CN101277712A - 一种含有肉桂皮提取物用于改善正常菌群及增强免疫应答的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有以肉桂皮提取物作为有效组分用于改善正常菌群与增强免疫应答的组合物，更确切地说，涉及一种含有以肉桂皮提取物作为有效组分，具有促进诸如长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的益生菌生长，促进免疫细胞诸如全身免疫系统淋巴细胞增殖，以及提高肠道免疫细胞活性的作用的组合物。由于具有通过促进免疫细胞增殖提高免疫力特别是肠道免疫力的活性，本发明的组合物可有效用作治疗便秘或其它肠相关疾病的药物和免疫增强剂。

Description

一种含有肉桂皮提取物用于改善正常菌群及增强免疫应答的组合物
【技术领域】
本发明涉及一种含有以肉桂皮提取物作为有效组分用于改善正常菌群及增强免疫应答的组合物，更确切地说，一种含有肉桂皮提取物的药物组合物，所述提取物具有促进长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、乳酸菌(Lacotobacillus sp.)和嗜酸乳酸菌(Lactobacillusacidophilus)生长，促进免疫细胞如全身淋巴细胞增殖，激活肠道免疫系统免疫细胞的作用。
【背景技术】
从出生起，人体就成为肠道微生物的栖居地，且一旦微生物处于平衡状态，它们就形成稳定的肠道细菌菌群。肠道细菌菌群受宿主状态，包括生理状况、食物、药物和压力等的影响。
形成正常菌群的微生物的数量和活性可通过外源因素和自体自身因素来调整(Yazawa T.，Letters in applied Microbiology 10：229-232，1990)。外源因素源于宿主环境及宿主饮食；而自身因素来自菌群内部的微生物。
在强厌氧环境，肠蠕动和持续排泄等条件下，正常菌群通过对栖居地和营养的竞争达到平衡。此外，有报道称：正常菌群的平衡也可以通过诸如pH值，氧化还原电位，胆汁酸，杆菌素，脂肪酸和硫化氢等因素进行调节(Yazawa K.和Tamura Z，BifidobacteriaMicroflora 1(1)：39-44，1982)。
组成肠道菌群的各种微生物对宿主有益或有害取决于其生产和分解的能力，例如，肠道菌群作为整体，参与提供维生素，防止感染和协助肠原生作用(蠕动和吸收)。因此，菌群的组分与便秘及其它肠相关疾病密切相关(Mistuoka T.Bifidobacteria Microflora，1(1)：3，1982)。在老年人群和肠胃虚弱人群中，可观察到异常的肠道菌群(Mitsuoka T，Journal of Industrial Microbiology，6：263，1990)。通常，菌群内的细菌数量在小肠道快速增长，特别是双歧杆菌(益生菌)减少或消失，而诸如产气荚膜芽孢梭菌(C.perfringers)的梭菌快速增长。因此，对长寿健康的人生来说，重要的是降低诸如产气荚膜芽孢梭菌(C.perfringers)的有害微生物，增加诸如双歧杆菌的有益微生物，从而使肠道菌群尽可能地平衡(Mitusoka T.，Ecology and role ofintestinal flora.，Japan Scientific Society Press，Tokyo，p.1，1989)。
肉桂皮是一种月桂科常绿乔木的外皮，主要分布在中国南方和越南。肉桂皮是指外皮，肉桂树干是指树枝，厚树皮，树的干燥老皮和厚外皮。肉桂皮含有1～3.4％精油(苯乙烯醛75～90％，苯丙烯醛等)，2～3％单宁酸、粘胶和碳水化合物。在5～6年生树皮中可观测到更高含量的精油。肉桂皮长期用作发汗剂，退烧药，止痛药和调味品。据报道，肉桂皮在肠道具有促进蠕动，抑制异常发酵的作用。但是，此作用的机制还未见解释。
