DE3880577T2

DE3880577T2 - Heparinderivate, verfahren zu deren herstellung und verwendung fuer pharmazeutische zwecke.

Info

Publication number: DE3880577T2
Application number: DE8888850184T
Authority: DE
Inventors: Karin Helena Louise Bergendal; Rolf Arne Johansson; Carl Magnus Erik Svahn
Original assignee: Kabi Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-26
Publication date: 1993-08-26
Anticipated expiration: 2008-05-27
Also published as: WO1988009347A1; JPH01503548A; DE3880577D1; US5039529A; FI890340A; FI890340A0; EP0319559A1; DK21989A; ES2054875T3; EP0302034A1; ATE88723T1; AU1936988A; SE8702254D0; DK21989D0; EP0302034B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Heilmittel, welches einen Kupfer-Ion Komplex umfasst, mit solchen Anteilen von Heparin, Heparansulfat, nieder molekularen Heparin, nieder molekularen Heparansulfat, Heparinfragmente, Heparansulfatfragmente und Oligosaccharide die von Heparin oder Heparansulfat abgeleitet sind, welche spezifisch zum Kupfer-Ion binden, oder ein Salz solcher Anteile, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Metall-Bindungs Anteile und deren Metallkomplexe, und die Verwendung dieser Komplexe in der Therapie. Es wurde unerwartet gefunden, dass die hemmenden Eigenschaften, an Angiogenese, der neuen erfindungsgemässen Komplexe in vivo in Anwesenheit eines geeigneten Angiostatischen Mittels, vor allem eines Steroides, deutlich erhöht wurden hinsichtlich solcher Anteile, die nicht an Metallionen gebunden waren, und auch im Hinblick auf die nicht-fraktionierten Produkte.

Hintergrund der Erfindung

Es wurde gezeigt dass eine Kombination von Heparin oder einem Hexasaccharidfragment zusammen mit einem geeigneten Steroid Hemmung der Angiogenese an Säugetieren verursacht und, dass Tumormassen in Säugetieren veranlasst werden zurückzugehen und die Metastase Bildung verhindert wird (Folkman et al.; Science 1983, 221, 719-725). Es wurde auch gezeigt, dass diese Kombination wirksam war, andere Angiogenese abhängige Verfahren, wie die Befruchtung der Ratte, zu hemmen (Folkman et al., Europäische Patentanmeldung EP-0114589). Sie ist auch wirksam in der Herabsetzung der Osteoporose und im Behandeln von Krankheiten die Neovaskularisierung umfassen, wie neovaskulare Krankheiten des Auges. Auch wegen dem Vorkommen von Angiogenese in Psoriasis und Arthritis wird erwartet, dass diese Kombination im Behandeln dieser Krankheiten nutzbringend sein wird.
Während die weitere Forschung und Entwicklung mehr wirksame und spezifische Steroide im Hinblick auf den Steroiden Teil dieser Kombination ergeben hat, welche Angiogenese hemmt, (Crum et al., Science 1985, 230, 1375-1378) wurde kein solcher Fortschritt hinsichlich der Heparin Komponente der Heparin Steroidzusammensetzung gemacht. Es wurde neulich gezeigt dass ein synthetisches, hochsulfatiertes nicht-Anticoagulans Pentasaccharid einen hemmenden Effekt auf Angiogenese in Anwesenheit eines Steroides hat im gleichen Ausmass, wie sein hoch-Anticoagulans aktives Analog (das 3-0- sulfatierte Analog) (Choay et al., Europäische Patentanmeldung EP-0140781). Dieses Ergebnis bekräftigt weiter den Befund, dass die Anticoagulans(Anti-Xa)Eigenschaften von Heparin und Heparinfragmenten nicht verlangt werden für Heparin und Heparinfragmente in Anwesenheit von Steroiden auf Angiogenese hemmend zu sein (Folkman et al., Science 1983, 221, 719-725; Crum et al., Science 1985, 230, 1375-1378).
Heparin ist ein glykosidisch vernetztes hochsulfatiertes Copolymer von Uronsäuren und D-Glukosamin. Die Uronsäuren sind L-Iduronsäure oder D-Glukuronsäure von welchen die erstere gewöhnlich sulfatiert und die letztere üblicherweise nicht sulfatiert ist. Das Glucosamin ist entweder N-sulfatiert oder N-acetyliert und auch häufig 6-0-sulfatiert. Geringe Mengen anderer struktureller Varianten kommen auch vor. Die genaue Struktur von Heparin und seine präzise Natur seines antithrombotischen Wirkungsmechanismus wurde nicht aufgeklärt, obwohl es im weitverbreiteten Gebrauch für beinahe 50 Jahre gewesen ist. Heparin ist polydispers mit einem Molekulargewichtsbereich von 3,000 bis 30,000 mit vielen strukturellen Möglichkeiten innerhalb einer gegebenen Kette. Die genaue Zusammensetzung von Heparin variiert, abhängig von seiner Quelle, welche gewöhnlich eine vom Schwein stammende Inteslinalschleimhaut, Rinderlunge, Rinder Intestinalschleimhaut oder Schaf Intestinalschleimhaut ist, und hängt auch von dem Herstellungsverfahren und der Reinigung ab. Nieder molekulares Heparin (Molekulargewichtsbereich 2000-10000) wurde in geringen Mengen durch Fraktionieren von Standard Heparin isoliert. Heparinfragmente mit einem Molekulargewichtsbereich von 500-10,000 wurden durch teilweise Depolymerisation von Heparin durch chemische oder enzymatische Verfahren hergestellt. Chemische Depolymerisation wurde auf vielen verschiedenen Wegen ausgeführt, häufig durch Nitrite bei niederem pH, durch alkalische β-Eliminierung, gewöhnlich nach der Esterifizierung von Uronsäuren, oder durch oxidative Verfahren die gewöhnlich Peroxide oder Periodate verwenden. Nach der Depolymerisation mit Nitriten wird die neu gebildete Anhydromannose am Ende der Reduzierung der Heparinfragmente und die Oligosaccharide, die von einem solchen Fragment abgeleitet sind gewöhnlich zu Anhydromannitol reduziert oder zu Anhydromannonsäure oxidiert für steigende Stabilität des Produktes. Die enzymatische Depolymerisation und die alkalische β-Elimination laufen in die gleiche 4,5-Ungesättigtkeit im nicht reduzierten Ende der Heparinfragmente und in den Oligosacchariden, die von diesen Fragmenten abgeleitet sind, hinaus. Für eine Stabilitätserhöhung können solche ungesättigten Gruppen in der Folge durch Standardverfahren, z.B. katalytische Hydrierung reduziert werden, oder das ganze 4,5-ungesättigte Monosaccharid kann z.B. durch eine milde Säurebehandlung oder durch Anwendung von Metall enthaltenden Reagentien, wie Quecksilbersalzen, eliminiert werden. In letzterem Fall werden Heparinfragmente, Heparansulfatfragmente und Oligosaccharide, die von diesen abgeleitet sind, und die eine ungerade Zahl von Saccharideinheiten aufweisen, erhalten. Heparansulfat ist das einzige andere Glykosaminoglykan neben Heparin, welches auch N-sulfatierte Glucosamine enthält. Die meisten Heparansulfate enthalten jedoch mehr N-acetylierte Glykosamine als N-sulfatiertes Glukosamin, das Gegenteil ist der Fall für Heparin.
Die gleichen Fraktionierungsverfahren und Depolymerisationsverfahren, die für Heparin angewandt werden, sind auch auf Heparansulfat anwendbar. Das Enzym, das für Heparansulfat angewandt wird, ist üblich ein Hepartitinase (Heparanase) anstelle von Heparinase, welches gewöhnlich für Heparin verwendet wird. Geringe Mengen Heparansulfat wird gewöhnlich in Standard Heparinen gefunden. Heparansulfat stellt auch einen grossen Bestandteil von Heparin Nebenprodukten, besonders der Rinderlunge, dar.
Heparin selbst (ohne ein Steroid) steigert die Intensität der Angiogenese die durch Tumoren und durch Tumor abgeleitete Faktoren in vivo induziert ist, obwohl in Abwesenheit der Tumorzellen oder Tumorextrakte oder von Tumor abgeleitete Faktoren, weder Heparin noch die Mastzellen, welche Heparin freigeben, Angiogenese induzierten konnten (Taylor und Folkman, Natur 1982, 297, 307-312).
Einige angiogenesischen Faktoren von normalen Zellen und Gewebe, z.B. sogenannte Heparin bindende Wachstumsfaktoren, können auch die Angiogenese induzieren und das Wachstum von kapillär Endothelialzellen stimulieren. Mit einigen Wachstumsfaktoren wird diese Stimulierung des kapillär Endothelialzellen Wachstums bei Heparin potenziert.
Heparin hat dank seiner hohen negativen Ladung eine starke Affinität zu Kationen wo die Bindung gewöhnlich ionisch ist, da eine pH Abhängigkeit üblicherweise beobachtet wird. Klinisch verwendetes Standard Heparin ist entweder das Natrium- oder Kalziumsalz der Heparinsäure. Das Kalzium Heparin hat gewöhnlich einen Kalziumgehalt von etwa 11 w/w%, welcher etwa 2.3 umol Ca²&supmin;/mg Heparin entspricht. Für Kupferionen (Cu²&spplus;) wurde gezeigt, dass die Bindung zu Heparin pH abhängig ist und für ein typisches Heparin (Molekulargewicht 13100, Anticoagulans Wirkung 146 IU/mg) betrugt die Kupferbindung 0.606 umole Cu²&spplus;/mg Heparin bei neutralem pH Wert (Stivala SS, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Bio. 1977, 36, 83-88). Demzufolge binden Kupferionen zu einem geringeren Ausmass an Heparin als Kalziumionen bei neutralem pH und ergeben für Kupferionen etwa 20% der Bindung von dem der Kalziumionen. Es wurde gezeigt, dass Heparin, welches 1 ug Kupfer pro 20 ug Heparin enthält (welches 0.787 umol Cu²&spplus;/mg Heparin oder etwa 10 umol Cu²&spplus;/umol Heparin entspricht) fähig ist, Angiogenese in vivo zu induzieren, was Heparin selbst nicht tun konnte (Alessandri G, Raju K. Gullino P.M, Microcirculation, Endothelium und Lymphatics 1984, 1, 329-346).
Metall Chelat Affinitätschromatographie, auch Ligandenaustausch Chromatographie oder immobilisierte Metallionen Adsorption genannt, wird gewöhnlich ausgeführt durch Binden (Chelatbildend) verschiedener Metallionen wie z.B. Cu²&spplus;, Zn²&supmin;, Ni²&supmin;, Co²&supmin;, Mn²&spplus;, Ca²&spplus;, Fe²&supmin; und Fe³&spplus; an eine feste Matrix, z.B. einem Kationaustauschharz oder einem speziellen Metallionen Chelator, wie Chelat bildende Sepharose 6B Pharmacia und Chelex 100 Bio-Rad und anschliessender Fraktionierung der Komplexmischungen.

