 이에 실시예 <1-2>와 같이 혐기적 조건에서 활성화시킨 비피도박테리움 롱검, 락토바실러스 에스피 및 락토바실러스 아시도필러스의 전배양액을 접종하여 혐기적으로 37℃에서 18시간 배양한 후, 600nm에서 O.D.를 측정함으로써 균의 생육상태를 조사하였다.

실험결과는 물로 처리한 대조군의 O.D. 값에 대해 계피 추출물을 처리한 실험군의 O.D. 값에 대한 비로 나타내었다. 계피 추출물을 포함한 액체배지에서 장내 유익균의 생육 활성정도를 측정한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 계피 추출물의 양을 늘릴수록 균주의 생육이 증가하여 O.D. 값이 높아졌는데 계피 추출물 10 mg/ml로 첨가하였을 때, 대조군에 비해 최대 2.4배 락토바실러스 에스피의 생육을 촉진하였고 비피도박테리움 롱검과 락토바실러스 아시도필러스 균주도 계피 추출물의 농도가 증가함에 따라 균주의 생육 활성비도 증가함을 관찰하였다.

<2-2> 아가 분산법(Agar diffusion method)에 의한 생육 활성 실험

EG 한천배지를 멸균한 후 50℃로 식히고 3 종의 균주가 각각 2~3% 포함 되도록 군주를 접종한 플레이트 3개를 만든 후, 상온에서 배지를 굳혔다. 직경 6 mm 디스크 페이퍼(Whatman paper No.41)에 0.1mg, 1mg, 10mg 농도가 되도록 계피 추출물을 적하한 후, 이를 굳힌 배지위에 일정 간격을 두고 배치하였다. 상기 배지를 혐기적 조건으로 37℃에서 48시간 배양한 다음 생육 활성환의 크기를 관찰하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 계피 추출물 10mg/disc를 배치한 고체 배지에서 비피도박테리움 롱검 균주는 + 정도의 생육 활성환을 나타내었고 락토바실러스 에스피 균주는 + 정도의 생육 활성환을 나타내었고 락토바실러스 아시도필러스 균주는 +++ 정도의 넓은 생육 활성환을 나타내어 본 발명의 계피 추출물이 높은 생육 활성 효능을 갖는 것을 확인하였다.

표 1: 계피에 대한 장내균총 개선 활성 결과

Strain	Dose (mg/disc)
	0.1	1	10
B. longum	n	n	+
C. perfringens	n	-	-
Lactobacillus sp.	n	+	+
L. acidophilus	+	++	+++

n : no effect, + : 직경 10-14 mm ++ : 직경 15-19 mm,

+++ : 직경 20-24 mm - : inhibitory zone 직경 10-14 mm

<실시예 3> 마우스 경구 투여시 계피 추출물이 혈액에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 계피 추출물을 마우스에 경구투여 하였을 때 혈액 구성 성분의 변화를 관찰하기로 하였다. 이를 위하여, 6 주령의 수컷(male) 마우스를 대조군, 계피 추출물 경구 투여군(각 군당 3마리씩)으로 나누고 15일 동안 500mg/kg/일의 양으로 계피 추출물을 경구투여 하였다. 혈액 조성의 분석은 쿨터 카운터(coulter counter, COLUTER JT)를 사용하였고, 결과는 표 2로 나타내었다.

테스트	정의	대조군	계피 추출물
체중	체중	38.49±2.356b)	36.61±3.192
WBC	백혈구(leukocyte)	2.77±0.831	2.5±1.127
LY	림프구	71.77±6.725	53±9.582
MO	단핵구(mononuclear cell)	9.83±3.85	6.4±4.667
GR	과립구(Granulocytes)	18.40±5.449	38.73±13.462
LY#	림프구	2.00±0.648	1.3±0.656
MO#	단핵구	0.28±0.117	0.2±0.141
GR#	과립구	0.48±0.223	1±0.656
RBC	적혈구(erythrocyte)	6.18±0.939	6.34±0.333
HGB	헤모글로빈	10.13±1.568	10.33±0.416
HCT	적혈구 용적률	31.57±4.807	33.13±1.115
MCV	평균 혈구 부피(Mean corpuscular volume)	51.11±1.426	52.3±1.646
MCH	평균 혈구 헤모글로빈(Mean corpuscular hemoglobin)	16.39±0.306	16.3±0.529
MCHC	평균 혈구 헤모글로빈 농도	32.06±0.712	31.17±0.252
RDW	적혈구 부피 분포폭(distribution width)	16.54±0.677	15.73±1.415
PLT	혈소판(thrombocyte)	88.00±21.463	108.67±16.773
MPV	평균 혈소판 (thrombocyte) 부피	4.24±0.374	4.23±0.153

표 2에 나타난 바와 같이, 마우스에서 계피 추출물을 경구투여 하였을 때, 투여군과 대조군은 유의적으로 차이를 나타내지 않았다.

