DE3750785T2

DE3750785T2 - Oligosaccharide von Heparin mit einer Affinität für Faktoren von Zellwachstum.

Info

Publication number: DE3750785T2
Application number: DE3750785T
Authority: DE
Inventors: Jean Choay; Jean-Claude Lormeau; Maurice Petitou
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1986-04-17
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1995-06-22
Anticipated expiration: 2007-04-17
Also published as: PT84719A; DE3750785D1; JPS6366192A; EP0244298A3; US5034520A; EP0244298A2; FR2597484B1; FR2597484A1; ATE114674T1; CA1339925C; PT84719B; EP0244298B1

Description

Die Erfindung betrifft Oligosaccharide des Heparin-Typs (Heparin oder Heparansulfat) sowie deren Fragmente, die eine Wirkung bezüglich der Zellteilung und Zelldifferenzierung ausüben, ihre Herstellung und ihre therapeutischen Anwendungen.
Es ist bekannt, daß Heparin, wie Heparansulfat, stark heterogene Glykosaminoglykane sind. Sie sind somit aus Ketten gebildet, die aus alternierenden Zuckerresten aufgebaut sind, d. h. Resten der D-Glucosaminstruktur und Resten der Uronsäurestruktur (L-Iduronsäure oder D-Glucuronsäure) oder umgekehrt. Diese Grundstruktur kann regelmäßig sein mit einer Verknüpfung von [D-Glucosamin] - [L-Iduronsäure]-Disaccharideinheiten oder unregelmäßig, wobei eine Uronsäureelnheit alternierend eine L-Iduronsäure und eine D-Glucuronsäure ist.
Darüber hinaus kann das Molekulargewicht dieser Ketten stark unterschiedlich sein und von etwa 2.000 bis 50.000 betragen. Weiterhin variiert die Ionenladung einer Einheit der gleichen Struktur in Abhängigkeit von ihrem Gehalt an Sulfatgruppen.
Dieser heterogene Charakter manifestiert sich in unterschiedlichen Wirkungen dieser Ketten in Abhängigkeit von den darin enthaltenen Sequenzen.
Es ist bekannt, daß etwa ein Drittel der Heparinketten eine Bindungsstelle für ATIII (Antithrombin III) besitzt. Diese Ketten besitzen eine spezifischere Wirkung gegenüber bestimmten Faktoren der Blutkoagulation.
Die 2/3 der Heparinketten, die frei sind von einer Bindungsstelle für ATIII sind andererseits frei von einer antikoagulierenden Wirkung, die auf diese Stelle zurückgeht.
Es wurde auch über die Affinität bestimmter Zellwachstumsfaktoren für Heparin berichtet. Diese Affinität wird dazu verwendet. Wachstumsfaktoren der Zellen durch Affinitätschromatographie über Heparin-Sepharose -Säulen zu reinigen.
Die Wachstumsfaktoren der Zellen, die eine Affinität für Heparin besitzen, sind anionische oder kationische Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 12.000 bis 20.000 und spielen eine Schlüsselrolle in der Zellphysiologie. Sie besitzen insbesondere eine Wirkung auf die Teilung und Differenzierung der Zelle. Diese Wirkung erstreckt sich insbesondere auf bestimmte Zelltypen, wie fibroblastische Zellen, kapillare endotheliale Zellen und bestimmte Muskelzellen. Sie sind weiterhin bei der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt.
Diese Faktoren werden abgekürzt als FGF für "Fibroblastic Growth Factor" oder ECGF, Abkürzung für "Endothelial Cell Growth Factor" bezeichnet (siehe die Veröffentlichungen von J. Courty, Y. Courtois und D. Barritault in: Biochimie, Vol. 66(1984), S. 419-429 und von Roy R. Lobbund James W. Fett in: Biochemistry, Vol. 23, Nr. 26 (1984); S. 6295-6299).
Zur Verdeutlichung des Standes der Technik kann man die EP-A-0 140 781 nennen, welche verschiedene Heparine mit niedrigem Molekulargewlcht beschreibt und insbesondere NH&sub2;-substituierte Heparlne. und die EP-A-0 114 589, welche Heparinfragmente offenbart, die man durch Abbau mit Heparinase erhält. Alle diese Heparine und Heparinfragmente besitzen D-Glucuronsäureeinheiten.
