TWI351961B - Pharmaceutical composition for enhancing immunity, - Google Patents

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TWI351961B
TWI351961B TW092113393A TW92113393A TWI351961B TW I351961 B TWI351961 B TW I351961B TW 092113393 A TW092113393 A TW 092113393A TW 92113393 A TW92113393 A TW 92113393A TW I351961 B TWI351961 B TW I351961B
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Tseng Jerming
Hsiou Yu Ding
Wen Liang Chang
Chien Lian Chao
Huang Hsin-Wen
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Sinphar Pharmaceutical Co Ltd
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Description

1351961 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種含有羊毛固醇類化合物作爲有效成 分以提昇人體免疫力的醫藥組合物。本發明亦有關—種可 提昇人體免疫力的茯苓萃取物。
【先前技術】 茯苓味性甘淡’有益脾胃’中醫/藥界歸類爲鎭靜劑 和利尿劑，以及補氣藥處方中的主要成份之一。但依據多 年硏究和試驗，發現茯苓另具其它療效，包括具抗腫瘤之 療效、和有助益於慢性病人的免疫及腸胃系統等。
例如，日本專利第55-1 1 1791號及第57-38794號中， 就揭示由人工培養茯苓菌絲體，經萃取成分，用來作爲抗 腫瘤用途。日本專利第55-1 1 1 422號中，亦揭示由茯苓原 材直接萃取成份，用來作爲抗腫瘤用途。日本專利第 8-1 1 9864號案，則揭示茯苓原材直接經由甲醇進行萃取， 並經過分離後，得到羊毛固醇（lanostane)類成分及及開 環羊毛固醇（secolanostane)類成分等三帖類化合物，用來 作爲鎭吐劑用途。日本專利第9-025232號公開案，又揭示 曰本產地之茯苓經甲醇萃取分離後，得到三帖類化合物， 可作爲促癌生成作用的抑制劑。日本專利第9-176184號 中，再揭示將茯苓甲醇萃取後，再分離精製成三帖類化合 物，可作爲抗炎及促癌生成作用抑制劑。 而中國第1 008183號專利，揭示一種製造含三帖類化 6 1351961 合物的茯苓萃取物的方法，以茯苓粉末經酸性酒精溶劑萃 取後，並用酸鹼方式抽提處理，所製得茯苓萃取物具抗腫 瘤及免疫活化作用的生物活性。 【發明內容】
本發明之主要目的即在提供一種從茯苓製備具有改善 的生物活性的有效成分的方法及含有該有效成分的茯苓萃 取物。 本發明之另一目的即在提供一種從茯苓製備具有改善 的提昇哺乳類動物免疫力的有效成分的方法及含有該有效 成分的茯苓萃取物。
本發明之另一目的即在提供一種羊毛固醇（lanostane) 用於提昇哺乳類動物免疫力的新用途。此用途的一具體例 子爲一提昇免疫力的醫藥組合物。本發明的醫藥組合物可 含單一或二種以上的羊毛固醇化合物，可使用於免疫調節 或增強用途，而且其劑型可以是經皮吸收、口服劑型、注 射劑型或緩釋劑型。 本發明以免疫試驗來確認茯苓粗萃取物中具有醫療活 性的有效成分就是低極性部位（PCM )，而且PCM所含主要 化合物爲 Kl、K2、K3、K4 及微量 K4a、K4b、K5、K6a、K6b， 均爲羊毛固醇（lanostane)類化合物，該PCM中含量較高 之Kl、K2、K3、K4均具有增強免疫之效能。 本發明所揭示之從茯苓製備具有改善的生物活性的有 效成分的方法，係利用傳統萃取法萃取茯苓得到一粗萃取 7 1351961
物’再經由層析法，分成極性小之羊毛固醇（lanostane) 類部位（以二氯甲烷：甲醇（96:4)爲沖提液）和極性大之 開環羊毛固醇（secolanostane)類部位（以二氯甲烷：甲醇 (90:10或0:100)爲沖提液），其中，利用矽膠薄層層析 法’顯示出羊毛固醇（lanostane)類部位之所在位置，即展 開溶媒爲二氯甲烷一甲醇（96:4)時，層析値（Rf)爲1〇· 1 ; 至於開環羊毛固醇（secolanostane)類成分，則層析値小於 0.1。用矽膠管柱層析法可進一步分離該羊毛固醇類部位， 其中沖提液使用二氯甲烷：甲醇（97:3至95:5)，分離出數 種羊毛固醇（lanostane)類化合物。 依據本發明之製備方法，每公斤茯苓可製得2. 6克 PCM。前述中國專利第1 008183號的製法每公斤茯苓可製得 3克的粗萃取物，若將該粗萃取物以本發明方法進一步純 化僅可製得1克PCM。 【實施方式】 根據申請人重複中國第1 008183號專利之實驗，以中 國雲南產地之茯苓，經酸鹼處理方式萃取’平均一公斤茯 苓可得3g茯苓三帖類粗萃取物（符合該專利所揭示之範圍 2.5g±Q.5g)。但申請人再經層析，可得U的低極性部位 PCM，進一步分離可得純化之羊毛固醇（lanostane)類成分 約400 mg。換言之，按照中國專利之所製得的萃取物其羊 毛固醇部位（lanostane fraction)類成分佔萃取物約 13%，萃取物之百分之八十七係開環羊毛固醇部位 8 1351961 一適合用於製備該茯苓萃取物的方法包含下列步驟： a) 以一水，甲醇，乙醇或它們的混合溶劑萃取茯苓菌 的代謝物，茯苓菌的醱酵產物或茯苓菌菌絲； b) 濃縮步驟a)萃取所獲得的液體： c) 將步驟a)所獲得的濃縮物導入一矽膠管柱；
d) 以一低極性沖提劑（eluent)沖提該矽膠管柱，及收集 所產生的溶離液（eluate);及 e) 濃縮步驟d)的溶離液。 較佳的，從步驟e)所獲得的溶離液的濃縮物以矽膠薄 層層析法分析具有一層析値（Rf) 1 0. 1，其中以紫外光燈 及碘作檢側，展開液爲二氯甲烷：甲醇= 96:4。 較佳的，步驟a)的萃取所使用的溶劑爲95%酒精。
較佳的，步驟b)的濃縮物被進一步以一體積比爲1:1的 甲醇及正己烷的兩相溶劑萃取；分離出甲醇層；及濃縮該 甲醇層，所獲得的濃縮物被用作爲步驟c)的矽膠管柱的進 料。 較佳的，步驟d)的低極性沖提劑爲體積比爲96.5:3.5的 二氯甲烷及甲醇的混合溶劑。 較佳的，該羊毛固醇⑴具有具下列化學式:
10 1351961
本發明還提供具上述化學式（i)的羊毛固醇作爲活性 成分在製備提昇哺乳類動物免疫力藥物中的應用。 本發明還提供本發明的茯苓萃取物作爲活性成分在製 備提昇哺乳類動物免疫力藥物中的應用。 下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但不 以此限制本發明。 實施例一
請參閱第一圖所示之流程圖。以雲南產茯苓30公斤， 磨成粉後，利用120 L酒精（濃度95%)萃取24小時，及過 濾分離。再重復前述萃取及固液分離三次。合倂濾液，並 將之濃縮後得乾燥萃取物265.2克。再利用一雨相萃取劑 (己烷：95%甲醇=1 : 1)對該乾燥萃取物進行分配萃取。 取出甲醇層並加予濃縮後得到乾燥固體246. 9克。利用矽 膠管柱層析對該乾燥固體進行分離，該矽膠管柱塡充有該 乾燥固體重量10-40倍的矽膠，係購自Merck公司，Silica gel 60，70-230 mesh。以二氯甲烷/甲醇混合液作爲沖提 劑（eluent)，依序以96:4、90:10、0: 10 0比例的混合液進 行沖提，溶離液（eluate)以矽膠薄層層析法（Thin Layer 11 1351961
Chromatography)(紫外光燈及碘作檢測，展開液爲二氯甲院： 甲醇= 96:4)檢測成分，將相同成分合倂。 以二氯甲烷—甲醇（96:4)混合液進行矽膠管柱層析’ 可得到屬PCM部份78克，PCM部份依上述矽膠薄層層析法 可明顯看到6個跡點。以二氯甲烷：甲醇（90:10)及（0:1 〇〇) 沖提液層析合倂可得到PCW部份1 68克。
