DD285606A5

DD285606A5 - Verfahren zur herstellung von selektiv o-azylierten glucosaminoglycanen

Info

Publication number: DD285606A5
Application number: DD89331045A
Authority: DD
Inventors: Maurice Petitou; Jean-Claude Lormeau; Jean Choay
Original assignee: K
Priority date: 1988-07-21
Filing date: 1989-07-21
Publication date: 1990-12-19
Also published as: DK362789A; DE68916878T2; FR2634485B1; FR2634485A1; IL91058A0; MA21602A1; FI893518A; EP0356275B1; TNSN89082A1; FI893518A0; NO892986L; AU3885689A; PT91249B; ZA895581B; NZ230041A; DE68916878D1; NO892986D0; HUT50489A; JPH0273801A; YU172789A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von selektiv O-acylierten Glucosaminoglycanen fuer die Anwendung als Arzneimittel. Erfindungsgemaesz werden Verbindungen der Formel{neue selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane; starke biologische Aktivitaet; Arzneimittel gegen Krankheiten; verursacht von umhuellten Viren oder Retroviren}

Description

Hierzu 8 Seiten Zeichnungen 4 1 Seite Formeln

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von selektiv O-acylierter. Glucosaminoglycanen sowie die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen und ihre Anwendung in der Therapeutic

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Unter der Bezeichnung „Glucosaminoglycane" versteht man die Substanzen, die aus Uronsäure-Ketten (D-Qlucuronsäure oder L-Iduronsäure) und Aminozuckern gebildet werden, wobei diese letzteren Glucosamine oder Galactosamine sind. Die Glucosaminoglycane natürlichen Ursprungs bestehen aus mehr oder weniger homogenen Mischungen von Verkettungen von Disaccharid-Einheiten, die gebildet werden durch eine Uron-Untereinheit (Glucuronsäure oder Iduronsäure) und durch eine Osamin-Untereinheit (Glucosamin oder Galactosamin), wobei sie über eine 1-4-Bindung oder eine 1-3-Bindung miteinander verbunden sind.

Bei den Glucosaminoglycanen sind die Hydroxyl-Gruppen verschieden durch funktioneile Gruppen substituiert, insbesondere durch Sulfat-Gruppen, und die Amino-Gruppen der Osamine ebenfalls durch Sulfat- und/oder Acetyl-Gruppen. Die hier betrachteten Glucosaminoglycane umfassen sechs Produkt-Typen: Heparin, Heparan-Sulfat, Chondroitin-Sulfat A, Chondroitin-Sulfat C, Chondr'-'tin-Sulfat B, genauer air Dermatan-Sulfat bezeichnet, und Hyaluron-Säure. Sie werden durch zwei Disaccharid-Strukturen u aase der Formel (A) und der Formel (B) (siehe Formelblatt) charakterisiert, wobei in der Formel (A) R eine SOyGruppe und/oder eine Acetyl-Gruppe darstellt und die Wellenlinie angibt, daß sich die Carbonsäure-Gruppe entweder unterhalb der Ringebene (Iduron-Einheit) oder oberhalb von ihr (Glucuron-Einheit) befindet. Die Glucosaminoglycane mit der Struktur der Base der Formel (A) werden als Glucosaminoglycane (oder GAGs) vom Heparin-Typ bezeichnet und umfassen die Heparine und die Heparan-Sulfate, und die Glucosaminoqlycane mit der Struktur der Base der Formel (B) bezeichnet man als GAGs vom Chondroitin-Sulfat-Typ, wobei sie die Chonc'roitin-Sulfate A und C und Dermatan-Sulfat umfassen.

Die Hyaluron-Säure besitzt die Struktur der Base der Formel (B), in de" das Galactosamin durch ein Glucosamin ersetzt ist. Wie bereits oben erwähnt, liegt in den GAJs vom Heparin-Typ und in den GAGs vom Chondroitin-Sulfat-Typ ein mehr oder weniger großer Prozentsatz an Hydroxyl-Gruppen von η Disaccharid-Einheiten in Form der Schwefelsäure-Ester vor. Daher kann das Heparin durch die Struktur der Base der Formel (A) dargestellt werden, in der η zwischen 1 und 80 schwanken kann, R bei der Mehrzahl von η Einheiten eine SGy-Gruppe und in dem Rest der Fälle eine Acetyl-Gruppe ist, die OH-Gruppen in Position 6 des Glucosamins und in Position 2 der Uron-Säure bei der Mehrzahl der Spezien sulfatiert sind, während die OH-Gruppe in Position 3 des Glucosamins nur in der Minderzahl der Spezien sulfatiert ist, wobei die OH-Gruppe in Position 3 der Uron-Säure praktisch nicht sulfatiert ist und diese Uron-Säure bei der Mehrzahl der Spezien eine Iduron-Säure darstellt.

Die Produkte mit der Struktur der Base der Formel (A) umfassen ebenfalls N-desulfatiortes-N-acetyliertes Heparin, das wie bei Nagasawa, K. und Inoue, Y., Methode In Carbohydrate Chemistry, Academic Press, 19Ö0, Vol.8, S. 291-294 beschrieben,

hergestellt werden kann. Dieses Heparin wird durch die Formel (A) dargestellt, in der R eine Acetyl-Gruppe ist.

Das Heparin enthält ebenfalls Spezien, die dio Struktur der Formel (A) mit einem variablen η von 3 bis 15 und dem gleichen

chemischen Profil besitzen. Diese Spezien können durch Fraktionierung nach bekannten Methoden (beispielsweise US 4692435)isoliert werden, wobei man sie als Heparine mit niedrigem Molekulargewicht (b. p. m.) bezeichnet.

Heparine (b. p.m.), die mit ihrer molekularen Verteilung und ihren biologischen Eigenschaften im wesentlichen mit den durch Fraktionierung erhaltenen Heparinen (b. p.m.) identisch sind, wurden durch Aufspaltung von Heparin gemäß den folgenden Methoden hergestellt:

- Methode der nitrosen Depolymerisation und Reduktion (beispielsweise EP 37319 oder US 4686288), die das Molekül unter Angriff auf die N-sulfatierten Glucosamin-Untt reinh6iten auftrennt, um eine 2,5-Anhydromannitol-Endgruppe der Formel (A') zu erhalten, die gegebenenfalls am ersten Hydroxyl in Position β sulfatiert ist;

- Methode der enzymatischen Depolymerisation (beispielsweise FP 244235 und 244236) oder alkalischen Depolymerisation (beispielsweise EP 40144), die das Molekül unter Angriff auf die uronischen Untereinheiten auftrennt, um eine a-ß-ungosättigte Uronsäure-Endgruppe der Formel (A") zu erhalten, die gegebenenfalls 2-sulfatiert ist:

- Methode der oxidativen Depolymerisation (beispielsweise US 4281108 und EP121067), die das Molekül durch Oxidation unter Erhaltung der „natürlichen" Endgruppen auftrennt.

Andere Heparine (b. p. m.), die eine von der des natürlichen Heparins unteischiedliche Molekularverteilung und besonders biologische Eigenschaften besitzen, können durch periodische Oxidation von natürlichem Heparin, gefolgt von einer Depolymerisation durch ß-Eliminierung oder saure Hydrolyse, hergestellt werden. Die periodische Oxidation trennt die nichtsulfatierten Uronsäure-Teile zwischen den Kohlenstoffatomen in Position 2 und 3 auf. Es ist bekannt, daß derartige Teile bei der Bindungslage zu Antiothrombin III (AT III) vorhanden sind, wobei der plasmatische Inhibitor der Koagulation von verschiedenen Serin-Proteesen und dessen Aktivität durch Heparin, das als Cofaktor wirkt, erheblich gesteigert wird. Die periodische Oxidation ermöglicht es daher Produkte zu erhalten, die von der Bindungslage zu AT III und dumit im wesentlichen von ihrer antikoagulierenden Wirkung befreit sind.

Heparine (b. p. m.) dieses Typs können insbesondere durch Anwendung des Verfahrens erhalten werden, des die folgenden Stufen umfaßt:

- schonende Oxidation von Heparin, die dadurch erfolgt, daß man Heparin in wäßriger Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 5% (Gew./Vol.) mit einem Salz der periodischen Säure mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 1 % (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 6,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5, und bei einerTemperatur von 0 bis 10⁰C, während 15 bis 48 Stunden unter Lichtausschluß umsetzt;

- Depolymerisation der erhaltenen Heparin-Ketten durch Zugabe einer stckcn Base, wie Natriumhydroxid," bei einem pH-Wert von höher als etwa 11, insbesondere zwischen 11 und 12, vorteilhafterweise von 11,2 bis 11,6, vorzugsweise bei etwa 11,5;

- Reduktion der Depolymerisations-Fragmente mit Hilfe eines Reduktionsmittels und, gegebenenfalls nach Entfernung des nicht umgesetzten Reduktionsmittels,

- die Gewinnung der reduzierten Heparin -Fragmente durch Aus'ällung mit Hilfe eines Lösungsmittels, in dem sie unlöslich sind;

- Isolierung der gesuchten Fragmente durch Fraktionierung einer wäßrigen Lösung, die unter Auflösen des vorstehend isolierten Niederschlages in Wasser erhalten wurde, mit Hilfe eines Alkohols in Anwesenheit eines Mineralsalzes und anschließendes Gewinnen des gebildeten Niederschlages.

Diese Heparine (b. p. m.) entsprechen der Formel (C), in der η von 6 bis 15 schwanken kann, R in etwa mindestens 90% der

η-Einheiten eine SOj-Gruppe und im Rest dieser Fälle eine Acetyl-Gruppe darstellt, die OH-Gruppen in Position 3 des

Glucosamins sulfatiert sein können und die OH-Gruppen in Position 6 des Gluosamins in 70% der Spezien sulfatiert sind. Außerdem ist die Induron-Säure im Verhältnis von 1 Gruppe pro mindestens 2 Ketten dieses Heparins (b. p. m.) durch ein

nichtsulfatiertes Uronsäure-Teil (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) ersetzt, das zwischen den Kohlenstoffatomen in

Position 2 und 3 offen ist und der Formel (C) entspricht. Derartige Heparine (b.p.m.) können durch Gel-Filtration zusätzlich nach bekannten Techniken fraktioniert werden, um Mischungen von Fragmenten zu erhalten, die im Hinblick auf ihre Molmasse homogen und von der Bindungslage zu AT III befreit Andere Glucosaminoglycane vom Heparin-Typ bestehen aus GAGs der Formel (A) oder (C), in denen die Carbonsäure-Funktion

durch die Uron-Säure getragen wird und verestert ist, beispielsweise durch Kondensation eines Alkohols in Anwesenheit eines

Kondensations-Mittels vom Carbodiimid-Typ, wie in dem Patent FR 2159724 beschrieben, oder auch durch Alkylierung des Carboxyls mit Hilfe eines Alkylhalogenids in Anwesen' ieit einer schwachen Base. In gleicher Weise bestehen Glucosaminoglycane vom Chondroitin-Sulfat-Typ aus Glucosaminoglycanen der Formel (B), in

denen die Carbonsäure-Funktion der Uron-Säuren verestert ist, beispielsweise durch Alkylierung des Carboxyls mit Hilfe eines

Alklyhalogenids in Anwesenheit einer schwachen Base. Die Herstellung derartiger Ester für die Hyaluron-Säure ist in dem Patent EP 21545L beschrieben, sie erfolgt durch Behandlung

der Hyaluron-Säure in Form des quaternären Ammoniumsalzes mit einem Alkohol in Anwesenheit eines Katalysators oder miteinem Veretherungsmittel.

Das Heparan-Sulfat wird durch die Formel (A) dargestellt, in der η von 1 bis 80 schwanken kann, R in der Mehrzahl der Spezien

eine Acetyl-Gruppe und in der Minderzahl der Spezien SO₃- darstellt. Außerdem sind die OH-Gruppen in Position 6 des

Glucosamins bei der Mehrzahl der Spezien nicht sulfatiert und die Uron-Säure wird in der Mehrzahl der Spezien durch Glucuron- Säure dargestellt. Die Chondroitin-Sulfato A und C sind durch die rormel (B) dargestellt, in der η jeweils von 1 bis 80 schwanken kann, die Gruppen

4-OH und 6-OH des Gluocsamins Sulfatiert sind und die Uron-Säure bei der Mehrzahl der Spezien eine Glucuron-Säure ist.

Das Dermatan-sulfat besitzt eine Struktur, die substantiell mit der des Chondroitin-Sulfates identisch ist, jedoch ist die Uron- Säure-Untereinheit bei der Mehrzahl der Spezien eine Iduron-Säure. Fragmente von Dermatan-Sulfat, die der Formel (B) entsprechen, in der η zwischen 1 und 20 schwanken kann, können durch

periodische Oxidation, gefolgt von einer Reduktion mit Natriumborhydrid und einer sauren Hydrolyse, wie in FRANSSON L. A.

und CARLSTEDT I., Carbohydr. Res., 36 (1974), 349-358 beschrieben, erhalten werden.

Die Glucosaminoglycarie besitzen zahlreiche biologische Aktivitäten, unter denen man ihre Wirksamkeit gegenüber den Koagulations-Faktoren, die über vermittelnde, unterschiedliche plasmatische Proteine wirken, hervorheben kann. Was das Heparin betrifft, so ist ebenfalle aus der Literatur bekannt, daß Heparin oder einige seiner Derivate, die eine antikoagufierende Wirkung besitzen oder nicht, eine Regulator-Wirkung für «lid Proliferation der Zellen glatter Muskel der vaskulären Wandung

aufweisen (GUYTON et al., Circ. Res., 46 [1980], 625-634) oder auch eine Inhibitoraktivität von Heparanase, einem Enzym, das indie Mechanismen der metastacischen Dissemination einbezogen Ist (EP-Anm. 254067). Außerdem bilden die

Glucosaminoglycane einen Teil der sehr großen Familie sulfatierter Polysaccharide, wobei einige im mehr oder weniger

bedeutenden Ausmaß eine antivirale Aktivität zeigten (BABA et al. Antimicrob. Agents Chemother. 32 [1938] 337-339) undinsbesondere eine anti-HIV-Aktivität (Human-Immunodefizienz-Virus), vgl. BABA et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 85 [1388] 6132-

Im folgenden Text wird der Ausdruck GAG für die Bezeichnung eines Glucosaminoglycans verwendet, das entweder eine

natürliche Struktur, wie durch Extraktion, Halbsynthese oder Synthese erhalten, oder eine an den Carbonsäure- oder Amin-

Funktionsgruppen chemisch modifizierte Struktur besitzt, wobei zuvor die Acylierungs-Reaktion durchgeführt wurde, durch die

man die selektiv O-acylierten GAGs erhält.

Trotz ihrer sehr interessanten pharmakologischen Aktivitäten weisen die natürlichen GAGs den Nachteil einer relativ kurzen Halbwertszeit auf, was bei wiederholten Verabreichungen in Erscheinung tritt. Dieser Nachteil wurde teilweise bei der Verwendung zur Vorbeugung und Behandlung von venösen Thrombosen gemindert, wo die Heparin-Derivate mit niedriger Molmasseauf subkutanem Weg verabreicht werden unddie Anzahl der Dosierungen daher auf eine Injektion pro Tag beschränkt

bleibt.

Dennoch ist es von großem Interesse, über Derivate mit einer Retard-Wirkung verfügen zu können, was die Anzahl von Verabreichungen dieser Produkte verringert und ihre Wirkungsdauer erhöht. Es kann ebenfalls von großem Interesse sein, nicht-antikoagulierende Derivate wie die von N-desulatiertem-N-acetyliertem Heparin zur Verfügung zu haben, an deren Aktivität als Inhibitor von Meparanase, einem mit den Phänomen der metastasischen Dissemination in Verbindung stehenden Enzym, weiter o^en erinnert wurde. Die Literatur beschreibt zahlreiche Glucosaminoglycan-Derivate, die in der Weise modifiziert sind, daß ihre Pharmako-Kinetik

verbessert ist, insbesondere Ester der Carbonsäure-Funktion der Uron-Säuren oder der Hydroxyl-Funktionen.

Es wurde insbesondere die teilweise oder vollständige Veresterung der Carbonsäure-Funktionen des Heparins angewendet, das

in Form des quaternären Ammoniumsalzes in einem inerten Lösungsmittel mit einem Alkohol oder einem Halogen-Derivat,gegebenenfalls in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, behandelt wurde (FR N 2159724 und EP 44228).

Es wurden ebenfalls Hyaluronsäure-Derivate beschrieben, erhalten durch Veresterung mit Hilfe eines Alkohols in Anwesenheit

eines Katalysators oder durch Reaktion mit einem Veretherungsmittel (EP 216453).

Außerdem wurden in der Literatur verschiedene Mittel im Hinblick auf die Veresterung der GAGs an ihren primären oder

sekundären Hydroxyl-Funktionen beschrieben.

Die Publikation Can. J. Res., 25B (1947), 472-476 beschreibt ein acetyliertes Heparin-Dorivat, das 1 Mol Acetyl-Gruppe pro

4 Saccharid-Einheiten entspricht. Das Produkt wird durch Einwirkung von Keten auf Heparin in Aceton hergestellt. Obowohl indieser Publikation ausgeführt ist, daß es sich bei dem erhaltenen Produkt um ein O-acetyliertes Derivat handelt, ist gut bekannt,daß Keten in Anwesenheit von Carbonsäure-Gruppen Anhydrids ergibt. (Vgl. J. March, Advancceci Organic Chemistry;

Reactions, Mechanisms and Structure, J.Wiley ans Sons Eds. 1935, pp. 686-687: „With ketenes, carboxylic acids give anhydrides

and acetics anhydride is prepared industrially in this manner.

