KR100613625B1 - 면역기능 향상을 위한 약제학적 조성물 및 복령 추출물 - Google Patents
면역기능 향상을 위한 약제학적 조성물 및 복령 추출물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간의 면역기능을 향상시킬 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 라노스탄(lanostane) 화합물을 유효성분으로서 포함한다. 또한, 본 발명은 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물, 균핵 및 발효산물로 부터 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출물은 라노스탄 화합물을 추출물의 중량을 기준으로 5-60%의 양으로 포함한다. 또한, 본 발명의 추출물은 면역반응을 억제할 수 있는 세코라노스탄(secolanostane)이 결여되어 있다.
복령(Poria cocos (Schw) Wolf), 라노스탄(lanostane) 화합물, 면역기능
Description
도 1은 본 발명에 따른 복령으로 부터 나노스탄 화합물을 제조하는 방법을 보여주는 순서도이다.
도 2는 중국특허 공개 제 1008183호에 기재된 방법에 따라서 복령추출물을 제조하고 본 발명에 따라서 상기 복령추출물의 저극성부을 제조하는 과정을 보여주는 순서도이다.
본 발명은 라노스탄(lanostane)을 유효성분으로 포함하는 면역기능 향상을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역기능 향상을 위한 복령(Poria cocos (Schw) Wolf) 추출물에 관한 것이다.
복령추출물은 위기능장애를 완화시키는 효과뿐만 아니라 강장효과를 가진다. 한방의학에서 복령추출물은 진정제 및 이뇨제로 분류된다. 또한, 복령추출물은 기 력 회복을 위한 한방조제의 중요한 성분중의 하나로서 사용된다. 최근 몇 년 동안의 복령추출물의 약제학적 효능과 관련된 연구 및 실험에 따르면, 복령추출물은 종양억제에 탁월한 효능이 있으며, 만성질환으로 고통받는 사람의 면역력을 향상시키고 위와 장을 보하는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
예를 들면, 일본특허 공개 제 55-111791호 및 제 57-38794호에서 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 배양된 균사체로 부터 수득한 추출물이 개시되어 있고, 이 추출물은 종양억제 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 일본특허 공개 제 55-111422호에서 직접 복령으로 부터 수득한 추출물이 개시되어 있고 이 추출물은 항암억제 용도로서 기술되고 있다. 일본특허 공개 제 8-119864호에서는 복령을 메탄올로 추출하여 수득한 추출물이 개시되어 있다. 한편, 상기 복령추출물로 부터 수득되는 라노스탄(lanostane), 세코라노스탄(secolanostane)과 같은 트리터펜(triterpene) 화합물은 항구토제로 사용된다. 일본특허 공개 제 9-025232호에서는 복령의 메탄올 추출에 의해서 수득한 트리터펜 화합물이 개시되어 있다. 이러한 트리터펜 화합물은 종양촉진에 대한 억제제로서 유용하다. 또한, 일본특허 공개 제 9-176184호는 복령추출물을 개시하고 있는데, 정제과정을 통해서 상기 복령추출물로 부터 염증 및 종양촉진에 대한 억제제로서 사용될 수 있는 트리터펜 화합물을 수득할 수 있음을 기술하고 있다.
중국특허 공개 제 1008183호는 트리터펜 화합물을 포함하는 복령추출물을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 구체적으로, 상기 방법은 산성알콜을 이용하여 복령분말을 추출하는 단계; 수득한 추출물을 염기성 용액을 이용하여 중화하는 단계; 중화된 용액을 농축하는 단계; 농축된 용액의 pH를 약 10으로 조절한 후 여과하는 단계; 여과액을 산성화시켜 침전물을 형성하는 단계; 상기 침전물을 여과한 후 세척하는 단계; 및 세척된 침전물을 건조하는 단계를 포함한다. 수득한 복령추출물은 종양억제효과 및 면역기능을 활성시키는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)으로 부터 개선된 생물학적 활성을 가지는 유효성분을 제조하는 방법 및 상기 유효성분을 포함하는 복령추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 복령을 이용하여 포유동물의 면역기능을 향상시킬 수 있는 유효성분을 제조하는 방법 및 상기 유효성분을 포함하는 복령추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 라노스탄(lanostane)의 새로운 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 한 측면에서, 라노스탄은 포유동물의 면역기능을 향상시키기 위한 약제학적 조성물로서의 용도로서 제공된다. 본 발명에 따라서 구현된 약제학적 조성물은 하나 이상의 라노스탄 화합물을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 면역기능의 적응 및 향상을 목적으로 사용되고, 경피투여, 경구투여 또는 피하투여에 의 해서 적용될 수 있으며, 서방형 복용형태로 제공될 수 있다.
본 발명은 면역실험을 이용하여 복령추출물의 유효성분의 약제학적 특성을 검증하였다. 유효성분은 주성분으로서 K1, K2, K3, K4와 미량성분으로서 K4a, K4b, K5, K6a, K6b를 포함하는 저극성부(PCM)이고, 상기 주성분과 미량성분은 모두 라노스탄 화합물이다. K1, K2, K3, K4 화합물은 면역기능을 향상시키는 효과를 가진다.
본 발명의 방법은 조추출물을 수득하기 위해서 종래의 추출과정을 이용한다. 크로마토그래피 분리방법은 조추출물에 함유된 성분을 분리하기 위해 사용되고, 상기 조추출물은 라노스탄(lanostane) 분획과 세코라노스탄(secolanostane) 분획을 포함한다. 라노스탄 분획은 세코라노스탄 분획보다 상대적으로 낮은 극성을 가진다. 라노스탄 분획은 96:4 비율의 디클로로메탄과 메탄올로 이루어진 용리액을 이용하여 수득하고, 반면 세코라노스탄 분획은 90:10 또는 0:100 비율의 디클로로메탄과 메탄올로 이루어진 용리액을 이용하여 수득한다. 나노스탄 분획의 위치는 박층크로마토그래피를 이용하여 확인되며, 이때 디클로로메탄과 메탄올의 혼합물(96:4)을 전개용액으로 사용할 경우 크로마토그래피값(Rf)은 0.1 이상이다. 세코라노스탄 분획의 크로마토그래피값은 0.1 미만이다. 라노스탄 분획은 실리카겔 컬럼크로마토그래피에 의해서 97:3 내지 95:5 비율의 디클로로메탄과 메탄올로 이루어진 용리액을 이용하여 몇개의 라노스탄 화합물로 분리된다.
본 발명의 방법에 따르면 복령 1 kg으로 부터 PCM 2.6 g이 수득된다. 중국특허 공개 제 1008183호에 기재된 방법에 따르면, 복령 1 kg으로 부터 조추출물 3 g이 수득된다. 이러한 조추출물이 본발명의 방법에 의해서 정제되는 경우 PCM은 단지 1 g이 수득된다.
본 발명자들은 중국에서 재배된 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)을 이용하여 중국특허 공개 제 1008183호에 기재된 실시예를 반복하여 실시하였다. 산을 이용한 추출과 알칼리/산 처리를 통해서, 복령 1 kg으로 부터 복령조추출물 3 g을 수득하였다. 이는 상기에서 언급한 중국특허 공개에 기재된 2.5±0.5 g의 범위에 상응하는 것이다. 분리과정을 더 실시하여 정제된 라노스탄 화합물 400 mg을 획득하였다. 즉, 상기에서 언급한 중국특허 공개에 기재된 방법에 따라서 수득한 추출물은 약 13%의 라노스탄 분획, 87%의 세코라노스탄 분획 및 기타 미확인 성분들을 포함한다.
본 발명자들은 실험을 더 수행하여 라노스탄 분획이 래트(rat) 비장세포에 대해 독성이 없으며 약제학적 효능을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 세토라노스탄 분획은 래트 비장세포에서 독성을 나타내었다.
본 발명은 호모 사피엔스를 포함하는 포유동물의 면역기능을 향상시킬 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 활성 성분으로서 하기의 화학식 1 으로 표시되는 치료학적으로 유효한 양의 라노스탄 및 상기 활성 성분에 대한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
상기 식에서, R1은 H 또는 CH3이고; R2는 OCOCH3, =O 또는 OH이고; R3은 H 또는 OH이고; R4는 -C(=CH2)-C(CH3)2Ra, 여기서, Ra는 H 또는 OH, 또는 -CH=C(CH3)-Rb이고, 여기서, Rb는 CH3 또는 CH2OH이고; R5는 H 또는 OH이고; 및 R6는 CH3 또는 CH2OH이다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 0.1% 내지 60%의 라노스탄(화학식 1)을 포함하고, 경구적으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물의 면역기능을 향상시킬 수 있는 복령추출물을 제공한다. 상기 추출물은 라노스탄(화학식 1)을 추출물의 중량을 기준으로 5% 내지 60%, 바람직하게는 10% 내지 20%의 양으로 포함한다. 상기 추출물은 실질적으로 세토라노스탄을 함유하고 있지 않다.
본 발명은 상기 복령추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 첫번째 단계로서 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물, 발효산물, 균핵(sclerotium)을 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합물과 같은 용매를 이용하 여 추출하여 액상 추출물을 수득하고, 이를 농축하여 농축된 물질을 형성하는 것을 포함한다. 농축된 물질은 실리카겔 컬럼에 도입하고 상기 컬럼을 저극성 용리액을 이용하여 용출하여 용출액을 회수한다. 수득한 용출액을 박층크로마토그래피에 의해서 농축하여 크로마토그래피값(Rf)이 0.1 이상인 농축된 용출액을 형성하고, 이때 용출액을 96:4 비율의 디클로로메탄과 메탄올로 이루어진 혼합용매를 이용하여 전개하고 자외선 램프와 요오드 증기를 이용하여 검출한다.