PCM部份進一步以二氯甲烷：甲醇（96.5:3.5)作爲 沖提劑進行矽膠管柱層析（同上述矽膠管柱），溶離液依矽 膠薄層層析分析結果可合倂得到三個部位，分別爲K1 (Rf = 0. 64)、PCM-1 (含微量 Kl，K3 (Rf = 0. 55)，K5 (Rf = 0· 49)) 和 PCM-2 (含 K2 (Rf=0.30)， K4 (Rf=0.24)， K6 (Rf = 0. 19))。管柱層析所得K1部位（3. 5 g)，進一步經高 效液相層析（碳-C18管柱、移動相爲甲醇-水（90:10))純 化可得K1成分3. 0 g。
PCM-1部位利用相同高效液相層析，以甲醇-水（87 :13) 沖提可得K3，K5及微量K1成分。K3成分利用相同高效液 相層析，以甲醇-水（84:16)沖提可得K3 (1. 93 g)。K5成 分利用相同高效液相層析，以甲醇-水（93:7)及（91:9)依序 純化可得K5(47. 6mg)。 而PCM-2之成分，利用相同高效液相層析法，以甲醇-水（87:13)沖提可得1^6微量成分（1(63 + 1(61))，1(4微量成分 (K4a + K4b) ’ K2成分及K4成分。後二者K2成分及K4成 分利用相同高效液相層析，以甲醇-水（84:16)沖提分別得 K2 (6. 2 g)及 K4 (0.55 g)。 12 1351961 K6微量成分則利用相同高效液相層析以 MeCN-H2〇(68:32)純化得到 K6a (21_4 mg)及 K6b (90.7 mg) ; K4微量成分則利用相同高效液相層析以甲醇-水 (76: 24)純化分離得到 K4a (66. 0 mg)及 K4b (86. 8 mg)。 上述之Π至K6化合物，其分析數據如下： Κ1:混合物，EI-MS:主成分，528[Μ]+;微量成分,526[Μ]+
Kl(主成分):13C-NMR ( 5 c):35.4 (c-1), 24.5 (c-2)，80·6 (c-3), 38·0 (c-4), 50.7 (c-5), 18.4 (c-6), 26.8 (c-7), 135.0 (c-8), 134.4 (c-9), 37.2 (c-10), 20.9 (c-11), 29.7 (c-12), 48.8 (c-13), 46.3 (c-14), 43.6 (c-15), 26.6 (c-16), 57.3 (c-17), 17.8 (c-18), 19.2 (c-19), 48.6 (c-20), 178.6 (c-21), 31.6 (c-22), 33.2 (c-23), 156.1 (c-24), 34.1 (c-25), 22.0 (c-26), 21.9 (c-27), 28.0 (c-28), 16.8 (c-29), 25.4 (c-30), 107.0 (c-31), 21.1 (CH3COO-), 170.5 (CH3COO-)
K1 (微量成分)：13C-NMR (δ c): 35.6 (c-1), 24.5 (c-2), 80.6 (c-3)，37.8 (c-4), 49.7 (c-5), 23.1 (c-6), 120.6 (c-7), 142.8 (c-8), 145.8 (c-9), 37.6 (c-10), 117.0 (c-11), 36.3 (c-12), 49.4 (c-13), 45.1 (c-14), 44.4 (c-15), 76.4 (c-16), 57.6 (c-17), 17.6 (c-18), 22.8 (c-19), 48.4 (c-20), 178.5 (c-21), 31.4 (c-22), 33.2 (c-25), 156.0 (c-24), 34.1 (c-25), 22.0 (c-26), 21.9 (c-27), 28.2 (c-28), 17.1 (c-29), 26.5 (c-30), 107.0 (c-31), 21.1 (CH3COO-), 170.4 (CH3COO-) K2:混合物，EI-MS:主成分，486[M]+;微量成分，484[M]+ K2(主成分)：13C-NMR (5 c): 36.6 (c-1)，29.1 (c-2)，78·5 (c-3)，40.0 (c-4)，51.4 (c-5), 19.2 (c-6), 27.4 (c-7), 135.4 (c-8), 135.3 (c-9), 37.9 (c-10), 21.4 (c-11), 30.2 (c-12), 49.3 (c-13), 46.7 (c-14), 44.2 (c-15), 77.1 (c-16), 57.8 (c-17), 18.2 (c-18), 13 1351961 19.8 (c-19), 49.2 (c-20), 179.4 (c-21), 32.1 (c-22), 33.7 (c-23), 156.5 (c-24), 34.6 (c-25), 22.5 (c-26), 22.4 (c-27), 29.1 (c-28), 16.8 (c-29), 25.9 (c-30), 107.5 (c-31)
K2 (微量成分)：13C-NMR (<5 c): 36.7 (c-1)，29_1 (c-2)，78.5 (〇3)，40.0 (c-4)，49.8 (c-5), 24.3 (c-6), 121.2 (c-7), 143.3 (c-8), 145.2 (c-9), 38.0 (c-10), 118.1 (c-11), 37.2 (c-12), 45.5 (c-13), 49.1 (c-14), 44.8 (c-15), 76.8 (c-16), 58.0 (c-17), 18.1 (c-18), 22.9 (c-19), 48.0 (c-20), 179.4 (c-21), 31.9 (c-22), 33.7 (c-23), 156.5 (c-24), 34.6 (c-25), 22.9 (c-26), 22.4 (c-27), 29.1 (c-28), 16.8 (c-29), 26.8 (c-30), 107.5 (c-31) K3: mp: 278-280〇C [a ]d24+3° (c 0.6, Pyridine)
EI-MS m/z: 482[M]+, 13C-NMR (<5 c): 37.5 (c-1), 35.7 (c-2), 216.7 (c-3), 48.3 (c-4), 51.8 (c-5), 24.6 (c-6), 121.4 (c-7), 143.5 (c-8), 145.4 (c-9), 38.2 (c-10), 118.3 (c-11), 36.9 (c-12), 45.7 (c-13), 50.0 (c-14), 44.9 (c-15), 77.2 (c-16), 58.1 (c-17), 18.3 (c-18), 22.7 (c-19), 49.2 (c-20), 179.6 (c-21), 32.0 (c-22), 33.8 (c-23), 156.7 (c-24), 34.8 (c-25), 22.7 (c-26), 22.6 (c-27), 26.3 (c-28), 23.1 (c-29), 27.1 (c-30), 107.8 (c-31) K4: mp:>300°C [a ]d24+1 8° (c 0.5, Pyridine) EI-MS m/z: 484[M]+, 13C-NMR (¢5 c): 31.4 (c-1), 27.4 (c-2), 76.0 (c-3), 38.6 (c-4), 44.5 (c-5), 24.2 (c-6), 122.0 (c-7), 143.5 (c-8), 147.4 (c-9), 38.6 (c-10), 116.9 (c-11), 37.0 (c-12), 45.9 (c-13), 50.2 (c-14), 45.1 (c-15), 77.3 (c-16), 58.2 (c-17), 14 1351961 18.4 (c-18), 23.7 (c-19), 49.3 (c-20), 179.8 (c-21).32.1 (c-22), 33.9 (c-23), 156.7 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.6 (c-27), 29.9 (c-28), 23.9 (c-29), 27.3 (c-30), 107.9 (c-31) K4a: mp: 284-287°C [a ]d24+44° (c 0.5, Pyridine)