CH₂ = C = O + CH₃ - COOH τ> CH₃ - COO - COCHj")

Demzufolge beschreibt diese Publikation tatsächlich ein Heparin, in dem die O-acetylierten Gruppen mit gemischten Anhydriden zwischen der Gruppe COO- da. Uron-Säure und der Acetyl-Gruppe, die vom Keten stammt, verbunden sind, was ihre Instabilität in Wasser erklären kann.

Das Patent FR 2100735 beschreibt partiell hydrolysierbare Ester von Heparin und einer nicht-toxischen organischen Säure, insbesondere 4-Chlorphenoxyisobuttersäure,4-Chlorphenoxyessigsäure, Cholsäure, Nikotinsäure, Pyridylessigsäure, N-Oxypyridylessigsäure oder Linoleinsäure. Die in dem genannten Patent beschriebene Herstellungsmethode, die durch die Reaktion eines quaternären Heparin-Salzes mit einer durch Carbodiimid aktivierten Säure gekennzeichnet ist, ergibt nicht nur dsa O-acetylierte Derivat, sondern ebenfalls in beträchtlicher Menge ein stabiles Sukundär-Produkt in Form eines O-Acylisoharnstoffester-Dorivates. Außerdem ist ein derartiger Reaktionstyp geeignet, die Bildung von Anhydriden sowie intramolekulare Reaktionen zwischen den Säure-Funktionen und den Hydroxyl-Funktionen des Heparins zu begünstigen. Das Patent JP 74/048533 beschreibt O-Ester von Chondroitin-Sulfat mit aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Säuren, die gegebenenfalls substituiert und im Hinblick auf eine verlängerte Wirkung dotiert sind. Die in diesem Dokument beschriebene Herstellungsmethode ist durch die Reaktion von Chondroitin-Schwefelsäure mit einem Säurechlorid charakterisiert und führt als Nebenreaktion zu einer N-Acylierung.Das Patent WO 83/00150 beschreibt in allgemeiner Weise Vorstufen von Medikamenten, die hergestellt werden unter Verwendung von verschiedenen Funktionen der GAGs, deren Hydroxyl, und in spezifischer Weise, einem O-Ester von Chondroitin-Sulfat mit Penicillin V. Die Herstellung dieses Produktes erfolgt über Carbodiimid und weist daher die oben erwähnten Nebenreaktionen auf.

Das Patent EP 46828 beschreibt O-Ester von Heparin mit ungesättigten Säuren, insbesondere Acrylsäure oder Metacrylsäure, die, gepfropft auf biomedizinische Materialien, diesen eine antithrombotische Aktivität von langer Dauer verleihen. Diese Pfropfung erfolgt durch kovalente Bindung im Bereich der a-ß-ungesättigten Bindungen dieser Ester mit der Oberfläche der genannten Materialien, die in Kontakt mit dem Blut tritt. Gemäß diesem Dokument werden die a-ß-ungesättigten O-Ester durch Reaktion von Heparin mit dem Chlorid oder Anhydrid einer a-ß-ungesättigten Carbonsäure hergestellt. Außerdem spezifiziert diese Beschreibung, die indifferent die Verwendung von Chloriden oder Anhydriden der α-ß-ungesättigten Säuren als Reaktionspartner angibt, nicht, welche der O-Ester von Heparin auf diese Weise erhalten werden.

Das Patent EP 256880 beschreibt die Veresterung von Heparin oder von Heparin (b. p. m.) durch Einwirkung von Säurechloriden in Formamid und Pyridin, um Derivate mit gesteigerter trnasmembraner Permeabilität zu erhalten. Diese Methode führt demzufolge zu Derivaten, die einer partiellen Desulfatierung unterzogen wurden und 0-, aber auch N-acetyliert sind und in denen das Verhältnis Sulfat/Carboxvl schlechter ist.

Das Patent FR 4 066M beschreibt die Acetylierung von N-Monomothylheparinamid durch Einwirkung von Essigsäure-anhydrid in Formamid und Pyridin. Das *'isgangsprodukt ist ein Heparin-Derivat, dessen Carboxyl-Funktionen durch Amid-Funktionen ersetzt sind.

Das für die Acetylierung angewendete Verfahren setzt kein im organischen Medium lösliches Salz ein. Deshalb kann die Acotylierungsreaktion nicht exakt kontrolliert werden und ermöglicht nur, eine geringe Acetylierungs-Ausbeute zu erhalten. Wenn man außerdem das beschriebene Verfahren bei Heparin anwendet, dessen Carboxyl-Funktionen nicht blockiert sind, so erhält man einen bedeutenden Anteil an gemischten Anhydriden zwischen den Carboxyl-Gruppen des Heparins und des Essigsäure-Anhydrids, wobei diese unerwünschten Nebenprodukte nicht aus dem Medium entfernt werden. Das Patent JP-PS 5128602 beschreibt die Acetylierung von Heparin durch Einwirkung eines Säureanhydrids in Formamid. Bei diesem angewendeten Verfahren liegt das Heparin nicht in Form eines im organischen Medium löslichen Salzes vor, wodurch keine exakte Kontrolle der Acyliarungs-Reaktion möglich ist und nur ein geringer Acylierungsgrad erreicht worden kann. Außerdem sind bei dem beschriebenen Verfahren gemischte Anhydride und Sekundär-Produkte der Reaktion im Medium »wesend.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von spezifischeren Produkten, deren biologische Aktivität wesentlich höher ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Glucosaminoglycane mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung, die eine gute Reproduzierbarkeit gewährleisten, aufzufinden.

Es wurde jetzt gefunden, daß man durch Reaktion eines im organischen Medium löslichen GAG-Salzes, wie eines tertiären oder quaternären Ammoniumsalzes, mit dem Anhydrid einer Carbonsäure in einem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel eine selektive Acylierung der freien Hydroxyle erhält, ohne die Carboxyl- oder Amino-Funktions-Gruppen des eingesetzten GAG negativ zu beeinflussen oder anzugreifen. Das in Form eines im organischen Medium löslichen Salzes eingesetzte GAG ermöglicht vorteilhafterweise die Kontrolle der Acylierungs-Reaktion mit großer Genauigkeit. Außerdem ist der Acylierungsgrad leicht modifizierbar und kann erhöht werden, ohne daß eine Beeinträchtigung oder ein Angriff beim Rest des Moleküls zu befürchten sind. So kann man einen Acylierungsgrad von 0,1 bis 3 Acyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit, insbesondere von 0,5 bis 2 Acyl-Gruppen, erreichen.

Es wurde ebenfalls gefunden, daß sich kein N-acyliertes Derivat bildet und daß, wenn Anhydride im Bereich der Carboxyl-Funktionen entstehen, diese einfach durch Anwendung einer schwachen Base in die freie Säure zurückgeführt werden können. In vorteilhafter Art und Weise ermöglicht die selektive Acylierung von GAGs gemäß der vorliegenden Erfindung eine Modifizierung ihrer biologischen Aktivitäten, die in einigen Fällen stark anwachsen.

Schließlich wurde gefunden, daß die auf diese Weise erhaltenen O-acylierten GAGs eine pharmakologische Aktivität von längerer Dauer besitzen.

Die vorliegende Erfindung hat dpher gemäß einem ihrer Aspekte selektiv O-acylierte Glucosaminoglycanezum Gegenstand, die der allgemeinen Formel (I) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- G eine Gruppe der Formel (a) oder eine Gruppe der Formel (a') oder eine Gruppe der Formel (b) darstellt,

- U eine Gruppe der Formel (c) oder eine Gruppe der Formel (d) oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, bedeutet,

- A eine Gruppe R₁, eine Gruppe der Formel R_r(c), eine Gruppe der Formel R,-(d) oder eine Gruppe der Formel (e) oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, darstellt,

- B eine Gruppe O-R„ eine Gruppe der Formel (a)-OR₁₍ eine Gruppe der Formel (a')-OR₍, eine Gruppe der Formel (b)-OR|, eine Gruppe der Formel (f) oder eine Gruppe der Formel (g) darstellt, oder eine Gruppe der Formel (a), eine Gruppe der Formel (a¹) oder eine Gruppe der Formel (b) bedeutet, deren Reste mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden sind,

- R₁ Wasserstoff, SO₃- oder Acyl darstellt, wobei Acyl der Rest einer nicht a-ß-ungesättigten Carbonsäure oder Dicarbonsäure ist, ausgewählt unter:

• einer Alkanoyl-Gruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen,

• einer Alkanoyl-Gruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, substituiert durch:

- eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen,

- eine Phenyl-Gruppe, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Alkyl-Radikale mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, durch Haloaenatome oder die Gruppen NC₁ oder OCH₃,

- ein ungesättigtes aliphatisches Kohlenwasserstoff-Radikal mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen,

• einer Benzoyl-Gruppe, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Alkyl-Radikale mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, durch Halogenatome oder die Gruppen NO₂ oder OCH₃,

• einer Cyc!oalkyl(3-7 CJ-carbonyl-Gruppe,

- R₂ SO₃- und/oder ein Acetyl-Radikal darstellt, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn R₁ ein Acetyl-Radikal bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, ider ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist,

wobei R₁ in einem Verhältnis von mindestens 0,1 bir. 3 Acyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit, vorzugsweise 0,5 bis 2 Gruppen, acyliert ist; sowie ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die ausgewählten Glucosaminoglycano solche vom Heparin-Typ, nämlich Heparin und Heparin-Derivate, entweder erhalten durch Fraktionierung, durch Halbsynthese oder Synthese, und Heparan-Sulfat und seine Derivate, ebenfalls erhalten durch Fraktionierung, Halbsynthese oder Synthese.

Die selektiv 0-acylierten Glucosaminoglycane dieses Typs gemäß der vorliegenden Erfindung entsprechen der allgemeinen Formel (II), in der

- A die oben bei der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R₁ Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eine wie bei der Formel (I) definierte Acyl-Gruppe darstellt,

- R2 SOa- und/oder ein Acetyl-Radikal darstellt, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn Ri ein Acetyl-Radikal bedeutet,

R3 Ra ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein substituiertes Alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, odor ein Alkalimetall- odor Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B Gruppen der Formeln Ia)-OR₁ oder (f), (a) und (f) wie sie bei der Formel (I) definiert sind, oder ORi dai stellt, oder eine Gruppe der Fomel (a) bedeutet, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden ist,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist.

Eine bevorzugte Familie (Il a) der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (II), in der

- A die oben bei der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R, Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eien wie bei der Formel (I) definierte Acyl-Gruppe darstellt,

- R] SO₃- und/oder ein Acetyl-Radikal darstellt, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn R₁ ein Acetyl-Radikal bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoff atom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein substituiertes Alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B Gruppen der Formeln (B)-OR₁ oder (f), (a) und (f) wie sie bei der Formel (I) definiert sind, oder OR, darstellt, oder eine Gruppe der Formel (a) bedeutet, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden ist,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist, unter dem Vorbehalt, daß, wenn A R₁, eine Gruppe der Formel R₁-(C) oder eine Gruppe der Formel R₁-Id) darstellt und B 0-R₁ bedeutet, η eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist.

Eine andere bevorzugte Familie (Mb) der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (II), in der

- A die oben bei der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R₁ Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eine Acyl-Gruppe darstellt, wobei Acyl der Rest einer nicht a-ß-ungesättigten Carbonsäure oder Dicarbonsäuro ist, ausgewählt unter:

• einerAkanoyl-Gruppemifi bis 18 Kohlenstoffatomen,

• einer Alkanoyl-Gruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, substituiert durch:

- eine Cycioalkyl-Gruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen,

- eine Phenyl-Gruppe, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Alkyl-Radikale mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, durch Halogenatome oder die Gruppen NO₂ oder UCH₃,

• einer Cycloalkyl(3-7C)-carbonyl-Gruppe,

- IJ₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vor jsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist,

wobei R₁ in einem Verhältnis von mindestens 0,5 bis 2 Acyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit, vorzugsweise 1 Gruppe, acyliert

Vorteilhafte Verbindungen der Erfindung sind diejenigen, die zu den Familien (Ha) und (Nb) gehören und in deren Formel (I!) R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation darstellt.

Andere Gruppen von vorteilhaften Verbindungen entsprechen den Verbindungen, die zu den Familien (Ha) und (lib) gehören und in deren Formel (II) R₃ ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein substituiertes Alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt.

Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung verwendet man Mischungen von Heparin-Fragmenten mit einer Molmasse von unterhalb 10000 Dalton, insbesondere solche, deren mittlere Molmasse zwischen 2000 und 7000 Dalton liegt, solche mit einer mittleren Molmasse von etwa 4500 Dalton oder solche mit einer mittleren Molmasse von etwa 2500 Dalton.

Für ihre Herstellung kann man vorteilhafterweise ein Verfahren zur Depolymerisation mittels salpetriger Säure anwenden, wie beispielsweise in dem Patent EP 37319 beschrieben. Die selektiv D-acylierton Glucosaminoglycane der Erfindung werden daher durch die allgemeine Formel (III) dargestellt, in der

- AR₁ oder eine Gruppe der Formol R₁-Jc) oder eine Gruppe der Formel R₁-Jd), wie bei der Formel (I) definiert, darstellt,

- R₁ Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eine Acyl-Gruppe, wie bei der Formel (I) definiert, bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom und/oder ein Alkyl-fiadikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 3 bis 12 ist.

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Bevorzugte Verbindungen der Erfindung entsprechen den Verbindungen ri?r Formel (III), in dor Ri ein Alkanoyl-Radikal mit 4 bis

10 Kohlenetoffatomen ist.

Um Mischungen von Heparin-Fragmenten mit einer Molmasse von unterhalb 10OvO üalton zu erhalten, kann man ebenfalls eine Methode zur enzymatischen Depolymerisation anwenden, wie beispielsweise beschrieben in den Patenten EP 244235 und EP 244236, oder zur alkalischen Depolymerisation, wie beispielsweise in dem Patent EP 40144 beschrieben. In diesem Fall werden die selektiv O-acylierten Glucosaminoglycane der Erfindung durch die Formel (IV) dargestellt, in der

- Ri Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eine Acyl-Gruppe, wie" bei der Formel (I/ definiert, bedeutet,

- R₂ SOj- und/oder ein Acetyl-Radikal darstellt, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn R_t ein Acetyl-Radikal bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom und/oder ein Alkyl-Radika!n.it 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B eine Gruppe der Formel (a)-OR,, wie bei der Formel (I) definiert, oder ORi darstel.;,

- η eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist.

Unter den Veroindungen der Formel (IV) sind diejenigen ν -teilhaft, in denen R₁ ein Alkanoyl-Rsdikal mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt.

Bei einem anderen vorteilhaften Aspekt der Erfindung kanr. .nan eine Mischung von Heparin-Frat menten verwenden, die im Hinblick auf ihre Molmasse homogen sind sowie ein durch Synthese erhaltenes Heparin-Fragment, das teils, was seine Molmasse betrifft und teils, was seine runktionalisierung betrifft, homogen ist.

Bei einem weiteren inteiessanten Aspekt der Erfindung kann man als Glucosaminoglycane Heparin-Derivate auswählen, die von ihrer Bindungslage zu Antithrombin II! (AT III) befreit sind, sei es, daß die Heparin-Ketten fraktioniert wurden, so daß die Oligosaccharid-Ketten, die die Bindungslage zu AT III enthalten, entfernt wurden, indem man beispielsweise eins Affinitäts-Chromatographie auf Sepharose-AT Mi-Harz oder lonenauotausclichromatographien anwendete, wio bescririeben in E. Sache et al.,Thromb. Res.,25 (1982), S.442-458, oder daß ^iese Bindungslagen zerstört wurden, beispielsweise durch Depolymerisation mittels Periodat, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder sauren Hydrolyse

Derartige Verbindungen können der Formel (V) entsprechen, in der

- A eine Gruppe der Formel R|-(c), eine Gruppe der Formel Rr(d) oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, darstellt,

- B aine Gruppe der Formel (a)-OR_t oder eine Gruppe der Formel (al bedeutet, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung odor einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbundsn ist,

- Ri die bei der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R₂ SO₃- oder ein Acetyl-Radikal darstellt, wobei das Verhältnis von SO₁- etwa 90% beträgt,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist.

Besonders vorteilhafte Verbindungen können ausgehend von Verbindungen erhalten werden, die durch das Verfahren einer periodischen Oxidation, gefolgt von einer alkalischon ß-Eliminierung, einer Reduktion und einer Fraktionierung, wie oben beschrieben, hergestellt wurden. Diese Verbindungen entsprechen der Formel (Vl), in der

- A R₁, eine Gruppe der Formel R_r(c), eine Gruppe der Formel R₁-Id) oder den Rest von (c) oder von (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung, darstellt,

- U eine Gruppe der Formel (Vl') bedeutet, oder, im Verhältnis von einer Gruppe pro zwei Ketten mindestens, eine Uronsäure (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) darstellt, die nicht sulfatiert und zwischen den Kohlenstoffatomen in Position 2 und 3 offen ist und der allgemeinen Formel (Vl") unterricht,

- B eine Gruppe der Formel (a)-OR, oder OR; euer eine Gruppe der F<" Yiel (a) darstellt, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung, vorliegt, verbunden ist,

- Ri die bei der Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R₂ SO₃- oder ein Acetyl-Radikal darstellt, wooei das Verhältnis von SO₃- mindestens etwa 90% beträgt,

- η eine ganze Zahl von 2 bis 18 ist.