본 발명의 방법의 첫단계에서의 추출은 95% 에탄올을 이용하여 실시될 수 있다.
바람직하게는, 농축된 물질은 메탄올 및 n-헥산을 1:1의 부피비율로 포함하는 2상 용매를 이용하여 더욱 추출된다. 메탄올층을 분리하여 농축하고, 수득한 농축물은 실리카겔 컬럼에 도입한다.
저극성 용리액은 디클로로메탄과 메탄올을 96.5:3.5의 부피비율로 포함하는 혼합용매인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 라노스탄(화학식 1)은 하기의 구조를 가진다.
또한, 본 발명은 포유동물의 면역기능을 향상시키기 위한 의약품의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 라노스탄(화학식 1)의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물의 면역기능을 향상시키기 위한 의약품의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 복령추출물의 용도를 제공한다.
이하, 구현예를 통하여 본 발명의 특징은 첨부된 도면을 참조하여 구체적으로 설명될 것이다. 그러나 하기의 구현예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명한 것으로 이들 구현예에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
도 1에 나타낸 바와 같이, 중국에서 재배된 복령 30 kg을 이용하여 복령추출물을 제조하였다. 복령분말을 95% 알콜 120 L를 이용하여 24시간 동안 추출하였다. 이 혼합물을 여과하여 여과액을 수득하였다. 잔액은 3회 반복하여 다시 추출하여 여과하였다. 여과액을 합친 후 농축하여 265.2 g의 건조된 추출물을 수득하였다. 건추출물을 2상 추출용매(n-헥산 : 95% 메탄올 = 1:1)를 이용하여 분배추출 한 후, 여기서 메탄올층을 분리하여 농축하여 246.9 g의 건고형물을 수득하였다. 건고형물 무게의 10 내지 40배 양에 해당하는 실리카겔로 충진된 실리카겔 컬럼을 이용하여 건고형물을 분리하였다. 상기 실리카겔은 70 내지 230 메쉬의 직경을 가지는 것으로서 머크(Merck)사에서 제공하는 실리카겔 60(Silica Gel 60)이다. 컬럼은 96:4 비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매, 90:10 비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매 및 순수 메탄올을 순서대로 이용하여 용출하였다. 용출액은 박층크로마토그래피(TLC)에 의해서 분석되었고, 이때 자외선 램프와 요오드 증기를 분석시 이용하였으며, 96:4 비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매를 전개용매로 사용하였다. TLC 분석결과 성분이 유사한 유출액들을 합쳤다.
96:4 비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매를 이용하여 컬럼을 용출한 결과, 78 g의 PCM부를 수득하였다. PCM부는 TLC에서 여섯 개의 미량 점(trace points)을 나타냈다. 90:10 비율의 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매 및 순수 메탄올을 이용한 용출을 통해서 수득한 용출액들을 합쳐서 168 g의 PCW부를 획득하였다.
PCM부를 디클로로메탄/메탄올(96.5:3.5) 용출액과 실리카겔 컬럼을 이용하여 더욱 분리하였다. 박층크로마토그래피를 수행하여 수득한 용출액들을 세 개의 분획으로 나누었다: K1 (Rf=0.64), PCM-1 (미량성분으로서 K1, K3 (Rf=0.55), K5 (Rf=0.49)를 포함), PCM-2 (K2 (Rf=0.30, K4 (Rf=0.24, K6 (Rf=0.19)). K1 분획(3.5 g)에 대해 C18 컬럼과 메탄올/물(90:10) 혼합물을 이동상으로 이용하여 고성능액상크로마토그래피(HPLC)를 실시하였고, 3.0 g의 K1 성분을 수득하였다.
메탄올/물(87:13) 혼합물을 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행하여 PCM-1 분획을 K3 성분, K5 성분 및 K1 미량성분으로 분리하였다. 메탄올/물(84:16) 혼합물을 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행함으로써 K3 성분를 더욱 정제하여 K3(1.93 g)을 수득하였다. 93:7 및 91:9 비율의 두 메탄올/물 혼합물을 순서대로 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행함으로써 K5 성분를 더욱 정제하여 K5(47.6 mg)을 수득하였다.
메탄올/물(87:13) 혼합물을 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행함으로써, PCM-2 분획을 K6 미량성분(K6a + K6b), K4 미량성분(K4a + K4b), K2 성분 및 K4 성분으로 분리하였다. 메탄올/물(84:16) 혼합물을 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행함으로써, K2 성분과 K4 성분을 더욱 정제하여 K2(6.2 g)와 K4(0.55 g)를 수득하였다.
CH3CN/물(68:32) 혼합물을 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행함으로써, K6 미량원소를 정제하여 K6a(21.4 mg)와 K6b(90.7 mg)를 수득하였다. K4 미량원소에 대해서 메탄올/물(76:24) 혼합물을 이동상으로 이용하여 상기와 같이 HPLC를 수행하여 K4a(66.0 mg)와 K4b(86.8 mg)를 수득하였다.
상기 언급한 K1 내지 K6 화합물을 분석하여 하기와 같은 결과를 얻었다.
K1: mixture, EI-MS: major component, 528[M]+; trace component, 526[M]+
K1 (major component): 13C-NMR (δc):35.4 (c-1), 24.5 (c-2), 80.6 (c-3), 38.0 (c-4), 50.7 (c-5), 18.4 (c-6), 26.8 (c-7), 135.0 (c-8), 134.4 (c-9), 37.2 (c-10), 20.9 (c-11), 29.7 (c-12), 48.8 (c-13), 46.3 (c-14), 43.6 (c-15), 26.6 (c-16), 57.3 (c-17), 17.8 (c-18), 19.2 (c-19), 48.6 (c-20), 178.6 (c-21), 31.6 (c-22), 33.2 (c-23), 156.1 (c-24), 34.1 (c-25), 22.0 (c-26), 21.9 (c-27), 28.0 (c-28), 16.8 (c-29), 25.4 (c-30), 107.0 (c-31), 21.1 (CH3COO-), 170.5 (CH3
COO-)
K1 (trace component): 13C-NMR (δc): 35.6 (c-1), 24.5 (c-2), 80.6 (c-3), 37.8 (c-4), 49.7 (c-5), 23.1 (c-6), 120.6 (c-7), 142.8 (c-8), 145.8 (c-9), 37.6 (c-10), 117.0 (c-11), 36.3 (c-12), 49.4 (c-13), 45.1 (c-14), 44.4 (c-15), 76.4 (c-16), 57.6 (c-17), 17.6 (c-18), 22.8 (c-19), 48.4 (c-20), 178.5 (c-21), 31.4 (c-22), 33.2 (c-25), 156.0 (c-24), 34.1 (c-25), 22.0 (c-26), 21.9 (c-27), 28.2 (c-28), 17.1 (c-29), 26.5 (c-30), 107.0 (c-31), 21.1 (CH3COO-), 170.4 (CH3
COO-)
K2: mixture, EI-MS: major component, 486[M]+; trace component, 484[M]+
K2 (major component): 13C-NMR (δc): 36.6 (c-1), 29.1 (c-2), 78.5 (c-3), 40.0 (c-4), 51.4 (c-5), 19.2 (c-6), 27.4 (c-7), 135.4 (c-8), 135.3 (c-9), 37.9 (c-10), 21.4 (c-11), 30.2 (c-12), 49.3 (c-13), 46.7 (c-14), 44.2 (c-15), 77.1 (c-16), 57.8 (c-17), 18.2 (c-18), 19.8 (c-19), 49.2 (c-20), 179.4 (c-21), 32.1 (c-22), 33.7 (c-23), 156.5 (c-24), 34.6 (c-25), 22.5 (c-26), 22.4 (c-27), 29.1 (c-28), 16.8 (c-29), 25.9 (c-30), 107.5 (c-31)
K2 (trace component): 13C-NMR (δc): 36.7 (c-1), 29.1 (c-2), 78.5 (c-3), 40.0 (c-4), 49.8 (c-5), 24.3 (c-6), 121.2 (c-7), 143.3 (c-8), 145.2 (c-9), 38.0 (c-10), 118.1 (c-11), 37.2 (c-12), 45.5 (c-13), 49.1 (c-14), 44.8 (c-15), 76.8 (c-16), 58.0 (c-17), 18.1 (c-18), 22.9 (c-19), 48.0 (c-20), 179.4 (c-21), 31.9 (c-22), 33.7 (c-23), 156.5 (c-24), 34.6 (c-25), 22.9 (c-26), 22.4 (c-27), 29.1 (c-28), 16.8 (c-29), 26.8 (c-30), 107.5 (c-31)
K3: mp: 278-280℃
[α]D24+3°(c 0.6, Pyridine)