在亚洲民间传统医药中，肉桂皮还用作体质虚弱和气血(体力和血)虚弱的人的处方药物以提高他们的免疫反应。但是，提高免疫反应的确切机制还未被了解。因此，本发明人猜想：通过观察肉桂皮提取物对参与免疫反应过程的粒细胞(淋巴细胞，浆细胞，吞噬细胞和粒性白细胞)和淋巴器官的影响，可以导出肉桂皮关于增强免疫应答的确切机制的解释。特别是，肠道免疫系统是由各种食物抗原和正常菌群一起存在而引发的免疫耐受性的绝佳示例。更确切地说，对无害抗原如食物和正常菌群，肠道免疫系统无反应，而对有害抗原如病毒和致病菌，免疫系统有选择地作出反应(免疫自稳机制)。肠道的免疫自稳机制通常由对无害抗原的口腔免疫耐受性和对有害抗原的免疫反应维持。但是，一旦肠道免疫机制使免疫耐受性失效，免疫系统就会对包括食物和正常菌群，甚至肠壁本身的抗原作出反应，引起肠炎，从而引发肠消化和肠排泄功能失调。肠道免疫存在于肠相关淋巴网状组织中，淋巴网状组织是三个粘液淋巴器官之一，至少占据活体淋巴组织的1/3；属于两种淋巴组织中的第二淋巴组织；并且可在肠道等器官中由IgA引发的自防御系统起重要作用的肠道粘膜中观察到(Bienestock，J.et.al.，Immunol.，41，249-270(1980))。肠道免疫的关键作用是通过胞饮和吞噬作用吞噬可溶抗原、病毒和细菌，然后将其运到淋巴细胞来激活细胞(Trier，J.，Gastroenterol.Clin.North Am.，20，531-547(1991))。
一些专利文献描述了含有肉桂皮提取物的组合物。例如，含有肉桂皮提取物的防治动脉硬化的药物组合物(Korean Patent No.10-1998-0021474)，含有肉桂皮提取物的化妆品组合物(Korean PatentNo.10-1999-0034707)，以及含有纳米肉桂皮提取物的口腔卫生组合物(Korean Patent No.10-2002-0074210)。但是，还没有关于肉桂皮改善肠道菌群，提高免疫力的说明。
因此，本发明人研究了肉桂皮提取物，证实以肉桂皮提取物为有效组分的组合物可以增加长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳酸菌(Lacotobacillus sp.)和嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)这些益生菌的数量，有助于免疫细胞如淋巴细胞在脾脏和肠道的增殖。由此，本发明人基于通过证实本发明的组合物能用作治疗便秘和其它肠相关疾病的药剂及免疫增强剂，特别是肠道免疫增强剂的发现，进一步完成了此发明。
【发明内容】
【技术问题】
本发明的一个目的是提供一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于改善肠道菌群的组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于增强免疫应答的组合物。
本发明的进一步的目的是提供一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于提高肠道免疫的组合物。
本发明的更进一步的目的是提供一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于增强免疫应答的保健食品。
【技术方案】
为达到上述目的，本发明提供一种含有肉桂皮提取物用于改善肠道菌群的组合物。
本发明也提供了一种含有肉桂皮提取物用于增强免疫应答的组合物。
本发明还提供了一种含有肉桂皮提取物用于提高肠道免疫力的组合物。
本发明还提供一种改善肠道菌群的方法，包括施用有效剂量的肉桂皮提取物的步骤，以改善肠道菌群。
本发明还提供一种提高免疫的方法，包括为需增强免疫力的病人施用有效剂量的肉桂皮提取物的步骤。
本发明还提供一种治疗肠相关疾病的方法，包括为有需求的病人施用药学上有效剂量的肉桂皮提取物的步骤。
最后，本发明还提供了含有肉桂皮提取物作为有效组分用于增强免疫力的保健食品。
下文中，将详述本发明。
本发明提供一种含有肉桂皮提取物，改善肠道菌群的组合物。
肉桂皮是一种月桂科常绿乔木的外皮，主要分布在中国南方和越南，肉桂皮长期用作发汗剂，退烧药，止痛药和调味品。据报道，肉桂皮在肠道具有促进蠕动、抑制异常发酵的作用。但是，还没有对此行为的机制的解释。
一旦达到平衡，栖居在肠道的微生物便开始生长并形成肠道菌群。组成肠道菌群的各种微生物都与提供维生素，防止感染及其它肠道机能有关，表明这些微生物与便秘和其它肠相关疾病密切关联的(Mistuoka T.Bifidobacteria Microflora，1(1)：3，1982)。