Vorteilhafte Verbindungen, die der Formel (Vl) entsprechen, sind diejenigen, in denen η eine ganze Zahl von 7 bis 15 fü. die Mehrzahl der Spezien, die sie bilden, darstellt. Vorteilhafte Verbindungen, die den Formein (V) und (Vl) entsprechen und insbesondere diejenigen, die der Forme! (Vl)

entsprechen mit η als ganzer Zahl von 7 bis 15 für die Mehrzahl der Spezien, sind solche, in denen R, ein Alkanoyl-Radikal mit 2bis 10 Kohlenstoffatomen, vorteilhafterweise 4 bis 10, vorzugsweise 4 oder C "ohlensioffatomen, darstellt.

Andere bevorzugte Verbindungen, die der Formel (Vl) entsprechen, sind Mischungen von Verbindungen, die im Hinblick auf ihre Molmasse homogen sind und durch Gel-Filtration erhalten würden. Mit Bezug auf die Formel (Vl) stellt η hier eine ganze Zahl von Unter den Verbindungen mit Heparin-Struktur, die von der Bindungslage zu AT III und demzufolge von ihrer antikoagulierenden Wirkung befreit sind, entspricht eine Familie der vorteilhaften Verbindungen den selektiv O-acylierten, N-desulfatierten-N-

acetylierten Heparin-Derivaten der Formel (VII), in der

- A Ri, eine Gruppe der Formel R_r(c) oder eine Gruppe der Formel R,-(d), wie sie bei der Formel (I) definiert sind, darstellt,

- Ri ein Alkanoyl-Radikal mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation darstellt,

- B eine Gruppe der Formel (a)-OR,, wie bei der Formel (I) definie¹1, oder ORi bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist.

Bei einem anderen vorteilhaften Aspekt der Erfindung sind die ausgewählten Glucosaminoplycane vom Chondroitin-Sulfat-Typ, nämlich die Chondroitin-4- und 6-Sulfate, das Dermatan-Sulfat und ihre Fragmente.

Die gemäß der Erfindung selektiv O-acylierten Glucosarninoglycane dieses Typs werden durch die Formel (VIII) dargestellt, in der

- A die Bedeutungen der Formel (I) besitzt,

- R) Wasserstoff und/odor SOr- und/oder eine wie bei der Formel (I) definierte Acyl-Gruppe darstellt,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B Gruppen der Formeln (b) -OR₁ oder (g), wie bei der Formel (l).definiert, oder OR₁ oder eine Gruppe der Formel <b) darstellt, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxydation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder eine sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden ist,

- η eine ganze "iahl von 1 bis 80 ist.

Unter den Verbindungen der Formel (VIII) entspricht eine vorteihafte Familie den Verbindungen, in denen R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation darstellt. Andere vorteilhafte Verbindungen der Formel (VIII)

sind diejenigen, in denen R₃ ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oderein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Eine andere vorteilhafte Familie der Verbindungen der Formel !VIII) entspricht den Verbindungen, in denen R₁ ein Alkanoyl- Radikal mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der selektiv O-acylierten Glucosarninoglycane ist dadurch gekennzeichnet,

daß man das Glucosaminoglycan im organischen Medium in ein lösliches Salz überführt und daß man dieses Salz mit einem

Acylierungsmittel behandelt, das fähig ist, die primären und sekundären Hydroxyl-Gruppen dieses Glucosaminoglycans zu

acylieren, ohne die vorder Acylierungs-Reaktion beim Glucosaminoglycan vorhandenen Funktionsgruppen NHR₃OdBrCOOR₃zu beeinflussen oder anzugreifen, wobei die Reaktion in einem polaren aprotischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von O⁰Cbis 100°C in Anwesenheit eines Katalysators und in Anwesenheit einer Base erfolgt, die geeignet ist, die bei der Acylierungfreiwerdonde Säure zu binden.

Das Produkt wird dann mit Hilfe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Ethanol, ausgefällt, zu dem man ein die Fällung unterstützendes Zusatzmittel geben kann, wie ein Mineralsalz. Das O-acylierte Glucosaminoglycan wird durch Auflösen

des Niederschlages in Wasser und, vorteilhaftorweise, Dialyse in Anwesenheit einer schwachen Base isoliert.

In vorteilhafter Art und Weise wird das erfindungsgemäße Verfahren gemäß der folgenden Stufen durchgeführt, indem man

(1) ein Glucosaminoglycan der allgemeinen Formel (IX) (siehe Formelblatt), in der

- G⁰ eine Gruppe der Formel (a)° oder eine Gruppe der Formel (a')° oder eine Gruppe der Formel (b)° darstellt,

- U° eine Gruppe der Formel (c)° oder eine Gruppe der Formel (d)° oder den Rest der Gruppe (c)° oder der Gruppe (d)° nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, bedeutet,

- A° eine Gruppe R₁ ⁰, eine Gruppe der Formel Ri°-(c)°, eine Gruppe der Formel R₁ ¹Md)⁰ oder eine Gruppe der Formel (e)° oder den Rest der Gruppe (c)° oder der Gruppe (d)° nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, darstellt,

- B⁰ eine Gruppe ORi⁰, eine Gruppe der Formel (a)°-0Ri°, eine Gruppe der Formel (a')-ORi⁰ oder eine Gruppe der Formel (f)° oder eine Gruppe der Formel (g)° darstellt, oder die Gruppen (a)°, (a')° oder (b)° bedeutet, deren Reste mit einem Rest von (c)° oder von (d)°, wie sie nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse vorliegen, verbunden sind,

- R,° Wasserstoff oder SO₃-darstellt,

- R₃ SO₇- oder ein Acetyl-Radikal bedeutet, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn R₁ ein Acetyl-Radikal bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall-odr- Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist,

in ein Salz des gonannten Glucosaminoglycans umwandelt, das in polaren aprotischen organischen Lösungsmitteln löslich ist:

(2) dieses Salz mit einem Anhydrid der Formel:

Acyl-O-Acyl ₍

in der Acyl wie bei der Formel (I) definiert ist, in dem genannten polaren aprotischen organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer '.atalytischen Menge von Pyridin oder eines Dialkylaminopyridins und eines Protonen-Akzeptors behandelt;

(3) das auf diese Weise erhaltene Produkt mit Hilfe einer Lösung von Natriumacetat in Ethanol ausfällt, und

(4} das selektiv O-acylierte Glucosaminoglycan durch Auflösung des auf diese Weise erhaltenen Niederschlages in Wasser und durch Dialyse in Anwesenheit einer schwachen Base isoliert, und gegebenenfalls das auf diese Weise erhaltene Natriumsalz des selektiv O-acylierten Glucosaminoglycans in ein anderes pharmazeutisch akzeptables Salz überführt. Bei einem vorteilhaften Aspekt des Verfahrens der Erfindung wird das in der Stufe (1) eingesetzte Glucosaminoglycan ausgewählt nus der durch Heparin, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer Molmasse von unterhalb 10000 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer mittleren Molmasse, die zwischen 2000 und 7000 Dalton liegt, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer mittleren Molmasse von etwa 4500 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer mittleren Molmasse von etwa 2500 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten, die im Hinblick auf ihrer Molmasse homogen ist und einem durch Synthese erhaltenen Heparin-Frayment, das teils, was seine Molmasse betrifft und teils, was seine Funktionalisierung betrifft, homogen ist, gebildeten Gruppe.

Bsi einem weiteren vorteilhaften Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das in der Stufe (1) eingesetzte Glucosaminoglycan Heparin, eine Fraktion oder ein Heparin-Fragment, die von ihrer Bindungslage zu Antithrombin IU befreit sind.

Das in der Stufe (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Glucosaminoglycan kann vorteilhafterweise ausgewählt warden aus der durch Dermatan-Sulfat und seinen Fragmenten oder Chondroitin-4- und 6-Sulfat und seinen Fragmenten gebildeten Gruppe.

In vorteilhafter Art und Weise ist das in der Stufe (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Salz des Glucosaminoglycana das Salz eines tertiären Amins, insbesondere einTributylamin-Salz, oder ein quaternä res Ammoniumsalz,

insbesondere ein Tetrabutylammonium-Salz.

Bei einem weiteren vorteilhaften Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das in der Stufe (2) eingesetzte Anhydrid das Anhydrid einer Alkanoe-Säure mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, vort6ilhafterweise 4 bis 10, vorzugsweise 4 bis 6 Kohlenstoffatomen. Das polare aprotische Lösungsmittel, in dem die Stufe (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt wird, kann

vorteilhafterweise ausgewählt werden aus der durch Dimethylformamid, Hexamethylphosphortriamid, Pyridin oder einer

Mischung dieser Lösungsmittel untereinander oder mit Dichlormethan, gebildeten Gruppe sowie der Katalysator aus der durch Amine, wie Pyridin und Oimethylaminopyridin, gebildeten Gruppe. Die für die Neutralisierung der Azidität vorgesehene Base kann Pyridin (das gleichzeitig als Lösungsmittel, Katalysator und Base

dienen kann), Triethylamin oder Tributylamin sein.

In vorteilhafter Art und Weise erfolgt die in der Stufe (4) durchgeführte Dialyse in Anwesenheit einer schwachen Base wie Natriumbicarbonat, um gegebenenfalls gebildete Nebenprodukte, wie Anhydride, zu entfernen. In vorteilhafter Art und Weise können die Temperatur und die Dauer der Reaktion in Abhängigkeit vom gewünschten Acylierurigsgrad schwanken, jeweils von 0°C b's 100⁰C, insbesondere von O⁰C bis 5O⁰C, und vorteilhafterweise erfolgt die Reaktion bei Umgebungstemperatur, beispielsweise innerhalb von 1 bis 24 Stunden. Die erfindungsgemäßen, selektiv O-acylierten Verbindungen weisen in vivo eine verlängerte Aktivität auf. Wenn diese Verbindungen beispielsweise solche vom Heparin-Typ sind, die die Bindungslage zu AT III aufweisen und daher befähigt s' .d,

eine antithrombotische Aktivität auszuüben, so ist diese Wirkung deutlich in der Zeit verlängert, im Verhältnis zur gleichen

Verbindung, die nicht selektiv O-acyliert wurde. Die erfindungsgemäßen, selektiv O-acylierten Heparin-Derivate, die entweder ihre bindungslage zu AT III behalten haben oder

auch nicht, wobei die letzteren praktisch von ihrer antikoagulierenden Wirkung befreit sind, weisen ebenfalls verschiedenebiologische Aktivitäten auf, insbesondere:

- Inhibierung der Proliferation der Zellen glatter Muskel, die von großem Interesse ist für die Vermeidung der Restenosen bei Eingriffen, wie der Angioplastie, By-pass-Operationen, venösen und arteriellen Transplantationen, Organtransplantationen und insbesondere Herztransplantationen,

- Inhibierung der Heparanase und der Heparitinase, das sind Enzyme, die mit der metastasischen Dissemination in Verbindung stehen,

- anti-virale Eigenschaften, insbesondere gegenüber Retroviren, besonders gegenüber den verschiedenen HIV (Human-Immunodefizienz-Virus), was ein großes Interesse bei der Behandlung von AIDS darstellt,

- Eigenschaften zur Inhibierung von Leukozyten-Elastase, zur Erhöhung des Kreislaufgrades von Elastase-Inhibitoren sowie dor selektiven Inhibierung der Synthese von Typ-Ill-Collagen und von Fibronectin, was ein großes Interesse bei der Behandlung von Krankheiten begründet, die mit einem Ungleichgewicht des Systems Elastase-Anti-elastase einhergehen, wie das Emphysem. sow<e bei <J?r Behandlung von degenerativen Krankheiten des Bindegewebes, wie Arteriosklerose und Diabetes.

Die selektive O-acylierten Glucosaminoglycane der Erfindung können daher den Wirkstoff von Medikamenten mit großer Bedeutung für zahlreiche Indikationen bilden. Die Erfindung hat daher ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet sind,

daß sie als Wirkstoff eine wirksame Menge von mindestens einem erfindungsgemäßen, se'ektiv O-acylierten

Glucosaminoglycan in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff enthalten. In vorteilhafter Art und Weise liegt das selektiv O-acylierte Glqcosaminoglycan in Form eines pharmazeutisch akzteptablen Salzes vor, wie einem Natrium-, Magnesium- oder Calcium-Salz. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen dadurch

gekennzeichnet, daß der pharmazeutische Trägerstoff für eine Verabreichung auf oralom Weg geeignet ist und daß sie in Formvon magenresistenten Kapseln, Tabletten oder Täfelchen, Pillen oder auch in Form trinkbarer Lösungen vorliegen, dievorteilhafterweise 50mg bis 5g pro Einheitsdosis, vorzugsweise 100 bis 1000mg für Kapseln, Tabletten oder Pillen und 10 bis150 mg für trinkbare Lösungen, beispielsweise ein bis drei mal pro Tag, enthalten; oder auch dadurch, daß diese

Zusammensetzungen in Form steriler oder sterilisierbarer Injektionslösungen vorliegen für die Verabreichung auf intravenösem,

intramuskulärem oder subkutanem Weg, wobei diese Lösungen vorteilhafterweise 50 bis 200 mg/ml selektiv O-acyliertes

Glucosaminoglycan enthalten, wenn sie für die Injektion auf subkutanem Weg vorgesehen sind, oder 20 bis 200mg/ml selektiv O-acyliertes Glucosaminoglycan, wenn sie für die Injektion auf intravenösem Weg oder für die Perfusion bestimmt sind. Diese Dosierungsintervalle sind nur ein Richtwert, und die zu verabreichenden Dosierungen werden in jedem Fall durch den Kliniker berechnet, unter Berücksichtigung des Zustandes des Erkrankten und seiner persönlichen Reaktion im Hinblick auf die Medikamente. Die Erfindung betrifft ebenfalls als biologische Reaktionspartner die selektiv-O-acylierten Glucosaminoglycane der Erfindung,

die als Referenzprodukte oder Eichmaße bei Vergleichsversuchen für Untersuchungen des Verhältnisses Struktur/Aktivität beiverschiedenen physiologischen Systemen, in die die Glucosaminoglycane eingreifen, verwendet werden können.

-14- 285 606 Ausfuhrungsbeisplel

Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Anwendungsbeispiele, die Keinen einschränkenden Charakter besitzen, näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von O-acetyllertem Heparin (IC 1938), ausgehend vom Heparln-Tetrabutylammonium-Salz

a) Herstellung des Heparin-Tetrabutylammonlum-Salzes

Das in Wasser (500 ml) gelöste Heparin-Natriumsalz (1 Og) wird durch eine Kationenaustauscherharz-Kolonne (Dowex 50 Wx 4, in H⁺-Form) perkoliert. Die erhaltene Lösung wird mit Tetrabutylammonium-Hyxdroxid neutralisiert. Nach Lyophilisierung erhält man das Hepdrin-Totrabutylammonium-Salz (19,55g).

b) Acotyllerung

1,05gTetrabutylammonium-Heparinat werden in wasserfreiem Dimethylformamid (5ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C gibt man tropfenweise Essigsäureanhydrid (1 ml; 10,46mMol) und anschließend Triethylamin (1,45ml; 10,46mMol) sowie Dimethylaminopyridin (64mg; 0,5mMol) hinzu. Dann wird die Mischung 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von Wasser (5ml) wird die Lösung 72 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Tetrabutylammonium-Salz wird mitteis Passage über ein Harz Dowex 50, H⁺ bei O⁰C, gefolgt von einer Neutralisation durch 1 N-Natriumhydroxid-Lösung, in das Natriumsalz umgewandelt. Nach Lyophilisierung erhält man 0,49g selektiv O-acfltyliertes Natrium-Hoparinat, das die folgenden Charakteristiken aufweist:

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,28meq/g

(Ausgangsprodukt: 2,20meq/g)

APTT-Titer: 91 ui/mg Spektrum ¹³C NMR (Methanol 51,6ppm, interner Standard)

- Signal bei 23,4 ppm: CH₃ von CH₃-CO-O-

- Signal bei 24,5 ppm (schwach): CH₃ von CH₃-CO-NH-(identisch mit dem Ausgangsprodukt)

Das NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von etwa zwei Acetyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit. Beispiel 2 Herstellung von O-acetyllertem Heparin (IC 1938) ausgehend vom Heparln-Trlbutylammonlum-Salz

a) Herstellung des Heparln-Tributylammonlum-Salzee

Das in Wasser (500ml) gelöste Heparin-Natriumsalz (10g) wird durch eine Katlonoriaustauscherharz-Kolonne (Dowex 50 Wx4, in H⁺-Form) perkoliert. Die Lösung wird durch Zugabe einer 10%igen Lösung von Tributylamin in Ethanol neutralisiert. Nach Waschen in ether und Lyophilisierung erhält man das Tributylammonium-Salz des Heparins (14,77g).

b) Acetyllerung

Zu einer auf O⁰C gekühlten Lösung des obigen Salzes (4g) in wasserfreiem Dimethylformamid (SOmI) gibt man Dimethylaminopyridin (250mg), Essigsäureanhydrid (3,9ml) und Tributylamin (9,7 ml). Nach 24stündigem Stehenlassen bei Umgebungstemperatur wird Wasser (1,5ml) zugesetzt. Dann wird die Mischung in eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol gegossen. Nach Waschen mit Ethanol wird der Niederschlag in Wasser gelöst und anschließend gegen Bicarbonat (5%ig in Wasser) und dann gegen Wasser riialysiert. Man erhält nach'Lyophilisierung das O-acetylierte Natrium-Heparinat (1,81 g). Das Infrarot-Spektrum weist eine starke Ester-Bande bei 1730cm"' auf

Nach Verseifung besitzt das Produkt:

- ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl von 2,33meq/g (Ausgangsprodukt 2,40meq/g),

- einen APTT-Titer von 85 iii/mg.