Es ist weiterin festzuhalten, daß der in der folgenden Beschreibung und den Patentansprüchen benutzte Begriff "Oligosaccharid" oder auch der Begriff "Glykosaminoglykan" native Produkte, durch Depolymerisation von längeren Glykosaminoglykanketten erhaltene Oligosaccharidfragmente sowie auf synthetischem Wege erhaltene Oligo- oder Polysaccharidsequenzen umfaßt. Bei diesen Fragmenten und Sequenzen können die am reduzierenden Ende und/oder am nichtreduzierenden Ende vorhandenen Einheiten chemisch modifiziert sein im Vergleich zu den Resten, die denjenigen natürlicher Ketten von Heparin oder Heparansulfat entsprechen. Diese modifizierten Einheiten werden in der folgenden Beschreibung und in den Patentansprüchen ebenfalls als Zuckerreste oder Oligosaccharideinheiten bezeichnet.
Es konnte überraschenderweise von den Erfindern festgestellt werden, daß die oben angesprochenen Wachstumsfaktoren nur für bestimmte Oligosaccharidketten eine erhöhte Affinität besitzen. Die Untersuchung dieser Affinität im Hinblick auf die Abtrennung dieser Ketten hat es ermöglicht, nachzuweisen, daß Oligosaccharidfamilien, die im Hinblick auf ihr Molekulargewicht homogen sind, in der Tat aus einer Mischung aus einer Vielzahl von anionischen Molekülen unterschiedlicher Ladung gebildet sind und daß die am stärksten anionischen Vertreter regulierende Wirkungen auf die Teilung und die Differenzierung von Zellen ausüben, was pharmakologisch von hohem Interesse ist.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung von Oligosacchariden des Typs Heparin oder Heparansulfat, die eine erhöhte Affinität für Zellwachstumsfaktoren, die sich an Heparin zu binden vermögen, besitzen.
Sie zielt weiterhin darauf ab, ein Verfahren zur Herstellung dieser Oligosaccharide anzugeben.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist auf die Anwendung dieser Oligosaccharide für die Herstellung von Arzneimitteln gerichtet, die bezüglich der Teilung und Differenzierung von Zellen wirksam sind.
Die erfindungsgemäßen Oligosaccharide sind Produkte, die im wesentlichen aus Ketten gebildet sind, die
- eine spezifische Affinität für die Heparin erkennenden kationischen oder anionischen Zellwachstumsfaktoren besitzen,
- mindestens eine Sequenz von 5 Monosaccharideinhelten umfassen, die jenen entsprechen, die in natürlichem Heparin enthaletn sind, und besitzen eine starke Anionizität, wie sie durch das in der Figur 1 dargestellte NMR-Spektrum charakterisiert wird, sowie die pharmakologisch annehmbaren Salze dieser Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Oligosaccharide entsprechen der nachfolgenden Formel III:
R(GH)nR' (III)
in der
- n eine Zahl mit einem Wert von 2 bis 6,
- G-H eine Disaccharidkette der Struktur (L-Iduronsäure-2-O-sulfat)-(D-Glucosamin-NH-sulfat-6-O-sulfat),
- G eine L-Iduronsäure-2-O-sulfat-gruppe,
- H eine D-Glucosamin-NH-sulfat-6-O-sulfat-gruppe,
- R entweder ein Wasserstoffatom oder eine Disaccharideinheit G'-H, worin die Gruppe G' für den Rest einer α,β-ungesättigten Uronsäure steht,
- R' entweder ein Wasserstoffatom oder eine Disaccharideinheit G-H', worin die Gruppe H' eine 2,5-Anhydromannitol- oder 2,5-Anhydromannonsäure-gruppe bedeuten.
mit der Maßgabe, daß die Bedeutungen von R und R' derart sind, daß die Gesamtzahl der Monosaccharideinheiten der Oligosaccharide einschließlich der modifizierten Einheiten höchstens 14 beträgt,
- die dazu fähig sind, sich in einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer pH 7,4, 0,2 M NaCl an anionischen FGF, der an eine Chromatographiesäule fixiert ist, zu binden, und deren pharmakologisch annehmbare Salze.