EI-MS m/z: 498[M]+, 13C-NMR (<5c): 35.9 (c-1), 37.1 (c-2), 217.3 (c-3), 53.5 (c-4), 43.9 (c-5), 24.5 (c-6), 121.5 (c-7), 143.7 (c-8), 144.9 (c-9), 37.9 (c-10), 119.0 (c-11), 36.9 (c-12), 45.9 (c-13), 50.0 (c-14), 45.0 (c-15), 77.3 (c-16), 58.2 (c-17), 18.5 (c-18), 23.3 (c-19), 49.4 (c-20), 179.9 (c-21), 32.2 (c-22), 34.1 (c-23), 157.0 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.7 (c-27), 19.4 (c-28), 67.5 (c-29), 26.9 (c-30), 107.8 (c-31) K4b: mp: 230-232〇C [a ]d24+38。（c 0.5, Pyridine)
EI-MS m/z: 542[M]+, 13C-NMR (<5 c): 36.6 (c-1), 25.0 (c-2), 82.1 (c-3), 39.4 (c-4), 56.7 (c-5), 68.9 (c-6), 129.2 (c-7), 142.1 (c-8), 145.8 (c-9), 39.2 (c-10), 117.9 (c-11), 36.9 (c-12), 45.8 (c-13), 49.9 (c-14), 44.9 (c-15), 77.3 (c-16), 58.1 (c-17), 18.4 (c-18), 24.8 (c-19), 49.3 (c-20), 179.9 (c-21), 32.1 (c-22), 33.9 (c-23).156.7 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.7 (c-27), 31.9 (c-28), 18.1 (c-29), 27.1 (c-30), 107.9 (c-31), 22.0 (CH3COO-), 172.0 (CH3COO-)
K5: mp: 274-275〇C 15 1351961 [<2]d24+10〇 (c 0.5, Pyridine) EI-MS m/z: 454[M]+, ,3C-NMR ( δ c): 36.8 (c-1) > 29.6 (c-2) > 79.0 (c-3), 38.6 (c-4), 50.6 (c-5), 24.3 (c-6), 122.1 (c-7), 143.6 (c-8), 147.3 (c-9), 37.2 (c-10), 117.5 (c-11), 34.1 (c-12), 45.0 (c-13), 51.3 (c-14), 30.8 (c-15), 28.1 (c-16), 48.9 (c-17), 17.4 (c-18), 23.7 (c-19), 49.9 (c-20),
179.9 (c-21), 32.4 (c-22), 27.5 (c-23), 124.3 (c-24), 132.7 (c-25), 26.6 (c-26), 18.6 (c-27), 29.2 (c-28), 17.1 (c-29), 26.7 (c-30) K6a: mp: 248-250〇C [a ]d24+63° (c 0.4, Pyridine) EI-MS m/z: 498[M]+, 13C-NMR (<5 c): 37.1 (c-1), 35.0 (c-2), 219.0 (c-3), 48.4 (c-4), 57.0 (c-5), 68.0 (c-6), 128.6 (c-7), 141.8 (c-8), 144.2 (c-9), 38.3 (c-10), 120.2 (c-11), 36.6 (c-12), 45.8 (c-13), 49.7 (c-14), 44.8 (c-15), 77.2 (c-16), 58.1 (c-17), 18.4 (c-18), 22.7 (c-19), 49.4 (c-20), 179.6 (c-21), 32.1 (c-22), 33.9 (c-23), 156.8 (c-24), 34.9 (c-25), 22.8 (c-26), 22.7 (c-27), 31.5 (c-28), 24.5 (c-269), 26.6 (c-30),
107.9 (c-31) K6b: mp: 267-270〇C [a ]d24+68° (c 0.3, Pyridine) EI-MS m/z: 516[M]+, 13C-NMR ( 6 c): 34.4 (c-1), 29.4 (c-2), 74.1 (c-3), 42.6 (c-4), 87.7 (c-5), 133.1 (c-6), 134.7 (c-7), 79.6 (c-8), 145.8 (c-9), 42.1 (c-10), 120.7 (c-11), 36.8 (c-12), 49.1 (c-13), 48.7 (c-14), 42.7 (c-15), 76.8 (c-16), 57.6 (c-17), 19.0 (c-18), 29.3 (c-19), 49.1 (c-20), 179.6 (c-21), 32.2 (c-22), 33.9 (c-23), 156.8 (c-24), 34.9 (c-25), 22.9 (c-26), 22.7 (c-27), 25.1 (c-28), 20.3 (c-29), 20.8 (c-30), 16 1351961 上述之Π至K6化合物，其結構如下： 107.9 (c-31)
K2: R2 = 0H ，微量成分 K1 : R2 = 0C0CH3,主成分 K2: R2 = 0H ，主成分
K3 ： Re = Rs =H K4a ： Re =ch2〇h Rs =H K6a ： Re =CHa Rs = OH K4: R2 = a -OH Rs = Η
K4b: R2 = /3 -OCOCHs R5 = OH
實施例二 17 1351961 將2公斤與實施例一相同之雲南茯苓粉末，以中國第 1008183號之方法，參閱第二圖可得萃取物6. Q克。重覆 實施例一步驟對6.0 g萃取物進一步以二氯甲烷-甲醇 (96 : 4 )混合液作爲沖提劑進行矽膠管柱層析，可得到屬 PCM-E部份2. 0 g。以二氯甲烷：甲醇（90:10)及（0: 100)混 合液進行沖提，合倂可得到PCW-E部份2. 3 g。
對照結果 將實施例二之PCM-E及PCW-E，以40mg/kg/day 口服（餵 食）給予動物，分別檢測此二部位成分對動物脾臟細胞（免 疫細胞）生長是否有促進作用或者產生抑制作用，如促進 細胞增生顯示有利於免疫反應，如抑制細胞增生不利於免 疫反應，即對細胞產生毒性作用。
經由下述免疫學硏究方法，取得（動物）離體脾臟細 胞，培養5天，再以MTT assay檢測（參考下述免疫學硏 究方法），比較細胞生長情形。 結果如表一所示，饌食PCM-E之小鼠，在第三天及第 四天其脾臟細胞有增加情形，在統計上與控制組無顯著差 異；不過餵食PCW-E之小鼠，其脾臟細胞培養三天及四天 後，活細胞數顯著低於控制組，顯示PCW-E有細胞毒性， 減少存活細胞數。 因此，可說明含羊毛固醇（lanostane)的低極性部位， 不具脾臟細胞毒性作用，相反的是有脾臟細胞增加情形； 而含開環羊毛固醇（secolanostane)的高極性部位（Rf<0. 1) 18 1351961 則爲對脾臟細胞有毒性作用。亦即，習知方法所得到的茯 苓萃取物含有對脾臟細胞具毒性的極性部位（PCW-E)。 表一脾臟細胞生長情形-PCM、PCW、PCM-E、PCW-E之作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 培養天數(天） 3 4 5 控制組 0.608±0.042a 0·777±0·141 0·515±0.055 PCM-E 40 0.890±0.195 0.857±0.137 0.449±0.083 PCW-E 40 0.245±0.072* 0.451±0.020** 0·344±0.132 a:表中數據爲5次實驗之Mean 土 S.E.Μ ; *表示 PC0.05，**表示 Ρ<0.01