EI-MS m/z: 482[M]+, 13C-NMR (δc): 37.5 (c-1), 35.7 (c-2), 216.7 (c-3), 48.3 (c-4), 51.8 (c-5), 24.6 (c-6), 121.4 (c-7), 143.5 (c-8), 145.4 (c-9), 38.2 (c-10), 118.3 (c-11), 36.9 (c-12), 45.7 (c-13), 50.0 (c-14), 44.9 (c-15), 77.2 (c-16), 58.1 (c-17), 18.3 (c-18), 22.7 (c-19), 49.2 (c-20), 179.6 (c-21), 32.0 (c-22), 33.8 (c-23), 156.7 (c-24), 34.8 (c-25), 22.7 (c-26), 22.6 (c-27), 26.3 (c-28), 23.1 (c-29), 27.1 (c-30), 107.8 (c-31)
K4: mp:>300℃
[α]D24+18°(c 0.5, Pyridine)
EI-MS m/z: 484[M]+, 13C-NMR (δc): 31.4 (c-1), 27.4 (c-2), 76.0 (c-3), 38.6 (c-4), 44.5 (c-5), 24.2 (c-6), 122.0 (c-7), 143.5 (c-8), 147.4 (c-9), 38.6 (c-10), 116.9 (c-11), 37.0 (c-12), 45.9 (c-13), 50.2 (c-14), 45.1 (c-15), 77.3 (c-16), 58.2 (c-17), 18.4 (c-18), 23.7 (c-19), 49.3 (c-20), 179.8 (c-21).32.1 (c-22), 33.9 (c-23), 156.7 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.6 (c-27), 29.9 (c-28), 23.9 (c-29), 27.3 (c-30), 107.9 (c-31)
K4a: mp: 284-287℃
[α]D24+44°(c 0.5, Pyridine)
EI-MS m/z: 498[M]+, 13C-NMR (δc): 35.9 (c-1), 37.1 (c-2), 217.3 (c-3), 53.5 (c-4), 43.9 (c-5), 24.5 (c-6), 121.5 (c-7), 143.7 (c-8), 144.9 (c-9), 37.9 (c-10), 119.0 (c-11), 36.9 (c-12), 45.9 (c-13), 50.0 (c-14), 45.0 (c-15), 77.3 (c-16), 58.2 (c-17), 18.5 (c-18), 23.3 (c-19), 49.4 (c-20), 179.9 (c-21), 32.2 (c-22), 34.1 (c-23), 157.0 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.7 (c-27), 19.4 (c-28), 67.5 (c-29), 26.9 (c-30), 107.8 (c-31)
K4b: mp: 230-232℃
[α]D24+38°(c 0.5, Pyridine)
EI-MS m/z: 542[M]+, 13C-NMR (δc):
36.6 (c-1), 25.0 (c-2), 82.1 (c-3), 39.4 (c-4), 56.7 (c-5), 68.9 (c-6), 129.2 (c-7), 142.1 (c-8), 145.8 (c-9), 39.2 (c-10), 117.9 (c-11), 36.9 (c-12), 45.8 (c-13), 49.9 (c-14), 44.9 (c-15), 77.3 (c-16), 58.1 (c-17), 18.4 (c-18), 24.8 (c-19), 49.3 (c-20), 179.9 (c-21), 32.1 (c-22), 33.9 (c-23).156.7 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.7 (c-27), 31.9 (c-28), 18.1 (c-29), 27.1 (c-30), 107.9 (c-31), 22.0 (CH3COO-), 172.0 (CH3
COO-)
K5: mp: 274-275℃
[α]D24+10°(c 0.5, Pyridine)
EI-MS m/z: 454[M]+, 13C-NMR (δc):
36.8 (c-1)，29.6 (c-2)，79.0 (c-3), 38.6 (c-4), 50.6 (c-5), 24.3 (c-6), 122.1 (c-7), 143.6 (c-8), 147.3 (c-9), 37.2 (c-10), 117.5 (c-11), 34.1 (c-12), 45.0 (c-13), 51.3 (c-14), 30.8 (c-15), 28.1 (c-16), 48.9 (c-17), 17.4 (c-18), 23.7 (c-19), 49.9 (c-20), 179.9 (c-21), 32.4 (c-22), 27.5 (c-23), 124.3 (c-24), 132.7 (c-25), 26.6 (c-26), 18.6 (c-27), 29.2 (c-28), 17.1 (c-29), 26.7 (c-30)
K6a: mp: 248-250℃
[α]D24+63°(c 0.4, Pyridine)
EI-MS m/z: 498[M]+, 13C-NMR (δc): 37.1 (c-1), 35.0 (c-2), 219.0 (c-3), 48.4 (c-4), 57.0 (c-5), 68.0 (c-6), 128.6 (c-7), 141.8 (c-8), 144.2 (c-9), 38.3 (c-10), 120.2 (c-11), 36.6 (c-12), 45.8 (c-13), 49.7 (c-14), 44.8 (c-15), 77.2 (c-16), 58.1 (c-17), 18.4 (c-18), 22.7 (c-19), 49.4 (c-20), 179.6 (c-21), 32.1 (c-22), 33.9 (c-23), 156.8 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.7 (c-27), 31.5 (c-28), 24.5 (c-269), 26.6 (c-30), 107.9 (c-31)
K6b: mp: 267-270℃
[α]D24+68°(c 0.3, Pyridine)
EI-MS m/z: 516[M]+, 13C-NMR (δc): 34.4 (c-1), 29.4 (c-2), 74.1 (c-3), 42.6 (c-4), 87.7 (c-5), 133.1 (c-6), 134.7 (c-7), 79.6 (c-8), 145.8 (c-9), 42.1 (c-10), 120.7 (c-11), 36.8 (c-12), 49.1 (c-13), 48.7 (c-14), 42.7 (c-15), 76.8 (c-16), 57.6 (c-17), 19.0 (c-18), 29.3 (c-19), 49.1 (c-20), 179.6 (c-21), 32.2 (c-22), 33.9 (c-23), 156.8 (c-24), 34.9 (c-25), 22.9 (c-26), 22.7 (c-27), 25.1 (c-28), 20.3 (c-29), 20.8 (c-30), 107.9 (c-31)
K1 내지 K6 화합물의 구조는 하기와 같다.
K1: R2 = OCOCH3, 주성분 K1: R2 = OCOCH3, 미량성분
K2: R2 = OH, 주성분 K2: R2 = OH, 미량성분
K3: R6 = CH3 R5 = H K4: R2 = α-OH R5 = H
K4a: R6 = CH2OH R5 = H K4b: R2 = β-OCOCH3
R5 = OH
K6a: R6 = CH3 R5 = OH
K6b K5
실시예 2
중국산 복령 2 kg을 이용하여 분말을 제조하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 중국특허 공개 제 1008183호에 기재된 방법에 따라서 6.0 g의 조추출물을 수득하였다. 실시예 1의 실험과 동일한 방법으로, 수득한 조추출물에 대해 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼을 96:4 비율의 디클로로메탄/메탄올 혼합용매를 이용하여 용출하여 PCM-E부(2.0 g)를 수득하였고, 90:10 비율의 디클로로메탄/메탄올 혼합용매 및 및 순수 메탄올을 이용하여 용출하여 PCW-E부(2.3 g)를 수득하였다.
상기 수득한 PCM-E와 PCW-E의 동물의 비장세포(면역세포) 성장에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 일일투여량 40 mg/kg으로 동물에게 경구투여하였다. 비장세포의 성장이 촉진되면 이들 동물의 면역계 기능은 향상된다. 반면, 비장세포의 성장이 저해되면 이들 동물의 면역계 기능은 저하되며, 이는 투여된 물질의 독성으로 인해서 비장세포가 사멸되었음을 의미한다.
비장세포를 5일 동안 배양한 후, MTT 분석를 실시하여 세포생장율을 조사하였다. MTT 분석은 면역학적 실험방법으로써 하기에 설명되어 있다. 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다. PCM-E을 경구투여한 후 3일과 4일에 마우스는 비장세포 성장에 있어서 뚜렷한 증가를 나타냈다. 통계학적 관점에 기초하여 대조군과 실험군간의 비장세포 성장에 있어서 차이는 없었다. 그러나, PCW-E을 경구투여한 후 3일과 4일에 대조군과 비교할 경우 마우스의 생존 비장세포수는 분명히 더 낮게 나타났다. 즉, 실험군의 비장세포성장은 대조군에 비해 분명히 약화되었다. 이러한 결과는 PCW-E는 세포독성이 있음을 의미한다.
이러한 결과는 라노스탄(lanostane)을 함유하는 저극성부인 PCM은 비장세포의 성장을 저해하는 효과를 가지고 있지 않음을 암시하다. 또한, PCM부는 비장세포의 성장을 촉진하는 효과가 있다. 세코라노스탄(secolanostane)을 함유하는 고극성부(Rf〈0.1)는 비장세포의 성장을 저해하는 효과가 있다. 본 발명의 복령추출물은 세코라노스탄부(PCW-E)를 포함하지 않는다. 반면, 종래의 방법에 따라서 제조된 복령추출물은 비장세포의 성장을 저해할 수 있는 PCW-E를 함유한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | in vitro 성장 (일) | ||
| 3일째 | 4일째 | 5일째 | ||
| 대조군 | 0.608±0.042a | 0.777±0.141 | 0.515±0.055 | |
| PCM-E | 40 | 0.890±0.195 | 0.857±0.137 | 0.449±0.083 |
| PCW-E | 40 | 0.245±0.072* | 0.451±0.020** | 0.344±0.132 |
a: 데이타는 5회 실험결과의 평균±표준편차 값임
*: P〈 0.05; **: P〈 0.01
상기 두 실시예 및 비교실험의 결과를 기초로 다음과 같은 사실을 알 수 있었다.