Beispiel 3 Herstellung von O-acetyllertem Heparin (IC 1938) unter Anwendung der Katalyse durch Pyrldln Das Tetrabutylammonium-Salz des Heparins (0,58g) wird in einer Mischung (1/1; v/v) von Pyridin und Dimethylformamid

(10ml) gelöst. Es wird Essigsäureanhydrid (0,5ml) hinzugesetzt und anschließend die Mischung bei Umgebungstemperaturstehengelassen. Nach 24 Stunden gibt man eine wäßrige Natriumacetat-Lösung (1M, 15ml) hinzu und gießt die Mischung dannin auf eine Temperatur von 0°C gekühltes Ethanol (80ml). Nach Zentrifugieren wird der Niederschlag wieder in Wasser (10ml)gelöst und anschließend Ethanol (160ml) und eine wäßrige Lösung von Natriumacetat (1M, 10ml) zugesetzt. Der Niederschlagwird dann in Wasser aufgenommen und lyophilisiert, wodurch man das O-acetylierte Heparin (0,22 g) erhält.

Beispiel 4 Herstellung von In verschiedenen Stufen O-proplonyliertem Heparin (IC 1939) Zu einer auf eine Temperatur von 0°C gekühlten Lösung von Tetrabutylammonium-Heparinat (1,85g), erhalten wie in Beispiel 1

beschrieben, in Dimethylformamid (10ml) gibt man tropfenweise Propionsäureanhydrid (2,7ml) und anschließend Triethylamin(2,9 ml) und Dimethylaminopyridin (128mg). Zu den Zeiten 1,2,4,8 und 24 Stunden wird ein Teil der Reaktionsmischungentnommen, mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt und 24 Stunden lang in destilliertem Wasser dialysiert. Nach Passageüber ein Harz Dowex 50H⁺ und Neutralisation durch Natriumhydroxid werden die erhaltenen Produkte lyophilisiert und weisendie folgenden Charakteristiken auf:

Reaktionszeit	Masse	Sulfat/Carboxyl	ΑΡΤΓ
		meq/g	(ui/mg)
24h	490 mg	2,31	80
8h	138 mg	2,35	88
4h	122 mg	2,33	94
2h	120 mg	2,42	109
1h	120 mg	2,33	120
Ausg. Produkt		2,40	150

Das Protonen-NMR-Spektrum der Produkte wurde in Wasser mit 3,3,3-Trimethylsilylpropionat (TSP) als internem Standard aufgenommen. Es weist Signale bei 1,1 ppm und 2,4ppm auf, die jeweils charakteristisch sind für die Reste CH₃ und CH₂ von CH₃-CHj-CO-O und Signale zwischen 3 und "" Dpm, die für Protonen des Osid-Gorüstes sprechen.

Der Vergleich der Intensität der Signale des Propionyls und des Gerüstes ^wischen den 1 Stunde lang behandelten Produkten und denen, die 24 Stunden lang der Reaktion unterzogen wurden, zeigt den Einfluß der Reaktionsdauer: wenn man beobachtet ein Anwachsen der Signale der Gerüst-Protonen, was auf eine Erhöhung des Substitutionsgrades hinweist.

Das Kohlenstoff-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) zeigt Signale bei 10,8 und 30ppm, die charakteristisch sind für die Radikale CH₃ und CH₂ der Propionester.

Beispiel 5 Herstellung von O-butyryliertem Heparin (IC 1940)

a) Verwendung des Heparln-Tetrabutylammonium-Salzes

Zu einer Lösung des Heparin-Tetrabutylammonium-Salzes (0,55g), erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, in Dimethylformamid (5ml) gibt man bei einer Temperatur von O⁰C Buttersäureanhydrid und Dimethylaminopyridin. Nach 24 Stunden bei Umgebungstemperatur wird Wasser (5ml) hinzugegeben und die Reaktionsmischung dann 72 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach Austausch auf Dowex 50H⁺, Neutralisation durch Natriumhydroxid und Lyophilisierung erhält man das O-butyrylierte Heparin in Form des Natriumsalzes (0,32g).

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,15 meq/g

(Ausgangsprodukt: 2,20 meq/g)

APTT-Titer: 59 ui/mg

Das Protonen-NMR-Spektrum (TSP, interner Standard) zeigt die Anwesenheit von Signalen bei 0,9ppm; 1,6ppm und 2,4ppm, die charakteristisch sind für CHr-CH₂-Gruppen von CH₃-CH₂-CH₂-CO-O- und Signale zwischen 3 und 6ppm, die für das Osid-Gerüst sprechen

Die Analyse des NMR-Spektrums zeigt die Anwesenheit von etwa einer Butyryl-Kette pro Disaccharid-Einhait.

b) Verwendung des Heparln-Tributylammonium-Salzes

Zu einer auf 0°C gekühlten Lösung des Heparinats vom Tributylamin (4g), erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, in Dimethylformamid (50ml) gibt man Dime'.iiylaminopyridin (0,25g), Buttersäureanhydrid (6,7 ml) und Tributylamin (9,7 ml). Dann beläßt man die Reaktionsmischung 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur. Es wird Wasser (1,5ml) und nach 30 Minuten eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol '(25OmI) hinzugesetzt. Der Niederschlag wird dann dreimal mit Ethanol gewaschen, anschließend gegen eine 5%ige Lösung von Bicarbonat und dann gegen Wasser dialysiert. Man erhält nach Lyophilisieruny das O-butyrylierte Natriumsalz des Heparins (2,1 g). APTT-Titer: 29ui/mg Nach Verseifung der Ester mit 0,5 M-Natriumhydroxyd-Lösung innerhalb von 2 Stunden bei einer Temperatur von O⁰C weist das erhaltene Produkt ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl von 2,36meq/g auf. (Ausgangsprodukt 2,40 meq/g).

Beispiel β

Herstellung von O-liexanoyllertem Heparin (IC 1941)

a) Verwendung des Heperin-TetrabutvlammonlunvSalzes

Zu einer Lösung des Yetrabutylammonium-Salzes von Heparin (0,55g), erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, in Dimethylformamid (3ml), gibt man bei einer Temperatur von O⁰C Capronsäureanhydrid (1 ml; 6mMol), Triethylamin (0,84ml; 6mMol) und Dimethylaminopyridin. Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur wird Wasser (5 ml) hinzugesetzt, unr/ anschließend dialysiert man die Reaktionsmischung 72 Stunden lang gegen eine 5%ige Bicarbonatlösung sowie gegen de itilliertes Wasser. Nach Austausch auf Dowex 50 H⁺, Neutralisation mit Natriumhydroxid und Lyophilisierung erhält man das O-hcxanoylierte Heparin in Form des Natriumsalzes (0,30g)

APTT-Titer: 25ui/mg

Das Protonen-NMR-Spektrum (TSP, i iterner Standard) weist Signale bei 0,8; 1,2; 1,5 und 2,3ppm auf, die charakteristisch sind für CH₃-CH₂ von CH₃-(CH₂Ig-CO-O-

b) Verwendung des Heparin-Tributylammonium-Salzes

Zu einer auf eine Temperatur von O⁰C gekühlten Lösung von Tributylammonium-Heparinat (4 g), erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, in Dimethylformamid (50ml) gibt man Dimethylaminopyridin (0,25g), Tributylamin (9,7ml) und Hexanoesäureanhydrid (10,6ml). Nach 24 Stunden Stehenlassen bei 20"C wird Wasser (1,5ml) hinzugesetzt und danach eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol. Nach Waschen mit Ethanol, Dialyse und Lyophilisierung erhält man das O-hexanoylierte Heparin (2,5g).

Beispiel 7

Herstellung von O-octenoyllertem Heparin (IC 1942)

Zu einer auf eine Temperatur von O⁰C gekühlten Lösung von Tributylammonium-Heparinat (4g), erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, in Dimethylformamid (50ml) tfibt man Dimethylaminopyridin (0,25g),Tributylamin (9,7ml) und Octanoeeäureanhydrid (12,1 ml). Nach 24 Stunden Stehenlassen bei 20⁰C wird Wasser (1,5ml) hinzugesetzt und nach 30 Minuten eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Etl.anol. Nach Dialyse gegen eine 20%ige Ethanol-Lösung und anschließend gegen destilliertes Wasser und nach Ultrafiltration wird das Produkt einem Kationenaustausch mittels Passage über Dowex 50H⁺ unterzogen, gefolgt von der Neutralisierunk durch Natriumhydroxid. Nach Lyophilisierung erhält man das O-octanoylierte Heparin (2,5g).

Beispiel 8 Herstellung von O-decanoyllertem Heparin (IC 1943)

a) Verwendung des Heparln-Tetrabutylammonlum-Salzes

Zu einer Lösung des Tetrabutylammcnium-Salzes von Heparin (0,55g), erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, in Dimethylformamid (5ml), gibt man bei einer Temperatur von O⁰C Caprylanhydrid (1 ml; 6mMol), Triethylamin (0,84ml, 6mMol) und Dimethylaminopyridin. Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur wird Wasser (5 ml) hinzugesetzt und anschließend dialysiert man die Reaktionsmischung 72 Stunden lang gegen eine 5%ige Bicarbonatlösung und anschließend gegen destilliertes Wasser. Nach Austausch auf Dowex 50H⁺, Neutralisation mit Natriumhydroxid und Lyophilisierung erhält man das O-decanoylierte Heparin in Form des Natriumsalzes (0,30g).

Das Protonen-NMR-Spektrum (TSP, interner Standard) weist Signale bei 0,8; 1,2; 1,5 und 2,4 ppm auf, die charakteristisch sind für CH₃ und CH₂ von CHr-(CH₂)a-CO-O-.

b) Verwendung des Heparln-Tributylammonlum-Salzes

Zu einer auf eine Temperatur von 0°C gekühlten Lösung von Tributylammonium-Heparinat (4g), erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, in Dimethylformamid (50ml) gibt man Dimethylaminopyridin (0,25g), Tributylamin (9,7ml) und Decanoesäureanhydrid (13,3g, gelöst in 20ml Dimethylformamid). Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur wird Wasser (1,5 ml) hinzugesetzt und dann eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol. Dor Niederschlag wird in Dimethylsulfoxid gelöst und anschließend gegen Wasser, Natriumbicarbonat und von neuem gegen Wasser dialysiert. Nach Lyophilisierung erhält man das O-decanoylierte Heparin (2,38g). '

Beispiel 9

Herstellung von O-oleoyliertem Hepnrin (IC 2013)

Das Tributylammonium-Salz des Heparins (3g) und N,N-Dimethylaminopyridin (244mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (50ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C gibt man tropfenweise Oleinsäureanhydrid (21 g), synthetisiert gemäß Plusquellec et al., Tetrahedron, 1988,44,2471-2476, in Lösung von Dichlormethan (20ml) hinzu, und anschließend Tributylamin (9,5ml). Nach 24 Stunden Reaktionsdauer und Abkühlung auf eine Temperatur »i O⁰C, trägt man eine 5%ige Bicarbonatlösung (10 ml) ein und dann, nach einer Stunde, eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat.

Nach Waschen mit absolutem Ethanol und Auflösung in einer Mischung von Dimethylsulfoxid-Wasser (4/1; v/v, 750ml) dialysiert man 2 Tage lang gegen 10%iges wäßriges Ethanol und dann 3 Tage lang gegen Wasser. Das Natriumsalz des O-oleoylierten Heparins wird nach Lyophilisierung und Fällung des wieder in DMF (2,77 g) aufgelösten Lyophilisats in Ethylether isoliert.

Gehalt an Oleinsäure: 1,44pMol/mg (Dosierung gemäß Ducombe W. et al., BiochemicalJournal, 1963,88,7).

Beispiel 10 Herstellung von O-benzoyllertem Heparin (IC 1944)

Das Tetrabutylammonium-Salz des Heparins, erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, wird mit Benzoesäureanhydrid unter den zuvor bei der Herstellung von O-decanoyliertem Heparin beschriebenen Bedingungen benzoyliert (Beispiel 8).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum des erhaltenen Produktes weist Signale bei 131,132 und 136ppm auf, die charakteristisch sind für die Benzoyl-Gruppen.

Das Produkt ist von der antikoagulierenden Aktivität in vitro befreit.

Beispiel 11 Herstellung von O-3-cyclopentyl-propionyllertem Heparin (IC 2014)

Das S-Cyclopentyl-propionsäureanhydrid wird gemäß der Methode von Plusquellec et al., Tetrahedron, 1988,44,2471-2476 hergestellt. Es wird erhalten nach Zugabe der Säure (23 ml) in Lösung von Dichlormethan (400ml) zu einergerührten und auf eine Temperatur von -10°C gekühlten Mischung, dieTetrabutylammonium-bromid (15 mMol), 20%ige Natriumhydroxid-Lösung (SOmI) und Dichlormethan (80ml) enthält, und nach Dekantieren, Waschen mit 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser sowie Konzentrieren zu einem Öl (96%). Charakteristische Infrarot-Frequenzon: 1800,1745,1040cm"¹. Das Tributylammonium-Salz des Heparins (4g) und das N,N-Dimethylaminopyridin (253mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (40ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von 0°C gibt man tropfenweise 3-Cyclopentylpropionsäureanhydrid (11 g) und dann Tributylamin (9,8 ml) hinzu. Nach 24 Stunden Reaktionsdauer bei Umgebungstemperatur und anschließende Abkühlung auf O⁰C wird Wasser (1ml) und nach einer Stunde eine gesättigte, alkoholische Natriumacetat-Lösung zugegeben. Nach Waschen mit absolutem Ethanol wird der Niederschlag 24 Stundon lang gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung und danach 3 Tage lang gegen Wasser dialysiert. Nach Lyophilisierung erhält man das O-3-cyclopentylpropionylierte Heparin in Form seines Natriumsalzes (2,64g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol zu 61,6 ppm, interner Standard) weist die charakteristischen Signale bei 27,4; 33,1; 34,8; 35,9 und 41,7ppm der O-Cyclopentylpropionyl-Gruppe auf

Verhä.tnis Sulfat/Carboxyl: 2,2

Beispiel 12

Herstellung eines O-acetyllerten Heparin« mit geringer Molmasse (mittleres Molekulargewicht 4500 Dalton, Molgewichts-Intervall von 1800-8000 Dalton) (IC 1945)

Dieses Heparin mit geringer Molmasse wurde durch partielle nitroso Depolymerisation und alkoholische Fraktionierung gemäß dem Patent EP181252 erhalten und wird nachfolgend mit CY 216 bezeichnet.

a) Verwendung des Tetrabutylammonlum-Salzes von CY 216

Das Natriumsalz des CY 216 (1 g) wird mittels Passage durch eine Harz-Kolonne Dowex 50H⁺, gefolgt von einer Neutralisation durch Tetrabutylammonium-Hydroxid, in das Tetrabutylammonium-Salz umgewandelt.

Das auf diese Weise erhaltene Salz (1,7g) wird drei Stunden lang unter Vakuum bei einer Temperatur von 50⁰C getrocknet und danach in wasserfreiem Dimethylformamid (10ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C wird tropfenweise Essigsäureanhydrid (1,7ml) hinzugegeben und dann Triethylamin (2,4ml) und Dimethylaminopyridin (102mg). Nach 20 Stunden Reaktionsdauer wird das Produkt über eine Sephadex-Kolonne G-25 unter Elution mit Wasser chromatographiert. Man erhält nach Umwandlung in das Natriumsalz und Lyophilisierung das O-acetylierte CY 216 (0,89g). Sein Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) zeigt ein Signal bei 23ppm, das charakteristisch ist für Acetate. Das Signal des CH₃ von CHa-CO-NH- bei 24,5ppm ist identisch mit dem des Ausgangsproduktes.

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,09meq/g

(Ausgangsprodukt: 2,05meq/g)

APTT-Titer: 18ui/mg

anti-Xa-Titer: 205 u/mg

(Dosierung von Yin et al., J. Lab. CNn. Med., 1973 81,298-310)

b) Verwendung des Tributylammonlum-Salzos von CY 216

Das Natriumsalz von CY 216 wird mittels Passage durch eine Harz-Kolonno Dowex 50H⁺, gefolgt von einer Neutralisation mit Tributylamin, in das Tributylammonium-Salz überführt, wie bereits bei Heparin beschrieben. Das Tributylammonium-Salz von CY 216 wird nach Waschen mit Ether, Lyophilisierung und Trocknen im Vakuumtrockenschrank erhalten.

Das obengenannte Salz (4g) und das Ν,Ν-Dimethylaminopyridin (288mg) werden in Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlung auf eineTemperatur von 0°C werden tropfenweise Essigsäureanhydrid (4,4 ml) und dann Tributylamin (11,2 ml) zugesetTt. Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur und Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C wird Wasser (1,7ml) zugegeben und nach einer Stunde eine gesättigte, alkoholische Lösung von Natriumacetat.

Der Niederschlag wird mit Ethanol gewaschen, in pyrogenfreiem Wasser gelöst, 36 Stunden lang gegen 5%ige Bicarbonatlösung und dann 3 Tage lang gegen Wasser dialysiert. Man erhält nach Lyophilisierung das acetylierte CY 216 in Form des Natriumsalzes (1,4g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol) zu 51,6ppm als interner Standard) weist bei 23ppm das für die Acetyl-Gruppe charakteristische Signal auf.