In vorteilhafter Weise sind solche Oligosaccharide wirksam im Hinblick auf den Mechanismus der Teilung und Differenzierung der Zellen, ohne daß eine Wirkung auf das Koagulationssystem erfolgt, was eine Folge der Tatsache ist, daß sie frei sind von einer Bindungsstelle für ATIII.
Die Disaccharidkette GH entspricht insbesondere der Struktur II:
in der B&spplus; ein anorganisches oder organisches Kation darstellt, welches ein physiologisch annehmbares Salz ergibt.
In der Gruppe der Oligosaccharide der obigen Formel III werden die nichtreduzierenden und die reduzierenden Enden durch eine intakte Monosaccharideinheit (Zuckerrest) gebildet, d. h. eine Einheit. die eine OH-Gruppe in der 4-Stellung bzw. an dem anomeren Kohlenstoffatom In der 1-Stellung aufweist.
Bei einer weiteren Gruppe tragen die Oligosaccharide am nichtreduzierenden Ende und/oder am reduzierenden Ende eine Gruppe, die von einem D-Glucosamin- Zuckerrest oder der L-Iduronsäure verschieden ist.
Es handelt sich insbesondere um eine Monosaccharideinheit (Zuckerrest), die chemisch in bezug auf die entsprechende Einheit einer Heparinkette modifiziert worden ist.
Als Folge der üblicherweise verwendeten Mittel zur Depolymerisation von Heparin, d. h. salpetrige Säure oder eine Heparinase, ist die Einheit am reduzierenden Ende eine Einheit mit einer 2,5-Anhydromanno-Struktur, d. h. eine 2,5-Anhydromannitolgruppe oder eine 2,5-Anhydromannonsäuregruppe, und die am nichtreduzierenden Ende ist eine α,β-ethylenisch ungesättigte Uronsäuregruppe.
Es ist jedoch für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß es auf synthetischem Wege möglich ist, an jedes der Enden verschiedene organische Gruppen einzuführen, solange sie die therapeutischen Eigenschaften der oben definierten Saccharidsequenzen nicht modifizieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Oligosaccharide im übrigen im Hinblick auf ihren Polymerisationsgrad homogen. d. h. bezüglich der Anzahl der ihre Ketten bildenden Einheiten.
Ein besonders vorteilhaftes Oligosaccharid ist ein Hexasaccharid.
Ein solches Hexasaccharid ist aus drei sich wiederholenden Disaccharidketten der Struktur [L-Iduronsäure-2-O-sulfat] - [D-Glucosamin-NH-sulfat, 6-O-Sulfat] gebildet. Es handelt sich um das Produkt der Formel III, worin R und R' jeweils beide ein Wasserstoffatom darstellen und n den Wert 3 besitzt.
Gemäß einer Variante sind die Einheiten am nichtreduzierenden Ende und/oder am reduzierenden Ende im Vergleich zu der in Heparin vorhandenen entsprechenden Einheit chemisch modifiziert worden. Die entsprechenden Hexasaccharide werden durch die Formel III verdeutlicht, In der R und/oder R' eine modifizierte Monosaccharideinheit darstellen.
Gemaß einer weiteren Ausführungsform entspricht das erfindungsgemäße Hexasaccharid
- einem Produkt. das In einer Fraktion enthalten ist, die jener entspricht, die zwischen einem Volumen von 32 bis 36 l von einem Gelfiltrationssystem eluiert wird, auf das man in Lösung in 500 ml 0,5 M NaCl 60 g eines Niederschlags, den man durch alkoholische Ausfällung aus einer durch Nitrit-Depolymerisation von Heparin gewonnenen Mischung erhalten hat, auf eine Säule mit den Abmessungen 100 cm x 25 cm, die 45 Liter Agarose-Acrylamid enthält, das mit einem 0,5 M NaCl-Puffer, pH 6,0, ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufträgt und die Elution mit einem Durchsatz von 1500 ml/Stunde bewirkt,
- welches Produkt durch Affinitätschromatographie über anionischer FGF- Sepharose abgetrennt wird unter Verwendung einer Säule mit den Abmessungen 2,5cm x 6,5cm, die mit einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 0,2 M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden ist und 30 ml anionische FGF-Sepharose enthält, auf welche Säule man 300 mg der oben beschriebenen Fraktion, gelöst in 60 ml des gleichen Puffers, aufträgt und mit diesem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer eluiert und das Oligosaccharid der aufgefangenen Fraktion mit Hilfe von Ethanol ausfällt.