本申请发明人研究了肉桂皮提取物的活性，得知其对肠道机能、对肠道益生菌有促进作用。首先，得到干燥的肉桂皮(来自HwajinDistribution Co.)然后在热水提取器中提取3个小时，提取物用滤纸过滤后用真空蒸发器浓缩，然后冷冻干燥得到粉末。当实验需用时，将粉末提取物以适当浓度悬浮分散在灭菌蒸馏水中并过滤。
本发明涉及的肉桂皮提取物是采用选自包括水、单一或混合醚、乙醇、甲醇及乙酸乙酯中的一种或多种来提取，然后减压蒸馏浓缩提取物。所述溶剂优选水，提取方法可以是热水提取、浸渍、回流或超声提取之一，优选热水提取。
各种肠道菌群中，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(ATCC15707)、乳酸菌(Lacotobacillus sp.)(KCTC 3930)和嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)(ATCC 4356)被用作益生菌的指标。可在BBL GasPak(Becton Dickinson and Company)设定37℃的厌氧条件下，利用强化梭状芽孢杆菌培养基(RCM)培养这些菌株。
本发明人研究了肉桂皮提取物对促进长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳酸菌(Lacotobacillus sp.)和嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)生长的影响。为进行此实验，粉末提取物以不同浓度加入要接种长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的预培养溶液的介质中，测量吸光度(O.D)来研究这些菌株的生长情况，当肉桂皮提取物的量增加时，菌株的生长也增加，吸光度更高，生长活性比(实验组吸光度/对照组吸光度)也增加(见图1)。
将不同浓度的肉桂皮提取物置于直径6mm的圆滤纸上，然后应用在固体培养基上。菌株培养完成后，测量生长活性区域的大小。如表1所示，应用肉桂皮提取物10mg/片的固体培养基上培养的促进长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌菌株显示大的生长活性区域，表明本发明涉及的肉桂皮提取物具有促进肠道益生菌生长的作用(见表1)。
将肉桂皮提取物口服施用于小鼠并研究小鼠的血液成分，特别是，以500mg/kg/天的肉桂皮提取物的量施用于小鼠15天，然后检测。结果为：小鼠的血液成分与对照小鼠的血液成分基本无差别(见表2)。
本发明还提供了一种含有肉桂皮提取物用于增强免疫应答的组合物。
本发明人进一步研究常被用作亚洲民间补充气血(能量和血液)的药物的肉桂皮提取物，除了已被证实的能促进肠道益生菌的生长的作用，是否还有促进免疫细胞增殖的作用。为进行此项研究，自施用肉桂皮提取物的小鼠的脾脏内分离淋巴细胞，并研究其细胞分裂能力，结果证明其具有高度细胞分裂能力(见图9)。
本发明也提供一种含有肉桂皮提取物用于提高肠道免疫力的组合物。肠道免疫和体液免疫的机制和作用区域有很大的差别，因此，即使一种物质具有提高体液免疫力的作用，这种物质也不是必然具有促进肠道免疫的作用。为研究肉桂提取物对肠道免疫和全身免疫的作用，本发明人将提取物经口服施用于小鼠，然后测量肠道免疫细胞(肠系膜淋巴结T细胞和B细胞，粘膜固有层单核细胞)的细胞因子表达，这些免疫细胞是肠道免疫反应的指标。
结果发现，当提取物施用于肠道，它可以通过调节参与增强或减弱免疫力的细胞因子表达，显著调节肠道免疫活性(见图2～图8，图10)。
本发明用于改善肠道菌群与增强免疫应答的药物组合物含有作为有效成分的肉桂皮提取物。肉桂皮提取物可以口服或注射施用，可采用药物制剂的所有形式。可口服施用的固体制剂形式是片剂、软或硬胶囊、溶液和悬浮液，这些药物制剂可将提取物与常用填充剂、膨胀剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、诸如表面活性剂的稀释剂或辅料混合制备。
肉桂皮提取物的有效剂量根据体重，年龄，性别，健康状况，食谱，施用频度，施用方法，排泄状况和疾病的严重程度确定。肉桂皮提取物的剂量范围是每天0.1mg～10g/kg，优选每天10mg～1g/kg。单次剂量最好含有活性组合物的有效量，可以一次施用，通常以全部日剂量的1/2，1/3或1/4分次施用。施用频度为一天1～6次。但是，当长期施用以提高健康状况时，提取物的含量可以低于上述分量。但由于本发明的提取物非常安全，有效剂量可含有高于上述分量的量。