복령추출물의 유효성분은 인간의 면역기능을 향상시킬 수 있는, 라노스탄(lanostane)을 함유하는 저극성부이다.
실리카겔 박층크로마토그래피와 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 복령의 비장세포 성장을 촉진하는 성분과 억제하는 성분을 분리할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 수득된 복령추출물은 고극성부인 PCW-E에 함유된 억제성분인 세코라노스탄과 고극성 분자를 포함하지 않는다. 이러한 이유로, 본 발명의 방법은 종래의 방법보다 월등하다.
본 발명에서 동물실험은 PCM-E와 PCW-E를 동물에게 경구투여함으로써 실시한다. 즉, 본 발명의 PCM-E와 PCW-E의 투여는 시험관내(in vitro)보다는 생체내(in vivo)에서 실시된다. 약제학적 화합물에 대한 비장세포에서의 in vitro 실험시 이 화합물과 세포대사간 상호작용이 일어나지 않기 때문에, in vitro 실험결과는 상기 화합물이 동물 비장세포의 성장에 미치는 효과를 실질적으로 반영하지 못한다. 따라서, 본 발명의 실험결과는 분명히 신빙성있고 의미가 있다.
복령추출물과 본 발명의 방법에 따른 크로마토그래피법에 의해 상기 복령추출물로 부터 수득한 정제된 화합물들을 하기에 기술한 다양한 면역반응실험을 이용하여 분석하였다. 복령추출물의 PCM부와 실시예 1에서 이로 부터 정제한 라노스탄 화합물인 K1, K, K3, K4는 하기의 면역반응실험에서 면역세포(T 세포/B 세포)에서 면역강화활성을 나타냈고, 표 2 내지 표 10에 나타낸 바와 같이, K1, K, K3, K4 화합물은 2.5 또는 5.0 mg/kg 보다 적은 투여량에서 강력한 활성을 나타냈다.
실험예
실험동물
생후 6-8 주된 BALB/c 숫컷 마우스를 이용하여 실험을 실시하였다. 실험동물은 타이완 타이페이에 있는 국립실험동물센타(National Laboratory Animal Center)에서 구입하였다. 구입한 마우스를 특정 피로겐(pyrogen)이 없는 환경을 제공하는 개별 환기 케이지 시스템(Individual Ventilation Cage System)에서 사육하였다. 이 시스템은 12시간 주야 사이클의 조도, 24-26℃ 온도 및 30-70% 습도로 조절되었다. 마우스에게 멸균한 물과 설치류용 먹이를 먹이고, 잠자리 짚도 멸균하여 사용하였다. 사료는 타이완 국립대(National Taiwan University) 소속의 동물센터에서 구입한 것으로 조단백질(〉23.0%), 조지방(〉4.5%), 조섬유(〈6.0%), 회분(〈8.0%), 미네랄(〈3.0%) 및 물(〈12%)로 구성된 것이다. 마우스를 상기와 같은 사육환경에 2주 동안 적응시킨 후 실험을 실시하였다.
실험동물의 약물투여
약물투여를 실시하기 위하여, 실험동물을 4개의 그룹으로 나누고 PCM을 10, 40 및 80 mg/kg 투여량(1 ml)으로 매일 4일 동안 경구투여하였다. 정제된 PCM-K1, K2, K3 및 K4의 경우 2.5, 5, 10 및 20 mg/kg/일의 투여량으로 경구투여하였고, 이 투여량은 PCM 투여량의 4분의 1에 해당한다. 이때 동일한 부피의 생리식염수 (0.85% NaCl)를 투여한 마우스를 대조군으로 이용하였다. 약물투여 후 5일 째에 마우스를 희생시킨 후, 혈청과 비장세포를 회수하였다. 혈청은 IgG, IgM 및 IgA 농도를 측정하는 데 이용하였다. 비장세포는 100 mm 직경의 세포배양 플레이트에 분주한 후 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. T 림프구, B 림프구 및 NK 세포 등의 비부착세포를 회수하여 각각의 분석실험에서 기술한 바와 같이 적절히 희석하였다.
약물준비
건분말상태의 PCM, PCM-K1, K2, K3 및 K4는 멸균수에 현탁하고 큰 입자를 분쇄하기 위해서 초음파처리를 실시하였다. 수득한 미세입자상태의 현탁액을 실험동물에 투여하였다.
비장 림프구 분리
마우스를 경추탈구에 의해서 죽인 후 70% 에탄올로 살균하였다. 먼저 심장에서 혈액을 채취하였다. 적혈구응집반응을 실시한 후 혈액 샘플을 원심분리하여 혈청을 회수하였다. 비장세포를 분리하기 위해서, 복막을 절개하여 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 RPMI-1640 배양배지를 포함하고 있는 세포배양용 플레이트에 옮겼다. 비장은 미세메쉬를 이용하여 분쇄하여 비장세포를 방출하도록 하였다. 상기의 배지에 현탁된 상태로 수득한 비장세포는 50 ml 원뿔형 원심분리 튜브에 옮긴 후 1300 rpm에서 원심분리하였다. 상층액은 버리고 세포 침전물을 EDTA-NH4Cl을 함유하는 차가운 RBC 용혈버퍼 1 ml에 다시 현탁하였다. 세포를 상온에서 10분 동안 방치한 후, 배양배지로 3회 세척하였고 이때 매회마다 원심분리하였다. 비장세포를 100 mm 직경 세포배양용 플레이트에 분주하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. T 림프구, B 림프구 및 NK 세포 등의 비부착세포를 회수하여 각각의 분석실험에서 기술한 바와 같이 적절히 희석하였다.
MTT 분석
MTT 분석은 살아있는 세포수와 배양한 세포의 생존율을 측정하는 데 일반적으로 이용되는 방법이다. 이 방법은 살아있는 세포의 미토콘드리아만이 생물학적으로 활성화된 산화-환원 효소들을 함유한다는 사실을 기본원리로 하고 있다. 이러한 효소는 MTT 시약과 반응하여 이 화합물을 상대적으로 불용성인 파란빛의 크리스탈로 전환시킨다. 생성된 크리스탈을 산성 이소프로판올에 용해한 후 ELISA 판독기(EL311, BioTek, VT)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 각 웰에서 측정한다. 간단히 설명하면, 비장세포를 10% 소태아혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 항생제 및 1 ㎍/ml 콘카나발린 A(concanavalin A, ConA)를 함유하는 RPMI-1640 배지를 포함하는 배지에 현탁하고, 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에 5×105 세포/100 ㎕/웰 세포수로분주한 후 5일 동안 배양하였다. 배양 후 3일, 4일 및 5일에 MTT 분석을 실시하였다. MTT 테트라졸리움(3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltertrazolium bromide, 인산완충 식염수에 5 mg/ml 농도로 용해되어 있음, Sigma Chemical, St. Leuis, MO)을 비장세포를 함유하는 각 웰에 20 ㎕씩 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 산-이소프로판올(이소프로판올에 0.04 N HCl 100 ㎕를 넣어 제조)를 각 웰에 첨가하고 진한 청색의 크리스탈이 용해되도록 완전히 혼합하였다. 모든 크리스탈이 용해되도록 상기 플레이트를 상온에서 20분 놓아둔 후, ELISA 판독기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
면역글로불린 농도 측정을 위한 ELISA 분석
면역글로불린 농도를 측정하기 위해서 ELISA 분석을 실시하였다. 간단히 설명하면, 비장세포(5×105 개/ml)를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 항생제 및 5 ㎍/ml 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS; 1 ㎍/105 세포)를 함유하는 RPMI-1640 배지를 포함하는 배지에서 5일 동안 배양하였다. 배양 후 3일, 4일 및 5일에 세포배양액을 회수하였다. IgM, IgG 및 IgM 농도를 샌드위치 ELISA 분석방법을 이용하여 측정하였다.
1. IgG 분석
96-웰 마이크로플레이트(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp, Nunc, 덴마크)를 포획항체(100 ng/웰)로 4℃에서 밤새동안 미리 코팅하였다. 포획항체로서 토끼 항마우스 IgG + IgA + IgM 항체(Zymed Laboratory, CA)를 사용하였다. 플레이트를 PBS-0.05% 트웬 20 용액으로 세척하고 PBS-1% 젤라틴으로 블로킹하였다. 블로킹 후, 적절히 희석한 샘플(105배 희석)과 표준 시료로서 IgG을 0.25 ㎍/ml 내지 0.039 ㎍/ml 농도로 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 배양한 후, HRP가 결합된 염소 항마우스 IgG(1:2,000 희석; 항-총 IgG 분자; Zymed Laboratory, CA)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 1시간 배양한 후, 발색반응은 pH 4.5의 0.1 M 시트레이트 버퍼, 0.03% H2O2 및 0.1% ο-페닐엔디아민을 포함하는 기질용액을 이용하여 실시하였다. 각 웰에 대해 흡광도는 ELISA 판독기(EL311, BioTek, VT)를 이용하여 490 nm에서 측정하였고, 데이타는 로그-로지트 모텔(log-logit model)을 이용하여 분석하였다.
