DE69925821T2

DE69925821T2 - Zusammensetzungen enthaltend Heparin mit niedrigem Molekülargewicht

Info

Publication number: DE69925821T2
Application number: DE69925821T
Authority: DE
Inventors: Jean Mardiguian
Original assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Current assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2019-10-14
Also published as: DK1070503T3; ATE309693T1; PT1070503E; EP1070503B1; ES2161615B1; US6384021B1; EP1070503B8; ES2244165T3; BR9905820A; ES2161615A1; DE69925821D1; EP1070503A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Heparinzusammensetzungen mit niedrigem Molekulargewicht (LMWH), die Fragmente oder Oligosaccharide umfassen.
Heparin ist ein Mucopolysaccharidsulfat tierischen Ursprungs, das aus dem Darm oder der Lunge von Säugetieren (Kuh, Schaf, Schwein) extrahiert und bereits seit einiger Zeit in der menschlichen Therapie zur Verhütung und Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen verwendet wird. Es ist hinlänglich bekannt, dass die Verwendung von Heparin von sehr schlimmen hämorrhagischen Effekten begleitet wird und ihre tägliche Verabreichung, drei subkutane oder intravenöse Injektionen, bedeutet einen sehr erheblichen Nachteil.
Im Laufe der letzten Jahre wurden verschiedene chemische Methoden zum Depolymerisieren von Heparin angewendet, wie z.B.:

– Behandlung von Natriumnitrid in einem sauren Medium
– Alkalibehandlung von Estern
– Verwendung von freien Radikalen, die in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid erzeugt wurden
– Behandlung eines quartären Ammoniumsalzes von Heparin in nichtwässrigem Medium mit einer starken Base gemäß einem Beta-Eliminierungsmechanismus.

Mit diesen Methoden können variable Erträge erzielt werden, Gemische von Heparinfragmenten, in denen das durchschnittliche Molekulargewicht und die Antikoagulationsaktivität je nach dem Verfahren und den Arbeitsbedingungen variieren. Die im Stand der Technik beschriebenen oder handelsüblichen Beparine mit niedrigem Molekulargewicht (LMWH) werden mit unterschiedlichen Depolymerisationsverfahren erhalten. Ihr durchschnittliches Molekulargewicht (Mw) liegt zwischen 4000 und 6000 Dalton.
Es wird derzeit anerkannt, dass die Antithromboseaktivität von LMWHs hauptsächlich auf ihre Kapazität zurückzuführen ist, Anti-Thrombin III zu aktivieren, ein Plasmaprotein und potenter Inhibitor von aktiviertem Faktor X und Thrombin. Auf diese Weise kann die Anti-Thromboseaktivität von Heparin mit Hilfe von Tests gemessen werden, die für die Inhibition dieser Faktoren spezifisch sind.
Von unterschiedlichen Autoren in den letzten Jahren durchgeführte Forschungsarbeiten zeigen, dass Fragmente oder Oligosaccharide von Heparin, die aus kurzen Ketten mit mittlerem Molekulargewicht von < 4800 Dalton bestehen, eine selektive Aktion auf aktiviertem Faktor X und nur einen geringen Effekt auf die globale Koagulation haben, die mit Methoden der Pharmakopöe gemessen werden.
Das Dokument 370 644 (Choay et al. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1981) beschreibt die chemische Struktur eines Hexasaccharids und eines Octasaccharids mit vorgeschlagenen Strukturen. Die Produkte gemäß diesem Dokument haben eine Anti-Xa-Aktivität zwischen 2100 und 2400 U/mg.
Die Dokumente US-A-4 981 955 und US-A-5 576 30 betreffen ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Heparinderivaten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 4000 und 6000 Dalton.
Das Dokument WO 98/55515 offenbart modifizierte Heparinderivate mit niedrigem Molekulargewicht; ihr durchschnittliches Molekulargewicht liegt zwischen 5000 und 9000 Dalton und ihre Antifaktor-IIa-Aktivität liegt zwischen 40 und 100 U/mg.
Das Dokument EP-A-0 293 539 betrifft eine Antithrombosezusammensetzung, die ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht und Dermatansulfat umfasst. Ihr durchschnittliches Molekulargewicht beträgt etwa 5000 Dalton.
Es wurde gefunden, dass es dort, wo Fragmente mit sehr niedrigem Molekulargewicht benötigt werden, die eine stärkere Antifaktor Xa Aktivität benötigen, bevorzugt wird, eine selektive Depolymerisationstechnik in einem nichtwässrigen Medium anzuwenden, wie im Patent USP 9,981, 955 beschrieben ist, bei der kein Risiko eines Angriffs auf den Bindungsort von Anti-Thrombin III besteht.
Angesichts des oben beschriebenen Hintergrunds und Standes der Technik hat die vorliegende Anmeldung, mittels eines Verfahrens in einem nichtwässrigen Medium, die kontrollierte Depolymerisation von Heparin entwickelt, mit der eine neue LMWH-Familie erhalten werden kann, die reich an Oligosacchariden mit niedrigem Molekulargewicht ist, die eine hohe Antifaktor Xa Aktivität und eine niedrige Antifaktor IIa Aktivität hat und die durch die folgende allgemeine Formel repräsentiert werden kann:
wobei:
n zwischen 1 und 12 variieren kann
R₁= H oder SO₃Na ist
R₂ = SO₃Na oder COCH₃ ist
Das genannte Heparin mit sehr niedrigem Molekulargewicht wird durch selektives Depolymerisieren des Heparins in einem nichtwässrigen Medium mit einem Beta-Eliminationsverfahren erhalten.
Die Heparinzusammensetzungen mit sehr niedrigem Molekulargewicht gemäß der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass ihr Molekulargewicht zwischen 2000 und 4000 Dalton liegt, dass ihre Antifaktor Xa Aktivität wenigstens 100 N/mg beträgt und vorzugsweise zwischen 100 und 150 N/mg liegt, und dass sie einen großen Anteil, bis zu 75%, an Oligosacchariden mit niedrigem Polymerisationsgrad enthalten, die von Hexasaccharid (n = 1) bis zu Dodecasaccharid (n = 4) gehen. Diese Zusammensetzungen sind bei der Prophylaxe und Behandlung von venösen und arteriellen Thrombosen nützlich. Sie können als Anti-Thrombosemedikament eingesetzt werden.
Die bekannten und handelsüblichen LMWHs enthalten kleine Anteile an Oligosacchariden mit niedriger Molekülmasse, insbesondere die Oligosaccharide, deren Polymerisationsgrad von Hexasaccharid zu Dodecasaccharid geht.
Die Haupteigenschaft der mit der vorliegenden Erfindung erhaltenen Heparinzusammensetzungen ist die Tatsache, dass sie einen großen Anteil, bis zu 75%, solcher Oligosaccharide enthalten. Ferner haben diese Oligosaccharide eine hohe Antifaktor Xa Aktivität (> 100 IU/mg), so dass sie eine lang andauernde und hohe Antithromboseaktivität erhalten. Die genannten Heparinzusammensetzungen haben eine Antifaktor Xa Aktivität, die zwischen 100 und 150 LU/mg liegt, und eine Antifaktor IIa Aktivität von gleich oder kleiner als 10 IU/mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht der Heparinzusammensetzungen der vorliegenden Anmeldung liegt zwischen 2000 und 4000 Dalton und weil sie:

– 25 bis 60% Oligosaccharide mit einem Molekulargewicht von weniger als 2000 Dalton enthalten;
– 40 bis 75% Oligosacchardie mit einem Molekulargewicht zwischen 2000 und 6000 Dalton enthalten; und
– weniger als 15% Oligosaccharide mit einem Molekulargewicht über 6000 Dalton enthalten.

Die Heparinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bestehen aus Gemischen von Oligosacchariden oder Heparinfragmenten. Der Prozentanteil der Fragmente, die Teil der vorliegenden Erfindung bilden, lauten wie folgt:

– weniger als 10% Gehalt an Fragmenten, wobei n zwischen 10 und 12 liegt;
– 80 bis 90% Gehalt an Fragmenten, wobei n zwischen 1 und 6 liegt; und
- weniger als 15% Gehalt an Fragmenten, wobei n zwischen 7 und 9 liegt.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele illustriert, wobei diese Beispiele den Umfang der Erfindung jedoch nicht begrenzen.
Das Molekulargewicht (Mw), die Molekularverteilung sowie die Antifaktor Xa und Antifaktor IIa Aktivitäten wurden mit Techniken ermittelt, die im Monograph Nr. 828 „Heparin of low molecular weight" der dritten Ausgabe der Europäischen Pharmakopöe beschrieben sind.
1. BEISPIEL:
Nach dem Auflösen von 1 kg unfraktioniertem Natriumheparin in 7 Litern gereinigtem Wasser werden 4,4 Liter einer Lösung aus Benzalkoniumchlorid in Wasser bei 50% w/v unter ständigem Rühren zur Heparinlösung gegeben.
Wasser wird zugegeben, bis ein Volumen von 30 Litern erreicht ist, und dekantieren gelassen.
Als Nächstes wird der Überstand beseitigt und Wasser wird zugegeben, um wieder ein Volumen von 30 Litern zu erhalten, und dekantieren gelassen.
Nach dem Dekantieren wird der Überstand entnommen und das Präzipitat liophilisiert. Es werden etwa 2,7 kg Benzalkoniumsalz von Heparin erhalten (Produkt A).
Nach dem Auflösen von 100 g Produkt A in 300 ml Dichlormethan wird Triton B^® in drei Portionen zugegeben:

– 25 ml Triton B^® werden zugegeben und das Gemisch 8 Stunden lang bei 25°C stehen gelassen
– 25 ml Triton B^® werden zugegeben und das Gemisch 16 Stunden lang bei 25°C stehen gelassen
– 25 ml Triton B^® werden zugegeben und das Gemisch 8 Stunden lang bei 25°C stehen gelassen

Die obige Lösung wird über 600 ml Natriumacetatlösung in Methanol bei 10% w/v ausgefällt und das Präzipitat wird durch Zentrifugation mit einer Methanolwäsche aufgefangen.
Das erhaltene Produkt wird in 500 ml Wasser aufgelöst, mit 0,1 N HCl neutralisiert, und Natriumchlorid wird zugegeben, bis eine Konzentration von 10% w/v erreicht ist. Die Ausfällung erfolgt durch Zugabe von 1,25 Litern Methanol.
Als Nächstes wird das Präzipitat durch Filtrationswäsche mit Methanol aufgefangen und unter Vakuum bei 35°C getrocknet, so dass 33 g Produkt B erhalten werden, das in Wasser bei 10% w/v aufgelöst wird.
Die Temperatur wird auf 25°C gebracht und Natriumchlorid wird bis zu einer Konzentration von 10% w/v zugegeben. Die Ausfällung erfolgt durch Zugabe von 2,5 Volumen Methanol. Das Präzipitat wird dann durch Filtrationswäsche mit Methanol aufgefangen und in Vakuum bei 35°C getrocknet, so dass 26 g gereinigtes Produkt erhalten werden, das in Wasser bei 5% w/v aufgelöst wird.
Der pH-Wert wird mit 0,1 N HCl auf 6,6 eingestellt und Natriumchlorid wird bis zu einer Konzentration von 5% w/v zugegeben.
Die Ausfällung erfolgt durch Zugabe von 0,8 Volumen Methanol.
Nach dem Auffangen des Präzipitats durch Filtrationswäsche mit Methanol wird das Produkt in Vakuum bei 35°C getrocknet.
Der Überstand wird mit 1,6 Volumen Methanol ausgefällt.
Dieses Präzipitat wird durch Filtrationswäsche mit Methanol und Trocknen in Vakuum bei 35°C aufgefangen.
Am Ende des Vorgangs erhält man 22 g Produkt.
2. BEISPIEL:
Das Verfahren zum Erhalten von Produkt B im 1. Beispiel wird wiederholt. 20 g Produkt B werden in 150 ml Wasser aufgelöst und es werden 100 ml Benzalkoniumchloridlösung in Wasser bei 50% w/v zugegeben.
Als Nächstes wird Wasser zugegeben, um ein Gemisch mit einem Volumen von 500 ml zu erhalten. Das Gemisch wird dekantieren gelassen.
Nach dem Dekantieren wird der Überstand beseitigt, Wasser wird zugegeben, um wieder ein Volumen von 500 ml zu erreichen, und das Gemisch wird dekantieren gelassen.
Nach dem Abziehen des Überstands wird das Präzipitat liophilisiert, um 50 g Benzalkoniumsalz zu erhalten.
20 g des erhaltenen Salzes werden in 60 ml Dichlormethan aufgelöst.
5 ml Triton B^® werden zugegeben und das Gemisch wird 8 Stunden lang bei 35°C stehen gelassen.
Als Nächstes wird die obige Lösung über 120 ml einer Natriumacetatlösung in Methanol bei 10% w/v ausgefällt und das Präzipitat wird durch Zentrifugationswäsche mit Methanol aufgefangen.
Das erhaltene Produkt wird in 100 ml Wasser aufgelöst, mit 0,1 N HCl neutralisiert und Natriumchlorid wird zugegeben, bis eine Konzentration von 10% w/v erreicht ist. Die Ausfällung erfolgt durch Zugabe von 250 ml Methanol.
Das Präzipitat wird durch Filtration, Wäsche mit Methanol und Trocknen in Vakuum bei 35°C aufgefangen.
Am Ende des Vorgangs erhält man 6,3 g Produkt.
3. BEISPIEL:
Zunächst werden 5 g des im 2. Beispiel erhaltenen Produkts in Wasser bei einer Konzentration von 5% w/v aufgelöst.
Der pH-Wert wird mit 0,1 N HCl auf 6,6 eingestellt und Natriumchlorid wird zugegeben, bis eine Konzentration von 5% w/v erreicht ist. Die Ausfällung erfolgt durch Zugabe von 1,5 Volumen Methanol.
Als Nächstes wird das Präzipitat durch Filtrationswäsche mit Methanol und Trocknen in Vakuum bei 35°C aufgefangen.
Am Ende des Vorgangs werden 3 g Produkt erhalten.
4. BEISPIEL:
Das im 1. Beispiel beschriebene Verfahren zum Erhalten von Produkt B wird wiederholt.
20 g Produkt B werden in 150 ml Wasser aufgelöst und es werden 100 ml Benzalkoniumchloridlösung in Wasser mit 50% w/v zugegeben.
Dann wird Wasser zugegeben, um ein Volumen von etwa 500 ml zu erreichen. Nach dem Abziehen des Überstands wird Wasser zugegeben, um ein Volumen von 500 ml zu erreichen, und das Gemisch wird dekantieren gelassen.
Der Überstand wird abgezogen, Wasser wird zugegeben, um ein Volumen von 500 ml zu erreichen, und das Gemisch wird dekantieren gelassen.
Nach dem Auflösen von 20 g des oben erhaltenen Salzes in 60 ml Dichlormethan wird Triton B^® in zwei Portionen zugegeben:

– 5 ml Triton B^® werden zugegeben und 8 Stunden lang bei 35°C stehen gelassen
– 5 ml Triton B^® werden zugegeben und 16 Stunden lang bei 35°C stehen gelassen

Die obige Lösung wird über 120 ml Natriumacetatlösung in Methanol bei 10% w/v ausgefällt und das Präzipitat durch Zentrifugationswäsche mit Methanol aufgefangen.
Das erhaltene Produkt wird in 100 ml Wasser aufgelöst, mit 0,1 N HCl neutralisiert und Natriumchlorid wird zugegeben, bis eine Konzentration von 10% w/v erreicht ist, und es erfolgt eine Ausfällung durch Zugabe von 250 ml Methanol.
Das Präzipitat wird dann durch Filtrationswäsche mit Methanol und Trocknen in Vakuum bei 35°C aufgefangen.
Am Ende des Vorgangs werden 8,7 g Produkt erhalten.
5. BEISPIEL:
Zunächst werden 5 g des im 4. Beispiel erhaltenen Produkts in Wasser bei 5% w/v aufgelöst.
Der pH-Wert wird mit 0,1 N HCl auf 6,6 eingestellt und Natriumchlorid wird zugegeben, bis eine Konzentration von 5% w/v erreicht ist. Als Nächstes erfolgt eine Ausfällung durch Zugabe von 0,93 Volumen Methanol.
Nach dem Auffangen des Präzipitats durch Filtration und Wäsche mit Methanol wird das Produkt in Vakuum bei 35°C getrocknet.
Der Überstand wird mit 2 Volumen Methanol ausgefällt.
Das Präzipitat wird durch Filtrationswäsche mit Methanol und Trocknen in Vakuum bei 35°C aufgefangen.
Schließlich werden 4 g Produkt erhalten.
ANALYSE DER PRODUKTE

* % Oligosaccharide mit einer Molekülmasse von weniger als 2000 Dalton
** % Oligosaccharide mit einer Molekülmasse zwischen 2000 und 6000 Dalton
*** % Oligosaccharide mit einer Molekülmasse von mehr als 6000 Dalton.

Claims

Zusammensetzung aus Heparinen, die ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, und Oligosaccharidfragmente aus Oligosacchariden der allgemeinen Formel
in welcher n zwischen 1 und 12 variieren kann, R₁ H oder SO₃Na ist und R₂ SO₃Na oder COCH₃ ist, umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weniger als 10% Oligosaccharidfragmente der allgemeinen Formel, in welcher n zwischen 10 und 12 liegt, 80 bis 90% Oligosaccharidfragmente der allgemeinen Formel, in welcher n zwischen 1 und 6 liegt, und weniger als 15% Oligosaccharidfragmente der allgemeinen Formel, in welcher n zwischen 7 und 9 liegt, umfasst und dass 25 bis 60% der Oligosaccharide ein Molekulargewicht von weniger als 2000 Dalton, 40 bis 75% der Oligosaccharide ein Molekulargewicht, das zwischen 2000 und 6000 Dalton liegt, und weniger als 15% der Oligosaccharide ein Molekulargewicht von größer als 6000 Dalton aufweisen, wobei das mittlere Molekulargewicht (M_w) der Zusammensetzung zwischen 2000 und 4000 Dalton liegt, wodurch die Zusammensetzung eine hohe Aktivität des Antifaktors Xa zwischen 100 und 150 I.U./mg und eine niedrige Aktivität des Antifaktors IIa von weniger als oder gleich 10 I.U./mg aufweist.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments gegen Thrombose.