<실시예 4> 마우스의 장관계 면역 증진 효능 확인

<4-1> 마우스 장면역 세포 분리

계피 추출물의 구강투여시 호스트의 면역체계에 미치는 영향을 알아보기 위해서 마우스 비장(spleen), 림프절(lymph node), 장림프절(mesentric lymph node), 라미나프로프리아(Lamina propria mononuclear cells)을 각각 분리하였다.

구체적으로, 계피추출물의 구강투여를 마친 후 실험용 마우스를 희생하여 비장, 장림프절 그리고 장을 적출한 후 비장과 장림프절에서 T 세포와 B 세포의 분리를 위하여 ‘자기적 방법’을 사용하였다. 자기적 방법이란 T 세포와 B 세포에 특이적인 자기적 비드를 이용하여 T, B 세포에 결합시킨 뒤 이것을 강한 자기장 위에 위치하게 하여 자기적 비드가 붙은 T, B 세포가 자기장에 고정되게하여 비특이적 세포들을 제거하고 후에 자기장을 제거함으로서 원하는 T 세포와 B 세포를 획득하는 방법이다.

장에서 라미나프로프리아 단일핵 세포를 분리하기 위해 일단 장을 적출한 후 그것을 콜라겐네이즈 효소(Type I collagenase, Sigma, USA)를 이용하여 장의 근육조직을 일차적으로 제거한 후(3시간 동안 1% 콜라겐네이즈 처리) 근육조직의 밑에 위치하고 있는 라미나프로프리아 층에서 세포를 단일 세포화 시킨 후 마지막으로 퍼콜(fercoll) 농도 구배 방법을 이용하여 살아 있는 라미나프로프리아 단일핵 세포를 획득하였다.

<4-2> 마우스 장 림프절의 T 면역 세포가 분비하는 사이토카인 발현량 측정

PMA(Sigma, USA)와 이오노마이신(Ionomycin, Kalbiochem, Switzerland)을 이용하여 세포에 자극을 주었으며, 생체 내 조건과 가깝게 하기 위해 생체내 T 세포를 대상으로 수행하는 실험에서 쓰이는 CD3와 CD28 항체(BD bioscience, USA)를 이용하여 일정시간(48시간) 자극을 가한 뒤 장 림프절에 위치하는 T 세포에서 나타나는 변화 양상을 확인해 보았다.

그 결과, 장 림프절에 T 세포에서 의미있게 나타난 단백질(면역유도물질)의 변화는 약 2가지 정도를 확인할 수 있었는데, 먼저, 장 림프절 B 세포에서 나타났던 티엔에프 알파(TNF-α, tumor necrosis factor-alpha)의 경우 B 세포의 결과와 동일하게 자극에 관계없이 대조군 세포에 비해 mRNA 발현양이 많음을 확인 할 수 있었다. 그러나 현재 계피추출물에 의해 유도된다고 보고되었던 인터페론 감마(Interferon gamma)의 경우는 세포가 받는 자극에 따라 다른 패턴을 나타내나 계피추출물에 의해서는 증가하는 경향을 확인 할 수 있었다(도 2a 및 도2b)

<4-3> 마우스 장림프절의 B 면역 세포가 분비하는 사이토카인 발현량 측정

마우스에 10일 동안 계피 추출물을 500mg/kg/일, 5000mg/kg/일을 구강투여한 뒤 생쥐를 희생하고 자기적 방법에 의해 장 림프 절에서 T 세포와 B 세포를 분리하였다. 상기 PMA와 이오노마이신을 이용하여 분리한 세포에 자극을 주었으며, 보다 더 동물의 실제상황에 가깝게 접근하기 위해 in vivo B 세포를 자극하기 위해 사용되는 LPS (lipopolysscaride)를 이용하여 역시 B 세포에 4시간 자극을 가한 후 각 그룹의 B 세포가 나타내는 변화를 확인하였다.