Ein weiteres vorteilhaftes Oligosaccharid wird durch ein Octasaccharid gebildet. Es handelt sich insbesondere um ein Octasaccharid, welches eine Hexasaccharidsequenz der oben definierten Art enthält. Im Vergleich zu der entsprechenden Struktur, die man in Heparin findet, ist das Octasaccharid durch nichtmodifizierte Einheiten gebildet oder enthält, wie oben für das Hexasaccharid definiert, am nichtreduzierenden Ende und/oder am reduzierenden Ende eine modifizierte Einheit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Octasaccharid dadurch gekennzeichnet, daß es:
- einem Produkt entspricht, das in einer Fraktion enthalten ist, die jener entspricht, die zwischen einem Volumen von 28 bis 32 l von einem Gelfiltrationssystem eluiert wird, auf das man in Lösung in 500 ml 0,5 M NaCl 60 g eines Niederschlags, den man durch alkoholische Ausfällung aus einer durch Nitrit-Depolymerisation von Heparin gewonnenen Mischung erhalten hat, auf eine Säule mit den Abmessungen 100 cm x 25 cm, die 45 Liter Agarose-Acrylamid enthält, das mit einem 0,5 M NaCl-Puffer, pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufträgt. und die Elutlon mit einem Durchsatz von 1500 ml/Stunde bewirkt,
- welches produkt durch Affinitatschromatographle über anionischer FGF- Sepharose abgetrennt wird unter Verwendung einer Säule mit den Abmessungen 2,5cm x 6,5cm, die mit einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 7.40.2 M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden ist und 30 ml anionische FGF-Sepharose enthält, auf welche Säule man 300 mg der oben beschriebenen Fraktion, gelöst in 60 ml des gleichen Puffers, aufträgt und mit diesem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer eluiert und das Oligosaccharid der aufgefangenen Fraktion mit Hilfe von Ethanol ausfällt.
Weitere vorteilhafte Oligosaccharide sind Decasaccharide, bei denen die Monosaccharideinheiten am reduzierenden Ende oder am nichtreduzierenden Ende chemisch modifiziert worden sind.
Solche Decasaccharide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie
- in einer Fraktion enthalten sind, die einem Elutionsvolumen zwischen 25 und 28 l in einem Gelfiltrationssystem der oben beschriebenen Art für die Gewinnung des Octasaccharids entspricht, und die durch Affinitätschromatographie über anionischer FGF-Sepharose unter Anwendung der für das Octasaccharid angegebenen Bedingungen abgetrennt werden.
Die Oligosaccharide, die aus Ketten gebildet sind, die 12 Monosaccharideinheiten umfassen und die gegebenenfalls an ihren Enden, wie oben beschrieben, chemisch modifiziert worden sind, sind ebenfalls vorteilhafte Produkte.
Die erfindungsgemäßen Oligosaccharide können in Form von physiologisch annehmbaren Salzen vorliegen. Genannt seien insbesondere die Salze von Calcium, Natrium, Kalium und Magnesium.
Die Erfindung erstreckt sich weiterhin auf ein Verfahren zur Gewinnung der oben definierten Oligosaccharide.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Glykosaminoglykanpräparate des Typs Heparin oder Heparansulfat mit einem anionischen oder kationischen Zellwachstumsfaktor, der mit Vorteil an einen Träger gebunden ist, in Kontakt bringt und durch Verwendung von Puffern mit definierten Ionenstärken die Ketten, die keine oder eine mittlere Affinität für den Wachstumsfaktor aufweisen, eliminiert und dann die an den Wachstumsfaktor gebundenen Saccharidketten gewinnt.
Diese Arbeitsweisen ermöglichen die Abtrennung einer Mischung aus Ketten mit starker Anionizität.