2. IgM 분석
IgM 분석은 다음의 조건을 제외하고는 IgG 분석의 경우와 동일한 방법으로 실시하였다. 샘플은 104배 희석하였고, 표준시료로서 IgM을 1 ㎍/ml 내지 0.0156 ㎍/ml 농도로 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 분석시 사용된 2차 항체로서 HRP가 결합된 염소 항마우스 IgM(1:1,000 희석; 중쇄-특이적; Zymed Laboratory, CA)를 사용하였다.
3. IgA 분석
IgA 분석은 다음의 조건을 제외하고는 IgG 분석의 경우와 동일한 방법으로 실시하였다. 샘플은 104배 희석하였고, 표준시료로서 IgA을 1 ㎍/ml 내지 0.0156 ㎍/ml 농도로 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 분석시 사용된 2차 항체로서 HRP가 결합된 염소 항마우스 IgA(1:1,000 희석; Zymed Laboratory, CA)를 사용하였다.
사이토카인 농도 측정을 위한 ELISA 분석
IFN-γ와 IL-10을 정량적으로 분석하기 위해서, 비장세포(1×106 개/ml)를
10% FBS, 2 mM L-글루타민, 항생제 및 1 ㎍/ml 콘카나발린 A(ConA)를 함유하는 RPMI-1640 배지를 포함하는 배지에서 3일 동안 배양하였다. 콘카나발린 A는 T 림프구에 대한 다클론 활성물질 중 하나이다. 배양 후 세포배양액을 회수하였다. R&D 시스템(MN, 미국)으로 부터 구매한 사이토카인 ELISA 세트(Cyto Set ELISA 키트)를 이용하여 IFN-γ와 IL-10의 농도를 측정하였다.
1. IL-10 분석
Cyto Set ELISA를 다음과 같이 실시하였다. 96-웰 마이크로플레이트(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp, Nunc, 덴마크)를 포획항체(100 ng/웰)로 4℃에서 밤새동안 미리 코팅하였다. 포획항체로서 마우스 IL-10에 대한 래트 단클론 항체를 사용하였다. 분석할 샘플 및 표준 시료로서 500 pg/ml 내지 15.6 pg/ml 농도로 IL-10를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 플레이트를 5회 세척한 후 바이오틴이 결합된 염소 항 IL-10 다클론 항체를 각 웰 에 첨가하였다. 발색반응은 HRP가 결합된 스트렙토아비딘(Zymed, CA, 미국)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 배양한 후 과산화수소와 테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenezidine, TMB)을 함유하는 기질 용액을 이용하여 실시하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 2 N 황산 100 ㎕을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 각 웰에 대해 흡광도는 ELISA 판독기(EL311, BioTek, Winooski, VT)를 이용하여 450 nm에서 측정하였고, 데이타는 로그-로지트 모텔(log-logit model)을 이용하여 분석하였다.
2. IFN-γ 분석
IFN-γ에 대한 Cyto Set ELISA는 다음의 조건을 제외하고는 IL-10의 경우와 동일한 방법으로 실시하였다. 포획항체로서 마우스 IFN-γ에 대한 래트 단클론 항체를 이용하였고, 2차 항체로서 바이오틴이 결합된 염소 항 IFN-γ 다클론 항체를 이용하였다.
T-세포군 분석을 위한 유세포분석(flow cytometric assay)
유세포분석을 이용하여 PCM이 T 림프구에서의 CD3(pan-T 마커), CD4(helper T 세포 마커) 및 CD8(cytotoxic T 세포 마커) 분자의 발현에 대한 in vivo 효과를 조사하였다. CD3, CD4 및 CD8 발현은 각각 CY-크롬(Chrome)이 결합된 햄스터 항마우스 CD3 항체(Becton Dickinson, San Jose, CA), PE가 결합된 햄스터 항마우스 CD4 항체(Becton Dickinson, San Jose, CA) 및 FITC가 결합된 햄스터 항마우스 CD8 항체(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 분석하였다. 간단히 설명하면, 비장 비부착세포를 멸균된 차가운 PBS로 3회 세척한 후 세포수를 1×106 개/ml로 조절하였다. 1×106개의 세포를 표지 물질로서 형광물질이 결합된 항체 1 ㎕과 혼합하고 암실에서 상온에서 15분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고 200×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 세포침전물을 분산시킨 후 1.0% 파라포름알데하이드 500 ㎕과 혼합하였다. 비장 림프구 중 CD3+ 세포의 비율 및 CD3+ 세포군중 CD4+8- 와 CD4-8+ 세포의 비율을 유세포 분석을 통해서 분석하였다.
NK 세포-매개 세포독성에 대한 분석
NK 세포에 의해서 매개되는 세포독성을 측정하기 위하여, IVE/DEAD 세포매개성 세포독성 키트(Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하였다. 이러한 2색 형광 분석방법은 세포매개성 세포독성을 직접적으로 분석할 수 있고, 이 방법에 의한 세포독성 측정치는 51Cr 방출 분석에 의한 결과와 잘 일치한다. 본 분석에서 YAC-1 세포(ATCC, TIB-160)를 표적세포로서 이용하였다. 간단히 설명하면, 배양한 YAC-1 세포를 회수하여 완전배양배지(10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640)로 세척하였다. 세포수를 1×106개/ml로 조정한 후 DiOC18(3,3'-diocatadecyloxacarbocyanine) 20 ㎕를 상기 ml당 세포수의 각 표적세포 시료에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 20분 동안 배양하였다. DiOC18 시약처리에 의해서 표적세포의 막은 녹색형광으로 표지되었다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 완전배양배지에 2×105 개/ml의 농도로 현탁시켰다. 비장 비부착세포(효과세포: Effector cells)는 Hank's balance salt 용액으로 3회 세척한 후 완전배양배지에 1×107개/ml의 농도로 현탁시켰다. 현탁된 효과세포를 2배 희석하여 5×106개/ml과 2.5×106 개/ml의 농도로 조정하였다. NK 세포독성 분석을 시작하기 위해서, 동일한 부피(즉, 200 ㎕)의 효과세포와 표적세포를 혼합하여 최종 효과세포:표적세포의 비율(E:T 비율)을 50:1, 25:1 및 12.5:1로 조정하였다. 세포혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 여기에 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 50 ㎕를 첨가하였다. 프로피디움 요오드화물은 손상된 세포막을 가진 세포를 통과할 수 있어 이 세포의 핵을 적색형광으로 염색시킨다. 세포를 1000×g에서 30초 동안 원심분리하여 침전시키고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 튜브를 손가락으로 가볍게 톡톡 두드려서 세포침전물을 분산시킨 후, 교반기(vortex mixer)를 이용하여 완전히 재현탁시켰다. 샘플을 유세포분석을 통해서 분석하였다. 사멸된 표적세포는 세포막이 녹색형광으로 염색되어 있는 동시에 핵이 적색형광으로 염색되어 있었다. 살아있는 표적세포는 세포막이 녹색형광으로 염색되어 있었다. 그러나, 사멸된 효과세포는 단지 핵만 적색형광으로 염색되어 있었다.
식세포작용 분석
복강 대식세포의 식세포기능은 Molecular Probes사(Eugene, OR)로 부터 구입한 Vybrant 식세포작용 분석키트를 이용하여 분석하였다. BALB/c 마우스를 4개의 그룹으로 나누고 PCM-K1을 2.5 mg/kg/일 내지 20 mg/kg/일의 투여량(1 ml)으로 매일 4일 연속하여 경구투여하였다. 이때 동일한 부피의 생리식염수(0.85% NaCl)를 투여한 마우스를 대조군으로 이용하였다. 마우스에 10% 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 2.5 ml을 2일째에 복강투여(i.p.)한 후, 5일째에 경추탈골에 의해서 희생시켰다. 2가 양이온 및 혈청을 함유하지 않는 DMEM 배지 2 ml을 복강내로 주사하였다. 30초 동안 가볍게 복강을 마사지한 후, 배지와 복막 삼출 세포와 함께 복수액을 25 게이지 주사기를 이용하여 회수하였다. 세포를 DMEM 완전배지로 세척한 후 세포수를 1×107개/ml로 조정하였다. 세포를 얼음위에 10분 동안 놓아둔 후, 5×106개의 형광표지 입자를 가진 1×106개의 세포와 혼합하였다. 본 식세포분석에서 플루오레신(fluorescein)으로 표지된 대장균(Escherichia. coli K-12 균주) BioParticles (Molecular Probes, Eugene, OR)을 형광표지 입자로서 사용하였다. 세포를 실험군과 대조군으로 나누었다. 실험군은 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 얼음위에 미리 놓아두어 차갑게 한 식힘(Quenching) 용액(1.25 mg/ml 트립판 블루) 100 ㎕으로 처리하였다. 대조군은 대신 0℃에서 배양하였다. 두 그룹의 세포는 PBS로 2회 세척하고 150×g에서 5분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 오염된 적혈구는 ACK 용혈용액을 첨가함으로써 제거하였다. 세포를 150×g에서 5분 동안 원심 분리하여 다시 침전시키고, 생성된 침전물을 분산시킨 후 1.0% 파라포름알데하이드 500 ㎕과 혼합하였다. 복강 대식세포의 식세포작용에 의해서 포획된 입자의 양은 유세포분석에 의해서 분석하였다.