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그 결과, 대조군에 비해 실험을 통해 확인하였던 분자물질 중 실험 군에서 의미 있는 변화가 있음을 확인하였는데, 우선 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)의 경우 대조군에서는 발현양이 거의 확인되지 못할 정도로 미비하였으나 500mg/kg/일, 5000mg/kg/일 경구투여 두 그룹 모두에서 대조군에 비해 자극에 관계없이 특이적인 과발현 패턴을 확인하였다 (도 3a). 인터루킨-10의 경우도 앞의 티엔에프 알파 단백질 경우와 같은 발현 양상을 보여 주었으며(도 3b), 인터루킨-4의 경우는 자극이 없을 때와 PMA/이오노마이신 자극이 가해졌을 때는 대조군에 비해 소폭의 증가를 보였으나 LPS를 이용하여 자극을 주었을 때는 대조군에 비해 약 100배 이상 발현양이 증가함이 확인되었다(도 3c). 뿐만 아니라 인터페론 감마 의 발현양 역시 농도에 의존적인 경향성을 보이며 자극의 종류에 관계없이 뚜렷이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3d).

일반적으로 장관면역계에 대한 연구를 할 때 가장 중요시 되는 세포가 라미나프로프리아 단일핵 세포이다. 이 세포는 장의 외피세포 바로 아래 위치하는 면역세포로서 장관면역을 조절하는 가장 큰 세포라 인식되어 지고 있다. 하지만 많은 연구자들이 그 세포의 획득에 어려움으로 그것을 이용한 실험을 못하고 있는 실정이다. 그러나 본 실험에 앞서 실험방법에서 언급했던 것과 같은 방법으로 라미나프로프리아 단일핵 세포를 획득하는 방법을 확립하였고 그에 따라 그 세포를 이용하여 앞서 진행하였던 실험과 동일한 방법으로 자극을 주어(PMA/Ionomycin, LPS, 항-CD3/항-CD28) 계피 추출물에 대한 mRNA 발현양의 변화를 확인하였다. 라미나프로프리아 단일핵 세포에 대한 계피 추출물에 대한 반응물질 분석 결과는 특이적으로 인터페론 감마(Interferon-gamma)가 대조군에 비해 큰 변화를 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.(도 4).

<실시예 5> 마우스 비장과 장림프절 면역증진 효능 확인

<5-1> 마우스 비장 T 헬퍼 세포 분리

마우스 비장에서 CD⁴⁺ T 헬퍼 세포를 분리하기 위하여 실험용 쥐를 희생한 후 그것에서 비장을 적출하였다. 비장의 적출 후 비장의 조직을 물리적 힘을 통해 파괴하여 단일 세포가 통과할 수 있는 정도의 필터(40μm nyron mesh; Falcon)에 흘려주어 단일 세포화 하였다. 비장세포의 단일화 후 CD⁴⁺ T 세포의 분리를 자기적 방법을 통해 분리한 후 CD4에 특이적으로 결합할 수 있는 금속성 비드(Miltenyi Biotec, USA)를 첨가하여 우선 CD⁴⁺ T 세포 표면에 붙도록 하였다. 그 후 세포를 강한 자기장 위에 위치시켜 금속성 비드가 붙어있지 않은 세포들을 제거하고 그 후 자기장을 제거하는 방법을 통해 CD⁴⁺ T 세포를 마우스 비장에서 획득할 수 있었다.

<5-2> 계피추출물의 구강투여시 마우스 비장과 장 림프절 T 세포에 분열 능력에 미치는 영향의 평가

한방에서 알려진 사실을 바탕으로 하여 본 실험자는 계피추출물의 구강투여가 호스트 T 세포에 분열 능력에 미치는 영향을 평가해보았다. 실험에 앞서 8주간 20회에 걸쳐 실험용 쥐에 계피추출물을(500mg/kg/1회)을 구강 투여 하였으며 구강투여가 끝난 후 쥐를 희생하여 비장과 장 림프절을 적출하였다. 적출된 두 조직에서 앞서 언급한 방법과 같은 방법으로 CD⁴⁺ T 헬퍼 세포를 분리 하였다. 분리한 T 세포의 분열 능력의 측정을 위해 일단 동일수의 세포에 항-CD3 항체(1ug/ml) 및 항-CD28 항체(1ug/ml)로 자극 후 약 3일간 세포배양을 통해 세포가 자극에 대해 충분히 반응 및 분열 할 수 있는 시간을 주었다. 그 후 방사선 동위원소([³H]-thymidine)를 일정량 첨가하여 그것이 세포내 DNA에 결합하도록 하여 증가한 세포의 수를 방사성 동위원소의 방사능을 측정함으로서 세포의 분열 정도를 비교하였다. 그 결과, PBS를 구강 투여한 T 세포에 비해 계피추출물을 투여한 T 세포가비장과 장 림프절 모두에서 자극에 대해 더 높은 분열 능력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 5).