由以上實施例及對照例之結果，可證實以下事項： 1. 茯苓的有效成分爲含有羊毛固醇（lanostane)類化合物 的低極性部位，得用來提昇人體的免疫效果。
2. 有效成分和毒性成分（開環羊毛固醇或其他極性大之分 子），可藉由矽膠薄層層析法鑑定及以矽膠管柱層析法分 離。 3. 以本發明之製備方法製得的低極性部位（PCM )含有羊毛 固醇類化合物的，且去除開環羊毛固醇類毒性成分，因 此提昇免疫力效果及安全性顯著增強，遠優於傳統習知 萃取法所萃取出的茯苓萃取物。 4. 上述動物實驗是經由口服吸收後，再檢驗對於脾臟細胞 的作用，與傳統利用體外細胞試驗有不同意義。因體外 19 1351961 細胞實驗避開藥物吸收，體內分佈和代謝對藥物之影 .響，無法反應藥物真正作用，因此，體內實驗意義較體 外所顯示意義更爲可信賴。 由於免疫反應爲一複雜過程，本發明之萃取物及層析 純化物，係依據免疫試驗按照下列幾項硏究而測得具免疫 功能：
1. 由動物之血淸中得知抗體變化情形。 2. 利用脾臟細胞（含免疫細胞）測定 (1) 淋巴球增加（或減少）； (2) 淋巴球類族群變化； (3) 自然殺手細胞活性； (4) 抗體之分泌；及 (5) 細胞激素之分泌。 3. 腹腔巨噬細胞吞噬力。
如實施例一所示，本發明經矽膠管柱層析及高效液相 層析’可分離或純化出雲南產茯苓之羊毛固醇類成分，K1、 K2、K3、K4、K4a、K4b、K5、K6a 及 K6b (其中 K1 及 K2 因 化合物性質’雖使用高效液相層析仍無法分離其內之微量 成分）’將矽膠層析之K1及高效液相層析所得之K2、K3 及K4進行免疫增強硏究（如免疫學硏究項下），由表二至 表十實驗結果，顯示ΚΙ、K2、K3及K4化合物在實驗最低 濃度（2.5mg/kg或5mg/kg)下，就能對免疫細胞（T細胞 /B細胞），出現免疫增強作用。 據此’可確認茯苓的有效成分，係羊毛固醇類成分， 20 1351961 其中PCM及主要成分ΚΙ、Κ2、Κ3、K4均具有加強免疫細胞 之效能。 硏究方法：（免疫學硏究） 實驗動物
BALB/c小白鼠：6-8週大，雄性，購自國家動物中心， 飼養於國立台灣師範大學生物系動物房，飼養環境採用標 準無特殊病源動物（SPF)、獨立吹塵式無菌動物籠架 (Individual Ventilation Cage System，IVC)，所飼養動 物所用的飮水、木屑及飼料皆經高溫高壓滅菌處理，溫度 保持在24-26°C，濕度保持在30-70%，照明使用定時器以 確保規律之光照週期，以一天12小時日12小時夜循環， 飼料購自台大動物中心（粗蛋白23. 5%以上：粗脂肪4.5% 以上；粗纖維6%以下；水份12%以下；灰份9%以上）， 飼養兩週後，即進行實驗。
動物慮琿 動物被分成4組（或3組），餵食給藥1亳升的萃取物或純 化成分’ 4天藥物劑量範圍如爲PCM則劑量爲1 0、40、 8 0mg/kg/day，如爲純化物K1及K2,劑量爲上述4分之一， 即2. 5、5、10、20mg/kg/day，對照控制組則不給藥以而 等體積無菌水取代，老鼠在第五天犧牲後，收集其血淸及 脾臟細胞作硏究材料，血淸部份則測其抗體，即IgG、IgM 和IgA、脾臟細胞則被置入ι〇公分直徑之培養皿，然後於 37°C下培養3小時，去除附著性細胞，非附著性細胞包括 21 1351961 Τ、B、NK等細胞，收集後按下列各項實驗指示處理。 φ物處理 茯苓成分加入無菌水，使用超音波處理使成懸浮狀溶液。 分離脾臟淋巴球
經斷頸及70%酒精噴灑消毒後，先以23G needle心 臟抽血，待凝血後，離心分離出血淸備用，再用剪刀剪開 其皮膚及腹膜，取出脾臟。脾臟取出後，打開胸腔，直接 由心臟取血，製備血淸，以備進一步實驗。另準備一盛有 l〇ml RPMI-1640細胞培養液之培養皿，其中放入細胞硏磨 器，將脾臟置於細網上以硏磨器磨碎，使細胞分離而懸浮 於培養液中。如此收集到的脾臟細胞自培養皿吸出，裝入 50ml離心管中，放置離心機，以1300rpm離心10分鐘。 加 lml cold RBC lysing buffer (EDTAUCl)處理 10 分 鐘，以去除紅血球。離心淸洗三次後，將細胞移至培養皿 中，於二氧化碳培養箱（37°C、5%C〇2、100%飽和濕度）放 置三小時，使附著性細胞附著於培養皿上，隨後收集非附 著性細胞，其中主要含脾臟淋巴球。 MTT法 MTT法是分析細胞存活數或活性常用方法，基本原理 是利用活細胞中粒線體的氧化還原酵素對受質作用，產生 顔色的變化，再進一步測定其吸光値（（Mosmann，J. Immunol. Method.，65，55-63( 1983))。詳細方法如下： 將分離好的脾臟淋巴球調成5X106 cell/ml，置入 22 1351961
96well的培養盤中，每weii加100" 1。—個sampie加5 個格，並每個 well 加入 1# 1 ConA (lmg/ml) (Sigma，MO. USA) ’最後置於37°C、5%C〇2、100%飽和濕度培養箱中培 養’於第三天、第四天及第五天以MTT法測試 方法如下：先加入MTT試劑（3-「4, 5-dimethylthiazol-2-yl」-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma, MO. USA)20# 1 後，放在 培養箱中作用4小時。4小時後取出培養盤，每個格加入 acid-isopropanol (0.04N HC1 in isopropanol)120# 1 ， 充分混合以溶解培養底部深藍色結晶。再置於培養箱20 分鐘，20分鐘後以ELISA測讀儀（波長570 nm)讀取吸光 値，以分析細胞存活數。 酵素免疫分析法測宙莬痔球蛋白
本硏究採用sandwich ELISA方法，簡述如下：將分離 好的脾臟淋巴細胞懸浮在含10%胎牛血淸，2mM glutamine ， 100u/ml Penici11in/Streptomycin 及 5ug/m1 脂多醣（LPS)的RPMI 1 640培養基中（稱爲完全培養基）， 調成5Xl05cell/ml，細胞隨後置入24-well之培養盤中， 每格加入lm卜在37°C、5%C(h、100%飽和濕度中培養5天， 然後收集上淸液作ELISA測試。 1·測 IgG : 首先將 goat anti-Mouse IgG + A+M (H+L) (Zymed ’ CA USA)，lmg/ml 稀釋成 1/1 000 加入 96 格的 ELISA plate (Nunc, 23 1351961
Denmark)，每格加入100 μΐ，放在4°C中隔夜，翌日，拿 出plate用0. 05% PBS-Tween20洗三次，吸乾。以 l%PBS-gelatin 進行 blocking，每格加入 1 〇〇 μ卜放在 37°C 下作用60分鐘。將血淸樣品用RPMI 1 640稀釋十萬倍 (1/105)，而培養脾臟細胞之上淸液樣品則不稀釋。IgG標 準液序列稀釋爲：0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、 0. 0078、0· 0039、0 pg/ml等各濃度。取出放在37°C培養 箱中之plate，以0. 05%PBS-Tween20淸洗三次並吸乾，隨 後分別加入待測樣品及標準液各1 00 μΐ，在37°C培養箱中 作用二小時。拿出 ELISA plate，續用 0. 0 5%PBS-Tween20 淸洗三次並吸乾後，再加入goat anti-mouse IgG-HRP(稀 釋1 /1 000)每格加入100 μΐ，續於37°C中作用60分鐘，