作为本发明提取物原料的肉桂皮，经证明是一种安全的物质。将肉桂皮口服施用于大鼠，以检测其毒性。结果发现，因肉桂皮对大鼠的半数致死剂量(LD50)远远大于10g/kg，肉桂皮被评定为安全物质。
本发明也提供了含有以肉桂皮提取物作为有效组分用于改善肠道菌群与增强免疫反应的保健食品。
保健食品可以含有本发明涉及的肉桂皮提取物，此时，根据常规方法，肉桂皮提取物可在与其它食物和组分混合时或混合后添加。有效组分的混合比例取决于用途(预防，保健或治疗)。制作含有肉桂皮提取物食物或饮料时，根据原材料，加入提取物优选40～70wt％，更优选为50～60wt％。但是，当长期施用以提高健康状况时，提取物可以低于上述的含量。但由于本发明的提取物非常安全，有效剂量可含有高于上述的含量。
适用的食物没有限制，肉类，香肠，面包，巧克力，糖果，点心、饼干、比萨、拉面、面条、包括冰激凌的奶制品、汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料及维生素合成物等，以及实际上包括通常制作的每一种保健食品，都可以作为例子说明。
【附图说明】
参考下列附图，将有助于理解本发明最佳实施例的应用，其中：
图1为说明益生菌在含有肉桂皮提取物的液态介质中的生长活性的柱状图；
图2为说明根据肉桂皮提取物的口服剂量，以分离于小鼠肠系膜淋巴结T细胞表示的TNF-α表达水平的柱状图；
图3为说明根据肉桂皮提取物的口服剂量，以分离于小鼠肠系膜淋巴结T细胞表示的IFN-γ表达水平的柱状图；
图4～图7为说明根据肉桂皮提取物的口服剂量，以分离于小鼠肠系膜淋巴结B细胞诱发的细胞因子表达水平，图4，5，6和7分别说明IL-4，IL-10，IFN-γ和TNF-α的表达水平的柱状图；
图8为说明根据肉桂皮提取物的口服剂量，以分离于粘膜固有层的单核细胞表示的IFN-γ水平的柱状图；
图9为说明根据肉桂皮提取物的口服剂量，分离于脾脏和肠系膜淋巴结的CD4+T-细胞中抗-CD3抗体和抗-CD28抗体激活的T-细胞增殖的柱状图；
图10为说明利用流式细胞测定仪检测TNF-α和IFN-γ细胞内水平的结果的曲线图。口服施用肉桂皮提取物后，将CD4+T-细胞和B-细胞从脾脏和肠系膜淋巴结分离，利用PMA和伊屋诺霉素激活6小时，然后用流式细胞测定法测量TNF-α和IFN-γ水平。
图11为通过PMA和伊屋诺霉素与肉桂皮提取物的联合用药的组图，其表明，肉桂皮提取物依赖于由TNF-α报道载体表达的小鼠淋巴T-细胞、EL4细胞的报道基因的表达水平与报道基因的表达水平。
【具体实施方式】
本发明的实用的和优选的实施方案将通过下述的实施例来说明。
但是，本领域技术人员应能理解，考虑本发明的内容，可在本发明精神和范围内进行一些修改和改进。
实施例1材料
<1-1>肉桂皮提取物的制备
将购买于Hwajin Distribution Co.公司的干燥肉桂皮粉碎，然后用热水提取器热水提取3小时，肉桂皮提取物用滤纸过滤后，上清液用旋转蒸发仪浓缩，然后将提取物用冻干机(Ilshin)冷冻干燥得到粉末。粉末提取物悬浮在蒸馏水中以配置适当浓度的溶液，过滤后使用。
<1-2>肠道细菌的制备
长双歧杆菌(ATCC 15707)、乳酸菌(KCTC 3930)和嗜酸乳酸菌(ATCC 4356)被用作肠道益生菌的指标。厌氧条件下，将BBLGasPak(Becton Dickinson and Company)设定37℃，在强化梭状芽孢杆菌培养基(RCM，Difco，USA)上培养这些菌株。
实施例2肉桂皮提取物对肠道益生菌的生长的影响
为研究肉桂皮提取物对肠道益生菌(长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌)的生长的影响，进行以下实验。每个实验重复三次，实验结果以提取物处理的实验组和只用水处理的对照组的吸光度的比值表示。
<2-1>通过悬浮培养测定生长活性