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,07.

Beispiel 13

Herstellung eines O-butyrylierten Heparlns mit geringer Molmasse (mittleres Molekulargewicht 4500 Dalton, Molgewichts-Intervall von 1800-8000 Dalton) (IC 1957)

Das Tributylammonium-Salz von CY 216 (4g), erhalten wie in Beispiel 12 beschrieben, und das Ν,Ν-Dimethylaminopyridin (288 mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (40ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C wird tropfenweise Buttersäureanhydrid (7,68mi) hinzugegeben und dann Tributylamin (11,2 ml). Nach 24 Stunden Reaktionsdauer bei Umgebungstemperatur und anschließendem Abkühlen auf O⁰C wird Wasser (1,7 ml) hinzugesetzt und nach einer Stunde eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat. Nach Waschen mit Ethanol, Auflösen in pyrogenfreiem Wasser, 36 Stunden lange Dialyse gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung und danach 3 Tage lange gegen Wasser wird das O butyrylierte CY 216 nach Lyophilisierung in Form des Natriumsalzes isoliert (2,14g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol) zu 51,6ppm, interner Standard) weist bei 15,6; 20,5 und 39,4ppm die für die O-butyryl-Gruppe charakteristischen Signale auf

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,08.

Beispiel 14

Herstellung eines O-hexanoylierten Heparlns mit geringer Molmasse (mittleres Molekulargewicht 4500 Dalton, Molgewichts- Intervall von 1800-8000 Dalton) (IC 1958)

Das Tributylammonium-Salz von CY 216 (4g), erhalten wie in Beispiel 12 beschrieben, und das Ν,Ν-Dimethylaminopyridin (288 mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (40ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von 0°C wird tropfenweise Capronsäureanhydrid (10,8ml) hinzugegeben und dann Tributylamin (11,2ml). Nach 24 Stunden Reaktionsdauer bei Umgebungstemperatur und anschließendem Abkühlen auf O⁰C wird Wasser (1,7 ml) hinzugesetzt und nach einer Stunde eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat. Nach Waschen mit Ethanol, Auflösen in pyrogenfreiem Wasser, 36 Stunden lange Dialyse gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung und danach 3 Tage lange gegen Wasser wird das O-caproylierte CY 216 nach Lyophilisierung in Form des Natriumsalzes isoliert (2,5g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol zu 51,6ppm, interner Standard) weist bei 15,9; 24,2 und 26,4ppm die für die Caproyl-Gruppe charakteristischen Signale auf

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,08.

Beispiel 15

Herstellung eines O-octanoyllerten Heparins mit geringer Molmasse (mittleres Molekulargewicht 4500 Dalton, Molgewichts-Intervall von 1800-6000 Dalton) (IC 1959)

Das Tributylammonium-Salz von CY 216 (4g), erhalten wie in Beispiel 12 beschrieben, und das Ν,Ν-Dimethylaminopyridin (288 mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (40ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C wird tropfe,iweise Caprylanhydrid (14ml) hinzugegeben und dann Tributylamin (11,2ml). Nach 24 Stunden Reaktionsdauer bei Umgebungstemperatur und anschließendem Abkühlen auf OX wird Wasser (1,7 ml) hinzugesetzt und nach einer Stunde eine gesät igte alkoholische Lösung von Natriumacetat. Nach Waschen mit absolutem Ethanol, Auflösen in pyrogenfreiem Wasser, 3S Stunden lange Dialyse gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung und danach 3 Tage lange gegen Wasser wird das O-octanoylierto CY 216 nach Lyophilisierung in Form des Natriumsalzes isoliert (1,76g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in d⁶ DMSO (Methanol zu 51,6ppm, interner Standard) weist bei 16,8; 25,0; 27,3; 30,9; 31,4; 34,1 und ?5,4ppm Signale auf, die charakteristisch sind für die Capryloyl-Gruppe. Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,07.

Beispiel 16

Herstellung eines O-decanoylierten Haparins mit geringer Molmasse (mittleres Molekulargewicht 4500 Dalton, Molgewichts-Intervall von 1800-8000 Dalton) (IC 1960)

Das Tributylammonium-Salz von CY 216 (4g), erhalten wie in Beispiel 12 beschrieben, und das N,N-Dimethylaminopyridin (288mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (40ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von 0°C wird tropfenweise Decanoesäureanhydrid (15,3ml) in Lösung von wasserfreiem Dimethylformamid (10ml) hinzugegeben und dann Tributylamin (11,2ml). Nach 24 Stunden Reaktionsdauer bei Umgebungstemperatur und anschließendem Abkühlen auf O⁰C wird Wasser (1,7ml) hinzugesetzt und nach einer Stunde eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat. Nach Waschen mit absolutem Ethanol und Suspendieren in pyrogenfreiem Wasser dialysiert man 2 Tage lang gegen eine 10%ige NaCI-Lösung und danach 5 Tage lang gegen Wasser. Das O-decanoylisrte CY 216 wird nach Lyophilisierung in Form des Natriumsalzes isoliert (2,76g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol zu 51,6ppm, interner Standard) weist bei 16,4; 22,3; 25,1; 29,2; 31,9; 34,4 und 36,5ppm Signale auf, die charakteristisch sind für die Decanoyl-Gruppe

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,13.

Beispiel 17

Herstellung eines O-acetylierten Heparins mit geringer Molmasse (mittleres Molekulargewicht 2500 Daiton, Molgewichts-Intervall von 1500-8000 Dalton) (IC 1946)

Dieses Heparin mit geringer Molmasse wurde durch partielle nitroso Depolymerisation gemäß dem in dem Patent EP 37319 beschriebenen Verfahren erhalten und wird nachfolgend mit CY 222 bezeichnet.

Das Natriumsalz des CY 222 wird mittels Passage durch eine Harz-Kolonne Dowex 50H⁺, gefolgt von einer Neutralisation durch Tributylamin, in das Tributylammonium-Salz umgewandelt.

Das r.ech Lyophilisierung erhaltene Salz (1,5g) wird in Dimethylformamid (5 ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C wird tropfenweise Essigsäureanhydrid (1,35ml) hinzugegeben und dann Triethylamin (2ml) und Dimethylaminopyridin (85mg). Nach 18 Stunden Reaktionsdauer wird Wasser (20ml) zugesetzt und die Mischung anschließend 3 Tage lang gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach Umwandlung in das Natriumsalz und Lyophilisierung erhält man das 0-acotylierte CY 222 (0,86g).

Das Produkt weist ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl vor 1,98meq/g auf (Ausgangsprodukt: 1,97meq/g). Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) des Produktes enthält ein Signal bei 23ppm, das charakteristisch ist für O-Acetyl. Der Intensitätsvergleich der Signale von N-Acetyl (bei 24,5 ppm) zwischen dem Ausgangsprodukt und dem Endprodukt demonstriert, daß die Acetylierung selektiv erfolgte.

APTT-Titer: 8ui/mg

anti-Xa-Titer: 191 u/mg

(Dosierung von Yin et al., J. Lab. CNn. Med., 1973 81,298-310).

Beispiel 18

a) Herstellung eines Heparln-Fragmentes, das von der Affinitat zu Antithrombln III befreit ist (IC 1772)

1. Auftrennung der Heparln-Ketten mit Hilfe von Perlod-Säura

10g injizierbares Heparin aus Schweine-Schleim, in Form des Natriumsalzes, das 157ui/mg in der Dosierung Codex titriert und 155u/mg in der Dosierung anti-Faktor Xa von Yin et al. wird in 25OmI demineralisiertem Wasser bei einerTemperatur von 4⁰C in Lösung gebracht. Der pH-Wert der Lösung wird durch konzentrierte Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Dann werden 10g Natriummetaperiodat (NaIO₄, MG: 213,89) in Lösung von 250ml demineralisiertem Wasser bei 4°C unter mäßigem Rühren hinzugefügt. Der pH-Wert des Ganzen wird durch konzentrierte Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Dann wird die Lösung 24 Stunden lang in der Dunkelheit und in einer Kühlkammer bei -I 4⁰C aufbewahrt.

2. Entfernung des restlichen Periodats

Man verteilt anschließend die Reaktions-Lösung auf drei Dialyse-Schläuche NOJAX 40ⁿ (Porosität 3 bis 4000Da) und unterzieht sie einer 15 Stunden langen Dialyse gegen demineralisiertes Leitungswasser.

3. Depolymerisation Im basischen Medium

Zu 780ml der nach der Dialyse erhaltenen Lösung werden 16ml 10N-Natriumhydroxid-Lösung gegeben und das Ganze 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur (in der Größenordnung von 18 bis 21 "C) gerührt.

4. Reduktion

600mg Natriumborhydrid (NsBH₄, MG: 37,83) werden dann hinzugesetzt und die Lösung von neuem 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Anschließend wird ihr pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 4 eingestellt. Nach 15 Minuten Rühren wird der p, i-Wert mit Hilfe von konzentrierter Natronlauge auf 7 eingestellt. Zu 820ml der auf diese Weise erhaltenen Lösung werden 16,4g NaCI und dann 1270ml Ethanol gegeben. Das Ganze wird 3 Stunden lang stehen gelassen und dann bei 2 500 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wird gesammelt, in 200ml reinem Ethanol in Suspension gebracht, mit einem Ultra-Türrax" zerkleinert und schließlich durch Filtration über eine Büchner-Fritte zurückgewonnen. Dann wird es 5 Stunden lang bei einer Temperatur von 40°C unter Vakuum getrocknet. Man gewinnt auf diese Weise 8,9g Produkt.

5. Alkoholische Fraktionierung

Diese 8,9g werden in etwa 120ml demineralisiertem Wasser bei Umgebungstemperatur gelöst. Man setzt 1,78g NaCI hinzu, und der pH-Wert der Lösung wird mit Hilfe von Salzsäure auf 3,5 gesenkt. Dann wird das Volumen der Lösung mit demineralisiertem Wasser auf 178ml eingestellt. Anschließend werden unter Rühren 151 ml reines Ethanol hinzugegeben. Nach Ende der Zugabe rührt man noch 15 Minuten lang und läßt das Ganze dann 10 Stunden lang bei Umgebungstemperatur stehen. Der entstandene Niederschlag wird durch 20minütiges Zentrifugieren mit 2500U/min gewonnen. Er wird in 150ml reinem Ethanol in Suspension gebracht, mit dem Ultra-Turrax" zerkleinert, durch Filtration über eine Büchner-Fritte zurückgewonnen, mit 300ml reinem Ethanol gewaschen und schließlich 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 40°C unter Vakuum getrocknet. Man gewinnt auf diese Weise 5g des Produktes IC 1772 in Form eines weißen Pulvers, das die folgenden Charakteristiken besitzt:

- SO₃": 3,55meq/g

- COO": 1,54meq/g

- S + C: 5,09meq/g

- S/C: 2,31 meq/g ·

Es ist praktisch von N-Acetyl-Glucosamin befreit (Abwesenheit des Signals bei 24,5ppm im Kohlenstoff-NMR-Spektrum).

- Codex-Titer: 11 ui/mg

- APTT-Titer: 9 ui/mg

- anti-Xa-Titer: 12 ui/mg

a) Herstellung eines O-acetyllerten Heparin-Fragmentes, das von dor Affinität zu Antithrombin III befreit Ist (IC 1924) Das in Stufe a) erhaltene Produkt wird mittels Passage über ein Harz Dowe.x 50 H⁺, gefolgt von einer Neutralisation mit Tetrabutylammonium-Hydroxid, in das Tetrabutylammonium-Salz überführt. Ausgehend von 9,5g Natriumsalz erhält man 18g Tetrabutylammonium-Salz

Zu einer Lösung von 6g des auf diese Weise erhaltenen Salzes in Dimethylformamid (55 ml) gibt man nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C Essigsäureanhydrid (6,2ml; 65,6 mMol) und danach Triethylamin (9 ml; 65,5 mMol) und Dimethylaminopyridin (403 mg; 3,3 mMol). Nach 24 Stunden Stehenlassen wird eine gesättigte alkoholische Lösung von Natriumacetat (250ml) zugesetzt. Nach Zentrifugieren und Waschen des Niederschlages mit Ethanol wird der Feststoff über Sephaden G-25 entsalzt und anschließend einem Ionenaustausch durch Passage über Dowex 50H⁺ unterzogen, gefolgt von der Neutralisation mit Natriumhydroxid. Nach Lyophilisierung erhält man das Produkt IC 1924 (3g).

Dieses Produkt weist die folgenden Charakteristiken auf:

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,28 meq/g.

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) zeigt deutlich, daß das Produkt O-acyliert wurde. Das charakteristische Signal des C₂ vom N-Acetyl-glucosamin, bei etwa 56ppm, fehlt, wie beim Ausgangsprodukt, völlig im Spektrum.

Beispiel 19

Herstellung eines O-butyrylierten Heparin-Fragmentes, das von der Aff initat zu Antithromb'i III befreit ist (IC 1925) 6g des Tetrabutylammonium-Salzes von IC 1772, erhalten wie in Beispiel 18 beschrieben, werden mit Buttersäureanhydrid unter den gleichen Bedingungen butyryliert, wie bei der Acetylierung beschrieben. Man erhält das Produkt IC 1925 (2,96g), das die folgenden Charakteristiken aufweist:

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,31 meq/g

Das ^<3C-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) enthält die für die Butyl-Gruppe charakteristischen Signale bei 15,6; 20,4 und 38,4 ppm.

Beispiel 20

Herstellung eines O-hexanoyllerten Heparin-Fragmentes, das von der Affinität zu Antithrombin III befreit ist (IC 1926) 6g des Tetrabutylammonium-Salzes von IC 1772, erhalten wie in Beispiel 12 beschrieben, werden mit Hexanoesäureanhydrid in der gleichen Weise wie bei der Acetylierung behandelt. Man erhält das Produkt IC 1926 (3g), das die folgenden Charakteristiken aufweist:

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 2,20meq/g

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) weist Signale bei 15,5; 23,9; 26,2; 32,7 und 36,1 ppm auf, die charakteristisch sind für CH₃ und CH₂ der Hexyl-Gruppe. Das Protonen-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von etwa einer Hexyl-Gruppe pro Disaccharid-Einheit.

Beispiel 21

Herstellung einer O-butyrylierten Mischung von Fragmenten, die von ihrer Affinität zu Antithrombin III befreit und im Hinblick auf ihre Molmasse homogen sind

Die Mischung der von der antikoagulierenden Aktivität befreiten Fragmente wurde wie in Beispiel 12 beschrieben durch Gel-Filtration in ihre verschiedenen Bestandteile fraktioniert. Man erhält auf diese Weise hinsichtlich der Molmasse homogene Fraktionen, deren Massen sind: 7700,6500,5800,5300,4980,4400,3900,3400,2600,1860 und 1210.

Beispiel für die Veresterung einer Fraktion

Die Fraktion der Masse 2600 (0,20g) wird in das Tributylammonium-Salz überführt und anschließend lyophilisiert und getrocknet (0,43g). Dieses Produkt wird dann in DMF (2 ml) gelöst und es werden nach Abkühlung auf eine Temperatur von 0°C nacheinander Dimethylamirjopyridin (18mg), Buttersäureanhydrid (0.49 ml) und Tributylamin (0,7 ml) hinzugesetzt. Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur gibt man Natriumbicarbonat (1 ml einer 5%igen Lösung) hinzu, und 2 S linden später wird die Mischung über eine Sephadex-G-25-Kolonne (1 Liter) unter Elution mit Natriumchlorid (0,2 M) Chromatographien. Das Produkt wird nach dem Entsalzen lyophilisiert und ergibt ein hell-beige-farbenes Pulver (0,24g). Die anderen Fraktionen werden in der gleichen Weise behandelt und ergeben entsprechende Produkte, deren IR-Analyse die Anwesenheit einer Ester-Bande bei 1734cm"¹ zeigt. Der Sulfatierungsgrad der Produkte (Verhältnis Sulfat/Carboxyl) ist nach der Acylierung unverändert

Bestimmung des AcyllerungsgrddiJ

Der Acylierungsgrad wird durch Gasphasen-Chromatographie bestimmt, nach Butanolyse der Produkte durch eine Buttersäure/ Schwefelsäure-Mischung, gefolgt von einer Extraktion der Butylester durch Chloroform und Entfernung des überschüssigen Butanols durch Waschen mit Wasser.