통계
대조군과 약물처리군으로 부터 얻은 데이타는 ANOVA 분석을 통해서 검증하였다. 두 평균값간의 차이는 Nann-Whitney rank sum test을 이용하여 분석하였다. 0.01 이하의 확률값은 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
결과
(1) PCM 및 PCM-K1, K2, K3, K4의 비장세포 성장에 미치는 영향
하기 표 2a과 표 2b에 나타낸 바와 같이, in vitro 세포배양의 3일째에, 40 mg/kg/일의 PCM, 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K1, -K3와 -K4, 10 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K2로 처리된 각각의 마우스로 부터 분리한 비장세포의 세포성장은 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 PCM 또는 PCM-K1, K2, K3 또는 K4와 같은 정제된 성분을 경구투여할 경우 이러한 화합물은 전반적으로 림프기관의 면역세포의 성장에 영향을 미친다는 것을 암시한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 0.359±0.076a | 0.481±0.044 | 0.414±0.067 | |
| PCM | 10 | 0.453±0.028 | 0.398±0.057 | 0.301±0.059 |
| PCM | 40 | 0.551±0.040* | 0.401±0.031 | 0.445±0.055 |
| PCM | 80 | 0.475±0.083 | 0.410±0.083 | 0.447±0.075 |
| K1 | 2.5 | 0.497±0.080 | 0.533±0.070 | 0.584±0.060* |
| K1 | 5 | 0.642±0.078** | 0.652±0.077 | 0.469±0.054 |
| K1 | 10 | 0.743±0.083** | 0.733±0.035*** | 0.562±0.025* |
| K1 | 20 | 0.634±0.048** | 0.571±0.091 | 0.452±0.049 |
| K2 | 2.5 | 0.533±0.069* | 0.460±0.052 | 0.414±0.054 |
| K2 | 5 | 0.489±0.087 | 0.480±0.072 | 0.527±0.062 |
| K2 | 10 | 0.928±0.078*** | 0.931±0.065*** | 0.585±0.041* |
| K2 | 20 | 0.655±0.075** | 0.605±0.072 | 0.530±0.057 |
a: 데이타는 MTT 분석결과로서 570 nm에서의 흡광도값임; 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 0.373±0.070a | 0.404±0.033 | 0.431±0.044 | |
| K3 | 5 | 1.154±0.172*** | 0.841±0.160* | 0.864±0.194 |
| K3 | 10 | 1.020±0.090*** | 0.900±0.193** | 0.957±0.200* |
| K3 | 20 | 1.103±0.081*** | 1.068±0.132*** | 0.943±0.159** |
| K4 | 5 | 0.949±0.101** | 0.981±0.087*** | 0.862±0.085** |
| K4 | 10 | 1.198±0.101*** | 1.273±0.147*** | 1.177±0.078*** |
| K4 | 20 | 1.233±0.040*** | 1.263±0.041*** | 1.061±0.124*** |
a: 데이타는 MTT 분석결과로서 570 nm에서의 흡광도값임; 데이타는 6회 반복 실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
(2) PCM 및 PCM-K1, K2, K3, K4의 면역글로불린의 혈청수치에 미치는 영향
하기 표 3a과 표 3b에 나타낸 바와 같이, 40 mg/kg/일의 PCM을 마우스에 경구투여하였을 경우 IgG 혈청수치가 유의적으로 증가하였다. 또한, PCM-K1, -K2와 -K4를 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 양으로 마우스에 경구투여하였을 경우 IgG 혈청수치가 유의적으로 증가하였다. 반면, PCM-K3을 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 양으로 마우스에 경구투여한 경우 IgG 혈청수치가 유의적으로 감소하였다. PCM, PCM-K1, PCM-K2, PCM-K3 및 PCM-K4를 각각 40 mg/kg/일, 10 mg/kg/일, 2.5 mg/kg/일 및 5 mg/kg/일의 양으로 마우스에 경구투여하였을 경우, IgM 혈청수치는 유의적으로 증가하였다. 80 mg/kg/일의 PCM을 경구투여받은 마우스에서 IgA 혈청수치는 유의적으로 감소하였다. 그러나, 10 mg/kg/일의 PCM-K1을 경구투여받은 마우스에서 IgA 혈청수치는 유의적으로 증가하였다. 이러한 실험결과는 PCM-K2, -K3 및 -K4는 IgA 혈청농도에 영향을 끼치지 않는다는 것을 증명한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 면역글로불린 농도 (mg/ml) | ||
| IgG | IgM | IgA | ||
| 대조군 | 1.81±0.19a | 0.90±0.18 | 3.67±0.54 | |
| PCM | 10 | 2.38±0.28 | 1.31±0.13 | 3.40±0.25 |
| PCM | 40 | 4.36±0.88* | 1.96±0.18*** | 2.54±0.28 |
| PCM | 80 | 4.53±0.92* | 2.07±0.21*** | 2.26±0.26* |
| K1 | 2.5 | 1.57±0.32 | 1.27±0.22 | 3.51±0.33 |
| K1 | 5 | 2.83±0.41* | 1.38±0.24 | 4.03±0.47 |
| K1 | 10 | 3.00±0.53** | 3.27±0.47*** | 6.57±0.71** |
| K1 | 20 | 3.74±0.62** | 1.46±0.27 | 3.79±0.35 |
| K2 | 2.5 | 1.69±0.24 | 2.82±0.41*** | 2.85±0.36 |
| K2 | 5 | 2.95±0.17** | 3.46±0.61*** | 2.81±0.28 |
| K2 | 10 | 3.75±0.54*** | 2.58±0.38*** | 4.33±0.33 |
| K2 | 20 | 5.11±0.72*** | 5.13±0.95*** | 5.02±0.65 |
a: 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 면역글로불린 농도 (mg/ml) | ||
| IgG | IgM | IgA | ||
| 대조군 | 1.80±0.11a | 1.11±0.13 | 3.15±0.48 | |
| K3 | 5 | 1.32±0.09** | 1.63±0.11** | 3.65±0.26 |
| K3 | 10 | 1.28±0.13** | 1.53±0.14* | 3.81±0.46 |
| K3 | 20 | 1.14±0.11** | 1.53±0.13* | 3.55±0.37 |
| K4 | 5 | 3.75±0.18*** | 2.65±0.21** | 3.33±0.13 |
| K4 | 10 | 4.33±0.29*** | 2.86±0.16** | 3.39±0.25 |
| K4 | 20 | 4.18±0.25*** | 2.36±0.16** | 3.54±0.12 |
a: 데이타는 6회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
(3) PCM 및 PCM-K1, K2, K3, K4의 비장 B 림프구에 의한 면역글로불린 분비에 미치는 영향
3.1) in vitro에서 비장세포에 의한 IgG 분비
하기 표 4a과 표 4b에 나타낸 바와 같이, in vitro 세포배양 후 3일 후, 40 mg/kg/일의 PCM, 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K1, 또는 10 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K2로 처리된 각각의 마우스로 부터 분리한 비장세포는 IgG 분비에 있어서 유의성있는 증가를 나타났다. 반면, PCM-K3로 처리하였을 경우 비장세포에 의한 IgG 분비는 억제되었다. 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K4로 처리된 마우스의 경우, 5일째에 비장세포에 의한 IgG 분비는 유의적으로 증가하였다. 이러한 결과는 PCM 또는 PCM-K1, K2 또는 K4와 같은 정제된 성분을 경구투여할 경우 이러한 화합물은 전반적으로 비장 B 세포에 의한 IgG 분비를 촉진시킨다는 것을 암시한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 7.40±1.07a | 10.00±1.42 | 11.21±1.31 | |
| PCM | 10 | 4.24±0.69 | 6.00±0.97* | 6.46±0.94* |
| PCM | 40 | 16.37±3.11* | 17.42±3.41 | 13.67±3.73 |
| PCM | 80 | 10.84±3.42 | 8.67±3.33 | 9.20±3.18 |
| K1 | 2.5 | 19.65±5.73 | 19.88±5.26 | 13.34±3.66 |
| K1 | 5 | 41.53±8.68*** | 32.94±8.84*** | 33.27±6.14** |
| K1 | 10 | 38.4±11.09*** | 30.01±7.40*** | 34.4±8.27*** |
| K1 | 20 | 59.5±13.04*** | 65.55±17.30*** | 70.58±20.47*** |
| K2 | 2.5 | 8.32±2.53 | 15.32±3.67 | 9.02±2.34 |
| K2 | 5 | 5.97±2.70* | 10.48±3.77 | 13.34±3.83 |
| K2 | 10 | 12.95±2.17* | 11.94±2.24 | 17.97±2.07** |
| K2 | 20 | 25.93±10.15* | 27.41±10.98* | 22.82±5.96* |
a: 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 7.17±0.89a | 12.04±0.46 | 9.55±0.77 | |
| K3 | 5 | 3.85±0.73** | 3.43±0.40** | 4.46±0.95** |
| K3 | 10 | 3.18±0.55** | 3.16±0.62** | 3.48±0.43** |
| K3 | 20 | 6.12±0.70 | 7.10±1.39* | 8.56±1.34 |
| K4 | 5 | 12.55±3.08 | 12.99±0.86 | 18.29±0.92** |