<5-3> 계피추출물의 구강투여시 마우스 비장과 장 림프절 T 세포에 인터페론-감마와 TNFα의 발현능력 측정

선행실험을 통해 계피의 구강투여가 T 세포에서 면역증강 작용을 하며 면역에 대표적인 사이토카인(cytokine)인 INFγ와 TNFα의 발현 양을 자극에 반응하여 비 투여 그룹의 T 세포에 비해 mRNA 레벨을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 하여 단백질 수준에서 위의 두 가지 사이토카인의 발현을 평가해 보았다. 이를 위해 상기 실험과 같은 방법으로 계피를 구강 투여한 실험쥐와 PBS를 구강 투여한 실험쥐에서 비장과 장 림프절 각각에서 T 세포와 B 세포를 분리하였다. 이렇게 분리된 T 세포와 B 세포가 사이토카인을 생산할 수 있도록 일정시간동안 PMA와 이오노마이신을 이용하여 자극을 준 뒤, 이렇게 자극에 의해 생산된 사이토카인이 세포 외부로의 방출을 막기 위해 Brefeldin A(Epicentre biocompany; B901MG, USA)를 자극을 받은 세포에 처리하여 ER에서의 생성 단백질의 이동을 막는 작업을 하였다. 이렇게 일정시간 ER내에서의 단백질의 이동을 막은 뒤, 세포에 투과 완충용액(permeabilization buffer; 0.5% saponin, 1% BSA in D.W)를 이용하여 세포막에 구멍을 만들고 그렇게 구멍이 만들어진 세포에 특정 형광물질(항-IFN-PE, 항-TNFa-PE)로 표지되어 있는 INFγ와 TNFα를 첨가하여 세포 내부에서 만들어진 사이토카인의 양을 유세포 측정기를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 계피를 구강투여 하였을 경우 대조군(PBS 투여 실험 쥐)에 비해 비장의 T 세포에서는 TNFα의 발현이 경미하게 증가함을 알 수 있었으며 장 림프절 T 세포에서는 그 발현양의 증가가 대단히 커짐을 확인할 수 있었다. 하지만 INFγ의 발현 증가는 거의 확인할 수 없었으며 B 세포에서는 두 사이토카인 모두가 대조군과 실험군에서 차이를 확인할 수 없었다(도 6).

<실시예 6> in vitro 리포터 어세이 시스템에서 면역증진 효능 확인

<6-1> 계피추출물이 사이토카인의 발현에 미치는 영향에 대한 in vitro 스크리닝

in vivo 실험에 앞서 계피추출물이 호스트의 면역체계에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 간접적 실험으로 루시퍼라제 리포터 어세이 시스템(TaKaRa, Japan)을 이용하여 계피추출물이 면역세포의 사이토카인(cytokine)의 발현에 미치는 영향을 스크리닝하였다. 먼저, 루시퍼라제 유전자를 가진 벡터 (pXPG vector, Plasmid 44, 173-182, 2000) 앞쪽에 IL2, IL4, IL10, IL24, TNFα 사이토카인의 프로모터 지역을 클로닝 방법을 통해 삽입하여 루시퍼라제의 활성이 업스트림의 사이토카인 프로모터의 발현 정도에 의해 조절될 수 있도록 재조합 벡터를 만들었다.

상기 제조과정은 구체적으로, XhoI 그리고 KpnI 제한효소를 이용하여 루시퍼라제가 발현되기 시작하는 부위의 앞부분을 잘라 벡터를 준비하고 인서트의 경우는 생쥐에서 T 세포를 분리한 뒤 게놈 DNA를 뽑아낸 후 그것에서 각 프로모터 특이적이며 양쪽 끝에 XhoI과 KpnI 제한효소 자리를 그리고 앞쪽에 시작코돈을 가지는 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 이용하여 프로모터 부위를 증폭 후 증폭되어진 프로모터를 두 제한효소를 이용해 자른 후 그것을 다시 정제하여 준비한 후, 이렇게 준비된 벡터와 인서트를 리가제(New England Biolabs)를 이용하여 연결시켰다.