最後再用〇. 〇5%PBS-Tween20洗三次，並加入100 μΐ的受 質（0.1% O-phenylenediamine; 0.1Μ citrate buffer, pH 4. 5; 0. 03% H2〇2)，於室溫中作用30分鐘。最後用ELISA reader(主波長490nm，輔波長630nm)讀O.D.値。參考標 準曲線，算出各待測樣品所含IgG之濃度。 2. 測 IgM :
IgM之測試方法與IgG相似，血淸樣品用RPMI 1640 稀釋一萬倍（1/1 Q4)，上淸液樣品則不稀釋。IgM標準液序 列稀釋爲：1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625、0. 0312、0· 0156、 0 gg/ml等各濃度。二次抗体使用goat anti-mouse IgM-HRP(稀釋 1 /1 000)。 3. 測 IgA : 24 1351961 UA測試方法與IgG相似，ELISA plate附上sheep anti-mouse IgA(稀釋成 1/1000)，血淸樣品用 RPMI 1640 稀釋—萬倍（1/104)，上淸液樣品則不稀釋。IgA標準液序 列稀釋爲 1、〇. 5、0. 25、0· 125、0. 0625、0. 0312、0 pg/ml 等各濃度。二次抗体使用goat anti-mouse IgA-HRP(稀釋 1/1000)。
酵素免疫分析法測定細胞激素（IL-10及IFN-r ) 將分離好的脾臟淋巴細胞以完全培養基調成IX 106cell/ml，不過以ConA (1 # g/ml)取代LPS，隨後細胞 置入24-well培養盤中，每格加入lml，在37°C、 5% C〇2， 100%飽和濕度下培養3天，第3天取上淸液測IL-10及IFN- r 〇 1.測 IL-10
以 Cyto Set ELISA kit ( R & D Systems, MN, USA) 測定之，方法簡述如下：以抗raIL-10單株抗體爲一次抗體 附在ELISA plate上，每格加入100ul之mlL-10標準品 濃度由500 pg/ml序列稀釋至15. 6 pg/ml或待測樣品， 37°C中作用20分鐘後，以沖洗液沖洗五次，每格再加入 100ul 之 biotinylated conjugated anti-IL-10 (二次抗 體），37°C中作用20分鐘，以沖洗液沖洗五次，每格再加 入 100# 1 之 HRP conjugated streptoavidin，37。(3 中作 用20min後，以沖洗液沖洗五次，每格再加入50/z 1之 substrate solution (含 IhCh 及 tetramethylbenezidine ； 25 1351961 ΤΜΒ)，以ELISA Reader (450nm)測0.D値，再以標準曲線 求樣品之IL-1Q濃度。 2.測 IFN-r
以 Cyto Set ELISA kit (R & D Systems, MN，USA) 測試方法與mIL-10相似，ELISA plate附上以抗m IFN-T 單株抗體（一次抗體），二次抗體爲biotinylated conjugated anti-IFN-γ，標準品濃度由 600 pg/ml 序列 稀釋至 18. 8 pg/ml。 T細朐CD4+及CD8 +次族群分析
將已經收集好的脾臟淋巴球放入Falcon tube，將細 胞調成 lxlO6 cell/ml，加入各 1 μΐ 的 Phycoerythin (PE)-conjugated anti-mouse CD4 、 Fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated anti-mouse CD8 ，在 室溫避光環境下作用15分鐘後，加入3ml無菌冷卻之 PBS，以13Q0rpm離心10分鐘，離心後吸除上淸液，均勻 打散細胞，加入〇.5ml含1.0% paraformaldehyde之冷卻 PBS，並輕微地振盪混合，隨即用流式細胞儀（Flow cytometry ; Becton Dickinson FACS, Sam，CA)進行營光 陽性細胞比例分析。 自然殺丰細朐活件分析 爲了測定動物之自然殺手細胞活性，須先培養自然殺 手細胞的目標細胞（YAC-1細胞株），將生長良好之YAC-1 26 1351961
細胞株配製成1 χ 105 cell/ml加入2 μΐ DiOC18(綠色螢光 標示目標細胞），於二氧化碳於培養箱中培養20分鐘。20 分鐘後，取 200 μΐ YAC-l(Target cells)及 200 μΐ 分離 好的脾臟淋巴球（Effector cells) ’配成Τ:Ε比例分別爲 1:50、1 :25、1:12. 5的細胞混合液，另一管只加YAC-1當 作負控制組，細胞混合液放入二氧化碳培養箱放置2小 時，2小時後加入50μ1 Propidium Iodide(紅色螢光，滲 入死亡細胞中，標示細胞核），置於冰浴中10分鐘，在4 艺避光環境下立即用流式細胞儀分析。 吞赚細朐活件分析
先製備老鼠腹腔巨噬細胞，方法如下：老鼠犧牲前三 天以腹腔注射10% 2.5ml proteose peptone，三天後斷頸 將老鼠致死，用剪刀把腹腔表皮剪開，打入3.0 ml無胎 牛血淸之DMEM，用鑷子輕拍腹腔約3分鐘後，用空針取出 腹腔液，以DMEM加至10ml，即以13Q0rpm離心10分鐘， 收集之腹腔細胞調成1 xlOVml。 一個 sample 準備二根 falcon tube，各加入 100 μΐ 巨噬細胞懸浮液，放置冰上10分鐘，隨後加入100 μΐ FITC-conjugated Escherichia co7/(K-12) 5xl07 cells/ml，兩管中一管放置冰上15分鐘（負控制組），另一 管放置37°C 15分鐘，作用結束後各加入1〇〇 μΐ trypan blue 混合均勻，以cold PBS 3ml於1300rpm離心5分鐘，如 此將細胞淸洗兩次後，加入500μ1 l%paraformaldehyde， 27 1351961 即可用流式細胞儀分析，有吞噬兄之巨噬細胞發出 黃綠色螢光。 統計方钱； 以Mann-Whitney Rank Sum Test，分析服藥組與控制 組之間的關係，P値<〇. 05視爲顯著差異。 硏究結果： (1) 脾臟細胞生長情形-PCM、ΚΙ、K2、K3及K4之作用 如表二所示，口服PCM、ΚΙ、K2、K3及K4之小鼠脾臟 細胞與控制組（餵食無菌水）相較結果：服用PCM 40mg/kg/day之小鼠在培養第三天後，活細胞顯著多於 控制組。而ΚΙ、K3及K4服用5mg/kg/day以上，K2服 用10rag/kg/day以上在培養第三天，活細胞顯著多於 控制組。 28 1351961 表二~1脾臟細胞生長情形-PCM, ΚΙ, K2之作用 成分 劑量 培養天數(天） (mg/kg/day) 3 4 5 控制組 PCM 10 0.359±0.076a 0.453±0·028 0·481±0.044 0.398±〇.