Beispiel 22 Herstellung von O-acetyliertem Dermatan-Sulfat (IC 1947)

Zu einer auf eine Temperatur von O⁰C gekühlten Lösung des Tetrabutylammonium-Salzes von Dermatan-Sulfat (0,91 g), erhalten unter den gleichen Bedingungen wie bei der Herstellung des Tetrabutylammonium-Heparinats in Beispiel 1 beschrieben, in Dimethylformamid (20ml) gibt man tropfenweise Essigsäureanhydrid (1,35ml; 14,2 mMol) und anschließend Trietylamin (1,97ml; 14,2 mMol) und Dimethylaminopyridin (0,7 mMol). Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur setzt man Wasser (40ml) hinzu und dialysiert 72 Stunden lang. Das Natriumsalz wird mittels Passage durch eine Harz-Kolonne Dowex 50 H⁺ bei O⁰C, gefolgt von einer Neutralisierung mit Natriumhydroxid, erhalten. Man erhält nach Lyophilisierung ein beigefarbenes Pulver (0,52 g)

Das O-acetylierte Dermatan-Sulfat weist die folgenden Charakteristiken auf:

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 0,99meq/g

(Ausgangsprodukt: 1,05meq/g)

^uC-NMR-Spektrum (Methanol 61,6ppm, interner Standard):

- Signal bei 25,5ppm CH₃ von CH₃-CO-NH- (identisch mit dem Ausgangsprodukt),

- Signal bei 23,0ppm CH₃ von CHj-CO-O-

Beisplel23

Herstellung von O-succinyHsrtem Dermatan-Sulfat (IC 2020) Das Tetrabutylammonium-Salz des Dermatan-Sulfates (1 g) und das Ν,Ν-Dimethylaminopyriclin (110mg) werden in

wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von Bernsteinsäureanhydrid (396mg) und Tributylamin (0,94ml) wird die

Mischung 2 Stunden lang unter wasserfreien Bedingungen bei einer Temperatur von 60°C inkubiert. Nach Abkühlung und Zugabe von Wasser (2 ml) führt man eine Fällung in einer mit Natriumacetat gesättigten, eiskalten alkoholischen Lösung durch. Der Niederschlag wird mit Ethanol gewaschen, in pyr igenfreiem Wasser gelöst und anschließend 36 Stunden lang gegen 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung sowie 3 Tage lang geger Wasser dialysiert. Man erhält nach Lyophilisierung das O-succinylierte Dermatan-Sulfat in Form des Natriumsalzes (0,83mg). Das Infrarot-Spektrum (KBr) weist bei 1730 und 142C cm"¹ die für die Carboxyl-Gruppe charakteristischen Frequenzen

(Wellenanzahl) auf.

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol 51,6ρρτ>, interner Standard) weist bei 33; 34,5 und 183,6ppm die für die Succinyl-Gruppe charakteristischen Signale auf und bei 25,3 ppm das charakteristische Signal für Methyl der Acetamido-Gruppe,

das mit dem Ausgangsprodukt identisch ist.

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 0,51 meq/g Beispiel 24 Herstellung von O-butyryliertem Heparin, das zuvor N-desulfatiert und N-acetyliert wurde (IC 1948)

Das Heparin wird N-desulfatiert und anschließend N-acetyliert gemäß der von Nagasawa und Inoue (Methods Carbohydr. Chem. Vol. VIII, S.291-294) beschriebenen Technik.

Das Tributylammonium-Salz (1 g) wird erhalten durch Passage über ein Harz Dowex 50H⁺, gefolgt von der Neutralisation mit einer Lösung von Tributylamin in Ethanol.

Nach Lyophilisierung und Trocknung wird dieses Salz in Dimethylformamid (10ml) gelöst, und anschließend wird nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C Buttersäureanhydrid (2 ml) sowie Tributylamin (2 ml) und Dimethylaminopyridin (65mg) hinzugesetzt. Nach 24 Stunden wird Wasser (5ml) zugegeben und die Misghung gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung und dann gegen Wasser dialysiert. Nach Passage über Dowex 50 H⁺, gefolgt von der Neutralisation mit Natriumhydroxid-Lösung, erhält man das N-acetylierte-O-butyrylierte Heparin-Natriumsalz.

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanoi 51,6ppm, interner Standard) zeigt ein Signal bei 24,6ppm, das charakteristisch ist für N-Acetyl und Signale bei 16,20 und 38ppm, die den Buttersäureestern entsprechen.

Der Versuch kann mit einem partiell N-desulfatierten-N-acetylierten Heparin wiederholt werden und führt dann zu einem partiell N-desulfatierten-N-acetylierten und O-butyrylierten Produkt.

Beispiel 25 Herstellung von peracetyllertem Dermaten-Sulfat (IC 1950)

Das Tetrabutylammonlum-Salz des Dermatan-Sulfates (0,8g), gelöst in Dimethylformamid (20ml), wird durch Zugabe von EselgsSureanhydrid (1,2 ml), Dimethylaminopyridin (76mg) und Triethylamin (1,7 ml) acetyliert. Die Mischung wird eine Stunde lang auf eine Temperatur von 80°C erhitzt.

Nach Rückkehr zur Umgebungstemperatur wird Wasser (0,45ml) hinzugesetzt und danach eine 0,3-M-Lösung von Natriumacetat in Ethanol (100ml). Nach Zentrifugieren wird der Niederschlag in Wasser gelöst und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert.

Das Natriumsalz wird erhalten durch Austausch auf einer Harz-Kolonne Dowex 50H⁺, gefolgt von der Neutralisation mit Natriumhydroxid. Man erhä t nach Lyophilisierung das peracetylierte Dermatan-Sulfat (0,51 g).

Dieses Produkt weist ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl von 1,07meq/g auf (Ausgangsprodukt: 1,05meq/g) und enthält etwa drei Acetyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit.

Beispiel 26 Herstellung von O-acetyllertem Heparin-Benzylester (IC 1949)

Zu einer Lösung von Tetrabutylammonium-Heparinat (1 g) in Dimethylformamid (10 ml) gibt man Benzylbromid (0,17 ml). Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur setzt man Tetrabutylammonium-Acetat (220mg) hinzu. Nach weiteren 24 Stunden führt man die Acetylierung des gebildeten Benzylesters durch. Zu diesem Zweck wird Dimethylaminopyridin (57 mg) eingetragen, gefolgt von Triethylamin (1,3ml) und Essigsäureanhydrid (0,9ml).

Nach Rückkehr zur Umgebungstemperatur wird die Reaktionsmischung 24 Stunden lang gerühit. Dann wird Wasser hinzugesetzt und danach fällt man das Produkt durch eine gesättigte Lösung von Natriumacetat in Ethanol.

Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser, Passage über Dowex 50 H⁺, Neutralisation durch Natriumhydroxid und Lyophilisierung erhält man das Natriumsalz des O-acetylierten Heparin-Benzylesters (0,57g).

Das Produkt weist ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl von 3,6meq/g auf (nicht benzyliertes Ausgangsprodukt: 2,20meq/g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) weist Signale bei 23,3 (O-Acetyl) und 131,6ppm (Benzyl) auf.

Das Signal des CHa von CH₃-CO-NH bei 24,5ppm ist identisch mit dem des Ausgangsproduktes.

Beispiel 27 Herstellung von O-acetyllertem DermaUn-Sulfat-Benzylester (IC 1953)

Das Tetrabutylammonium-Salz des Dermatan-Sulfates (1 g) wird in wasserfreiem Dimethylformamid (15ml).gelöst. Zu dieser auf eine Temperatur von O⁰C gekühlten Lösung gibt man Benzylbromid (0,25 ml) und läßt anschließend 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur stehen.

Danach wird Tetrabutylammonium-Acetat (0,32g) hinzugesetzt, und nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur führt man die Acetylierung durch.

Es wird Essigsäureanhydrid (1,5ml) eingetragen, gefolgt von Triethylamin (2,2ml) und Dimethylaminopyridin (96mg). Nach 24 Stunden Stehenlassen wird Wasser (0,6ml) hinzugegeben, und danach fällt man das Produkt durch Zugabe einer gesättigten ethanolischen Natriumacetat-Lösung.

Das Produkt wird gegen 10%ige Natriumchlorid-Lösung und dann gegen Wasser dialysiert.

Men erhält nach Lyophilisierung d· η Benzylester des O-acetylierten Dermatan-Sulfates (0,63g).

Beispiel 28 Herstellung von O-butyryliertem Der. latan-Sulfat (IC 2018)

Das Tributylammonium-Salz des Dermatan-Sulfates (2g), erhalten unter den gleichen Bedingungen, wie bei der Herstellung des Tributylammonium-Heparinats in Beispiel 2 beschrieben, und das N,N-Dimethylaminopyridin (220 mg) werden in wasserfreiem Dimethylformamid (25ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C fügt man tropfenweise Buttersäureanhydrid (5,9ml) und danach Tributylamin (8,6ml) hinzu. Nach 24 Stunden Inkubation und Abkühlung auf eine Temperatur von 0°C wird Wasser (1 ml) zugegeben und dann erfolgt die Fällung in einer mit Natriumacetat gesättigten, eiskalten alkoholischen Lösung.

Der Niederschlag wird mit Ethanol gewaschen, in pyrogenfreiem Wasser gelöst und 36 Stunden lang gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung sowie 3 Tage lang gegen Wasser dialysiert. Man erhält nach Lyophilisierung das Natriumsalz des O-butyrylierten Dermatan-Sulfates (1,3g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol 51,6ppm, interner Standard) weist Signale bei 15,6; 20,5 und 38,4 ppm auf, die charakteristisch sind für die Buty ryl-Gruppe und ein Signal bei 25,2 ppm, das dem Methyl der Acetamido-Gruppe entspricht und das mit dem Ausgangsprodukt identisch ist.

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 1,05meq/g

Beispiel 29 Herstellung von O-hexanoyliortom Dermatan-Sulfat (IC 2019)

Das Tributylammonium-Salz des Dermatan-Sulfates (2g), und das Ν,Ν-Dimethylaminopyridin (220mg werden in wasserfreiem Dimethylformamid (25ml) gelöst. Nach Abkühlung auf eine Temperatur von 0°C fügt man tropfenweise' Hexanoesäureanhydrid (9,4m!) und danach Tributylamin (8,6ml) hinzu. Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Umgebungstemperatur und Abkühlung auf eine Temperatur von O⁰C wird Wasser (1 ml) zugegeben und dann erfolgt die Fällung in einer mit Natriumacetat gesättigten, eiskalten alkoholischen Lösung. Der Niederschlag wird mit absolutem Ethanol gewaschen, in pyrogenfreiem Wasser gelöst und 36 Stunden lang gegen eine 5%ige Natriumbicarbonat-Lösung sowie 3 Tage lang gegen Wasser dialysiert. Man erhält nach Lyophilisierung das Nctriumsalz des O-hexanoylierten Dermatan-Sulfates (1 g).

Das Kohlenstoff-NMR-Spektrum in D₂O (Methanol 51,6ppm, interner Standard) weist Signale bei 15,9; 24,2; 26,5; 33,1 und 36,4ppm auf, die charakteristisch sind für die O-Hexanoyl-Gruppe und ein Signal bei 25,2ppm, das dem Methyl der Acetamido-Gruppe entspricht und das mit dem Ausgangsproduke identisch ist

Verhältnis Sulfat/Carboxyl: 1,02meq/g

Beispiel 30

Erläuterung der selektiven O-Acetyllerung des Verfahrens gemiß der Erfindung und Vergleich mit anderen Acyllerungs-Vertahren

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde mit den Verfahren der Patente FR 2100735 und EP 256880 verglichen.

Insbesondere wurden die Charakteristiken der Essigsäureester des Heparins, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (IC 19:18, Beispiel 1), den Essigsäureestern des Heparins gegenübergestellt, die unter Anwendung der in dem Patent FR 2100735 (Produkt A) beschriebenen Verfahrensbedingungen erhalten wurden sowie den Essigsäureestern des Heparins, die nach den in den Beispielen 3 und 4 des Patentes EP 256880 beschriebenen Verfahrensbedingungen (Produkte B und C) hergestellt wurden.

a) Herstellung des Produkte* A

In eine Lösung von Tetrabutylammonium-Heparinat (1 g) in wasserfreiem Dimethylformamid (10ml) trägt man Dicyclohexylcarbodiimid (4,2 g), gelöst in Dimethylformamid (15 ml), ein und anschließend wird tropfenweise innerhalb von 45 Minuten und bei einer Temperatur von 4°C Essigsäure (1,16ml), gelöst in Dimethylformamid (25ml), hinzugegeben.

Nach 24 Stunden Stehenlrsson bei Umgebungstemperatur wird die Reaktionsmischung filtriert und unter Vakuum konzentriert.

Der Rückstand wird in Ether in Suspension gebracht. Nach Filtration und Waschen wird der Niederschlag gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Natriumsalz wird mittels Passage durch eine Harz-Kolonne Dowex 50H⁺, gefolgt von einer Neutralisation durch Natriumhydroxid, erhalten. Man erhält 0,493g Produkt A.

Diese Herstellung wurde ebenfalls innerhalb von 48 Stunden bei einer Temperatur von 4°C realisiert.

Herstellung der Produkte B und C

Die Produkte B und C wurden durch Acetylierung von Heparin in einer Mischung von Formamid und Pyridin durch Acetylchlorid hergestellt, unter Verwendung von 2 ml Acetylchlorid für das Produkt B und 40ml für das Produkt C und den in den Beispielen 3 und 4 des Patentes EP 256880 beschriebenen Verfahrensbedingungen. Der Essigsäureester wird dann in Wasser aufgenommen und gegen Natriumchlorid dialysiert. .

c) Ergebnisse

Die Charakteristiken der Produkte sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Die Merkmale des als Ausgangsprodukt verwendeten Heparins sind bei jedem Versuch als Referenz angegeben.

TABELLE 1

Produkt	Verhältnis	APTT-Titer»	YW-Titer·
	Sulfat/Carboxyl	ui/mg	u/mg
	(meqAj)
IC 1938	2,28	91	70
Ausg.-Hep.	2,20	160	160
A	3,40	42	41
Ausg.-Hep.	2,40	160	160
B	2,10	57	39
C	1,15	<2	0,6
Ausg.-Hep.	2,40	160	160

* Die Titer APTT und Yin und Wessler wurden In vitro gemessen.

Die Ergehnisse zeigen, daß, obwohl die Titer APTT und YW bei allen Produkten niedriger sind als beim Ausgangs-Heparin, und dies noch stärker bei den Produkten A, B und C, lediglich das Produkt IC 1938 ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl beibehält, das praktisch mit dem des Ausgangs-Heparins identisch ist. Das liegt in der Tatsache begründet, daß es das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, die Hydroxyl-Funktionen selektiv zu acylieren, ohne die Funktions-Gruppen des Heparins zu beeinflussen oder anzugreifen, was durch die chemische Analyse der Produkte bestätigt wird.

Die Produkte IC 1938, A, B und C wurden mittels Kolilenstoff-NMR-Spektrum (Methanol 51,6ppm, interner Standard) analysiert. Die Spektren dieser Produkte sowie die vom Ausgangs-Heparin sind wie folgt;

Fig. 1: Ausgangs-Heparin

Fig. 2: IC 1938

Fig.3: Produkt A nach 24 Stunden Reaktion

Fig.4: Produkt A nach 48 Stunden Reaktion

Fig.5: Produkte

Fig.6: Produkte

Die Ergebnisse sind die folgenden:

1. Das Produkt IC 1938 weist in dem Kohlenstoff-NMR-Spektrum der Figur 2 auf:

- ein Signai bei 23,4ppm, das CH3 von CH₃-CO-O entspricht,

- ein Signal bei 24,4ppm, das CH₃ von CH₃-CO-NH entspricht und identisch ist mit dem Signal des Ausgangs-Heparins. Diese Signale zeigen, daß die Amin- und Carboxylgruppen nicht angegriffen wurden und daß die selektive Acetylierung im Bereich der Hydroxylgruppen stattgefunden hat.

2. Die Analyse des Produktes A im Kohlenstoff-NMR-Spektrum zeigt, daß das überwiegend erhaltene Produkt, sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden Reaktion (Figuren 3 und 4), ein Isoharnstoff-Derivat des Heparins ist, dessen Carboxyl-Funktionen aufgrund der Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid durch eine Gruppe der Formel (X) (siehe Formelblatt) substituiert sind. Tatsächlich beobachtet man bedeutende Signale, die den Kohlenstoffatomen der oben genannten Gruppe entsprechen, bei 28,34,54 und 156ppm, sowie das Signal, das CH₃ von CH₃-CO-O entspricht, bei 23ppm, das sehr schwach ist.

Das Verfahren erlaubt es daher nicht, eine selektive O-Acylierung zu erhalten und führt zu einer Beeinträchtigung bzw. Verschlechterung der Carboxyl-Funktionen, was durch die Erhöhung des Verhältnisses Sulfat/Carboxyl widergespiegelt wird.

3. Das Produkt S weist in dem Kohlenstoff-NMR-Spektrum der Figur 2 auf:

- ein Signal bei 23,1 ppm, das CH₃ von CH₃-CO-O entspricht,

- ein Signal bei 24,8 ppm, das CH₃ von CH₃-CO-NH entspricht und das deutlich intensiver ist als das des Ausgangs-Heparins und des IC 1938.

Diese Signale zeigen, daß men nicht nur eine O-Acetylierung zu verzeichnen hat, sondern ebenfalls eine starke N-Acetylierung. Das angewendete, nicht selektive Acylierungs-Verfahren zieht eine partielle N-Desulfatierung nach sich, gefolgt von einer Acetylieriing der Amine, was ebenfalls eine Verringerung des Verhältnisses Sulfat/Carboxyl verursacht.

4. Das Produkt C weist in dem Kohlenstoff-NMR-Spektrum auf:

- ein Signal bei 22 ppm, das CH₃ von CH₃-CO-O entspricht,

- ein Signal bei 24 ppm das CH₃ von CH₃-CO-NH entspricht und das deutlich intensiver ist als das des Ausgangs-Heparins und des IC 1938.

Wie beim Produkt B beobachtet man sowohl eine O- als auch eine N-Acetylierung. Die N-Desulfatierung, beträchtlicher als boim Produkt B, verursacht eine starke Verringerung des Verhältnisses Sulfat/Carboxyl.