Beschreibung der Erfindung

Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass Komplexe von Kupferionen mit solchen Anteilen von Heparin, Heparansulfat, nieder molekularen Heparin, nieder molekularen Heparansulfat, Heparinfragmenten, Heparansulfatfragmenten und Oligosacchariden die von Heparin oder von Heparan abgeleitet sind, oder einem Salz solcher Anteile, welche Fraktionen spezifisch zu dem Kupferion binden, bemerkenswert verbesserte antiangionesische Eigenschaften aufweisen, wenn sie in Verbindung mit einer angiostatischen Komponente verwendet werden, speziell einem Steroid, wie oben offenbart. Die vorliegende Erfindung bezieht sich demgemäss auf ein Heilmittel zur Behandlung einer Unpässlichkeit wo eine verminderte Angiogenese erwünscht ist, umfassend einen Komplex von
(a) einem Metallion, welches Kupfer ist, und
(b) einem Anteil Heparin, Heparansulfat, nieder molekularem Heparin, nieder molekularen Heparansulfat, Heparinfragmente, Heparansulfatfragmente und Oligosaccharide, abgeleitet von Heparin oder von Heparansulfat oder einem Salz solcher Anteile, wobei diese Anteile Molekulargewichte von 500 bis 35,000 haben und das Salz ein physiologisch annehmbares Salz wie Natrium, Kalzium oder Ammoniumsalz ist, welche Anteile an diesem Metallion binden und dieser Komplex 5 bis 1,000, vorzugsweise 10 bis 1,000 nmol Metall pro umol der Komponente (b) enthält;
- das Heilmittel das einen Komplex umfasst, wie oben beschrieben, worin die Komponente (b) Heparin oder nieder molekulares Heparin oder ein Heparinfragment oder ein Oligosaccharid abgeleitet von Heparin, wie Tetrasaccharid, Hexasaccharid, ein Oktasaccharid, ein Dekasaccharid, ein Dodekasaccharid, ein Tetradesaccharid oder ein Hexadekasaccharid ist;
- das Heilmittel umfassend einen Komplex, wie oben beschrieben, worin die Komponente (b) Heparasulfat ist, nieder molekulares Heparansulfat oder Heparansulfatfragmente oder ein Oligosaccharid das von Heparansulfat abgeleitet ist, wie ein Tetrasaccharid, Hexasaccharid, Oktasaccharid, Dekasaccharid, Dodekasaccharid, Tetradesaccharid oder ein Hexadekasaccharid;
- das Heilmittel, welches einen Komplex, wie oben beschrieben umfasst, worin die Komponente (b) in Salzform, vorzugsweise in Natrium oder Kalzium Salzform vorliegt;
- ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes, wie oben beschrieben, das darin besteht, Heparin, Heparansulat, nieder molekulares Heparin, nieder molekulares Heparansulfat, Heparinfragmente, Heparinsulfatfragment und Oligosaccharid, abgeleitet von Heparin oder von Heparansulfat, einer festen Matrix zuzugeben, welche Iminodiessigsäuregruppen enthält an welche ein Kupferion gebunden ist, abtrennen des Anteils von zugefügtem Material, welches nicht an die Kupferionen auf der Matrix bindet, und anschliessender Desorption des gebundenen Anteils an der Matrix;
- Verwendung eines Komplexes aus
(a) einem Metallion ausgewählt von Kupfer, Kalzium, Mangan, Eisen und Zinkionen und
(b) einem Anteil Heparin, Heparansulfat, nieder molekularem Heparin, nieder molekularem Heparansulfat, Heparinfragmente, Heparansulfatfragmente und Oligosaccharide, die von Heparin oder Heparan abgeleitet sind, oder ein Salz solcher Anteile, wobei diese Anteile Molekulargewichte von 500 bis 35,000 haben und das Salz ein physiologisch annehmbares Salz von Natrium, Kalzium oder Ammoniumsalzen ist, welche Anteile an dieses Metallion bindet und dieser Komplex von 5 bis 1,000 nMol Metall pro umol der Komponente (b) enthält
zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Unpässlichkeit wo eine verminderte Angiogenese erwünscht ist;
- Verwendung, wie oben beschrieben, worin das Heilmittel den Komplex in Verbindung mit einer angiostatischen Komponente, speziell einer sogenannten angiostatischen Steroid Komponente, umfasst.
Die Anteile dieser Erfindung enthalten Bestandteile von Heparin und/oder Heparansulfat. Sie werden von Heparinen und Heparansulfaten vom Rind, Schwein, Schaf oder anderem Ursprung, nieder molekularen Heparinen oder Heparansulfaten, Fragmenten von Heparinen und Heparansulfat, Oligosacchariden von einem dieser Produkte und auch solcher Oligosaccharide isoliert, welche in der Grösse gleichartig sind und von anderen Anteilen die Heparin oder Heparansulfat Bestandteile enthalten, z.B. "Nebenprodukten" der Heparinherstellung. Die Anteile der Erfindung enthalten 2 bis etwa 120 Zucker Einheiten entsprechend Molekulargewichten von 500 bis 35,000. Unter "Salze" dieser Heparinfragmente werden physiologisch annehmbare Salze, wie Natrium-, Kalzium- oder Ammoniumsalze verstanden. Die Natrium- und Kalziumsalze, vor allem das Natriumsalz sind die bevorzugten Salze. Normal werden die Heparinkomplexe gemäss der Erfindung in Salzform verwendet.
Die Anteile der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Kupferionen, die an eine feste Matrix chelatbildend sind zurückgehalten werden, und, dass sie von dieser Kupferion enthaltenden festen Matrix durch einen pH Gradient, einem kompetitiven Liganden oder anderen Chelatbildnern desorbiert werden können. Sie können auch auf diese Weise aus den Ausgangsmaterialien die oben beschrieben sind hergestellt werden.
Der Kupferionen Gehalt wird sich in einem Bereich von 5 bis 1,000 nMol pro uMol der Heparin/Heparansulfat Komponente bewegen. Ein bevorzugtes Intervall ist von 10 bis 1,000 nMol pro uMol der Heparin/Heparansulfat Komponente. Unter den Kupferbindungsanteilen der Heparin/Heparansulfat Komponente ist es bevorzugt, nieder molekulares Heparin oder nieder molekulares Heparan mit einem Molekulargewicht von 500 bis 10,000 oder von 500 bis 8,000 zu verwenden und niedermolekulare Oligosaccharide die von Heparin oder Heparansulfat abgeleitet sind, vor allem Tetrasaccharide, Hexasaccharide, Octasaccharide, Decasaccharide, Dodecasaccharide, Tetradecasaccharide und Hexadecasaccharide.
Angiogenese, der Wuchs neuer kapillärer Blutgefässe ist in normalen Prozessen, wie in der Entwicklung des Embryo, Bildung des Corpum Luteum und der Wundheilung wichtig. Sie ist auch eine Komponente in pathologischen Prozessen, wie chronischer Entzündung, bestimmten Imunreaktionen und Neoplasie. Angiogenese ist auch die Natur der meisten festen Tumore und ist notwendig für ihr Wachstum.
Heilmittel Indikationen wo eine verminderte Angiogenese gewünscht ist, können beispielhaft erwähnt werden bei
- Tumoren, vor allem feste Tumoren,
- Verhütung von Metastasen,
- Neovaskulare Krankheiten des Auges, wie Retrolentale Fibroplasie, Diabetische Retinopaty und Neovaskulares Glaukom,
- Osteoporose
- Psoriasis
- Arthritis.
Die oben beschriebenen Komplexe werden bevorzugt beabsichtigt in Verbindung mit einer angiostatischen Komponente zu verwenden, vor allem einem sogenannten angiostatischen Steroid (Crum et al., Science Vol. 230, p. 1377), das heisst ein Steroid mit einem hohen anti-Angiogenesen Effekt und niederen Glucocorticoiden und mineral-corticoiden Effekt. Beispiele solcher Steroide sind von Crum et al. gegeben und umfassen
- Cortison,
- Hydrocortison,
- 11α-Isomer von Hydrocortison
- 6α-Fluor-17,21-dihydroxy-16β-methyl-pregna-4,9,(11)dien-3,20-dion,
- 17α-Hydroxy-progesteron,
- 5β-Pregnan-3α,17α,21-triol-20on (Tetrahydro-S)
- Tetrahydrocortisol oder sein 3α-Glucuronid.
In der klinischen Praxis wird die Anwendung dieser Komplexe im wesentlichen durchgeführt wie für Standard Heparin und für nieder molekulares Heparin vorbeschrieben ist. Deshalb sind örtliche und parenterale Anwendungen - z.B., subkutan, intramuskulär - vorgesehen. Lokale Anwendung, z.B. im Auge oder an einem Tumor kann gewünscht sein. Zusätzlich können die Komplexe oral verabreicht werden.
Die Steroid Komponente wird in einer Art und Weise verabreicht, welche für die Verabreichung von Steroiden üblich ist, wie durch den oralen oder parenteralen Weg.
Die oben beschriebenen Komplexe und die angiostatische Komponente können vorgängig der Verabreichung zusammengemischt werden oder können getrennt verabreicht werden.
Die Menge, die von diesem Komplex und der angiostatischen Komponente verabreicht wird, muss auf das individuelle Bedürfnis jedes Patienten eingestellt sein.
Zur Herstellung dieser Komplexe wird Heparin, Heparansulfat, nieder molekulares Heparin, nieder molekulares Heparansulfat, ein Heparinfragment, ein Heparansulfatfragment, oder ein Oligosaccharid, das von Heparin oder von Heparansulfat abgeleitet ist, oder ein Salz davon, mit einem Kupferion zur Reaktion gebracht und der so gebildete Komplex anschliessend isoliert.
Die Reaktion kann mittels eines Ionenaustauschharzes vor allem einem Harz das Iminodiessigsäuregruppen enthält oder in Lösung durchgeführt werden. Die Reaktanten sind so eingestellt, dass der erhaltene Komplex im Fall von Kupferionen 5 bis 1,000 nMol Kupfer pro uMol Heparin/Heparansulfat Komponente enthält. Aehnliche Mengen sind für die anderen Metall Komplexe der Erfindung gewünscht.