〇57 0·414±0.067 0.30U0.059 PCM 40 0.551±0.040* 0.40U0.031 0.445±0.055 PCM 80 0.475±0·083 0.410±0.083 0.447±0.075 K1 2.5 0.497±0.080 0.533±0.070 0.584±0.060* K1 5 0.642±0.078** 0.652±0.077 0.469±0.054 K1 10 0.743±0·083** 0.733±0.035*** 0.562±0.025* K1 20 0.634±0.048** 0.57U0.091 0·452±0·049 K2 2.5 0.533±0.069* 0.460±0.052 0·414±0·054 K2 5 0.489±0.087 0.480±0.072 0.527±0.062 K2 10 0.928±0.078*** 0.93U0.065*** 0.585±0.041* K2 20 0.655±0.075** 0.605±0.072 0.530±0.057 a =表中數據爲ΜΤΤ測試所獲得之570nm波長吸光値 (O.D.);數據爲10次實驗之Mean±S.E.M ; *表示 p<0.05 ; **表示 P<0.01 ;…表示 PC0.001 29 1351961 表二~2脾臟細胞生長情形-K3，K4之作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 培養天數(天） 3 4 5 控制組 0.373±0.070 〇.404±0.033 0.431±0.044 K3 5 1.154±0.172*** 0.841±0.160* 0.864±0.194 K3 10 1.020±0.090*** 0.900±0.193** 0.957±0·200* K3 20 1.103±0.081*** 1.068±0.132*** 0.943±0.159** K4 5 0.949±0.101** 0.981±0.087*** 0.862±0.085** K4 10 1.198±0.101*** 1.273±0.147*** 1.177±0.078*** K4 20 1.233±0.040*** 1.263±0.041*** 1.061 土 0.124***
a :表中數據爲ΜΤΤ測試所獲得之570nm波長吸光値 (O.D.);數據爲6次實驗之Mean 士 S.E.M ; *表示 P<0.05; **表示 PC0.01 ; ***表示 PC0.001
(2) 血淸中免疫球蛋白濃度變化-PCM、ΚΙ、K2、K3及 K4之作用 如表三所示，口服40mg/kg/day以上之PCM顯著提昇 小鼠血淸中IgG之濃度，而餵食K1、K2及K4 5mg/kg/day 以上之血淸IgG濃度顯著高於控制組；相反的，餵食 5mg/kg/day以上之K3則IgG血淸濃度顯著低於控制 組。餵食 PCM 40mg/kg/day、K1 10mg/kg/day、K2 2. 5mg/kg/day、K3 5mg/kg/day 及 K4 5mg/kg/day 以 上之血淸IgM濃度顯著高於控制組。口服80mg/kg/day 之PCM顯著抑低小鼠血淸中IgA之濃度。然而，K1 30 1351961 10mg/kg/day則顯著提高IgA濃度，Κ2、K3及K4於所 測試濃度下對IgA並無影響。 表三~1血淸免疫球蛋白濃度-PCM，K1，K2之作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 免疫球蛋白濃度(mg/ml) IgG IgM IgA 控制組 1.81±0.19a 0.90±0_18 3.67±0.54 PCM 10 2.38±0.28 1.31±〇.13 3.40±0.25 PCM 40 4.36±0.88* 1.96 士 0.18*** 2.54±0.28 PCM 80 4.53±0.92* 2.07±0.21*** 2.26±0.26* K1 2.5 1·57±0·32 1.27±〇.22 3.51 士 0.33 K1 5 2.83±0.41* 1.38士0.24 4.03±0.47 K1 10 3.00±0.53** 3·27±0·47 … 6.57±0.71** K1 20 3·74±0·62** 1.46±〇.27 3.79±〇.35 K2 2.5 1.69±0·24 2·82±0·41 … 2.85±0.36 K2 5 2.95±0.17** 3.46±0.61*** 2.8U0.28 K2 10 3·75±0·54*** 2.58±0.38 … 4.33±0.33 K2 20 5·11±0·72 … 5.13±〇.95*** 5.02±0.65 a ： 表中數據爲 10次實驗之 Mean土S. Ε· Μ ; *表不P < 〇. 〇5，木*表示 ρ< 〇· οι m表示 p< 〇. 〇〇1 31 1351961 表三〜2血淸免疫球蛋白濃度-Κ3，Κ4之作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 免疫球蛋白濃度(mg/ml) IgG IgM IgA 控制組 1.80±0.11 1.11±0.13 3.15±0.48 K3 5 1.32±0·09** 1.63±0.11** 3.65±〇.26 K3 10 1.28±0.13** 1.53 士 0.14* 3.81±0·46 K3 20 1.14±0.11** 1.53±0.13* 3·55±0.37 K4 5 3.75±0·18*** 2.65±0.21** 3.33±0·13 K4 10 4.33±0.29*** 2.86±0.16** 3.39±0.25 K4 20 4.18±0.25*** 2.36±0.16** 3·54±0·12 a:表中數據爲6次實驗之Mean 土 S.E.Μ ; *表示 ρ<0.05，**表示 Ρ<0.01 ; ***表示 Ρ<0.001 (3) 離體培養下，脾臟細胞分泌抗體之能力-PCM、Κ1、 K2、K3及K4之作用 3-1 :離體培養下，脾臟細胞分泌IgG之能力一 PCM、K1、 K2、K3及K4之作用，如表四所示，口服40rag/kg/day PCM小鼠脾臟細胞培養三天後，IgG分泌有顯著增 加，而 K1 5mg/kg/day 以上及 K2 10mg/kg/day 以上 則IgG分泌有顯著增加，相反的，K3 5 mg/kg/day 以上IgG分泌有顯著抑制，而K4 5 mg/kg/day以 上，培養至第五天，IgG分泌有顯著增加。 32 1351961 表四〜1脾臟細胞分泌IgG(ng/ml)之能力-PCM，K1，K2之作用 成分 劑量 培養天數(天） (mg/kg/day) 3 4 5 控制組 7.40±1.07a 10.00±1.42 11.21±1.31 PCM 10 4.24±0.69 6.00±0.97* 6.46±0.94* PCM 40 16.37±3.11* 17.42±3.41 13.67±3.73 PCM 80 10.84±3.42 8.67±3.33 9.20±3.18 K1 2.5 19.65±5.73 19.88±5.26 13.34±3.66 K1 5 41.53±8.68*** 32.94±8.84*** 33.27±6.14** K1 10 38.43士11.09*** 30.01±7.40*** 34.49±8.27*** K1 20 59.53±13.04*** 65.55±17.30*** 70·58±20·47 … K2 2.5 8.32±2.53 15.32±3.67 9.02±2.34 K2 5 5.97 士 2.70 10.48±3.77 13.34±3.83 K2 10 12.95±2.17* 11.94±2.24 17·97±2·07** K2 20 25·93±10·15* 27.4U10.98* 22.82±5.96* a ： 表中數據爲 1 〇次實驗之 Mean土 S·Ε·Μ ; ► *表示 Ρ<0·05 ;表示 Ρ < 0.01 ; ***表示 Ρ < 0.001