为研究肉桂皮提取物对肠道益生菌的生长的影响，以100ug、1mg和10mg/ml的浓度加入肉桂皮提取物来制备改性EG(EggerthGagnon)介质(牛肉浸膏2g，朊蛋白胨No.3 10g，酵母提取物5g，Na2HPO4 4g，可溶淀粉0.5g，葡萄糖1.5g，L-半胱氨酸0.4g，硅消泡剂0.25ml，吐温80 0.5g，D.W 1000ml)。将在厌氧条件下激活的长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的预培养溶液接种到此介质，然后在厌氧条件、37℃下，进一步培养18小时，测定OD600来评价菌株的生长。
实验结果以提取物处理的实验组的吸光度与只用水处理的对照组的吸光度的比值表示。通过测定肠道益生菌在含有肉桂皮提取物的液态介质中的生长(见图1)，结果表明，菌株的生长随着肉桂皮提取物的增加而增强，显示为吸光度的增加。例如，加入10mg/ml的肉桂皮提取物，乳酸菌的生长与对照组相比，增加了2.4倍。同时，长双歧杆菌和嗜酸乳酸菌的生长也随着肉桂皮提取物的增加而增强。
<2-2>利用琼脂扩散法测定生长活性
将EG琼脂介质灭菌，在50℃冷却，并分到三个含有2～3％菌株的平板中。培养基在室温硬化，将不同浓度的肉桂皮提取物，0.1mg、1mg和10mg，置于直径6mm的圆滤纸(Whatman paper No.41)上，然后以固定间距分布在固体培养基上，培养基在厌氧条件下，37℃培养48小时，测定生长活性圈的大小。如表1所示，在含有10mg/盘的肉桂皮提取物的固体培养基上，长双歧杆菌显示+生长活性圈，乳酸菌也有同样表现，而嗜酸乳酸菌显示+++的生长活性圈。结果显示：肉桂皮提取物具有优良的生长促进活性。
表1肉桂皮提取物改善肠道菌群的活性
【表1】
Figure A20068003623800121
n：无效果；+：直径10-14mm；++：直径15-19mm；
+++：直径20-24mm；-：抑制区，直径10-14mm
实施例3经口服施用于小鼠，研究肉桂皮提取物对血液成分的影响
本发明人将肉桂皮提取物口服施用于小鼠，研究血液成分。将六周大雄性鼠分为两组：对照组和实验组(3只/组)，实验组以500mg/kg/天的量，口服肉桂皮提取物15天。利用库尔特粒度仪(COLUTER JT)研究血液成分，结果见表2。
【表2】
  实验   术语   对照组   实验组
  Weight   体重   38.49±2.356b)   36.61±3.192
  WBC   白细胞   2.77±0.831   2.5±1.127
  LY   淋巴细胞   71.77±6.725   53±9.582
  MO   单核细胞   9.83±3.85   6.4±4.667
  GR   粒细胞   18.40±5.449   38.73±13.462
  LY#   淋巴细胞   2.00±0.648   1.3±0.656
  MO#   单核细胞   0.28±0.117   0.2±0.141
  GR#   粒细胞   0.48±0.223   1±0.656
  RBC   红血球   6.18±0.939   6.34±0.333
  HGB   血色素   10.13±1.568   10.33±0.416
  HCT   红细胞压积   31.57±4.807   33.13±1.115
  MCV   平均红细胞容积   51.11±1.426   52.3±1.646
  MCH   平均细胞血色素   16.39±0.306   16.3±0.529
  MCHC   平均细胞血色素浓度   32.06±0.712   31.17±0.252
  RDW   红血球分布   16.54±0.677   15.73±1.415
  PLT   血小板   88.00±21.463   108.67±16.773
  MPV   血小板平均容积   4.24±0.374   4.23±0.153
如表2所示，施用提取物的实验组的血液成分与对照组的血液成分没有显著差别。
实施例4肉桂皮提取物对小鼠肠道免疫的影响
<4-1>肠道免疫细胞的分离
为研究根据肉桂皮提取物口服施用量，其对宿主免疫系统的影响，分离小鼠脾脏，淋巴结，肠系膜淋巴结和粘膜固有层细胞。
特别是，小鼠口服肉桂皮提取物后被处死，取出脾脏，肠系膜淋巴结和肠，采用磁选法(magnetic method)从取出的脾脏和肠系膜淋巴结中分离T-细胞和B-细胞。磁选法表明：T-细胞和B-细胞特定磁性小珠吸附在T-细胞和B-细胞上，将其置于强磁场中使磁珠紧紧吸附在磁场中的T-细胞和B-细胞上，以除去非特定细胞，然后去除磁场得到目标T-细胞和B-细胞。