Zur Herstellung und Isolierung der Anteile dieser Erfindung wurde eine Metall Chelat Affinität Chromatographie ausgeführt, unter Verwendung einer festen Matrix die Imininodiessigsäure Gruppen enthält zum Binden (Chelatbindend) der Metallionen (Chelex 100, Bio-Rad oder Chelatbindende Sepharose 6B Pharmacia). Unter Verwendung einer Kupferchlorid Lösung (CuCl&sub2;) als Quelle der Kupferionen sollten die Kupferionen, die Chelat gebunden sind, hauptsächlich Kupfer (Cu²&supmin;) Ionen sein. Einige der Kupferionen können jedoch als Kupfer (Cu&supmin;) Ionen vorhanden sein. In eine Kolonne die mit Kupferionen beschickt war, wurde das Muster das zu fraktionieren war, in destilliertem Wasser, einer Pufferlösung, einer Salzlösung oder einer Puffersalzlösung gelöst, angewandt. Die Kolonne wurde dann mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen, welches verwendet wurde um die Probe zu lösen. Der Stoff der nicht oder nur sehr wenig an die Kupfer Chelex Kolonne gebunden war, wurde in diesem Anteil gesammelt. Zur Desorption des angewandten Produktes, welches an die (zurückgehalten durch) Kolonne gebunden war wurden drei allgemeine Verfahren angewandt:
1. Desorption durch einen pH Gradienten. Wie gezeigt wurde, dass eine Heparin Kupfer Zwischenwirkung abhängig vom pH war ist dies eine wertvolle Alternative.
2. Desorption durch steigenden Gradienten oder Isokratisch durch einen kompetitiven Liganden, wie Imidazol, Histamin, Gyzin, wässriges Ammoniak, ein Ammoniumsalz, vorzugsweise Ammoniumchlorid oder einer Lösung die Metallionen der gleichen Art enthält, welche an die Matrix gebunden waren. Die Lösung des Liganden enthält vorzugsweise das Salz und/oder den Puffer der im Waschvorgang verwendet wurde.
3. Desorption durch Chelatierungsmittel, wie EDTA oder EGTA, welche die Metallionen vom Gel abstreifen und die Eluierung all der adsorbierten Stoffe verursachen.
Ligandenaustausch Chromatographie unter Verwendung von Kupferionen wurde an Protein, Aminosäuren und Nukleotiden angewandt, aber nicht vorher Carbohydrate, wie Heparin oder Heparansulfat oder Produkte die von diesen abgeleitet sind zu komplexieren. Wenn Heparin, Heparansulfat oder seine Fragmente, nieder molekulare Produkte oder die grössengleichen Oligosaccharide die von diesen Produkten oder Biprodukten der Heparin Herstellung abgeleitet sind durch eine Kupfer Chelat Affinitäts Chromatographie fraktioniert wurden wurde gefunden, dass eine geringe Menge dieser Produkte an die Kupferionen auf der Matrix gebunden wurde. Nach der Desorption dieser festgebundenen Anteile wurden sie untersucht auf die Hemmung von Angiogenese zusammen mit Hydrocortison oder einem anderen angiostatischen Steroid, wie von Folkman et al., Science 1983, 221, 719-725, Crum et al., Science 1985, 230, 1375-1378 beschrieben wurde. Es wurde dann unerwartet gefunden, dass diese Anteile die durch die Kupferionen zurückgehalten wurden (gebunden waren) auf der Matrix höher hemmende Wirkungen an Angiogenese in Gegenwart eines sogenannten angiostatischen Steroides zeigten als die Anteile dieser Produkte die nicht zurückbehalten waren (gebunden zu) durch die Kupferion enthaltende Matrix (Tabelle 1).
Die Anteile, die auf der Kupfer Chelex Kolonne zurückgehalten wurden, zeigten auch höhere hemmende Wirkung der Angiogenese in Anwesenheit eines sogenannten angiostatischen Steroides (z.B. Hydrocortison) als die entsprechenden Ausgangsprodukte, welche zur Fraktionierung verwendet wurden (Tabelle 1).
Klinisch verwendetes Standard Heparin, gemäss dem US Pharmacopeia und dem Britischen Pharmacopeia, dürfen nicht mehr als 30 ppm Schwermetalle enthalten. Durch eine Atom Absorptionsanalyse wurde gefunden, dass in Heparin, Heparansulfat und den nieder molekularen Materialien, Fragmenten, Anteilen und Oligosacchariden, die von Heparin und Heparansulfat hergestellt waren, bis etwa 10 ppm dieser Schwermetalle Kupfer war. Jedoch wurde innerhalb dieser 0-10 ppm Kupfer keine Korrelation zwischen dem Kupfergehalt und dem Grad der Hemmung von Angiogenese, in Anwesenheit eines Steroides, offenbart.
Wenn die Anteile, die von der Kupfer Chelex Kolonne eluiert wurden mit Chelex enthaltenden Natriumionen behandelt wurden, wurde gefunden, dass der erste Anteil, welcher mit Wasser eluiert wurde, eine Salzlösung, eine Pufferlösung oder eine Puffersalzlösung war die immer weniger als 20 ppm Kupfer enthielt, bestimmt durch Atom Absorptionsspektroskopie. Jedoch enthielten die Bindungsanteile, welche wie oben beschrieben, nach der Behandlung mit Chelex enthaltenden Natriumionen desorbiert wurden immer mehr Kupfer (siehe Tabelle 2). Diese Restmenge von Kupfer konnte nur mit grosser Schwierigkeit entfernt werden, z.B. durch eine Dialyse wider grosse Mengen einer Lösung EDTA (siehe Beispiel 9). Es wurde dann unerwartet gefunden, dass diese Restkupferionen Mengen in den Anteilen, welche gebunden waren (zurückgehalten wurden durch) an der Kupfer Chelex Kolonne notwendig war, für die verbesserte Hemmung von Angiogenese, wie durch diese Anteile gezeigt wird. Bei der Entfernung dieser zurückbleibenden Kupferionen Menge wurde die antiangiogenese Wirksamkeit verloren (siehe Tabelle 2). Zugabe von Kupferionen zu diesen Bindungsanteilen die an Kupferionen verarmt waren, stellte ihre anti-angionetische Wirkung (siehe Tabelle 2) wieder her.
Wenn Kupferionen zu einem nicht zurückgehaltenen Anteil (enthaltend 5 ppm Kupfer) zugefügt wurden in einer Menge, wo gefunden wurde, dass sie wirksam ist in dem Bindungsanteil von der gleichen Trennung, wurde kein Ansteigen, sondern vielmehr eine Verminderung in der anti-angiogenesen Wirksamkeit beobachtet (siehe Tabelle 2).
Die neuen Heparinanteile, Heparansulfatanteile und die Produktanteile die von diesen erhalten wurden, sind dadurch gekennzeichnet, dass
- sie eine erhöhte Hemmung von Angiogenese in Anwesenheit eines angiostatischen Steroides aufweisen,
- dass sie die Fähigkeit haben, eine bestimmte Menge Kupferionen stark zu binden,
- dass sie zusätzlich der Fähigkeit zu haben, eine bestimmte Menge von Kupferionen stark zu binden, auch genügend Kupferionen enthalten müssen um diese Fähigkeit anzugleichen um eine gesteigerte Hemmung von Angiogenese zu zeigen.
Die gesteigerte Hemmung von Angiogenese, in Anwesenheit eines angiostatischen Steroides, ist in der Eiprobe (Tabelle 1) gezeigt. Die starke Bindung von Kupferionen ist gezeigt durch die hohe Affinität dieser Anteile für eine Kupfer Chelex Kolonne, z.B. die nicht durch eine Wasserlösung, einer hohen Salzlösung entsprechend einer 0.5M bis 2M oder 3M Lösung NaCl, oder einer hohen Salzlösung eines neutralen oder vielmehr neutralen Pufferlösung eluiert wurde. Die starke Kupferbindung wird auch durch die Schwierigkeit gezeigt Kupferionen von diesen Anteilen zu entfernen, wenn sie einmal an die Kupferionen gebunden sind, z.B. Behandlung durch ein Kupfer Chelat Bildungsmittel, wie Chelex Kolonne in Natriumform konnte die stark gebundenen Kupferionen nicht entfernen. Diese konnten nur entfernt werden durch eine sehr extensive Behandlung mit dem starken Metall Chelat Mittel EDTA. Die Menge von Kupferionen die für die neuen Anteile notwendig ist um eine gestiegene Hemmung von Angiogenese zu zeigen, wird durch die Menge der Strukturelemente in diesen Anteilen bestimmt, welche verursacht sind zu der erhöhten Hemmung von Angiogenese. Kupferionen im Ueberschuss dieser Menge, (z.B. Kupferionen die weniger spezifische Strukturen binden) haben keine zusätzliche steigernde Wirkung auf die Hemmung von Angiogenese dieser Anteile, sondern vielmehr eine schädliche Wirkung die möglich ist im Hinblick auf ihre höhere Toxizität von Kupferionen. Für ein Heparin Fragment das gemäss Beispiel 1 hergestellt ist (z.B. HF-3) ist ein optimaler Kupferionen Gehalt zwischen 10 und 500 nMol pro uMol Bindungsanteil. Tabelle 1 Hemmung von Angiogenese durch Heparin, Heparin Fragment und Oligosaccharide von Heparin Fragmenten in Anwesenheit von Hydrocortison Beispiel Produkt Menge ug % Hemmung1) Anti-Xa U/mg Tetrasacch. Hexasacch. Heparin Fragment Heparin 1) Einzelheiten siehe experimentellen Teil 2) Ohne Hydrocortison Beispiel Produkt Menge ug % Hemmung1) Anti-Xa U/mg Heparin Tetrasacch. Hexasacch. Decasacch. 1) Einzelheiten siehe experimentellen Teil Tabelle 2 Hemmung von Angiogenese in Anwesenheit von Hydrocortison durch Heparin Anteile und Heparin Fragmente gemäss der Erfindung. Der Einfluss von zurückbleibenden Kupferionen in diesen Anteilen. Verbindung % Hemmung Kupfer ppm nMol Kupfer uMol Verbindung Bindungsanteil von Heparin Fragment 1) HF-3A wurde erhalten durch Eliminierung stark gebundener Kupferionen von HF-3 (siehe experimentellen Teil, Beispiel 9) HF-3B, HF-3C, HF-3D und HF-3E wurden erhalten durch Zugabe verschiedener Mengen von Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid zu HF-3A.HF-2A wurde durch Zugabe geeigneter Mengen Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid zu HF-2 erhalten. HF-3A wurde durch Eliminierung von stark gebundenen Kupferionen aus H-3 erhalten. H-3B und H-3C wurde erhalten durch Zugabe von Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid zu H-3A. H-2A wurde durch Zugabe einer geeigneten Menge von Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid zu H-2 erhalten. 2) Nichtbindender Anteil.