33 1351961 表四〜2脾臟細胞分泌IgGCng/ml)之能力-K3,K4之作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 培養天數(天） 3 4 5 控制組 7.17±0.89 12.04±0.46 9.55±0.77 K3 5 3.85±0.73** 3.43±0.40** 4.46±0.95** K3 10 3.18±0.55** 3.16±0.62** 3.48±0.43** K3 20 6.12±0.70 7.10±1.39* 8.56±1.34 K4 5 12.55±3.08 12.99±〇.86 18.29±0.92** K4 10 6.54±1.43 15.15±5.16 22.59±5.35* K4 20 21.23±3.19** 19.11±4.23 22.56±3.84* a : 表中數據爲 6次實驗之Mean土 S.E.M ; *表示 P < 0.05 ; **表示 Ρ< 〇·〇1 ; 3-2 :離體培養下，脾臟細胞分泌IgM之能力一 PCM、Κ1、 K2、K3及K4之作用如表五所示，口服40mg/kg/day 以上之 PCM，10 mg/kg/day 以上之 K1 及 K3，2. 5 mg/kg/day以上之K2，5 mg/kg/day以上之K4小鼠 脾臟細胞，從培養第三天起，其IgM之分泌量皆顯 著高於控制組。 34 1351961 表五〜1脾臟細胞分泌IgM(ng/ml)之能力-PCM,K1，K2之作 _I_ 成分 劑量 _培養天數(天)_ _(mg/kg/day)_3_4_5 控制組 PCM 10 PCM 40 PCM 80 ΚΙ 2.5 ΚΙ 5 ΚΙ 10 ΚΙ 20 Κ2 2.5 Κ2 5 Κ2 10 Κ2 20 138.27±42.55a 184·37±36·35 375.07±13·6*** 328.96±24.46… 181.30±34.26 223.32±51·46 356·52±28·8*** 267·18±58·97 378.0±55·5 … 457·81±87·3** 540.23±68.8*** 837·1±114·5*** 171·10±39.90 251.78±37.64 352·16±17.60*** 322.79±23.76* 201.03±33.98 233.67±31.32 362.17±31.1** 280.79±32.08* 479.8±60.9*** 507.62±91.9** 512.47 士84.20*** 695.2±144.7** 184.29±30.97 273.91±33.30 323.52±13.70*** 296.89±12.42** 190.20±38.67 249.35±38·32 527.33±41.00*** 320.44±41.39* 254.4±30.8 334.75±48.7* 550.54±50.10*** 591.5±108.4*** a:表中數據爲10次實驗之Mean 土 S.E.Μ ; *表示 Ρ<〇.〇5 ; **表示 Ρ<0·01 ; ***表示 Ρ<0·001 35 1351961 表五~2脾臟細胞分泌IgM(ng/ral)之能力-Κ3，Κ4之作 用 成分 劑量 (mg/kg/day) 培養天數(天） 3 4 5 控制組 121.91i34.35 200.75±32.77 219.30±18.60 K3 5 222.42±42.83 214.45±28.51 277.52±101.63 K3 10 287.66±44.44* 294.30±30.68* 309.51±30.88* K3 20 372.14±69.48* 519.53 士52.63 … 606.44±88.10** K4 5 463.65±76.41*** 688.17±85.78*** 649.89±70.09*** K4 10 514.45 士70.30… 733.58±95.70*** 807.32±104.21*** K4 20 747.6±128.42*** 746.50±157.76*** 857.49±92.19***
a:表中數據爲6次實驗之Mean 土 S. Ε. Μ ;*表示Ρ< 0. 05 ; *木表示 Ρ< 0· 01 ; ***表示 Ρ< 0. 001
3-3 :離體培養下，脾臟細胞分泌IgA之能力一 PCM、Κ1、 K2、K3及K4之作用，如表六所示，口服不同劑量之 PCM小鼠，脾臟細胞培養三天後，IgA分泌量顯著低 於控制組；相反的，口服ΚΙ 1 Omg/kg/day，培養第3 天至第5天後IgA分泌顯著高於控制組，口服K2 lOmg/kg/day以上，IgA分泌顯著高於控制組。口服 5mg/kg/day K3培養第4天之後，IgA分泌顯著低於 控制組，口服5mg/kg/day K4培養第5天之後，IgA 分泌顯著高於控制組 36 1351961 表六〜1脾臟細胞分泌IgA(ng/ml)之能力-PCM，K1，K2之作 用 成分 劑量 培養天數(天） (mg/kg/day) 3 4 5 控制組 PCM 10 130.48±30.76a 50.67±13.28** 144.72土31.06 66·09±8·68* 128·56±35·52 74.73±15·17 PCM 40 84.31 ±8.09 94.72土 10.64 125.41±8.51 PCM 80 36.03±4.10** 46.16±5.09** 56·05±7·71* K1 2.5 118.64±19.79 94.65±53.54 108·37±16.01 K1 5 148.60±24.55 127.93±66.0 148.81 ±22.97 K1 10 432.11±48.1*** 378·5±196·2 … 422.74±76.67** K1 20 145.93±26.52 144.08±84.36 179·0±18·86 K2 2.5 133.90±33.39 181.00 土 47.98 277.13±101.1 K2 5 155.67±18.66 142.89±26.86 94.91 ±12.07 K2 10 239·64±43·1* 258.20±46.4* 260.00±40.93* K2 20 273·20±54·87* 211·48±57·82 324.7±153.4** a:表中數據爲10次實驗之Mean土S.E.M; *表示P< 0· 05 ; **表示 P<0.01 ; ***表示 P<0.001 37 1351961 表六〜2脾臟細胞分泌IgA(ng/ml)之能力-Κ3,Κ4之作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 培養天數(天） 3 4 5 控制組 58.21 ±12.63 66.92±17.16 73.41 ±14.64 K3 5 32·83±7.00 27·37±5·83* 21·96±4.17** K3 10 26·57±3·68* 28.97±5.95* 18·87±2·66** K3 20 43·08±4.05 43.45±5.92 30·50±3.60* K4 5 55.56±4.71 79.51 ±3.74 106.69±7.29* K4 10 66.43 ±5.26 95.39±10·08 121·97±12·69* K4 20 119.59±15.08** 101.53±25·08 133.16±20.09*
a:表中數據爲6次實驗之Mean 土 S. Ε.Μ; *表示ρ<〇.〇5; **表示 Ρ< 0. 01 ; (4)脾臟細胞分泌Td型及ΤΒ2型細胞激素分泌能力-PCM '、ΚΙ、Κ2、Κ3 及 Κ4 之作用
ΤΗ1型免疫反應主要激發細胞性免疫反應，而Τη2型免 疫反應主要激發體液（抗體）性免疫反應。如表七所 示，本硏究檢視小鼠口服PCM、ΚΙ、Κ2、Κ3及Κ4之後， 脾臟細胞分泌ΤΗ1型細胞激素（Interferon-τ ; IFN-r ) 及Tb2型細胞激素（Interleukin-10 ; IL-10)的變化；發 現小鼠服用 10 mg/kg/day 及 80 mg/kg/day 之 PCM 後 IFN-r的分泌顯著高於控制組。服用K1及K2 2.5mg/kg/day以上，IFN-r的分泌顯著高於控制組； 服用 5mg/kg/day 及 10mg/kg/day 之 K3 IFN-r 的分泌 38 1351961 顯著高於控制組；服用20mg/kg/day之K4 IFN-r的分 泌顯著高於控制組。IL-10的分泌在服用PCM、K3及K4 之後，沒有明顯的變化，然而，服用K1 2.5mg/kg/day 以上，K2 5mg及20mg/kg/day，則顯示明顯增加IL-1 0 之分泌。 