Man verwendet als Ausgangsmaterial Glykosaminoglykanpräparate, aus denen man im wesentlichen die Ketten oder Fragmente eliminiert, die eine Bindungsstelle für ATIII besitzen. Diese Präparate sind aus Mischungen von Ketten von nativem Heparin oder Heparansulfat gebildet oder aus Fragmenten der Depolymerisation solcher Ketten von nativem Heparin oder Heparansulfat oder aus Mischungen von Ketten oder Fragmenten, die höchstens 14 Einheiten enthalten.
Das Inkontaktbringen der Glykosaminoglykanpräparate mit dem Zellwachstumsfaktor wird mit Vorteil in einer Chromatographiesäule bewirkt, die mit einem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Der Zellwachstumsfaktor ist mit Vorteil an einen Träger gebunden. Geeignete Träger sind solche auf der Grundlage von Polysacchariden, insbesondere von Agarose. Ein für diese Anwendung geeigneter Träger dieses Typs wird durch ein Agarosegel gebildet, das im Handel unter der Marke Sepharose vertrieben wird. Man kann auch blutverträgliche Matrizes verwenden, die beispielsweise aus gepfropften Polystyrolen gebildet sind, insbesondere Träger, wie sie in der französischen Patentanmeldung 2 534 486 vom 15.10.1982 des Commlssariat l'Energie Atomique und in der französischen Patentanmeldung 2 553 518 vom 13.10.1983 von CHOAY S.A. und C.N.T.S. beschrieben sind.
Eine zufriedenstellende Trennung erfolgt dadurch, daß man ein Präparat von Glykosaminoglykanen über eine zuvor bebildete Matrix führt, an der ein anionischer oder kationischer Zellwachstumsfaktor gebunden ist, die mit einem Puffer mit einer Ionenstärke, die einer Konzentration von 0,2 M NaCl entspricht, ins Gleichgewicht gebracht worden ist, und dann die von der Säule zurückgehaltene Oligosaccharidfraktion eluiert, indem man den Puffer auf eine Ionenstärke einstellt, die einer NaCl-Konzentration von 1 M bis 2 M entspricht.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung bewirkt man die Affinitätschromatographle über den Zellwachstumsfaktor an einer Fraktion von Glykosaminoglykanen, die im Hinblick auf ihr Molekulargewicht homogen sind, um in dieser Weise aus einer gegebenen Fraktion einen Typ von Glykosaminoglykanen mit bestimmten Eigenschaften abzutrennen.
Man erhält eine Fraktion von Glykosaminoglykanen dieser Art mit Vorteil dadurch, daß man ein Glykosaminoglykanpräparat der oben definierten Art einer Gelfiltrationsbehandlung unterzieht.
Durch Elution der auf den Kopf der Gelsäule aufgetragenen Mischung mit Hilfe eines geeigneten Puffers gewinnt man nacheinander in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht homogene Oligosaccharidfraktionen. Man verwendet Gele, die in klassicher Weise für solche Maßnahmen angewandt werden, beispielsweise Gele des Agarose-Acrylamid-Typs.
Eine zufriedenstellende Trennung dieser Fraktionen bewirkt man durch Eluieren mit einem Puffer mit einer Ionenstärke, dlejener eines NaCl-Puffers von etwa 0,5 M entspricht.
Die Säulenabströme, die der gewünschten Glykosaminoglykanfraktion entsprechen, werden aufgefangen und die Fraktion wird nach der Zugabe eines anorganischen Salzes mit einem alkoholischen Lösungsmittel, insbesondere Ethanol, ausgefällt. Die gewonnene Fraktion, die bezüglich des Molekulargewichts der Ketten homogen ist, ist andererseits im Hinblick auf die Ionenladung stark heterogen.
Das Präparat von Glykosaminoglykanen, das aus der Mischung von Ketten, die zu fraktionieren und dann bezüglich ihrer Affinität für Wachstumsfaktoren zu trennen sind oder direkt mit Hilfe dieser Faktoren ohne Fraktionierung zu trennen sind, erhält man insbesondere durch Depolymerisation von Heparin, gefolgt von einer Fraktionierung zur Trennung der Ketten, die eine Bindungsstelle für ATIII aufweisen, von Ketten, die frei von einer solchen Stelle sind.