| K4 | 10 | 6.54±1.43 | 15.15±5.16 | 22.59±5.35* |
| K4 | 20 | 21.23±3.19** | 19.11±4.23 | 22.56±3.84* |
a: 데이타는 6회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
3.2) in vitro에서 비장세포에 의한 IgM 분비
하기 표 5a과 표 5b에 나타낸 바와 같이, in vitro 세포배양 후 3일 후, 40 mg/kg/일의 PCM, 10 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K1, 2.5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K2, 10 mg/kg/일의 PCM-K3, 또는 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K4로 처리된 각각의 마우스로 부터 분리한 비장세포는 IgM 분비에 있어서 유의성있는 증가를 나타났다. 이러한 결과는 PCM 또는 PCM-K1, -K2, -K3 또는 -K4와 같은 정제된 성분을 경구투여할 경우 이러한 화합물은 비장 B 세포에 의한 IgM 분비를 촉진시킨다는 것을 암시한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 138.27±42.55a | 171.10±39.90 | 184.29±30.97 | |
| PCM | 10 | 184.37±36.35 | 251.78±37.64 | 273.91±33.30 |
| PCM | 40 | 375.07±13.6*** | 352.16±7.6*** | 323.52±13.7*** |
| PCM | 80 | 328.96±24.46*** | 322.79±23.76* | 296.89±12.42** |
| K1 | 2.5 | 181.30±34.26 | 201.03±33.98 | 190.20±38.67 |
| K1 | 5 | 223.32±51.46 | 233.67±31.32 | 249.35±38.32 |
| K1 | 10 | 356.52±28.8*** | 362.17±31.1** | 527.33±41.0*** |
| K1 | 20 | 267.18±58.97 | 280.79±32.08* | 320.44±41.39* |
| K2 | 2.5 | 378.0±55.5*** | 479.8±60.9*** | 254.4±30.8 |
| K2 | 5 | 457.81±87.3** | 507.62±91.9** | 334.75±48.7* |
| K2 | 10 | 540.23±68.8*** | 512.47±4.2*** | 550.54±50.1*** |
| K2 | 20 | 837.1±114.5*** | 695.2±144.7** | 591.5±108.4*** |
a: 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 121.91±34.35a | 200.75±32.77 | 219.30±18.60 | |
| K3 | 5 | 222.42±42.83 | 214.45±28.51 | 277.52±101.63 |
| K3 | 10 | 287.66±44.44* | 294.30±30.68* | 309.51±30.88* |
| K3 | 20 | 372.14±69.48* | 519.53±52.63*** | 606.44±88.10** |
| K4 | 5 | 463.65±76.41*** | 688.17±85.78*** | 649.89±70.09*** |
| K4 | 10 | 514.45±70.30*** | 733.58±95.70*** | 807.32±104.21*** |
| K4 | 20 | 747.6±128.42*** | 746.50±157.76*** | 857.49±92.19*** |
a: 데이타는 6회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
3.3) in vitro에서 비장세포에 의한 IgA 분비
하기 표 6a과 표 6b에 나타낸 바와 같이, in vitro 세포배양 후 3일 후, 40 mg/kg/일의 PCM으로 처리된 마우스로 부터 분리한 비장세포는 IgA 분비에 있어서 대조군에 비해 유의성있는 감소를 나타났다. 그러나, 마우스를 정제된 성분으로 처리하였을 경우 다소 다른 결과를 얻었다. 10 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K1을 마우스에 경구투여하였을 경우, 3일째와 5일째에 in vitro에서 비장세포에 의한 IgA 분비가 증가하였다. 10 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K2 또는 5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K4를 마우스에 경구투여하였을 경우, IgA 분비는 유의적으로 증가하였다. 반면, PCM-K3은 IgA 분비를 유의적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 PCM은 IgA의 혈청수치와 비장세포에 의한 IgA의 분비에 있어서 상반된 효과를 가진다는 것을 암시한다. 그러나, PCM-K1, K2 또는 K4와 같은 정제된 성분은 전반적으로 비장 B 세포에 의한 IgA 분비를 촉진시킨다는 것을 암시한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 130.48±30.76a | 144.72±31.06 | 128.56±35.52 | |
| PCM | 10 | 50.67±13.28** | 66.09±8.68* | 74.73±15.17 |
| PCM | 40 | 84.31±8.09 | 94.72±10.64 | 125.41±8.51 |
| PCM | 80 | 36.03±4.10** | 46.16±5.09** | 56.05±7.71* |
| K1 | 2.5 | 118.64±19.79 | 94.65±53.54 | 108.37±16.01 |
| K1 | 5 | 148.60±24.55 | 127.93±66.0 | 148.81±22.97 |
| K1 | 10 | 32.11±48.1*** | 378.5±196.2*** | 422.74±6.67** |
| K1 | 20 | 145.93±26.52 | 144.08±84.36 | 179.0±18.86 |
| K2 | 2.5 | 133.90±33.39 | 181.00±47.98 | 277.13±101.1 |
| K2 | 5 | 155.67±18.66 | 142.89±26.86 | 94.91±12.07 |
| K2 | 10 | 239.64±43.1* | 258.20±46.4* | 260.00±0.93* |
| K2 | 20 | 273.20±54.87* | 211.48±57.82 | 324.7±153.4** |
a: 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 투여 후 기간 | ||
| 3일 | 4일 | 5일 | ||
| 대조군 | 58.21±12.63a | 66.92±17.16 | 73.41±14.64 | |
| K3 | 5 | 32.83±7.00 | 27.37±5.83* | 21.96±4.17** |
| K3 | 10 | 26.57±3.68* | 28.97±5.95* | 18.87±2.66** |
| K3 | 20 | 43.08±4.05 | 43.45±5.92 | 30.50±3.60* |
| K4 | 5 | 55.56±4.71 | 79.51±3.74 | 106.69±7.29* |
| K4 | 10 | 66.43±5.26 | 95.39±10.08 | 121.97±12.69* |
| K4 | 20 | 119.59±15.08** | 101.53±25.08 | 133.16±20.09* |
a: 데이타는 6회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
(4) PCM 및 PCM-K1, K2, K3, K4의 비장 T 림프구에 의한 TH1-타입 및 TH2-타입 사이토카인의 분비에 미치는 영향
인터루킨-2(IL-2), 인터페론-γ(IFN-γ)와 같은 TH1-타입 사이토카인은 세포성 면역반응을 유발한다. 반면, 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6)과 같은 TH2-타입 사이토카인은 B 림프구에 의해서 매개되는 체액성 면역반응을 촉진한다. 면역반응의 조절에 있어서 PCM과 이의 정제된 성분의 역할을 증명하기 위해서, 비장 T 림프구에 의한 TH1-타입 및 TH2-타입 사이토카인의 분비 가능성을 조사하였다. PCM 및 이의 정제된 성분인 PCM-K1, K2, K3, K4로 각각 처리된 마우스로 부터 분리한 비장세포를 ConA 존재하에서 5일 동안 배양하였다. 비장 T 림프구에 의해서 분비되는 인터페론-γ(IFN-γ; TH1-타입 사이토카인)와 인터루킨-10(IL-10; TH2-타입 사이토카인)의 양을 측정하였다 (표 7a 및 표 7b). 10 mg 및 80 mg/kg/일의 PCM, 2.5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K1, 2.5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K2, 5 mg 및 10 mg/kg/일의 PCM-K3, 및 2.5 mg/kg/일의 PCM-K4를 각각 마우스에 경구투여하였을 경우, ConA로 자극한 비장 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비는 유의적으로 증가하였다. 그러나, 40 mg/kg/일 또는 그 이상의 투여량으로 마우스를 처리하였을 경우, 이 마우스부터 분리된 비장세포에서 IL-10의 분비는 영향을 받지않은 것으로 나타났다. 2.5 mg/kg/일 또는 그 이상의 PCM-K1, 또는 2.5 mg 및 20 mg/kg/일의 PCM-K2를 마우스에 경구투여한 경우, 비장세포에 의한 IL-10의 분비는 유의적으로 증가하였다. 종합하면, PCM은 상대적으로 낮은 투여량에서 TH1-타입 사이토카인의 분비를 촉진시키지만 TH2-타입 사이토카인의 분비를 촉진하지 못했다. 그러나, PCM-K1 및 -K2와 같은 정제된 성분은 TH1-타입 및 TH2-타입 사이토카인 모두의 분비를 촉진시키는 효과가 있다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 사이토카인 (pg/ml) | |
| IFN-γ | IL-10 | ||
| 대조군 | 254.14±55.68a | 103.91±20.36 | |
| PCM | 10 | 465.11±26.6** | 115.90±17.29 |
| PCM | 40 | 264.79±48.36 | 77.31±9.31 |
| PCM | 80 | 433.44±31.10** | 181.97±33.26 |
| K1 | 2.5 | 428.7±38.9* | 170.28±13.0* |