Beispiel 1:

Kupfer gebundenes Heparin Fragment von Heparin Fragment erhalten durch alkalische β-Eliminierung

Natriumheparin von der Intestinal Schleimhaut des Schweines (40 g) wurde in Wasser (200 ml) gelöst und tropfenweise unter rühren zu einer Lösung von Hyamin 1622 [Diisobutylphenoxy-ethoxyethyl]-dimethylbenzylammonium Chlorid (200 g) in Wasser (1,000 ml) zugegeben. Die Mischung wurde für eine weitere Stunde gerührt und dann in einem Kühlschrank über Nacht gekühlt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde abgetrennt und der Niederschlag mit Wasser (800 ml) gewaschen und für eine 1/2 Std. zentrifugiert. Der Niederschlag wurde bei 60ºC im Vakuum über Nacht getrocknet. Das erhaltene klebrige Harz wurde in Dichlormethan (750 ml) gelöst und α-Bromtoluol (85 ml) wurden zugefügt. Diese Lösung wurde für 72 Std. bei 23ºC gerührt. Der gebildete Benzylester wurde dann durch Zugabe von Natriumacetat, das in Methanol (15 w/v, 1,000 ml) gelöst war, abgetrennt. Der Niederschlag wurde für eine 1/2 Std. zentrifugiert, mit Methanol (500 ml) gewaschen und abermals zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in Wasser (100 ml) und Methanol (25-100 ml) gelöst. Dann wurde Natriumacetat (15 g) zugefügt. Nach dem rühren für eine 1/2 Std. wurde die Mischung durch Celit filtriert und Methanol (1,000 ml) wurde dem Filtrat zugegeben. Der Niederschlag wurde schliesslich mit Methanol gewaschen, zentrifugiert und im Vakuum über Nacht getrocknet. Die Ausbeute an Heparin Benzylester beträgt 26 g.
Heparin Benzylester (1.0 g) wurde in Wasser (5 ml) gelöst und auf 60ºC erwärmt. Natriumhydroxid (0.40 M, 5 ml) wurde zugefügt und die Lösung wurde für 11/2 Std. bei 60ºC gerührt. Nach dem Kühlen der Mischung auf Raumtemperatur wurde ein Kationaustauschharz (Dowex 50 W-X8H) zugegeben um die alkalische Lösung zu neutralisieren. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser (1 ml) gewaschen. Der pH der kombinierten Lösungen (Filtrat und Waschflüssigkeiten) wurde durch Zugabe von verdünnten Natriumhydroxid auf einen pH Wert von 7 eingestellt und dann gefriergetrocknet. Ausbeute 1.0 g. Das durchschnittliche Molekulargewicht dieses Heparin Fragmentes (HF-1) betrug 8000 bestimmt durch Gelfiltration an Sephadex G-75 unter Verwendung von Heparin Fragmenten eines bekannten Polymerisations Grades als Bezugssubstanz. Die Antikoagulans Wirksamkeit wurde mit einem Anti-Xa Prüfgerät unter Verwendung von chromogenen Substrat S-2222 (Kabi Diagnostica Stockholm, Schweden) gemäss Andersson et al., Thromb. Res. 1979, 15, 531 gemessen. Die Anti-Xa Wirkung dieses Heparin Fragmentes (HF-1) betrug 90 U/mg.
Eine Kupfer Chelat Affinitäts Chromatographie Kolonne wurde auf folgende Weise hergestellt. Chelex 100 (Bio-Rad) 50 ml wurde in Natriumform zu einer Lösung von Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid (500 ml, 0.5 M) zugegeben. Die Mischung wurde für 24 Std. belassen und dann filtriert. Das Affinitätsgel wurde mit destilliertem Wasser (3 x 100 ml) gewaschen. Das Affinitätsgel wurde in destilliertes Wasser gegeben und entlüftet. Eine Kolonne wurde hergestellt durch zugeben von Chelex 100 enthaltend Natriumionen (5 ml) in eine Chromatographie Kolonne (25 x 1.6 cm) und an den oberen Teil dieses Ges das Kupfer Chelex Gel. Die Kolonne wurde mit Ammoniak (100 ml, 0.5 M) und Wasser (250 ml) gewaschen. Heparin Fragment (HF-1) (5 g) erhalten von Heparin durch alkalische β- Eliminierung, wie oben beschrieben, wurde in Wasser (20 ml) gelöst und auf den oberen Teil der Kupfer Chelex Kolonne angewandt. Wasser wurde als Fliessmittel bei 1.2 cm/Std. verwendet und sobald kein Heparin Fragment mehr eluierte, bestimmt durch einen UV- Monitor der bei 240 nm eingestellt war, wurde das Fliessmittel auf wässriges Ammoniak (2 M) gewechselt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum aus dem Anteil, der durch Wasser eluiert wurde, verdampft und der eluierte Anteil mit Ammoniak eluiert. Sie wurden dann in destilliertem Wasser gelöst und mit Chelex 100 enthaltenden Natriumionen behandelt, filtriert und gefriergetrocknet. Aus der Wasser Lösung wurde ein Anteil (3.2 g) eines Original Heparin Fragmentes erhalten. Dieser Anteil, bezeichnet als Heparin Fragment HF-2, hatte eine sehr geringe oder keine Affinität für die Kupfer Chelex Kolonne. Der Anteil, welcher mit wässrigem Ammoniak eluierte, wurde in destilliertem Wasser gelöst und einer Ultrafiltration auf einer Diaflo Membran 5 YCO5 in einer Amicon 8050 Ultrafilterzelle unterworfen. Der Rückstand wurde dann gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in Natriumchlorid (2 M) gelöst und erneut einer Ultrafiltration auf dem gleichen Filter unterworfen, gründlich mit Wasser gewaschen bis es frei von Chloridionen ist, und dann gefriergetrocknet um den Anteil von Original Heparin Fragment zu ergeben, welcher auf der Kupfer Chelex Kolonne zurückbehalten wurde 0.2 g. Dieser Anteil des Heparin Fragmentes HF-1 wurde als Heparin Fragment HF-3 bezeichnet. Der zurückbehaltene Anteil HF-3 hatte ein durchschnittliches Molekulargewicht von 6,000 bestimmt durch Gelfiltration am Sephadex G-75. Durch Elementaranalyse betrug der N Gehalt 2.4%, Schwefel 9.5% und Kupfer 255 ppm. Uronsäuren waren 30 w/w% bestimmt durch die Carbazol Schwefelsäure Methode gemäss Bitter und Muir, Anal. Biochem. 1962, 4, 330.
Die anti-Xa Aktivität dieses Heparin Fragmentes (HF-3) betrug 16 U/mg. Der Anteil HF-3 enthielt nur Glukosamin und kein Galaktosamin wie durch eine Aminosäure Analyse bestimmt wurde. Ein ¹H-NMR Spektrum in D&sub2;O/NaOD zeigte nicht irgendein Signal bei 2.7 ppm im Hinblick auf H-2 von Glukosamin das eine freie Aminogruppe in dieser Stellung aufweist.