Die bekannten Depolymerisationsverfahren beruhen Insbesondere auf der Einwirkung von salpetriger Säure, von Heparinase, von Heparitinase oder von Periodat auf Heparin, wobei die Salpetrigsäure-Depolymerisation oder die mit Periodat für die technische Anwendung am Interessantesten ist. Das verwendete Heparin ist ein rohes Heparin oder eines mit pharmazeutischer Qualität.
Die eingesetzten Depolymerisatlonsfragmente können am nichtreduzierenden Ende und am reduzierenden Ende eine Einheit aufweisen, die im Vergleich zu der entsprechenden Struktur, die man in Heparin findet, modifiziert ist: es handelt sich dabei um eine α,β-ungesättigte Uroneinheit im Fall der Depolymerisation mit Heparase, Heparitinase oder einer α,β-Eliminierung, oder um eine Gruppe mit der 2,5-Anhydromanno-Struktur im Fall einer Depolymerisatlon mit salpetriger Säure.
Eine milde Nitrit-Depolymerisation entspricht jener, die Gegenstand der französischen Patentanmeldung Nr. 2 503 714 der Anmelderin vom 10.04.1981 ist. Nach dem Verfahren dieser Anmeldung setzt man Heparin und salpetrige Säure in wäßrigem Medium unter solchen Konzentrationen um, daß sämtliche Nitritionen verbraucht sind, wenn der gewünschte Depolymerisationsgrad erreicht ist.
Mit Vorteil werden die am Ende der Salpetrigsäure-Deaminierung erhaltenen reduzierenden Gruppen der 2,5-Anhydromannose-Struktur anschließend mit einem Reduktionsmittel, wie Natriumtetrahydroborat, zu Gruppen mit der 2,5-Anhydromannitol-Struktur reduziert oder mit einem Oxidationsmittel, wie einem Permanganat, insbesondere Kaliumpermanganat, zu Gruppen mit 2,5-Anhydromannonsäure-Struktur oxidiert.
Die Fraktionierung der gegenüber ATIII affinen und nichtaffinen Ketten besteht mit Vorteil in einer alkoholischen Fraktionierung, Insbesondere einer ethanolischen Fraktionierung in Gegenwart eines anorganischen Salzes, welche zu:
- einer Untereinheit, die aus Fragmenten, deren Größe im wesentlichen 10, 12, 14, 16 und 18 Saccharideinheiten von Heparin entspricht, gebildet ist und die die Pentasaccharideinheit mit der Bindungsstelle für Antithrombin III aufweist und eine starke Anti-Xa-Faktor-Wirkung und eine schwache globale antikoagulierende Wirkung aufweist,
- und einer Untereinheit führt, die aus Fragmenten mit einer Größe von im wesentlichen 2, 4, 6, 8 und 10 Saccharideinheiten des Heparins gebildet ist und die praktisch frei ist von einer globalen antikoagulierenden Wirkung und die eine sehr geringe Anti-Xa-Faktor-Wirkung aufweist.
Gemäß einer Variante erhält man die erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane durch Ionenaustausch mit stark basischen Anionenaustauschern, wie quaternären Ammoniumaustauschern, indem man die Ionenstärke des für die Elution verwendeten Puffers gemäß einem geeigneten Gradienten variiert.
Die Verwendung eines Puffers für das Insgleichgewichtbringen und das Spülen und dann eines Elutionspuffers, der Ionenstärken aufweist, diejenen eines 0,5 M ± 0,1 M NaCl-puffers und dann einem NaCl-Puffer mit 1 bis 2 M entsprechen, ermöglicht die Abtrennung der gewünschten affinen Ketten aus der Mischung in zufriedenstellender Weise.
Eine zufriedenstellende Abtrennung von Saccharidketten des Glykosaminoglykan-Typs mit starker Anionizität, wie sie oben definiert worden sind, erreicht man dadurch, daß man die Ionenstärke des Glelchgewichtspuffers von einem Wert, der einer NaCl-Konzentration von 0,4 M entspricht, zu einem Wert, der einer Konzentration von 1 M entspricht, variiert, wobei der Gradient an dem Typ der zu trennenden Glykosaminoglykane angepaßt ist, insbesondere an die Länge ihrer Ketten.
Die pharmakologische Untersuchung der erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane verdeutlicht ihre Wirkungen auf die Teilung und die Differenzierung von Zellen.