| K1 | 5 | 673.33±96.73** | 178.76±24.56* |
| K1 | 10 | 682.28±73.78** | 176.17±45.24 |
| K1 | 20 | 783.97±76.1*** | 334.7±45.8*** |
| K2 | 2.5 | 414.80±31.3* | 135.71±19.89 |
| K2 | 5 | 432.70±50.22* | 226.48±55.67* |
| K2 | 10 | 348.45±72.56* | 135.62±48.15 |
| K2 | 20 | 457.48±57.60** | 195.27±40.0* |
a: 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 사이토카인 (pg/ml) | |
| IFN-γ | IL-10 | ||
| 대조군 | 124.25±28.15a | 107.80±20.79 | |
| K3 | 5 | 917.07±130.41* | 262.09±108.41 |
| K3 | 10 | 449.74±100.67* | 86.48±33.26 |
| K3 | 20 | 176.20±45.96 | 98.74±27.05 |
| K4 | 5 | 240.45±107.83 | 128.91±45.46 |
| K4 | 10 | 252.26±103.76 | 197.39±68.73 |
| K4 | 20 | 292.00±77.77* | 155.91±26.16 |
a: 데이타는 6회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01, ***: p〈0.001 (대조군에 비해)
(5) PCM의 비장 T 림프구 군(population)에 미치는 영향
CD4+8- T 세포는 주로 헬퍼(helper) T 세포(TH)이고, CD4-8+ T 세포는 주로 세포독성(cytotoxic) T 림프구(CTL)이다. T 림프구 아군(sub-population)의 변형에 있어서 PCM과 이의 정제된 성분의 역할을 증명하기 위해서, 비장비부착세포중 CD4+와 CD8+ 세포의 비율을 FASC에 의해서 분석하였다. PCM을 10 mg 내지 80 mg/kg/일의 양으로 4일 연속하여 마우스에 경구투여하였다. 5일째에 마우스를 죽이고 비장비부착세포를 분리하였다. PCM으로 처리한 마우스에서 PCM의 투여량이 80 mg/kg/일까지 증가함에 따라 CD4+8- 세포의 비율이 증가하는 경향이 나타났지만, PCM이 CD4+8- T 세포의 비율에 대해 유의성있는 영향을 끼치지 않은 것으로 나타났다 (표 8). 그러나, PCM으로 처리한 마우스에서 CD4-8+ 세포의 비율은 유의적으로 증가하였다 (표 8). 즉, CTL 군이 마우스에 PCM를 투여한 후 증가하였다. CTL의 분화는 주로 TH1-타입 사이토카인에 의해서 유도된다. 따라서, 이러한 결과는 PCM의 IFN-γ분비를 증가시키는 효과와 잘 일치한다. 또한, CD4+8- 세포가 증가하는 경향이 나타났기 때문에, 비장 림프구 군에서 CD4/CD8 비율의 증가는 관찰되지 않았다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 형광양성 세포(%) | ||
| CD4 | CD8 | CD4/CD8 | ||
| 대조군 | 23.40±2.31a | 12.50±0.82 | 1.87 | |
| PCM | 10 | 28.67±2.54 | 15.31±0.72* | 1.87 |
| PCM | 40 | 27.72±0.66 | 16.67±1.08** | 1.66 |
| PCM | 80 | 29.95±2.75 | 16.76±1.29** | 1.79 |
a: 데이타는 5회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01 (대조군에 비해)
(6) PCM의 NK 세포의 세포독성 활성에 미치는 영향
NK 세포는 선천성 면역기능에서 중요한 역할을 한다. NK 세포는 종양세포(형질전환된 세포)와 바이러스에 감염된 세포를 비특이적으로 살상한다. PCM으로 처리된 마우스로 부터 분리한 비장비부착세포에 대해 분리후 바로 NK-매개 세포독성 분석을 실시하였다. PCM은 10 mg/kg/일의 투여량에서 NK-매개성 세포독성을 증가시키는 것으로 나타났다 (표 9). PCM 투여량을 증가시켰을 경우, NK 세포의 활성은 기본수준으로 떨어졌다. NK 세포의 활성화는 주로 H1-타입 사이토카인에 의해서 촉진된다. 따라서, 이러한 결과는 PCM의 IFN-γ분비를 증가시키는 효과와 잘 일치한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 표적세포:효과세포 (Target:Effector) | ||
| 1:12.5 | 1:25 | 1:50 | ||
| 대조군 | 16.57±0.61a | 17.04±1.06 | 16.57±0.61 | |
| PCM | 10 | 14.24±2.18 | 20.78±1.25 | 23.12±2.86* |
| PCM | 40 | 18.62±2.62 | 18.20±2.02 | 20.99±3.59 |
| PCM | 80 | 15.54±3.49 | 18.27±2.05 | 16.35±0.90 |
a: 데이타는 비장 세포군중 NK 세포에 의해서 살상되는 표적세포(YAC-1 세포)의 비율임. 사멸된 세포는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 반응에서 양성반응을 나타낸다; 데이타는 5회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05 (대조군에 비해)
(7) PCM의 대식세포의 식세포활성에 미치는 영향
식세포는 침입한 병원균에 대한 첫번째 방어기작에 관여한다. 선천성 면역시스템에서 작용하는 주요 식세포는 중성구와 대식세포이다. 본 실험에서, 복막에서 삼출되는 대식세포를 형광물질로 표지된 대장균(E. coli)이 포함된 배지에서 배양한 후, 대식세포의 유도된 식세포활성을 측정하였다. 대조군의 경우, 평균 20.88%의 대식세포가 식세포활성을 나타냈다. 그러나, 마우스에 40 mg 또는 80 mg/kg/일의 PCM을 투여하였을 경우, 각각 27.49% 및 38.22%의 대식세포가 식세포활성을 나타냈다. 이러한 결과는 PCM이 복막 대식세포의 식세포활성을 유의적으로 증가시키는 효과가 있음을 시사한다.
| 성분 | 투여량 (mg/kg/일) | 식세포활성 |
| 대조군 | 20.88±3.90a | |
| PCM | 10 | 17.08±1.82 |
| PCM | 40 | 27.49±3.99* |
| PCM | 80 | 38.22±2.20** |
a: 데이타는 형광표지된 E. coli를 세포내로 포획한 대식세포의 비율임; 데이타는 10회 반복실험의 결과의 평균±표준편차 값임; *: p〈0.05, **: p〈0.01 (대조군에 비해)
본 발명의 약제학적 조성물은 호모 사피엔스를 포함하는 포유동물의 면역기능을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 수득된 복령추출물은 고극성부인 PCW-E에 함유된 억제성분인 세코라노스탄과 고극성 분자를 포함하지 않는다. 이러한 이유로, 본 발명의 방법은 종래의 방법보다 월등하다.
Claims (16)
- 활성 성분으로서 하기의 화학식 1 으로 표시되는 치료학적으로 유효한 양의 라노스탄(lanostane) 및 상기 활성 성분에 대한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 포유동물의 면역기능을 향상시킬 수 있는 약제학적 조성물.(화학식 1)
상기 식에서, R1은 H 또는 CH3이고; R2는 OCOCH3, =O 또는 OH이고; R3은 H 또는 OH이고; R4는 -C(=CH2)-C(CH3)2Ra, 여기서, Ra는 H 또는 OH, 또는 -CH=C(CH3)-Rb이고, 여기서, Rb는 CH3 또는 CH2OH이고; R5는 H 또는 OH이고; 및 R6는 CH3 또는 CH2OH이다. - 제 1항에 있어서, 상기 라노스탄(화학식 1)은 하기의 구조를 가지는 것을 특 징으로 하는 약제학적 조성물.
또는
- 제 1항에 있어서, 상기 라노스탄(화학식 1)을 상기 조성물의 중량을 기준으로 0.1-60% 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 경구투여되는 것을 특징으로하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항의 라노스탄(lanostane, 화학식 1)을 추출물의 중량을 기준으로 5-60% 포함하고 세코라노스탄(secolanostane)이 실질적으로 결여되어 있는 포유동물의 면역기능을 향상시킬 수 있는 복령추출물.
- 제 6항에 있어서, 상기 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 따라서 제조되는 것을 특징으로하는 복령추출물:(a) 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물, 발효산물, 균핵(sclerotium)을 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계;(b) 단계 (a)에서 수득한 액상 추출물을 농축하는 단계;(c) 단계 (b)에서 수득한 농축된 물질을 실리카겔 컬럼에 도입하는 단계;(d) 상기 실리카겔 컬럼을 저극성 용리액을 이용하여 용출하여 용출액을 회수하는 단계; 및(e) 상기 용출액을 농축하여 농축된 용출액을 형성하는 단계.
- 제 7항에 있어서, 상기 단계 (e)에서 수득한 농축된 용출액은 96:4 비율의 디클로로메탄과 메탄올로 이루어진 혼합용매를 이용하여 전개하고 자외선 램프와 요오드 증기를 이용하여 검출하는 박층크로마토그래피에 의해서 0.1 이상의 크로마토그래피값(Rf)을 가지는 것을 특징으로하는 복령추출물.
- 제 7항에 있어서, 상기 단계 (a)의 추출은 95% 에탄올을 이용하여 실시되는 것으로 특징으로하는 복령추출물.
- 제 7항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득한 농축된 물질은 메탄올 및 n-헥산을 1:1의 부피비율로 포함하는 2상 용매를 이용하여 더욱 추출되고, 생성된 2상 용매추출혼합물로 부터 메탄올층을 분리하여 상기 단계 (c)의 실리카겔 컬럼에 도입될 수 있는 농축물을 형성하기 위해 농축하는 것을 특징으로 하는 복령추출물.
- 제 7항에 있어서, 상기 저극성 용리액은 디클로로메탄과 메탄올을 96.5:3.5의 부피비율로 포함하는 혼합용매인 것을 특징으로 하는 복령추출물.
- 제 6항에 있어서, 상기 라노스탄(화학식 1)을 10-20% 포함하는 것을 특징으로 하는 복령추출물.
- 제 6항에 있어서, 상기 라노스탄(화학식 1)은 하기의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 복령추출물.
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