Beispiel 2:

Kupfergebundene Oligosaccharide erhalten von Oligosacchariden, welche von einem Heparin Fragment erhalten wurden das durch alkalische β-Eliminierungs Depolymerisation von Natriumheparin hergestellt war.

Natriumheparin aus Intestinaler Schleimhaut vom Schwein (40 g) wurde in Wasser (200 ml) gelöst und unter rühren tropfenweise einer Lösung von Hyamin 1622 [Diisobutylphenoxy-ethoxyethyl]-dimethylbenzylammonium Chlorid (200 g) in Wasser (1,000 ml) zugegeben. Die Mischung wurde für eine zusätzliche Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde abgetrennt und der Niederschlag mit Wasser (800 ml) gewaschen und für eine 1/2 Std. zentrifugiert. Der Niederschlag wurde bei 60ºC im Vakuum über Nacht getrocknet. Das so erhaltene klebrige Harz wurde in Dichlormethan (750 ml) gelöst und Methyliodid (45 ml) wurden zugefügt. Diese Lösung wurde für 72 Std. bei 23ºC gerührt. Der gebildete Methylester wurde dann durch Zugabe von Natriumacetat, gelöst in Methanol (15% w/w, 1,000 ml), abgeschieden. Der erhaltene Niederschlag wurde in Wasser (100 ml) und Methanol (500 ml) gelöst. Dann wurde Natriumacetat (15g) zugegeben. Nach dem rühren für eine 1/2 Std. wurde die Mischung durch ein Celit filtriert und Methanol (1,000 ml) wurde dem Filtrat zugegeben. Der Niederschlag wurde zentrifugiert und der Flüssigkeitsüberstand dekantiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt bis ein Niederschlag erhalten wurde, der vollständig wasserlöslich war. Der Niederschlag wurde schliesslich mit Methanol gewaschen, zentrifugiert und im Vakuum über Nacht getrocknet. Ausbeute an Heparin Methylester 23 g.
Heparin Methylester (1.0 g) wurde in Wasser (5 ml) gelöst und auf 60ºC erwärmt. Natriumhydroxid (0.40 M, 5 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde für 1 1/2 Std. bei 60ºC gerührt. Nach dem Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur wurde ein Kationaustauschharz (Dowex 50 W-X8H) zugegeben um die alkalische Lösung zu neutralisieren. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser (1 ml) gewaschen. Der pH der kombinierten Lösungen wurde auf einen pH Wert von 7 durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxid eingestellt und dann gefriergetrocknet. Ausbeute 0.98 g. Das durchschnittliche Molekulargewicht dieses Heparin Fragmentes betrug 3,500.
Dieses Heparin Fragment (MW 3,500) (1 g) wurde in Natriumchlorid (0.25 M, 5 ml) gelöst und auf einer Gel Permeations Kolonne (5 x 180 cm P-6, Bio-Rad) angewandt. Die Kolonne wurde mit Natriumchlorid (0.25 M) bei 5.8 cm/Std. unter Verwendung eines UV- Nachweises bei 214 nm eluiert. Die Anteile wurden gesammelt und auf Sephadex G-10 unter Verwendung von Wasser bei 3.6 cm/Std. als Eluiermittel entsalzt und durch refraktive Indexmessung nachgewiesen. Nach der Gefriertrocknung wurden die folgenden Anteile erhalten:
Disaccharide 5 mg
Tetrasaccharide 36 mg
Hexasaccharide 65 mg
Octasaccharide 89 mg
Decasaccharide 118 mg
Dodecasaccharide 95 mg
Tetradecasaccharide 71 mg
Hexadecasaccharide 83 mg
Octadecasaccharide und höhere Saccharide 305 mg
Tetrasaccharide (TS-1), 450 mg) erhalten wie oben beschrieben, wurden in Wasser (5 ml) gelöst und auf einer Kupfer Chelex Kolonne angewandt, die hergestellt wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Eluierung wurde bei 1.2 cm/Std. mit Wasser als Fliessmittel ausgeführt und mit UV Nachweis bei 240 nm kontrolliert. Sobald die nicht zurückbehaltenen (nicht gebundenen) Tetrasaccharide eluiert wurden, wurde das Fliessmittel auf wässriges Ammoniak (2 M) gewechselt, welches einen Anteil von Tetrasacchariden ergab die (gebunden an) von der Kolonne zurückgehalten wurden. Diese beiden Anteile wurden eingedampft. Der Bindungsanteil wurde mehrmals eingedampft. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels wurden die Anteile in destilliertem Wasser gelöst und mit Chelex behandelt, welches Natriumionen enthielt, filtriert und durch Chromatographie an Sephadex G-10 gereinigt wie bei der Isolation der Tetrasaccharide wie oben beschrieben. Nach dem Gefriertrocknen wurde ein Tetrasaccharid Anteil von der Eluierung mit Wasser erhalten der sehr klein war, oder nicht ganz auf der Kupfer Chelex Kolonne zurückbehalten wurde. Die Ausbeute betrugt 435 mg (TS-2). Die Elution mit Ammoniak ergab einen anderen Anteil. Dieser Anteil enthielt Tetrasaccharide zurückgehalten durch (gebunden an) die Kupfer Chelex Kolonne. Ausbeute 6.5 mg (TS-3).
In der gleichen Weise wurden Hexasaccharide (HS-1, 550 mg), wie oben beschrieben erhalten, von Heparin Fragment erhalten durch alkalische β-Eliminierung von Heparin an der Kupfer Chelex Kolonne fraktioniert, wie oben beschrieben, um einen Hexasaccharid Anteil zu ergeben der sehr gering oder nicht gesamthaft zurückbehalten war. Ausbeute 526 mg (HS-2). Es wurde auch ein Hexasaccharid Anteil erhalten, Ausbeute 8.9 mg (HS- 3) der an der Kupfer Chelex Kolonne zurückbehalten wurde. Weder das zurückbehaltene Tetrasaccharid (TS-3) noch das zurückbehaltene Hexasaccharid (H 5-3) zeigte irgendein ¹H-NMR Signal in D&sub2;O/NaOD bei 2.7 ppm im Hinblick auf H-2 von Glukosamin das an dieser Stelle eine freie Aminogruppe aufweist.
Jeder der grösseren Oligosaccharide wurde in der gleichen Weise fraktioniert, wie für die Tetra- und Hexasaccharide mit der Ausnahme, dass ein entsalzen an einer Ultrafilter Membran Diaflo 5YCO5 (Amicon Corp.) durchgeführt wurde. Die Ausbeuten der Anteile, die an der Kupfer Chelex Kolonne zurückbehalten wurden, betrugen 0.3-3%.