Es ist bekannt, daß die Zellwachstumsfaktoren mit Affinität für Heparin insbesondere dadurch wirken, daß sie sich an die Rezeptoren von Zellen unterschiedlicher Kategorien binden, die man bei verschiedenen Zelltypen findet.
Wie die Erfinder erkannt haben, modifizieren die erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane die Aktivität dieser Wachstumsfaktoren.
Bestimmte Zellen können autokrin sein (in dem von M.B. Spron und G.J. Todaro, New Engl. J. Med., 303 (1980), 878-880 definierten Sinne) und ermöglichen den Nachweis des modulierenden Potentials, d. h. des aktivierenden oder inhibierenden Potentials (insbesondere gemäß dem Phenotyp, dem Zustand der Differenzierung der in Rede stehenden Zellen), der erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane auf die Teilung und die Differenzierung der Zellen, ohne Zugabe des Wachstumsfaktors.
Es wurden Versuche durchgeführt unter Anwendung von besonderen experimentellen Modellen unter Verwendung von Kulturen von endothelialen Kapillarzellen von Mäusen und Rindern oder der Nabelvene vom Menschen durchgeführt. Sie haben eine Modulierung der Zellvermehrung im Vergleich zu einer von Glykosaminoglykanen freien Kontrollkultur gezelgt oder im Vergleich zu einem Vergleichs-Hexasaccharid, das frei ist von einer Affinität für anionischen FGF.
Man kennt weiterhin die inhibierende Wirkung von bestimmten Steroiden in Gegenwart von Heparinfragmenten auf die Neoangiogenese. Die zusammen mit Corticoiden verabreichten erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane haben bei dem experimentellen Modell der Chorionallantoismembran des Huhns, das von J. Folkman et al. in Science, 221 (1983). 719 beschrieben worden ist, eine vorteilhafte Wirkung dieses Typs gezeigt.
Diese vorteilhaften Eigenschaften werden von einer großen Unschädlichkeit begleitet.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane als Modulatoren der Vermehrung von endothelialen Zellen. Sie können entweder in geringen Dosierungen als Inhibitoren bei den Prozessen, wo die Neoangiogenese pathologisch ist, oder in starken Dosierungen als Stimulatoren des Wachstums bei bestimmten Prozessen, wo der Schutz der Wachstumsfaktoren notwendig oder eine Regenerierung erwünscht ist, wirken.
Als Beispiel für einen Prozeß der pathologischen Neoangiogenese kann man Retinopathien von Diabetikern, die Entwicklung von Metastasen und die Psoriasis nennen.
Die erfindungsgemäßen Produkte können auch dazu verwendet werden, die Einbryonenentwicklung zu inhibieren.
Man kann auch die Verwendung der erfindungsgemaßen Produkte zur Stimulierung der Regenerierung von bestimmten Fällen von endothelialen Schädigungen oder von Nekrosen, die sich als Folgen von Zirkulationsstörungen ergeben, wie beispielsweise von Ulcus cruris, in Betracht ziehen. Man kann sie auch zur Behandlung von Verletzungen traumatischen oder angeborenen Ursprungs oder von erworbenen pathologischen Degenerationserscheinungen, Insbesondere von Herzgewebeschädigungen nach Gefäßschädigungen, wie Infarkten, in Betracht ziehen.
Die Erfindung erstreckt sich weiterhin auf pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine wirksame Menge mindestens eines Glykosaminoglykans der oben definierten Artin Kombination mit einem pharmazeutischen Trägermaterial enthalten.
Bevorzugte pharmazeutische Zubereitungen enthalten das weiter oben beschriebene stark anionische Hexasaccharid oder auch das Octasaccharid, das Decasaccharid oder das Dodecasaccharid oder eine Mischung dieser Materialien in Form ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze.
Der Wirkstoff dieser Arzneimittel umfaßt das Glykosaminoglykan allein oder gemäß einer Variante in Kombination mit einem Zellwachstumsfaktor, der eine Affinität für Heparin besitzt. Gemaß einer weiteren Ausführungsform verwendet man das Glykosaminoglykan und den Wachstumsfaktor gleichzeitig ohne vorhergehendes Vermischen diese Wirkstoffe.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane kann man diese in Kombination mit einem Steroid verwenden.