为从肠中分离粘膜固有层细胞，首先取出肠，用1％胶原蛋白酶(Type I，Sigma，USA)处理三小时去除肌肉组织，在肌组织下的粘膜固有层细胞被处置成单个细胞，最后，通过Fercoll密度梯度法得到粘膜固有层细胞。
<4-2>小鼠肠系膜淋巴结的T细胞分泌的细胞因子表达水平
将细胞用PMA(Sigma，USA)和伊屋诺霉素(Kalbiochem，Switzerland)激活，为提供活体环境，采用用于活体T细胞评价的CD3和CD28抗体(BD bioscience，USA)，激活细胞48小时，观测T-细胞的变化。
结果，观察到T-细胞的蛋白质(免疫诱导物)变化。首先，与对照组相比，不论是否激活，肿瘤坏死因子(TNF-α)的mRNA水平增加，与肠系膜淋巴结B-细胞的增加一致。但是，被认为是肉桂皮提取物诱发的干扰素的表达形式随激活变化，实际上，表达式随着肉桂皮提取物增加(见图2和图3)。
<4-3>小鼠肠系膜淋巴结的B-细胞分泌的细胞因子表达水平
小鼠以500mg/kg/天，5000mg/kg/天口服肉桂皮提取物10天。处死小鼠，利用磁选法从肠系膜淋巴结中分离T-细胞和B-细胞。分离的细胞用PMA和伊屋诺霉素激活，为达到活体类似环境，采用常用于激活活体B-细胞的LPS(lipopolyssacaride)激活B-细胞4小时，然后观察每组B-细胞的变化。
实验结果：在实验组观察到分子的显著变化。首先，对照组的肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平低到难以发现，而不论是否激活，服用500mg/kg/天，5000mg/kg/天的两个实验组的肿瘤坏死因子(TNF-α)都过度表达(见图4)。白细胞间素-4的表达形式与TNF-α的一致(见图5)。用或不用PMA和伊屋诺霉素激活，白细胞间素-10的表达形式有微小增加，但采用LPS(lipopolyssacaride)激活，其显著增加，比对照组至少约增加100倍(见图6)，无论是否激活，γ-干扰素(interferon-gamma)的表达也依赖提取物剂量而增加(见图7)。
<4-4>粘膜固有单核细胞分泌的细胞因子表达
粘膜固有单核细胞是研究肠道免疫系统的最重要的关键细胞，这些免疫细胞可以在肠表皮细胞下找到，参与肠道免疫的调节。但是，这些细胞难于得到以致于很多研究者未能在实验中成功应用这些细胞。本发明人以前建立了一种获得粘膜固有单核细胞的方法，过程如前所述。因此，发明人可测定依赖于经上述同样激活(PMA/伊屋诺霉素，LPS和抗-CD3/抗-CD28抗体)细胞的mRNA表达的肉桂皮提取物。实验结果：与对照组相比，施用肉桂皮提取物的粘膜固有单核细胞的干扰素表达显著增加(见图8)。
实施例5肉桂皮提取物对小鼠脾脏和肠系膜淋巴结的影响
<5-1>将T-辅助细胞从小鼠脾脏分离
为从小鼠脾脏中分离CD4+T辅助细胞，将小鼠处死取出脾脏，然后将脾脏组织物理粉碎，流动通过滤膜(40μm尼龙筛；Falcon)，制备单细胞。然后，采用磁选法分离CD4+T细胞，加入CD4-特定结合金属小珠(Miltenyi Biotec，USA)使小珠吸附在CD4+T细胞表面。将细胞置于强磁场中以除去未被金属小珠吸附的细胞，然后去除磁场得到CD4+T细胞。
<5-2>口服肉桂皮提取物对小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中T细胞分裂 能力的影响
参考亚洲民间传统医药，本发明人研究口服肉桂皮提取物对宿主T细胞分裂能力的影响。实验前，将肉桂皮提取物口服施用于小鼠8～20周(500mg/kg/次)。口服施用完成后，处死小鼠，取出小鼠脾脏和肠系膜淋巴结，以上述相同方式从取出的组织中分离CD4+T辅助细胞。为评价分离的T细胞的分裂能力，采用抗-CD3抗体(1ug/ml)和抗-CD28抗体(1ug/ml)激活相同数量的细胞，将激发后的细胞培养三天使细胞有足够时间反应和分化，加入放射同位素([3H]-脱氧胸腺嘧啶)吸附在细胞内DNA上。通过测定其中反射性同位素的放射性，检测细胞的增加水平来评价分裂能力。实验结果：在脾脏和肠系膜淋巴结中，可观察到经肉桂皮提取物处理的T细胞比经PBS处理的T细胞具有更强的分裂能力(见图9)。