PHARMAKOLOGISCHEAKTIVIT/ . DER ERFINDUNGSGEMASSEN PRODUKTE

a) Atitikoagullerende Aktivität In vitro

1. Berechnung des Titers in vitro im Verhältnis zu einem Standard:

Diese Messung wurde mit Hilfe des Testes „Temps de cephaline'kaolin sensibilise" (Diagnostica Stago, Asnieres, France) auf Human-Plasma durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

TABELLE 2

Produkt	Titer (ui/mg)
IC 1940	113
IC 1941	28
IC1943	7
Heparin	160

IC 1940 = O-butyryliertes Heparin, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben IC 1941 = 0-hexanoynertes Heparin, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben IC 1943 = O-decanoyliertes Heparin, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben

Die erhaltenen Resultate zeigen, daß die selektiv O-acylierten Produkte der Erfindung In vitro einen Titer von niedriger als dem des Heparins besitzen, wobei ihre antikoagulierende Aktivität abnimmt, wenn die Länge der Acyl-Kette größer wird. 2. Messung der antikoagulierenden Aktivität der erfindungsgemäßer, Produkte In vitro auf Human-Blut: Die Versuche wurd in zwei Dosierungen der erfindungsgemäßen Produkte durchgeführt, 2Mg/ml und 4|ig/ml pro 5ml Human-Blut. Für jedes Produkt wurde gleichzeitig ein Kontrollversuch durchgeführt, unter Austausch des zu testenden Produktes durch isotonische NaCI-Lösung. Nach 30 Minuten Inkubation bei Umgebungstemperatur wird das Blut 20 Minuten lar g mit 3000U/ min zentrifugiert. Das von den Blutplättchen befreite Plasma wird dekantiert, um die Durchführung der folgenden Tests zu ermöglichen:

- TCK (Temps de Cephaiine Kaolin) mit Hilfe des Kits "Temps de cephaline kaolin sensibilise" (Diagnostics Stago, Asnieres, Fr.),

- Heptest" (Herrischem, St Louis, USA).

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angegeben. Jedes Resultat entspricht dem Mittel von drei Versuchen.

TABELLE 3

Produkt	Dosis ^g/ml)	TCK(S)	HEPTEST(S)
Kontrollo		48,00	21,50
		±2,70	±1,73
IC 1940	2	208,75	61,00
		±45,54	±8,52
IC 1940	4	428,00	101,00
		±103,43	±28,36
Kontrolle		45,00	23,66
		±5,00	±2,08
IC 1941	2	53,00	40,33
		±5,19	±7,63
IC 1941	4	84,66	61,33
		±15,01	±11,01
Kontrolle		49,66	23,00
		±8,50	±4,35
IC 1943	2	50,00	23,00
		±9,54	±4,58
IC 1943	4	56,00	24,00
		±10,00	±5,29

Die Ergebnisse zeigen bei den zwei Methoden eine Verlängerung der Koagulationszeit für die Produkte IC 1940 und IC 1941.

Diese Verlängerung ist proportional der Dosis.

Dagegen zeigt bei diesen Methoden Ir vitro das Produkt IC 1943 nur eine sehr schwache Wirkung auf die Verlängerung der Koagulationszeit.

3. Messung der antikoaguliorenders Aktivität der erfindungsgemäßen Produkte in vitro durch Thromboelastographie auf Human-Blut: Die Produkte der Erfindung, in Dosen von 2pg/ml und 4(ig/ml werden mit 5ml Human-Blut vereinigt, wie beim vorstehenden Versuch beschrieben, wobei für jedes Produkt eine Kontrolle, unter Austausch des zu testenden Produktes durch eine isotonische NaC'-Lösung, durchgeführt wurde.

Nach 30 Minuten Inkubation bei Umgebungstemperatur wird ein thromboelastographischer Anriß mit Hilfe eines Hellige-Thromboelastographen mit 0,25ml recalcifi/iertem Blut pro 0,1 ml 0,058M-CaCI₂ realisiert.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt.

TABELLE 4

Produkt	Dosis	r	k	r + k	amx	IPT
	(Mg/ml)
Kontrolle		13,00	8,25	21.25	48,00	11,25
		±0,81	±1,25	±1,50	±2,44	±2,35
IC 1940	2	33,50	22,25	55,75	35,50	2,57
		±2,88	±4,03 '	±5,85	±3,69	±0,77
IC 1940	4	78,75	44,00	122,75	27,00	0,82
		±17 34	±8,68	±13,02	±0,16	±0,27
Kontrolle		10,50	4,50	15,00	57,00	37,00
		±0,70	±2,12	±2,82	±8,48	±28,28
IC 1941	2	14,00	10,33	24,33	51,66	21,33
		±3,00	±6,50	±6,00	±10,96	±19,85
IC 1941	4	20,33	15,00	35,33	40,33	4,66
		±3,51	+4,58	±5,03	±2,51	±2,03
Kontrolle		13,33	9,00	22,33	47,00	10,33
		±2,30	±2,64	±4,93	±4,58	±4,04
IC 1943	2	12,66	8,00	20,66	47,00	12,00
		±2,08	±2,64	±4,72	±5,29	±5,29
IC 1943	4	12,66	9,83	22,50	45,66	9,33
		±2,08	±3,01	±5,07	±5,77	±4,04

r = Reaktionszeit

k = Koagulationszeit, entsprechend einer Amplitude des Anrisses von 20 mm

amx = Maximal-Amplitude

IPT - Index des thrombodynamlschen Potentials

Die Ergebnisse zeigen, daß IC 1940 und IC 1941 eine Erhöhung des r + k sowie eine Verringerung des amx und des IPT nach sich ziehen, was einer gesteigerten Hypokoagulation entspricht. Diese Hypokoagulation steigt in Abhängigkeit von der angewendeten Dosis und zugleich von der Länge der Acyl-Kette.

IC 1943 bewirkt bei diesem Test keine spürbare Veränderung der Parameter.

b) Antikoagullerende Aktivität in vivo

1. Messung der antikoagulierenden Aktivität der erfindungsgemäßen Produkte in vivo am Kaninchen (i.V.):

Die Versuche wurden an neuseeländischen, männlichen Kaninchen durchgeführt. Vor der Injektion des Produktes wurde eine Blutprobe aus der Mittelarterie des Ohres entnommen.

Dann injiziert man in die Randvene des Ohres eine Lösung des zu testenden Produktes von 25mg Produkt in 5ml isotonischer NaCI-Lösung.

Der Test von TCK und der HEPTEST" werden an dem vor der Injektion der Produkte entnommenen Blut durchgeführt sowie an den Proben, die 6,24,48 und 96 Stunden nach der Injektion entnommen wurden.

Die Ergebnisse sind in den Figuren 7 und 8 angegeben. Sie zeigen eine deutliche Verlängerung in der Zeit der antikoagulierenden Aktivität, wobei diese Verlängerung mit der Länge der Acyl-Kette ansteigt.

Tatsächlich ist diese antikoagulierende Aktivität des Produktes IC 1940 noch deutlich länger als 6 Stunden nach der Injektion vorhanden, während sie noch 24 Stunden nach der injektion beim Produkt IC 1941 besteht und sich bis auf 96 Stunden beim Produkt IC 1943 verlängert.

2. Messung der anlikoagulierenden Aktivität der erfindurigsgemäßen Produkte In vivo durch Thromboelastographie: Die zu untersuchenden Produkte wurden intravenös wie beim vorstehenden Versuch beschrieben injiziert (25mg in 5ml isotonischer NaCI-Lösung). Es wurde ein thromboelastographischer Anriß mit Hilfe eines Heilige-Thromboelastographen an 0,25 ml von Blutproben, die vor der Injektion und 6,24,48 und 96 Stunden nach der Injektion entnommen wurden, realisiert, wobei zusätzliche Proben erfolgten, wenn die antikoagulierende Aktivität langer als 96 Stunden anhielt.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5,6 und 7 aufgeführt.

Tabelle 5 Testprodukt: IC 1940

	Tabelle β	Tabelle 7	r	r	13	r	12	k	6	k	5	4	r + k	amx	IPT
Vor Injektion	Testprodukt: IC 1941	Testprodukt: IC 1943	13	135	40	60	31	27	19	67	33
eStd.nachlnj.			91	19	13	5	12	7	151	56	2,1
24Std.nachlnj.	Vor Injektion	Vor Injektion	12	22	53	3	10	34	17	67	40
96Std.nachlnj.	6Std. nachlnj.	6 Std. nach Inj.	8		112			185	11	70	77
24Std.nachlnj.	24 Std. nach Inj.			82			45
48 Std. nachlnj.	48 Std. nachlnj.		19	k	9
72 Std. nach Inj.	17	5	r + k	amx	IPT
96 Std. nach Inj.	18	67	40
168 Std. nach Inj.	166	45	2,6
192 Std. nach Inj.	31	68	11,5
32	72	25


r + k	amx	IPT
16	69	55
67	>40	-
20	72	36
87	54,5	4,7
297	>38	-
127	62	3,6
28	68	23
22	70	46

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß man bei allen Produkten einen starken Anstieg bei r + k und eine Verringerung des IPT bei

der 6. Stunde verzeichnen kann, was eine Verlängerung der Hypokcagulierbarkeit anzeigt. Diese verlängert sich noch bis auf mindestens 24 Stunden nach der Injektion beim Produkt IC 1941 und ist noch meßbar 96 Stunden nach der Injektion beim Produkt IC 1943.

Man stellt daher fest, daß alle Produkte eine starke antikoagulierende Aktivität In vivo aufweisen, daß diese Aktivität zeitlich verlängert ist und daß IC 1943, das bei den Versuchen in vitro nur gering oder gar nicht wirksam war, sich als sehr aktiv mit starker Retard-Wirkung bei den Versuchen in vivo erweist.

3. Antikoagulierende Aktivität der Produkte IC 1945, IC 1957 und IC 1958, jeweils hergestellt nach den Beispielen 12,13 und 14 und ebenfalls in vivo am Kaninchen getestet:

Die Ergebnisse zeigten eine verlängerte Pharmakokinetik für die Produkte IC 1957 und IC 1958 bei intravenöser und subkutaner Verabreichung.

c) Aktivität der Inhibierung der Viren HIV-I uri HIV-2 bei einem In-vitro-Modell

Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte wurden an einenr. Modell der Inhibierung der Viren HIV-1 und HIV-2 in vitro getestet wie in R. Pauwels et al., J. Virol. Methods, 1987,16,171-185 beschrieben.

Alle untersuchten Produkte erwiesen sich als aktiv bei Dosierungen, die von einer Cytotoxizität völlig befreit sind. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Produkte IC 1925 und IC 1926 aktiver waren eis das Ausgangsprodukt.

d) Aktivität der Inhibierung der Bildung von Syncitia bei einem In-vitro-Modell

Die Syncitia sind Riesenzellen mit multiplen Kernen, die durch Fusion von gesunden Lymphozyten T4 mit infizierten Lymphozyten T4 gebildet werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte wurden in einem Modell dor Co-Kultur von MOLT4-Zellen (gesunde Lymphozyten T4) und von HUT-78/HTLVIII B-Zellen (infizierte Lymphozyten T4 der Human-Linie) getestet.

Alle untersuchten Produkte erwiesen sich als aktiv in diesem Modell bei Dosierungen, die von einer Cytotoxizität völlig befreit sind. Insbesondere waren die Produkte IC 1924, IC 1925 und IC 1926 aktiver als das Ausgangsprodukt.

e) Aktivität der Inhibierung von verschiedenen umhüllten Viren bei einem In-vitro-Modell

Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten Produkte gegenüber der Inhibierung verschiedener umhüllter DNA- oder RNA-Viren, insbesondere der folgenden Viren:

- HSV 1 und 2 (Herpes simplex virus 1 und 2, DNA-Viren)

- VSV (Vasicular stomatitis virus, RNA-Virus)

- Sindbis Virus, RNA-Virus

Alle untersuchten Produkte erwiesen sich als aktiv bei der Inhibierung dieser Viren in Dosen, die von einer Cytotoxizität befreit sind. Insbesondere wiesen die Produkte IC 1924, IC 1925 und IC 1926 eine stark gesteigerte Aktivität gegenüber dem VSV und dem Sindbis Virus im Vergleich zum Ausgangsprodukt auf.

f) Aktivität der Inhlolorung der Proliferation von Zellen glatter Muskel bei einem In-vlvo-Modell

Die erfindungsgemäß hergestellten Pioduktewurden in einem Modell der Inhibierung der Proliferation von Zellen glatter Muskel

an der Ratte In vivo getestet (Modell des Ballon-Katheters wie beschrieben in A. W. Clowes et M. M. Clowes, Labor. Investig., 1985,[6], 612-616).

Die untersuchten Produkte erwiesen sich als aktiv. Insbesondere die Produkte IC 1924, IC 1925 und IC 1926 zeigten eine

gesteigerte Aktivität im Verhältnis zum Auspangsprodukt.

Bericht Ober das Ergebnis der Prüfung auf Schutzfähigkeit und Bewertung der technisch-ökonomischen Effektivität Zu 1) Eine Recherche wurde ausgeführt vom Institut Nationale de la Propriete Industrielle in Frankreich. Recherchiert wurde in der Patentliteratur, Internationale Klassen C08B sowie in Chemical Abstracts und Patent Abstracts

von Japan.

Ermittelt wurden folgende Veröffentlichungen: FR-M- 3066 (ROUSSEL-UCLAF) Chemical Abstracts Vol.75,1971, page 100, no. 7782a Vol. 77,1972, pages 371-372, no. 24821 j Zu 2) Der Patentanmeldung liegen weiterhin folgende Veröffentlichungen zugrunde:

JP-PS	5128602
JP-PS	74/048533
FR-N 2	159724
FR-PS	2100735
FR-PS	2159724
US-PS	4 281108
US-PS	4692435
US-PS	4686288
EP-PS	37319
EP-PS	40144
EP-PS	44228
EP-PS	46828
EP-PS	121067
EP-PS	215453
EP-PS	216453
EP-PS	244235
EP-PS	244 236
EP-PS	256880

Nagasawa, K., und Y. Inoue, Methods in Carbohydrate Chemistry, Academic Press, 1980, Vol.8, S.291-294

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Ynietal.,

J. Lab. Chim. Med. 1973,81,298-310

Glucosaminoglycano sind bereits bekannt. Man versteht darunter Substanzen, die aus Uronsäure-Ketten (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) und Aminozuckern gebildet werden, wobei diese letzteren Glucosamine oder Galactosaminesind.

Die Glucosaminoglycane natürlichen Ursprungs bestehen aus mehr oder weniger homogenen Mischungen von Verkettungen von Disaccharid-Einheiten, die gebildet werden durch eine Uron-Untereinheit (Glucuronsäure oder Iduronsäure) und durch eine Osamin-Untereinheit (Glucosamin oder Galactosamin), wobei sie über eine 1-4-Bindung oder eine 1-3-Bindung miteinander verbunden sind.

Bei den Glucosaminoglycanen sind die Hydroxyl-Gruppen verschieden durch funktioneile Gruppen substituiert, insbesondere durch Sulfat-Gruppen und die Amino-Gruppen der Osamine ebenfalls durch Sulfat- und/oder Acetyl-Gruppen.

Die Glucosaminoglycane umfassen verschiedene Produkttypen, wie z.B. Heparin, Heparin-Sulfat, Chondroitin-Sulfat-A, Chondroitin-Sulfat C, Chondroitin-Sulfat B, bezeichnet als Dermatan-Sulfat, und Hyaluron-Säure.

Es ist weiterhin bekannt, daß die Glucosaminoglycane zahlreiche biologische Aktivitäten aufweisen, insbesondere eine Wirksamkeit gegenüber den Koagulations-Faktoren, die über vermittelnde, unterschiedliche plasmatische Proteine wirken. Die Glucosaminoglycane bilden auch einen Teil der großen Familie dor Polysaccharide, von denen einige in mehr oder weniger bedeutendem Ausmaß eine antivirale Aktivität aufweisen.

Die natürlichen Glucosaminoglycane weisen neben ihren interessanten pharmakologischen Aktivitäten nur eine relativ kurze Halbwertzeit auf, was bei wiederholten Verabreichungen deutlich wird.

Diese Nachteile wurden verbessert durch zahlreiche Glucosaminoglycan-Derivate, die in der Weise modifiziert sind, daß ihre Pharmako-Kinetik verbessert ist, insbesondere Ester der Carbonsäure-Funktion der Uron-Säuren oder der Hydroxyl-Funktionen.

Bekannt sind auch d'e teilweise oder vollständige Veresterung der Carbonsäure-Funktionen des Heparins, die Veresterung von Glucosaminoglycanen an ihren primären oder sekundären Hydroxyl-Funktionen und viele andere.

Zu 3) Das erfindungsgemäße Verfahren wird angewandt in der pharmazeutischen Industrie auf dem Gebiet der Arzneimittelsynthese.

Zu 4) Erfindungsgemäß werden neue spezifischere Glucosaminoglycane zur Verfügung gestellt, deren biologische Aktivität wesentlich höher ist, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung, das eine gute Reproduzierbarkeit gewährleistet. Die erfindungsgemäßen, selektiv O-acylierten Verbindungen weisen In vivo eine verlängerte Aktivität auf. Wenn diese Verbindungen beispielsweise solche vom Heparin-Typ sind und eine antithrombotische Aktivität ausüben, so ist diese Wirkung deutlich verlängert gegenüber zur gleichen Verbindung, die nicht O-acyliert wurde.