表七〜1脾臟細胞分泌IFN-r及IL-10的變化-PCM,K1,K2 之作用 成分 劑量 細胞激素(pg/ml) (mg/kg/day) IFN-γ IL-10 控制組 254.14±55.68a 103.91±20.36 PCM 10 465.11±26.6** 115.90±17.29 PCM 40 264.79±48.36 77‘31±9‘31 PCM 80 433.44±31.10** 181.97±33.26 K1 2.5 428·7±38·9* 170.28±13.0* K1 5 673.33±96.73** 178.76±24.56* K1 10 682.28±73.78** 176.17±45.24 K1 20 783.97±76.1*** 334·7±45·8*** K2 2.5 414.80±31.3* 135.71±19.89 K2 5 432.70±50.22* 226.48±55.67* K2 10 348.45±72·56* 135.62±48.15 K2 20 457.48±57.60** 195.27±40·0* a:表中數據爲10次實驗之Mean土S.E.M; *表示P< 0. 05 ’ 木*表示 P< 0. 01 ; ***表示 P< 0. 001 39 1351961 表七〜2脾臟細胞分泌IFN-r及IL-10的變化-Κ3,Κ4之作 用 成分 劑量 細胞激素(pg/ml) (mg/kg/day) IFN-γ IL-10 控制組 124.25±28.15a 107.80±20.79 K3 5 917.07±130.41* 262.09± 108.41 K3 10 449.74± 100.67* 86.48±33.26 K3 20 176.20±45.96 98.74±27.05 K4 5 240.45 ±107.83 128.91 ±45.46 K4 10 252·26± 103.76 197.39±68.73 K4 20 292·00±77·77* 155·91±26·16 a:表中數據爲6次實驗之Mean 土S.E.M ; *表示Ρ< 0. 05 (5)Τ淋巴球CD4 + 8_& CD4~8 +次族群的變化 CD4+CD81細胞主要是輔助型T細胞（Helper T-ce 11s)，而 CD4_CD8 +主要是胞殺型 T 細胞（Cytotoxic T-ce 11 s)。如表八所示，本硏究以不同濃度PCM餵食 小鼠後，取出脾臟細胞，分離出非附著性細胞，進行 免疫螢光測試。結果顯示CD4 + 8-細胞所佔的比例有上 升趨勢，但與控制組相較無顯著差異；不過，CD41 + 細胞所佔的比例，與控制組比較，有顯著增加的現象。 由於CD4 + 8·細胞也有增加的趨勢，故CD4/CD8比例沒有 顯著變化。CDC8+ T細胞的增加，與脾臟細胞IFN-τ 40 1351961 分泌量增加的現象相吻合，因爲CD41+T淋巴球是「專 —性細胞免疫反應」的主要反應細胞（effector cel Is) 0 表八T淋巴球次族群的變化-PCM之作用 成分 劑量 螢光陽性細胞百分比(％ ) (mg/kg/day) CD4 CD8 CD4/CD8 控制組 23.40±2.31 a 12.50 土 0.82 1.87 PCM 10 28·67±2.54 15.31±0.72* 1.87 PCM 40 27.72±0.66 16.67±1.08** 1.66 PCM 80 29.95±2.75 16.76±1.29** 1.79
a:表中數據爲5次實驗之Mean 土S.E.M ; *表示P< 0.05， 木木表示P< 0. 01 (6)自然殺手細胞活性
自然殺手細胞（Nature killer cells; NK cells)爲對抗 腫瘤細胞及病毒感染細胞的非專一性胞殺細胞，小鼠口 服PCM後，分離非附著性脾臟細胞，測試其所含之NK 細胞活性。如表九所示，口服10 mg/kg/day之PCM有顯 著增加NK細胞活性的現象，高於此劑量則沒有增強NK 活性的現象。IFN-r爲促進NK細胞活化的細胞激素， 此數據也與IFN-τ分泌量增加的現象相吻合。 41 1351961 表九自然殺手細朐活件-PCM之作用 成分 劑量 Target : Effector (mg/kg/day) 1 : 12.5 1 ： 25 1 ： 50 控制組 16.57±0.61a 17.04±1.06 16.57±0.61 PCM 10 14.24±2.18 20.78±1.25 23.12±2.86* PCM 40 18.62±2.62 18.20±2.02 20.99士 3.59 PCM 80 15.54±3.49 18.27±2.05 16.35±0.90 a :數據爲目標細胞（YAC-1)死亡百分比，即propedium iodide陽性反應細胞比例。數據爲5次實驗之 mean土S.E.M，*爲 PC0.05 (7)腹腔巨噬細胞吞噬能力 巨睡細胞〇8(：1'(^113£65)爲免疫系統中主要的吞喷細胞 之一，負責淸除入侵的病原菌及體內壞死的細胞。如表 十所示，本硏究以PCM餵食小鼠後，分離出腹腔巨噬細 胞（peritoneal macrophages)，再以帶有螢光之 K-12 大腸桿菌爲目標細胞，.觀察其呑噬能力。結果顯示，口 服40及80 mg/kg/day之PCM後，腹腔巨噬細胞隨著 PCM濃度增加，顯著增強對大腸桿菌的吞噬能力。 42 1351961 表十腹腔巨噬細胞吞噬作用 成分 劑量 (mg/kg/day) 吞噬作用 控制組 20.88士 3.90a PCM 10 17.08±1.82 PCM 40 27.49±3.99* PCM 80 38.22±2.20 ** a:數據爲巨噬細胞有吞噬目標細胞佔所有巨噬細胞 百分比，表中數據爲10次實驗之Mean±S.E.M ; * 表示 P<0.05，**表示 P<0.01 圖式簡單說明 圖一爲依本發明的一實施例從茯苓製備具有改善的生 物活性的低極性部位（PCM )，及分離該PCM所含羊毛固 醇（lanostane)類化合物的流程圖。 圖二爲依中國第1 008183號專利所揭示的方法從茯苓 製備一種含三帖類化合物的萃取物的流程圖。 43

Claims (1)

1351961 i 、公告本:拾、申請專羽麗冒 -Ί poll年〆月修正） 1. 一種使用具下列化學式ΚΙ、K2、K3或K4的羊毛固醇於製備 用於提昇哺乳類動物免疫力的藥物的用途，
ΚΙ K2
K3 K4。 2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該哺乳類動物爲人類。 3. 一種使用茯苓萃取物於製備用於提昇哺乳類動物免疫力的 藥物的用途，該茯苓萃取物係利用分離技術並取其低極性部 分，包含5-60重量％的羊毛固醇且不含開環羊毛固醇，其中該 羊毛固醇具下列化學式（I) 44 1351961 (2011年/月修正)
(I) 於式（I)中R1爲Η或CH3 ; R2爲〇C〇CH3，=0或〇H ; R3爲Η或〇H ; R4爲 -C( = CH2)-C(CH3)2Ra，其中 1爲11或 OH; Rs 爲 Η或 OH;及 R6爲 CH3 或 CH2〇H。 4. 如申請專利範圍第3項的用途，其中該分離技術包含下列步 驟： a) 以一水，甲醇，乙醇或它們的混合溶劑萃取茯苓菌的代謝物， 茯苓菌的醱酵產物或茯苓菌菌絲； b) 濃縮步驟a)萃取所獲得的液體； c) 將步驟a)所獲得的濃縮物導入一矽膠管柱； d) 以一低極性沖提劑（eluent)沖提該矽膠管柱，及收集所產生的溶 離液（eluate);及 e) 濃縮步驟d)的溶離液’ 其中步驟a)的萃取所使用的溶劑爲95%酒精； 步驟b)的濃縮物被進一步以一體積比爲1:1的甲醇及正己烷的兩相 溶劑萃取；分離出甲醇層；及濃縮該甲醇層’所獲得的濃縮物被 用作爲步驟c)的矽膠管柱的進料；及 步驟d)的低極性沖提劑爲體積比爲96.5:3.5的二氯甲烷及甲醇的混 合溶劑。 45 1351961 (2〇11年〆月修正) 5. 如申請專利範圍第4項的用途，其中從步驟e)所獲得的溶離 液的濃縮物以矽膠薄層層析法分析具有一層析値（Rf) 1 G. 1， 其中以紫外光燈及碘作檢側，展開液爲二氯甲烷：甲醇=96 : 4。 6. 如申請專利範圍第3項的用途，其中該茯苓萃取物包含10-20 重量％的羊毛固醇。+ 7. 如申請專利範圍第3項的用途，其中該藥物爲口服的。 8. 如申請專利範圍第3項的用途，其中該哺乳類動物爲人類。
46
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