<5-3>通过口服肉桂皮提取物，在小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞中 表达干扰素和TNF-α
上述实验已经证实口服肉桂皮提取物可提高，最具代表性的参与免疫的细胞因子，INF-γ和TNF-α的mRNA水平，说明提取物具有通过T细胞增强免疫应答的作用。基于此结果，此实施例将在蛋白质层面评价上述两个细胞因子的表达。从口服肉桂皮提取物实验小鼠和仅经PBS处理的对照小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结中，分离T细胞和B细胞，为使以上分离的T细胞和B细胞分泌细胞因子，采用PMA和伊屋诺霉素细胞激活一段时间。为防止分泌的细胞因子外泄，采用布雷菲德菌素A(Epicentre biocompany；B901MG，USA)处理激活细胞，以达到防止红细胞(ER)中分泌的蛋白质移动的结果。为阻断红细胞(ER)中的蛋白质移动，用透化缓冲液(permeabilization buffer(0.5％皂素，1％BSA的葡萄糖水溶液))在细胞膜上制作孔洞，向有孔的细胞内加入有放射标志的INF-γ和TNF-α，然后用流式细胞测定仪测定细胞中分泌的细胞因子水平。
实验结果：根据肉桂皮提取物的口服量，小鼠脾脏T细胞中TNF-α表达轻度增加，肠系膜淋巴结的T细胞显著增加。但INF-γ表达没有增加。还测定了B细胞，对照组和实验组没有显著差别(见图10)。
实施例6肉桂皮提取物在体外报道测定系统中的免疫增强活性
<6-1>用于评价肉桂皮提取物对细胞因子表达的影响的体外筛选
在活体实验前，以间接方式研究肉桂皮提取物对宿主免疫系统的影响，更确切地说，采用荧光酶素指针测定系统(TaKaRa，Japan)，对细胞因子进行筛分。通过克隆构造重组体载体，其中，定位在上游的细胞因子启动因子调节荧光酶素的活性，将IL2，IL4，IL10，IL24和TNF-α的启动子区(Promoter regions)插入含有荧光酶素基因(pXPGvector，Plasmid 44，173-182，2000)的载体的上游。
特别是，表达荧光酶素的载体上游随XhoI和KpnI消化。为准备插入，从取出的小鼠脾脏和基因组DNA中分离T细胞，采用两末端含有XhoI和KpnI限制性内切酶区域、上游含有起译密码子的启动因子特定引发剂，利用PCR放大启动子区。放大的启动因子由上述限制性内切酶消化并纯化。用连接酶(New England Biolabs)将准备好的插入片段和载体连接起来。
上述重组体载体采用lipoplex(Invitrogen；Lipofectamine 2000)将一种小鼠T细胞系的EL4细胞(ATCC；TIB-39)转染。仅采用肉桂皮提取物激发或还联合使用PMA和伊屋诺霉素激发细胞一段时间，用荧光酶素测定试剂盒(Dual luciferase assay system，Promega，USA)测定荧光酶素，此实验应用的启动因子是IL2，IL4，IL10，IL24和TNF-α，但重复实验证实只有TNF-α可以被肉桂皮提取物激发，即：当利用肉桂皮提取物激发细胞时，细胞因子活性增加，特别是，当施用1％肉桂皮提取物激发时，荧光酶素活性约增加5～6倍，当施用肉桂皮提取物，并联合使用浓度分别为0.1％和0.3％的PMA+伊屋诺霉素激发时，活性高于只施用PMA+伊屋诺霉素的活性(见图11)。
实施例7经口服施用于大鼠测定急性毒性
利用6周龄无特殊病原体(SPF)SD系大鼠进行急性毒性实验。将实施例1制备的肉桂皮提取物悬浮在0.5％的甲基纤维素溶液中，分别以1g/kg，5g/kg和10g/kg的剂量一次口服施用于每组的5只大鼠，观察大鼠的死亡、临床症状和体重变化，进行血液实验和血液生化实验，在尸检时，肉眼检查胸腹部胃肠组织的任何异常现象。
结果显示：实验化合物未引起任何特定的临床症状、体重变化或死亡，血液实验，血液生化实验和尸检也没有变化。因此，由于直至10g/kg的剂量不会引发大鼠的任何中毒变化，判断其半数致死量远远大于10g/kg，本发明涉及的肉桂皮提取物被评定为安全物质。
制备实施例1软胶囊的制备