상기와 같이 만들어진 재조합 벡터로 마우스 T 세포주의 한 종류인 EL4 세포(ATCC; TIB-39)를 lipoplex 방법(Invitrogen; Lipofectamine 2000)을 이용하여 형질감염시킨 뒤 계피추출물만으로 또는 계피추출물과 PMA+이오노마이신으로 T 세포주에 자극을 일정시간 준 뒤 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석용 키트(Dual luciferase assay system, Promega, USA)를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용된 유전자 프로모터는 앞서 언급한 것과 같이 IL2, IL4, IL10, IL24, TNFα 다섯 가지를 측정하였으나 여러 번의 반복적인 실험을 통해 계피추출물의 자극에 의해 활성이 증가하는 사이토카인이 TNFα임을 확인할 수 있었다. 즉 계피추출물로 세포주에 자극을 주었을 경우 자극을 주지 않았을 경우에 비해 농도 별로 그 활성이 증가하며 1%의 계피추출물로 자극을 주었을 경우 약 5~6배의 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었고 계피추출물과 PMA+이오노마이신으로 함께 자극을 주었을 경우에는 0.1%와 0.3% 농도로 함께 자극을 주었을때 그 활성이 단지 PMA+이오노마이신으로 자극을 주었을때 보다 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

<실시예 7> 래트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 계피 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/㎏, 5g/㎏ 및 10g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 계피 추출물은 랫트에서 10 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD₅₀)은 실시예 1에 따라 조제된 계피 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 연질캅셀제의 제조

실시예 1에 따라 조제된 계피 추출물 100.0mg, 콩기름 175.0mg, 황납 45.0 mg, 야자경화유 127.5mg, 대두인지질 21.0mg, 젤라틴 212.0mg, 글리세린 (비중 1.24) 50.0mg, 디-소르비톨 76.0mg, 파라옥시안식향산메칠 0.54mg, 파라옥시안식향산프로필 0.90mg, 메칠바닐린 0.56mg, 황색 203호 적량의 성분이 1 캅셀 중에 함유되도록 약전 제제총칙중 연질캅셀의 제법에 따라 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 1에 따라 조제된 계피 추출물 100.0mg, 옥수수전분 90.0mg, 유당 175.0mg, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 15.0mg, 폴리비닐피롤리돈90 5.0mg 및 에탄올 적량의 원료를 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8mg을 가하여 혼합한 후 1정이 400mg이 되도록 타정하였다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

실시예 1에 따라 조제된 계피 추출물 100.0mg, 옥수수전분 83.2mg, 유당 175.0mg 및 스테아린산 마그네슘 1.8mg의 원료를 균질하게 혼합하여 1캅셀에 360mg이 함유되도록 충전하였다.

<제제예 4> 산제의 제조

계피 추출물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 5> 츄잉껌의 제조

실시예 1에 따라 제조된 계피 추출물 0.24 ∼ 0.64%, 껌베이스 20%, 설탕 76.36 ∼ 76.76%, 후르츠향 1% 및 물 2%의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

<제제예 6> 음료의 제조

실시예 1에 따라 제조된 계피 추출물 0.48 ∼ 1.28㎎, 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎, 염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<제제예 7> 소세지의 제조

실시예 1에 따라 제조된 계피 추출물 0.24 ∼ 0.64%, 돈육 63.6%, 계육 27.5%, 전분 3.5%, 대두단백 1.7%, 식염 1.62%, 포도당 0.5% 및 기타첨가물(글리세린) 0.94 ∼ 1.34%의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 소세지를 제조하였다.

본 발명의 계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 장내 균총 개선 및 면역기능 증진용 조성물은 장내 유익균인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 에스피(Lacotobacillus sp.)와 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 대해 생육 활성 효과를 나타내고, 일반면역계 및 장관계 면역계 림프구와 같은 면역 세포 증식능을 높이는 기능이 있으므로 계피추출물을 첨가한 요구르트제품, 계피추출물을 첨가한 유제품, 소화능력이 떨어진 노인이나 와병환자의 소화능력을 향상시켜줄 수 있는 계피음료, 한방소화제, 변비, 숙변치료제 등의 장 관련 질환 치료제 및 면역 증진제로 이용될 수 있다.

Claims

계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 계피 추출물은 물, 에탄올 및 메탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 장내 균총 개선용 조성물.
제 1항에 있어서, 장내 균총은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) , 락토바실러스 에스피(Lactobacillus sp.) 및 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 균총 개선용 조성물.
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계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장내 균총 개선 건강식품.
제 7항에 있어서, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 또는 환의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 장내 균총 개선 건강식품.
계피 추출물을 유효성분으로 함유하는 장관계 면역 증진용 조성물.
제 9항에 있어서, 면역증진은 장림프절의 면역세포 증식 촉진 또는 장림프절의 T-세포의 사이토카인 분비능 향상을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.