Die erfindungsgemäßen, selektiv O-acylierten Heparin-Derivate weisen ebenfalls verschiedene biologische Aktivitäten auf, insbesondere:

- Inhibierung der Proliferation der Zellen glatter Muskel, die von großem Interesse ist für die Vermeidung der Restenosen bei Eingriffen, wie der Angioplastie, By-pass-Operationen, venösen und arteriellen Transplantationen, Organtransplantationen, insbesondere Herztransplantationen,

- antivirale Eigenschaften, insbesondere gegen Retroviren, besonders gegenüber den verschiedenen H/V- (Human-Immunodefizienz-) Virus, was großes Interesse bei der Behandlung von AIDS hat,

- Eigenschaften zur Behandlung von Leukozyten-Elastase, zur Erhöhung des Kreislaufgrades von Elastase-Inhibitoren sowie der selektiven Inhibierung der Synthese von Typ-Ill-Collagen und von Fibronectin, geeignet für die Behandlung von Krankheiten wie Emphysem, sowie von degenerativen Krankheiten des Bindegewebes wie Arteriosklerose und Diabetes.

Die erfindungsgemäßen selektiv O-acyxlierten Glucosaminoglycane sind daher hervorragend geeignet als Wirkstoff für Medikamente mit großer Bedeutung für zahlreiche Indikationen.

Zu 5) Versuchsergebnisse bezüglich der pharmakologischen Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen sind auf den Seiten 54 bis 62 der Anmeldungsunterlagen angegeben.

2 8 5 6 O 6

(A)

CH₂OH

0 -

(B)

I.

CH₀OH

CH₂OK

COO

/coo"

OSO.

CH₂OH

NHR

(C)

Claims

1. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane der allgemeinen Formel (I) (siehe Formel blatt), in der

- G eine Gruppe der Formel (a) oder eino Gruppe der Formel (a') oder eine Gruppe der Formel (b) darstellt

- A eine Gruppe R₁, eine Gruppe der Formel R₁-(C), eine Gruppe der Formel RHd) oder eine Gruppe der Formel (e) oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, darstellt,

- B eine Gruppe 0-R₁, eine Gruppe der Formel (aJ-ORv eine Gruppe der Formel (a'J-OR,, eine Gruppe der Formel (b)-ORv eine Gruppe der Formel (f) oder eine Gruppe der Formel (g) darstellt, oder eine Gruppe der Formel (a), eine Gruppe der Formel (a') oder eine Gruppe der Formel (b) bedeutet, deren Reste mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden sind,

• einer Alkanoyl-Gruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen,

• einer Alkancyl-Gruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, substituiert durch:

- eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen,

- eine Phenyl-Gruppe, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Alkyl-Radikale mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, durch Halogenatome oder die Gruppen NO₂ oder OCH₃,

• einer Benzoyl-Gruppe, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Alkyl-Radikale mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, durch Halogenatome oder die Gruppe NO₂ oder OCH₃,

• einer Cycloalkyl(3-7 O-carbonyl-Gruppe,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist,

wobei R₁ in einem Verhältnis von mindestens 0,1 bis 3 Acyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit, vorzugsweise 0,5 bis 2 Gruppen, acyliert ist; sowie ihre pharmazeutisch akezptablen Salze.

2. SeleKiiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der -- A die Bedeutungen von Anspruch 1 besitzt,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B Gruppen der Formeln Ja)-OR₁ oder (f), (a) und (f), wie sie in Anspruch 1 definiert sind, oder OR₁ darstellt, oder eine Gruppe der Formel (a) bedeutet, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gnfolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden ist,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist, unterdem Vorbehalt, daß, wenn A R₁, eine Gruppe der Formel R₁-(C) oder eine Gruppe der Formel RHd) darstellt und B 0-R₁, eine Gruppe der Formel (8J-OR₁ oder eine Gruppe der Formel (b)-ORi bedeutet, η eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist.

3. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A, B, R₁, R₂ und η die Bedeutungen von Anspruch 2 besitzen,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation darstellt.

4. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A, B, R₁, R₂ und η die Bedeutungen von Anspruch 2 besitzen,

- R3 ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radika! mit? bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt.

5. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A die Bedeutungen von Anspruch 1 besitzt,

- R₁ Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eine Acyl-Gruppe darstellt, wobei Acyl der Rest einer nicht a-ß-ungesättigten Carbonsäure oder Dicarbonsäure ist, ausgewählt unter:

• einer Alkanoyl-Gruppe mit 4 bis 18 Kohlenstoffatomen,

• einer Alkanoyl-Gruppe mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, substituiert durch:

- eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen,

• einer Cycloalkyl (3-7C)-carbonyl-Gruppe,

- R₂ SO₃- und/oder ein Acetyl-Radikal darstellt, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn R₁ ein Acetyl-Radikal bedeutet, '

- R₃ ein Wasserstoffatom orl' ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, 0 einPhenyl-alkyl-Radikalmit7bis12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder ErdalkaLnetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist,

wobei R₁ in einem Verhältnis von mindestens 0,5 bis 2 Acyl-Gruppen pro Disaccharid-Einheit, vorzugsweise 1 Gruppe, acyliert ist.

6. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A, B, R₁, R₂ und η die Bedeutungen von Anspruch 5 besitzen,

- R₃ ein Wasserstcffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation darstellt.

7. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (II) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A, B, R₁, R₂ und η die Bedeutungen von Anspruch 5 besitzen,

- R₃ ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellt.

8. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucosaminoglycan aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer Molmasse von unterhalb 10000 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragnvjnten mit einer mittleren Molmasse, die zwischen 2000 und 7000 Dalton liegt,

einer Mischung von Heparin-Fragrr ^n mit einer mittleren Molmasse von etwa 4500 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragrnenten mit einer mittleren Molmasse von etwa 2500 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten, die im Hinblick auf ihre Molmasse homogen sind, einem durch Synthese erhaltenen Heparin-Fragment, das teils, was seine Molmasse betrifft und teils, was seine Funktionalisierung betrifft, homogen ist;

wobei die Acyl-Gruppe in einem Verhältnis von mindestens 0,1 bis 3 Gruppen, vorzugsweise von 0,5 bis 2 Gruppen, pro Disaccharid-Einheit vorliegt.

9. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucosaminoglycan Heparin ist, wobei die Acyl-Gruppe in einem Verhältnis von mindestens 0,5 bis 2 Gruppen, vorzugsweise von 1 Gruppe, pro Disaccharid-Einheit vorliegt.

10. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (IM) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A R₁ oder eine Gruppe der Formel RHc) oder eine Gruppe der Formol R₁-(O¹), wie in Anspruch 1 definiert, darstellt,

- R₁ Wasserstoff und/oder SO₃- und/oder eine Acyl-Gruppe, wie in Anspruch 1 definiert, bedeutet,

- R2 SO₃- und/oder ein Acetyl-Radikal darstellt, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn R₁ ein Acetyl-Radikal bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom und/oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall-oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 3 bis 12 ist.

11. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formol (IV) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- R₁ Wasserstoff und/oder SO3-und/oder eine Acyl-Gruppe, wie in Anspruch 1 definiert, bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom und/oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B eine Gruppe der Formel (a)-ORi, wie in Anspruch 1 definiert, oder OR₁ darstellt,

- η eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist.

12. Selektiv O-acetylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucosaminoglycan ausgewählt wird unter Heparin, einer Fraktion oder einem Heparin-Fragment, die von ihrer Bindungslage zu Antithrombin III befreit sind.

13. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1,2,5 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (V) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A eine Gruppe der Formel R₁-(C), eine Gruppe der Formel RHd) oder den Rest der Gruppe (c) oder der Gruppe (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, darstellt,

- B eine Gruppe der Formel (8J-OR₁ oder eine Gruppe der Formel (a) bedeutet, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden ist,

- R₁ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R₂ SO₃- oder ein Acetyl-Radikal darstellt, wobei das Verhältnis von SO₃- etwa 90% beträgt,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist.

14. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1,2,5 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß sia der allgemeinen Formel (Vl) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A R₁, eine Gruppe der Formel Ri-(c), eine Gruppe der Formel R₁-Jd) oder den Rest von (c) oder von (d) nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung, darstellt,

- U eine Gruppe der Formel (Vl') bedeutet, oder, im Verhältnis von einer Gruppe pro zwei Ketten mindestens, eine Uronsäure (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure) darstellt, die nicht sulfatiert und zwischen den Kohlenstoffatomen in Position 2 und 3 offen ist und der allgemeinen Formel (Vl") entspricht,

- B eine Gruppe der Formel (8J-OR₁ oder OR₁ oder eine Gruppe der Formel (a) darstellt, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung, vorliegt, verbunden ist,

- Ri die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt,

- R₂ SO₃- oder ein Acetyl-Radikal darstellt, wobei das Verhältnis von SO₃- mindestens etwa 90% beträgt,

' - R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 2 bis 18 ist.

15. Selektiv O-acetylierte Giucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1,2,5 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (Vl) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- η eine ganze Zahl von 7 bis 15 für die Mehrzahl der Spezien ist,

- R₁ ein Alkanoyl-Radikal mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorteilhafterweise 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, darstellt.

16. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Mischung von Fragmenten bestehen, die im Minblick auf ihre Molmasse homogen sind und in denen η eine ganze Zahl von 2 bis 12 ist.

17. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1,2,5 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (VII) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A R₁, eine Gruppe der Formel Ri-(c) oder eine Gruppe der Formel Ri-(d), wie sie bei der Formel (I) definiert sind, darstellt,

- R₁ ain Alkanoyl-Radikal mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein. Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation darstellt,

- B eine Gruppe der Formel Ia)-OR₁, wie bei der Formel (I) definiert, oder OR₁ bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist.

18. Selektiv O-acetylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (VIII) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A die Bedeutungen von Anspruch 1 besitzt,

- R₁ Wasserstoffund/oderSOa-und/odereinewieinAnspruch 1 definierteAcyl-Gruppedarstellt,

- R₃ ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-RadikaJ mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder ein Phenyl-alkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- B Gruppen der Formeln (b)-ORi oder (g), wie bei der Formel (I) definiert, oder OR₁ oder eine Gruppe der Formel (b) darstellt, deren Rest mit einem Rest von (c) oder von (d), wie er nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, vorliegt, verbunden ist,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist.

19. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (VIII) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A, B, R₁ und η die in Anspruch 18 angegebenen Bedeutungen besitzen,

20. Selektiv O-acetylierte Glucosaminoglycane nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie der allgemeinen Formel (VIII) (siehe Formelblatt) entsprechen, in der

- A, B, R₁ und η die in Anspruch 18 angegebenen Bedeutungen besitzen,

21. Selektiv O-acylierte Glycosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1,18,19 und 20, dadurch gekennzeichnet, däß das Glucosaminoglycan ausgewählt wird aus der durch Dermatansulfat und seinen Fragmenten oder Chondroitin-4- und 6-sulfaten und ihren Fragmenten gebildeten Gruppe, wobei die Acyl-Gruppe in einem Verhältnis von mindestens 0,1 bis 3 Gruppen, vorzugsweise von 0,5 bis 2 Gruppen, pro Disaccharid-Einheit vorliegt.

22. Selektiv O-acylierte Glucosaminoglycane nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21, in denen R₁ ein Alkanoyl-Radikal mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.

23. Verfahren zur Herstellung von selektiv O-acylierten Glucosaminoglycanen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man (1) ein Glucosaminoglycan der allgemeinen Formel (IX) (siehe Formelblatt), in der

- G⁰ eine Gruppe der Formel (a)° oder eine Gruppe der Formel (a')° oder eine Gruppe der Formel (b)° darstellt, ..,

- U° eine Gruppe dar Formel (c)° oder eine Gruppe der Formel (d)° oder den Rest der Gruppe (c)° oder der Gruppe (d)° nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, bedeutet,

- A⁰ eine Gruppe R₁ ⁰, eine Gruppe der Formel R₁Mc)⁰, eine Gruppe der Formel R₁Md)⁰ oder eine Gruppe der Formel (e)° oder den Rest der Gruppe (c)° oder der Gruppe (d)° nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eliminierung oder einer sauren Hydrolyse, darstellt,

- B⁰ eine Gruppe OR₁ ⁰, eine Gruppe der Formel (3JM)R₁ ⁰, eine Gruppe der Formel (3'J-OR₁ ⁰ oder eine Gruppe der Formel (f)° oder eine Gruppe der Formel (g)° darstellt, oder die Gruppen (a)°, (a')° oder (b)° bedeutet, deren Reste mit einem Rest von (c)° oder von (d)°, wie sie nach periodischer Oxidation, gefolgt von einer ß-Eleminierung oder einer sauren Hydrolyse vorliegen, verbunden sind,

- R₁ ⁰ Wasserstoff oder SO₃-darstellt,

- R2 SO3- oder ein Acetyl-Radikal bedeutet, unter dem Vorbehalt, daß das Verhältnis von N-Acetyl-Glucosamin höchstens gleich dem von Heparin ist, wenn Ri ein Acetyl-Radikal bedeutet,

- R3 ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein Phenylalkyl-Radikal mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, oder ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Kation bedeutet,

- η eine ganze Zahl von 1 bis 80 ist,

in ein Salz des genannten Glucosaminoglycans umwandelt, das in polaren aprotischen organischen Lösungsmitteln löslich ist;

(2) dieses Salz mit einem Anhydrid der Formel:

Acyl -O- Acyl

in der Acyl wie in Anspruch 1 definiert ist, in dem genannten polare:« aprotischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer katalytischer) Menge von Pyridin oder eines Dialkylamiriopyridins und eines Protonen-Akzeptors behandelt;

(4) das selektiv O-acylierte Glucosaminoglycan durch Auflösung des erhaltenen Niederschlages in Wasser und durch Dialyse isoliert, und gegebenenfalls das auf diese Weise erhaltene Natriumsalz des selektiv O-acylierten Glucosaminoglycans in ein anderes pharmazeutisch akzeptables Salz überführt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Stufe (1) eingesetzte Glucosaminoglycan ausgewählt wild aus der durch Heparin, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer Molmasse von unterhalb 10000 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer mittleren Molmasse, die zwischen 2000 und 7000 Dalton liegt, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer mittleren Molmasse von etwa 4500 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten mit einer mittleren Molmasse von etwa 2500 Dalton, einer Mischung von Heparin-Fragmenten, die im Hinblick auf ihre Molmasse homogen ist und einem durch Synthese erhaltenen Heparin-Fragment, das teils, was seine Molmasse betrifft und teils, was seine Funktionaüsierung betrifft, homogen ist, gebildeten Gruppe.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Stufe (1) eingesetzte Glucosaminoglycan Heparin, eine Fraktion oder ein Heparin-Fragment ist, die von ihrer Bindungslage zu Antithrombin III befreit sind.

26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Stufe (1) eingesetzte Glucsaminoglycan ausgewählt wird aus dor durch Dermatansulfat und seinen Fragmenten oder Chondroitin-4- und 6-sulfat und seinen Fragmenten gebildeten Gruppe.

27. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Glucosaminoglycan der Stufe (1) das Salz eines tertiären Amins, insbesondere ein Tributylamin-SaIz, oder ein quatemäres Ammoniumsa'z, insbesondere ein Tetrabutylammonium-Salz, ist.

28. Verfahren nach irgendeinem der Ansprache 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Stufe (2) eingesetzte Anhydrid das Anhydrid einer Alkanoe-Säure mit2 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorteilhafterweise 4 bis 10 Kohlenstof/atomen, vorzugsweise 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, ist.

29. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (2) in einem polaren aprotischen Lösungsmittel durchgeführt wird, ausgewählt aus der durch Dimethylformamid, Hexamethylphosphortriamid, Pyridin oder einer Mischung dieser Lösungsmittel untereinander oder mit Dichlormethan, gebildeten Gruppe.

30. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man als Deprotonenakzeptor in der Stufe (2) eine Base verwendet, ausgewählt aus der durch Pyridin, Triethylamin und Tributylamin gebildeten Gruppe.

31. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse der Stufe (4) in Anwesenheit einer schwachen Base durchgeführt wird.

32. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (2) bei einer Temperatur zwischen 0⁰C und 100⁰C, insbesondere zwischen 50⁰C und 100⁰C, durchgeführt wird.

33. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff eine wirksame Menge von mindestens einem selektiv O-acylierten Glucosaminoglycan nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Trägerstoff, enthält.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das selektiv O-ac/lierte Glucosaminoglycan in Form "eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes, wie eines Natrium-, Magnesium- oder Calcium-Salzes, vorliegt.

35. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, daß der pharmazeutische Trägerstoff für die Verabreichung auf oralem Weg geeignet ist und daß er in Form von magenresistenten Kapseln, Tabletten, Täfelchen oder Pillen vorliegt, oder auch in Form von trinkbaren Lösungen, wobei er vorteilhafterweise 50mg bis 5g pro Einheitsdosis, vorzugsweise 100 bis 1000 mg für Kapseln, Tabletten oder Pillen, und 10 bis 150 mg für trinkbare Lösungen, umfaßt.

36. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer sterilen oder sterilisierbaren, injizierbaren Lösung für die Verabreichung auf intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Weg vorliegt, wobei diese Lösungen vorteilhafterweise 50 bis 200mg/ml selektiv O-acyliertes Glucosaminoglycan umfassen, wenn sie für die Injektion auf subkutanem Weg bestimmt sind, oder 20 bis 200mg/ml selektiv O-acyliertes Glucosaminoglycan, wenn sie für die Injektion auf intravenösem Weg oder die Perfusion vorgesehen sind.

37. Pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 33 bis 36 für die Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten, die mit umhüllten Viren verbunden sind.

38. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36 für die Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten, die mit Retroviren, wie AIDS, verbunden sind.