每个软胶囊含有100mg实施例1制备的肉桂皮提取物，175.0mg大豆油，45.0mg黄蜂蜡，127.5mg棕榈硬化油，21.0mg大豆卵磷脂，212.0mg明胶，50.0mg甘油(比重1.24)，76.0mgD-山梨醇，0.54mg对氧甲基安息香酸(paraoxymethylbenzoic acid)，0.90mg对氧丙基安息香酸(paraoxypropylbenzoic acid)，0.56mg甲基香荚兰醛和适量食用黄色素203，根据韩国药典软胶囊的生产流程制造。
制备实施例2片剂的制备
将100.0mg实施例1制备的肉桂皮提取物，90.0mg玉米淀粉，175mg乳糖，15.0mg L-羟丙基纤维素，5.0mg聚乙烯吡咯烷和适量乙醇均匀混合，用湿淀粉法(wet-granulizing method)淀粉化。再加入1.8mg硬脂酸镁，制备每片含有400mg混合物的药片。
制备实施例3胶囊的制备
将100.0mg实施例1制备的肉桂皮提取物，83.2mg玉米淀粉，175.0mg乳糖和1.8mg硬脂酸镁均匀混合，然后制备每粒含有360mg混合物的胶囊。
制备实施例4粉剂的制备
肉桂皮提取物                    2g
乳糖                            1g
混合上述组分，装入气密性包装中制得粉剂。
制备实施例5口香糖的制备
口香糖以以下组分制备：肉桂皮提取物0.24～0.64％，口香糖胶基20％，糖76.36～76.76％，水果风味剂1％，水2％。
制备实施例6饮料的制备
饮料以以下组分制备：肉桂皮提取物0.48～1.28mg，蜂蜜522mg，二硫化苯酰5mg，烟酰胺5mg，核黄素氯化钠(sodium riboflavinhydrochloric acid)3mg，维生素B6 2mg，纤维醇30mg，正酸(orthoacid)50mg，水200ml。
制备实施例7香肠的制备
香肠以以下组分制备：肉桂皮提取物0.24～0.64％，猪肉63.6％，鸡肉27.5％，淀粉3.5％，大豆蛋白1.7％，食盐1.62％，葡萄糖0.5％，其它添加剂(甘油)0.94～1.34％。
【工业实用性】
如前所述，含有肉桂皮提取物，改善肠道菌群、增强免疫应答的组合物显示出对长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌，还有免疫细胞，特别是全身免疫系统和肠道免疫系统的淋巴细胞的生长促进活性，因此，本发明的组合物可以发展成肠相关疾病如便秘和便积的治疗药剂，免疫促进剂和保健食品，例如酸奶或其它奶制品，促进老年人或病人消化的肉桂饮料，助消化中草药等。
本领域技术人员可以理解前述说明书揭露的概念和特定实施方案，可轻易将其作为修改或设计其它实施例的基础，来实现与本发明同样的目的。本领域技术人员也可以理解不偏离如附加权利要求所述的本发明精神和范围的同等实施方案。

Claims (10)

1、一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于改善肠道菌群的组合物。
2、根据权利要求1的改善肠道菌群的组合物，其中的肉桂皮提取物是用选自水、单一或混合醚、乙醇、甲醇及乙酸乙酯的溶剂来提取的。
3、根据权利要求1的改善肠道菌群的组合物，其中肠道菌群包括一种或多种选自长双歧杆菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的菌株。
4、一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于增强免疫应答的组合物。
5、根据权利要求4的增强免疫应答的组合物，其中所述的免疫增强作用表现为诱导免疫细胞增殖的活性。
6、根据权利要求5的增强免疫应答的组合物，其中所述的免疫细胞是T-淋巴细胞和B-淋巴细胞。
7、一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于改善肠道菌群和增强免疫力的保健食品。
8、根据权利要求7的改善肠道菌群和增强免疫力的保健食品，其中所述的食品可以为片剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，溶液或丸剂。
9、一种含有肉桂皮提取物作为有效组分用于提高肠道免疫力的组合物。
10、根据权利要求9的提高肠道免疫力的组合物，其中所述的免疫提高作用通过加速免疫细胞增殖或增加肠系膜淋巴结T-细胞的细胞因子分泌来获得。
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