Beispiel 3

Kupfergebundenes Heparin Fragment von Heparin Fragment das durch teilweise Depolymerisation von Natriumheparin durch salpetrige Säure erhalten wurde.

Natriumheparin, von der Intestinal Schleimhaut vom Schwein, wurde teilweise bei pH 5 mittels salpetriger Säure die in situ durch Zugabe einer Lösung von Natriumnitrit (5% w/w) gebildet wurde depolymerisiert. Anhydromannose Gruppen wurden dann bei 3ºC mit einem Ueberschuss von Natriumborhydrid reduziert. Nach der Zerstörung des überschüssigen Natriumborhydrides durch Essigsäure und neutralisieren der Lösung durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxid, wurde ein Teil der Lösung einer Gel Permeations Chromatographie am Sephadex G-15 mit Wasser als Fliessmittel unterworfen. Ein Heparin Fragment (Heparin Fragment HF-4), das Tetradeca- bis Hexadecasaccharide als Hauptkomponenten gemäss der HPLC Gel Permeations Chromatographie enthielt, wurde gesammelt. Die HPLC Gel Permeations Chromatographie wurde an zwei TSK G 3,000 SW Kolonnen durchgeführt, jede 600 mm x 7.5 mm im Durchmesser und in Reihe verbunden. Eine TSK SWP Kolonne (75 mm x 7.5 mm im Durchmesser) wurde als Schutz Kolonne verwendet. Das Fliessmittel war 0.2 M Natriumacetat. Die Fliessgeschwindig keit betrugt 0.5 ml/Min. Peaks wurden durch refraktive Indexmessungen, unter Verwendung von Heparin Oligosacchariden bekannter Grösse als Bezug, festgestellt.
Eine Kupfer Chelat Affinitäts Chromatographie Kolonne wurde wie folgt hergestellt: Chelex 100 (Bio-Rad, 50 ml, 100-200 mesh) die Natriumionen enthalten wurde mit Wasser gewaschen und in eine Kolonne (2.6 x 30 cm) gefüllt. Das Chelex Gel wurde mit Kupferionen gesättigt durch Pumpen einer Lösung von Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid (0.5 Mol; 500 ml) durch die Kolonne bei 3.8 cm/Std.. Ueberschüssiges Kupfer Chlorid wurde durch destilliertes Wasser weggewaschen. Die Kolonne wurde dann mit Natriumchlorid (0.5 M), enthaltend Natriumphosphat (0.02 M) equilibriert. Nach der Kupfer Chelex Kolonne wurde eine Kolonne, die Chelex mit Natriumion enthielt, angebracht. An dieses zwei Kolonnen System wurde Heparin Fragment HF-4, erhalten wie oben beschrieben (500 mg) gelöst in Natriumchlorid, Natriumphosphat (0.5 M, 0.02 M), angewandt. Das Heparin Fragment, welches nur sehr gering war oder nicht gesamthaft zurückehalten wurde an der Kupfer Chelex Kolonne wurde mit Natriumchlorid, Natriumphosphat (0.5 M, 0.02 M) eluiert. Die Eluierung wurde fortgesetzt bis kein Fragment mehr durch UV bei 214 nm festgestellt wurde.
Dieser Anteil von Heparin Fragment HF-4 wurde als Heparin Fragment HF-5 bezeichnet. Nach der Entsalzung an Sephadex G-15 und Gefriertrocknen betrug die Ausbeute 395 mg. Die Hauptpeaks dieser Fraktion am HPLC waren Tetradeca- bis Hexadecasaccharide. Ein anderer Anteil von Heparin Fragmenten, welcher zurückgehalten wurde (gebunden an) an der Kupfer Chelex Kolonne wurde durch Ammoniumchlorid (2 M), enthaltend Natriumchlorid (0.5 M), eluiert. Nach der Chromatographie an Sephadex G-15 wurde eine Ausbeute von 0.7 mg erhalten. Dieser Anteil des Heparin Fragmentes wurde als Heparin Fragment HF-6 bezeichnet. Gemäss dem HPLC bestand er hauptsächlich aus Octa- bis Hexadecasacchariden.

Beispiel 4

Kupfer gebundener Heparin Anteil von Standard Natriumheparin

Eine Kupfer Chelex Kolonne (5 x 25 cm) die etwa 500 ml Kupferion enthaltenes Gel enthält, wurde gemäss Beispiel 3 hergestellt. Nach dieser Kolonne wurde eine Natrium Chelex Kolonne (1.6 x 10 cm) angebracht. Zu diesem zwei Kolonnen System wurde ein Standard Natriumheparin USP (20 g, anti-Xa 138 U/mg, H-1) gelöst in Natriumchlorid (0.5 M) zugegeben. Heparin, welches nur wenig war oder nicht alles durch die Kupferionen am Gel zurückbehalten wurde wurde mit Natriumchlorid (0.5 M, 1.8 l) eluiert. Sobald eine stabile Grundlinie erhalten wurde (UV-Erfassung bei 214 nm) wurde die Eluierung unter Verwendung vom wässrigen Ammoniak (2 M), das Natriumchlorid (0.5 M) enthielt, fortgesetzt.
Ein Anteil des Heparin Anteiles, welcher nicht gesamthaft oder sehr wenig zurückgehalten wurde, wurde mit Chelex, welches Natriumionen enthielt behandelt und dann gefriergetrocknet (Heparin Anteil H-2). Der zurückbehaltene Heparin Anteil wurde eingedampft, an Sephadex G-15 entsalzt, gefriergetrocknet und mit Chelex, welches Natriumionen enthielt, behandelt und dann an Sephadex G-15 unter Verwendung von destilliertem Wasser entsalzt. Nach der Gefriertrocknung wurde ein Heparin Anteil (Heparin Anteil H-3) erhalten der an der Kupfer Chelex Kolonne (88 mg) zurückbehalten wurde. Die anti-Xa Aktivität betrug 119 U/mg. Die Elementaranalyse ergab für N 2.1%, S 10.7%, Na 10.3% und für Kupfer 220 ppm. Der einzige Aminozucker in diesem Anteil, gemäss der Aminosäure Analyse, war Glukosamin. Uronsäuren waren 28±3% w/w bestimmt durch die Carbazol Schwefelsäure Methode gemäss Bitter und Muir, Anal. Biochem. 4, (1962) 330. Der Uronsäuregehalt des Standard Natriumheparins das als Ausgangsmaterial verwendet wurde war 30±3% w/w.

Beispiel 5

Herstellung eines Kupfer gebundenen Tetrasaccharid Anteils von Heparin Fragment das erhalten wurde durch teilweise Depolymerisation von Natriumheparin durch salpetrige Säure

Depolymerisiertes Heparin von Beispiel 5 wurde durch Zugabe von 8 Volumen Ethanol ausgefällt. 5 g des so erhaltenen Produktes wurden in 12 ml Wasser gelöst und einer Gel Permeations Chromatographie an einem Biogel P-6 Gel, 180 x 5 cm mit 0.25 M Natriumchlorid als Eluierungsmittel bei 3.7 cm/Std. unterworfen. Die Chromatographie wurde durch eine Brechungsindex Messeinrichtung überwacht und die Anteile wurden vereinigt um grösseneinheitliche Oligosaccharide zu erhalten. Die betreffenden Anteile wurden konzentriert. Die kleineren Grössenanteile wurden durch Chromatographie an einer Sephatex G-10 Kolonne (85 x 5 cm) mit Wasser bei 3.6 cm/Std. als ein Fliessmittel entsalzt. Der Nachweis von Kohlenhydrat enthaltendem Material wurde mit einer Brechungsindex Messeinrichtung vorgenommen. Oligosaccharide von grösserer Grösse (≥ Monosaccharid Einheiten) wurden durch Ultrafiltration in einer Amicon 8400 Zelle mit einem YC05 Filter entsalzt. Die Ausbeuten waren wie folgt:
Tetrasaccharide 0.51 g
Hexasaccharide 0.71 g
Octasaccharide 0.35 g
Decasaccharide 0.51 g
Dodecasaccharide 0.17 g
Tetradecasaccharide 0.31 g
Hexadecasaccharide 0.15 g
Octadecasaccharide 0.14 g
Eicosasaccharide und höhere Saccharide 0.43 g
Der Tetrasaccharidanteil (6.0 g) (TS-4) wurde in Wasser (10 ml) gelöst und auf eine Chelex 100 Kolonne (25 x 1.6 cm), Kupferform angewandt. Wasser wurde bei 1.2 cm/Std. als ein Fliessmittel verwendet um einen Anteil mit niederer Affinität für Kupfer zu erhalten. Der Nachweis wurde mit einem ultraviolett UV 214 Detector vorgenommen. Sobald der erste Anteil eluiert war wurde das Eluierungsmittel auf Ammoniak (1,000 ml, 2 M) gewechselt und ein zweiter Anteil wurde gesammelt. Die betreffenden Anteile wurden konzentriert und dann mit Chelex 100, Natriumform behandelt. Schliesslich wurden die Anteile an Sephadex G-10 mit Wasser bei 3.6 cm/Std. als Fliessmittel chromatographiert um die nicht bindenden Anteile (5.8 g) (TS-5) und Bindungsanteile (84 mg) zugeben.
Der Bindungsanteil wurde in 0.25 M Natriumchlorid gelöst und an einer Gel Permeations Chromatographie an einer Biogel P-6 Gel angewandt, 180 x 5 cm Kolonne und wie oben mit 0.25 M Natriumchlorid, eluiert. Der Tetrasaccharid Anteil wurde gesammelt und an einer Sephadex G-10 mit Wasser als Fliessmittel entsalzt um nach der Gefriertrocknung 70 mg eines Produktes zu ergeben, das einen Kupfergehalt von 3,900 ppm (TS-6) aufweist. Der Bindungsanteil (18 mg) wurde in Wasser (5 ml) gelöst und Natriumchlorid (20 mg) und Chelex 100 wurden zugefügt. Die Mischung wurde für 2 Std. sich selbst überlassen und dann filtriert. Nach der Konzentration wurde der Rückstand an einer G-10 Kolonne, wie oben, entsalzt. Das Tetrasaccharid wurde gesammelt und gefriergetrocknet um 9.5 ml eines Produktes mit einem Kupfergehalt von 2,900 ppm (TS-7) zu ergeben. Die Tetrasaccharid Natur von TS-7 wurde durch HPLC Gel Permeations Chromatographie gemäss Beispiel 3 bestätigt.

Beispiel 6

Ein Hexasaccharid Anteil (HS-4), hergestellt gemäss Beispiel 5 (1.15g), wurde in 0.5 M Natriumchlorid gelöst und an ein zwei Kolonnen System, bestehend, aus einer Kupfer Chelex Kolonne gefolgt durch eine Natrium Chelex Kolonne, angewandt. Die Kolonnen wurden durch eine schrittweise ansteigende Konzentration von Ammoniumchlorid eluiert.
Jeder Anteil wurde durch wiederholte Chromatographie an einer Sephadex G-15 entsalzt und dann mit einem grösseren Ueberschuss Natriumchlorid behandelt und wieder entsalzt, um die folgenden Anteile zu ergeben. Die Anteile HS-5 und HS-9 wurden weiter durch Behandlung mit Natrium Chelex gereinigt. Anteil Nr. Fliessmittel Volumen (ml) Ausbeute (mg) Cu-Gehalt (ppm)
Es wurde durch HPLC Gel-Permeations Chromatographie bestätigt dass die Anteile HS-9 Hexasaccharid waren. Das AlH-NMR Spektrum ist in Figur 1 gezeigt.

Beispiel 7

Chelat bildende Sepharose 6B (Pharmacia; 110 ml) wurden in ein Becherglas gegeben. Kupfer (Cu²&spplus;) Sulfat (0.5 M, IL) wurde zugegeben und das Gel wurde über Nacht sich selbst überlassen. Das Kupferion enthaltende Gel wurde auf einem Sinter-Glastrichter filtriert und gründlich mit Wasser (10 l) gewaschen. Es wurde dann einer Natriumchloridlösung (1M, 300 ml), enthaltend Natriumphosphat (0.1 M; pH 7.5) zugegeben (Buffer A). Das Gel wurde entlüftet und in eine Chromatographie Kolonne (40 x 2.6 cm) transferiert und mit dem Buffer A (100 ml) gewaschen. Ein Decasaccharid (DS-1) das gemäss Beispiel 5 erhalten wurde (5 g), wurde im Buffer A (15 ml) gelöst und am Kopf des Kupferion entaltenden Kolonne eingebracht. Die Eluierung wurde mit dem Buffer A bei 6.8 cm/Std. durchgeführt. Das Eluat wurde mit einem befestigten wellenlängen UV Detector (UV-214, Pharmacia) überwacht und die Anteile wurden gesammelt (20 Min./Rohr). Nach 30 Min. tauchte ein nicht gebundenes Material auf. Die Anteile, die das nicht gebundene Material enthalten, wurden zusammengelegt und konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet um Decasaccharid DS-2 zu ergeben. Die Kupfer Kolonne wurde dann mit Natriumchlorid (3 M), das Natriumphosphat (0.1 M, pH 7.5) Buffer B enthält, bei 6.8 cm/Std. für 7 Std. gewaschen. Keine Peaks erschienen im Chromatogram, während dieser Periode. Das Fliessmittel wurde dann auf Ammoniumchlorid (2 M) gewechselt und die Chromatographie wurde fortgesetzt bis ein Peak auftauchte. Anteile die diesem Peak entsprachen wurden gesammelt und zusammengelegt, konzentriert und in einer Amicon 8000 Ultrafilter Zelle unter Verwendung einer YCO 5 Membran entsalzt. Der Rückstand wurde mit Natriumchlorid (1 M, 2 x 300 ml) gewaschen und dann mit Wasser bis er frei von Chloridionen war. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet um einen Bindungsanteil (DS-3), 14 mg, Kupfergehalt 640 ppm zu ergeben. Keine weiteren Peaks erschienen bei fortgeführter Chromatographie mit 2M Ammoniumchlorid über Nacht.

Biologische Tests

Die Angiogenese Wirkung der chorioallantoischen Membran (CAM) zu Heparin, Heparansulfat oder Produkten die Heparin und/oder Heparansulfat Bestandteile enthalten wurde an befruchteten Eiern erforscht. Nicht inkubierte (0-Tag) befruchtete Eier die von Linköpings Kontrollhönseri, Linköping, Schweden erhalten wurden, wurden in einem nieder Temperatur Inkubator 13-17ºC gelagert bis sie fertig waren für die Inkubation bei 37ºC in einem Eiinkubator (Andersson & Bonde Typ 40). Inkubierte Eier (37ºC) wurden am dritten Tag der Inkubation (3-Tag) gespalten und der ganze Inhalt in eine Petrischale gegeben. Nur Eier mit intaktem Eigelb wurden für die weitere Inkubation in einem CO&sub2; Gewebe Kultur Inkubator mit 3% CO&sub2; bei 37CC mit erhöhter relativer Feuchtigkeit verwendet. Nach 3-tägiger Inkubation (6-Tage) in CO&sub2; Atmosphäre werden die Eier in einer Methylcellulose Schale, hergestellt wie unten beschrieben, Implantiert. Methylcellulose wird zu 3-fach destilliertem Wasser bei einer Konzentration von 0.5% zugegeben, dann 30 Min. im Autoklaven bei 138 kPa und 120ºC für die Sterilität behandelt. Diese Mischung wird einen Ball von gelierter Methylcellulose enthalten. Nachfolgende langsame Rührung, für 2 bis 3 Tage bei 5ºC, stellt eine vollständige Auflösung der Lösung sicher. Die Lösung wird dann in einem Kühlschrank gehalten bis sie fertig zur Verwendung ist. Das Versuchsmaterial ist in der Methylcelluloselösung bei Raumtemperatur bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 50 ug/10 ul suspendiert. Aliquoten von 10 ul Methylcellulose die die Versuchsprobe enthalten, werden am Ende des Teflonstabes (3 mm Durchmesser) ausgeschieden. Wenn die Methylcellulose Versuchsmaterialschale trocken (30 bis 40 Min.) ist, wird sie vom Teflon mit zwei feinen Pinzetten abgehoben und an den Randteil eines 6- Tage CAM gelegt um nicht wachsende Gefässe zu vermeiden. Am 8. Tag werden die wachsenden Gefässe unter und um die transparente Schale herum unter einem Präpariermikroskop (x 26 bis x 40 Vergrösserung) untersucht. Die Gefässwachstumshemmung wird entweder als keine Gefässwachstumshemmung oder als Gefässwachstumshemmung markiert. Jede Verbindung wird mit einem Minimum von 15 Eiern untersucht und die Kerbmarkierung wird durch zwei Techniker vorgenommen die nicht betreffs der Natur und Konzentration der Versuchssubstanz informiert sind.
Die Ergebnisse werden ausgedrückt als % Eier die Hemmung zeigen.

Beispiel 9

Kupfergehalt von Anteilen von Heparin Fragmenten der Erfindung (Tabelle 2)

Heparin Fragmente HF-1, HF-2 und HF-3 wurden auf Kupfer mittels einer Atom Absorptions Spektroskopie analysiert. Es wurde gefunden, dass sie 9 ppm, 5 ppm, beziehungsweise 255 ppm enthalten. Weitere Behandlung einer Lösung von Heparin Fragment HF-3 in destilliertem Wasser mit Chelex 100, welches Natriumionen enthält, ergab keine Abnahme im Kupfergehalt. Um den Kupfergehalt unter 10 ppm zu reduzieren, wurden die folgenden Schritte angewandt. Für all die ausgeführten Schritte wurde eine Diaflo Membran 5YCO5 in einer Amicon 8050 Ultrafilter Zelle verwendet.
Heparin Fragment (HF-3) wurde in Natriumchlorid (2 M, 50 ml) gelöst und zusätzlich mit Natriumchlorid (2 M; 250 ml) gewaschen und dann mit destilliertem Wasser (200 ml) und dann gefriergetrocknet. Dieses gefriergetrocknete Fragment wurde dann in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 0.1 M; pH 7.0; 50 ml) gelöst und mit zusätzlich 250 ml der gleichen Lösung gewaschen. Es wurde dann sukzessiv mit Natriumchlorid (1 M, 250 ml) und destilliertem Wasser (250 ml) gewaschen und dann gefriergetrocknet. Dieses gefriergetrocknete Fragment wurde einmal mehr in der gleichen Weise unter Verwendung von zweimal dem Waschvolumen behandelt und dann gefriergetrocknet. Das Heparin Fragment, bezeichnet HF-3A, hatte jetzt einen Kupfergehalt von 5 ppm. All die gefriergetrockneten obigen Zwischenprodukte wurden auf Kupfer analysiert aber nur nach allen Schritten war der Kupfergehalt weniger als 10 ppm.
Für die Zugabe von Kupferionen zu Heparin Fragment HF-3A wurde eine Stammlösung von Kupfer ((Cu²&spplus;) Chlorid wie folgt hergestellt: Kupfer (Cu²&spplus;) Chlorid x 2H&sub2;O (27.1 mg) wurde in eine Messflasche eingewogen und dreifach destilliertes Wasser wurde zu der Marke 10 ml zugegeben. Von dieser Lösung wurde 1 ml in eine zweite Messflasche abgezogen und dreifach destilliertes Wasser wurden bis zu der Marke 1,000 ml zugefügt. Diese Lösung enthielt 1.01 ug Cu/ml H&sub2;O. 5.2 mg von Heparin Fragment, die 5 ppm Kupfer (HF-3A) enthalten, wurde in dreifach destilliertem Wasser (2.0 ml) gelöst. 0.51 ml der Stammlösung wurden zugefügt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden belassen, dann gefriergetrocknet um ein Heparin Fragment HF-3B zu ergeben. Der Kupfergehalt, bestimmt durch Atom Absorptions Analyse, betrug 100 ppm.
Heparin Fragment HF-3A (5.9 mg) wurden in dreifach destilliertem Wasser (2.0 ml) gelöst und 3.80 ml der Stammlösung wurden zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Std. belassen und dann gefriergetrocknet, um ein Heparin Fragment HF- 3C zu ergeben, dessen Kupfergehalt durch Atom Absorptions Analyse 645 ppm betrug.
Heparin Fragment HF-3A (4.6 mg) wurde in 2.0 ml dreifach destilliertem Wasser gelöst, und 6.90 ml der Stammlösung wurden zugefügt, und die Mischung wurde für 4 Std. bei Raumtemperatur belassen, und dann gefriergetrocknet um ein Heparin Fragment HF-3D zu ergeben. Der Kupfergehalt durch Atom Absorption betrug 1,500 ppm.
HF-3C (3.6 mg) und HF-3D (4.1 mg) wurden in Wasser (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde dann gefriergetrocknet um ein Heparin Fragment HF-3E (7.6 mg) zu ergeben, welches 1100 ppm Kupfer enthielt, wie durch Atom Absorption bestimmt wurde.
Für die Zugabe von Kupferionen zu Heparin Fragment HF-2 wurden 20.0 mg HF-2 in 2.0 ml dreifach destilliertem Wasser gelöst und 3.17 ml der Stammlösung wurden zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden belassen und dann gefriergetrocknet, um ein Heparin Fragment HF-2A zu ergeben. Der Kupfergehalt durch Atom Absorptions Spectroskopie betrug 160 ppm.
Die Heparin Anteile wurden in der gleichen Weise behandelt wie die Heparin Fragment Anteile um Heparin Anteile H-3A, H-3B, H-3C und H2A zu geben.
Wie aus der Tabelle 2 entnommen werden kann, ist beinahe die ganze anti-Angionesische Wirkung verloren, wenn der Kupfergehalt reduziert wird. Zum Beispiel beträgt die % Hemmung 8 für das Fragment HF-3A verglichen mit 57 für das Fragment HF-3. Die Zugabe von Kupferionen erneuert die Aktivität, wie z.B. gesehen werden kann in den Fragmenten HF-3B, HF-3D und HF-3E die, 37, 70, beziehungsweise 53% Hemmung aufweisen. Ein ähnlicher Effekt, wie für Heparin Fragmente, kann auch für Heparin, vergleiche H-3A und H-3B mit H-3 der Tabelle 2, entnommen werden.

Claims

1. Heilmittel zur Behandlung einer Unpässlichkeit wo eine verminderte Angiogenesis erwünscht ist, umfassend einen Komplex von

(a) einem Metallion, welches Kupfer ist, und

(b) einem Anteil von Heparin, Heparansulfat, Heparin geringer Molekülmasse, Heparansulfat geringer Molekülmasse, Heparinfragmente, Heparansulfatfragmente und Oligosaccharide, abgeleitet von Heparin oder von Heparansulfat, oder einem Salz solcher Anteile, wobei diese Anteile Molekulargewichte von 500 bis 35.000 haben und das Salz ein physiologisch annehmbares Salz wie Natrium, Kalzium oder Ammoniumsalz ist, und wo die Anteile an diesem Metallion gebunden sind und dieser Komplex 5-1.000 nMol Metall pro uMol der Komponente (b) enthält.

2. Heilmittel gemäss Anspruch 1, umfassend einen Komplex, worin die Menge Kupfer 10 bis 1.000 nMol pro uMol der Komponente (b) beträgt.

3. Heilmittel gemäss der Ansprüche 1 oder 2, umfassend einen Komplex, worin die Komponente (b) Heparin oder Heparin geringer Molekülmasse oder ein Heparinfragment oder ein Oligosaccharid abgeleitet von Heparin ist.

4. Heilmittel gemäss Anspruch 3, umfassend einen Komplex, worin das Oligosaccharid ein Tetrasaccharid, ein Hexasaccharid, ein Octasaccharid, ein Decasaccharid, ein Dodecasaccharid, ein Tetradesaccharid oder ein Hexadecasaccharid ist.

5. Heilmittel gemäss der Ansprüche 1 oder 2, umfassend einen Komplex, worin die Komponente (b) Heparansulfat, Heparansulfat geringer Molekülmasse oder Heparansulfatfragmente oder ein Oligosaccharid, abgeleitet von Heparansulfat, ist.

6. Heilmittel gemäss Anspruch 5, umfassend einen Komplex, worin das Oligosaccharid ein Tetrasaccharid, ein Hexasaccharid, ein Octasaccharid, ein Decasaccharid, ein Dodecasaccharid, ein Tetradesaccharid oder ein Hexadecasaccharid ist.

7. Heilmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend einen Komplex, worin die Komponente (b) in Salzform vorliegt.

8. Heilmittel gemäss Anspruch 7, umfassend einen Komplex worin das Salz ein Natrium- oder Kalziumsalz ist.

9. Heilmittel gemäss Anspruch 8, umfassend einen Komplex worin das Salz ein Natriumsalz ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes gemäss den Ansprüchen 1-9, bestehend aus zufügen von Heparin, Heparansulfat, Heparin geringer Molekülmasse, Heparansulfat geringer Molkülmasse, Heparinfragmente, ein Heparansulfatfragment und Oligosaccharide abgeleitet von Heparin oder von Heparansulfat, zu einer festen Matrix, enthaltend Iminodiessigsäuregruppen an welche ein Kupferion gebunden ist, abtrennen des Anteils von zugefügtem Material, welches nicht an die Kupferionen auf der Matrix bindet und anschliessender Desorption des Anteiles der an die Matrix gebunden ist.

11. Verwendung eines Komplexes aus

(a) einem Metallion ausgewählt von Kupfer, Kalzium, Mangan, Eisen und Zinkionen, und

(b) einem Anteil von Heparin, Heparansulfat, Heparin geringer Molekülmasse, Heparansulfat geringer Molekülmasse, Heparinfragmente, Heparansulfatfragmente und Oligosaccharide abgeleitet von Heparin oder von Heparansulfat oder einem Salz solcher Anteile, wobei diese Anteile Molekulargewichte von 500 bis 35.000 haben und das Salz ein physiologisch annehmbares Salz wie Natrium, Kalzium oder Ammoniumsalz ist, und wo die Anteile an diesem Metallion gebunden sind und dieser Komplex 5 bis 1.000 nMol Metall pro uMol der Komponente (b) enthält, zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Unpässlichkeit, wo eine verminderte Angiogenesis erwünscht ist.

12. Verwendung gemäss Anspruch 11, worin das Heilmittel den Komplex in Verbindung mit einer angiostatischen Komponente, besonders einer sogenannten angiostatischen Steroid-Komponente, umfasst.