Aufgrund ihrer Wirkung auf die Teilung und Differenzierung von Zellen sind diese pharmazeutischen Zubereitungen insbesondere für die Behandlung der folgenden therapeutischen Indikationen geeignet:
- Stimulierung der Wiederherstellung von Muskelgewebe nach Verletzungen, insbesondere traumatischen Ursprungs oder von angeborenen Verletzungen; des Herzgewebes nach Schädigungen. die durch Gefäßbeeinträchtigungen verursacht sind, wie Infarkten; von Hautgewebe nach Verletzungen insbesondere traumatlschen Ursprungs,
- Beschleunigung der Vernarbung nach Verletzungen traumatischen Ursprungs,
- allein oder in Kombination mit Steroiden zur Inhiblerung von Prozessen, bei denen die Neoangiogenese pathologisch ist, wie Retinopathien bei Diabetikern, die Entwicklung von Metastasen und der Psoriasis.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können in unterschiedlicher Form verabreicht werden.
Diese pharmazeutischen Formen können wasserhaltig sein. wenn das Glykosaminoglykan allein für die Bildung des Wirkstoffs verwendet wird. Sie müssen wasserfrei sein, wenn der Wirkstoff einen Wachstumsfaktor enthält. Dieser letztere ist in einer Menge von 1 bis 200 ug pro Dosiseinheit, vorzugsweise in einer Menge von 25 bis 100 ug, vorhanden.
Zur Verabreichung auf oralem Wege verwendet man insbesondere Gelkapseln, Tabletten, Kompretten, Pillen oder Liposome. Diese Zubereitungen enthalten vorzugsweise 50 mg bis 5 g pro Dosiseinhelt und vorzugsweise 50 bis 250 mg im Fall von Gelkapseln, Tabletten und Pillen.
Andere Verabreichungsformen der erfindungsgemäßen Zubereitungen umfassen Sprühprodukte, Salben, Cremes oder gegebenenfalls Aerosole, wobei die Konzentration des Wirkstoffs im Bereich von 0,5 bis 10 % liegt.
In vorteilhafter Weise werden die erfindungsgemäßen Produkte in Form von injizierbaren Zubereitungen auf intravenösem, subkutanem oder intramuskulärem Wege in Form von sterilen oder sterilisierbaren Lösungen verabreicht.
Mit Vorteil verwendet man die erfindungsgemäßen Produkte in Kombination mit Wachstumsfaktoren, insbesondere im Fall von topisch anzuwendenden Präparaten.
Die zur Verabreichung auf intravenösem, subkutanem oder intramuskulärem Wege geeigneten Lösungen enthalten mit Vorteil 10 bis 250 mg/ml der Glykosaminoglykan-Zubereitungen, bevorzugter 10 bis 100 mg/ml, beispielsweise 100 mg/ml, wenn diese Lösungen auf subkutanem Wege verabreicht werden. Sie können beispielsweise 10 mg bis 500 mg, insbesondere 150 mg/ml der Glykosaminoglykane enthalten, wenn sie durch Injektion auf intravenösem Wege oder durch Perfusion verabreicht werden.
Mit Vorteil liegen solche pharmazeutischen Zubereitungen in Form von nicht wiederverwertbaren anwendungsfertigen Injektionsspritzen vor.
Zur Verdeutlichung der Erfindung sei im folgenden ein Beispiel einer für den Menschen geeigneten Dosierung angegeben: Diese Dosierung umfaßt beispielsweise die Verabreichung von etwa 30 bis 500 mg des Wirkstoffs pro Tag in einer oder mehrfacher Gabe auf subkutanem oder intravenösem Wege an den Patienten. Bei der Verabreichung auf intravenösem Wege gibt man etwa 150 mg/Tag unter Berücksichtigung der Tatsache, daß bei der Verabreichung durch Perfusion die injizierten Mengen mehrere 10 ml betragen können. Diese Verabreichungen bewirkt man diskontinuierlich in regelmäßigen Intervallen oder kontinuierlich durch Perfusion. Diese Dosierungen können natürlich fürjeden Patienten in Abhängigkeit von den Ergebnissen und den zuvor durchgeführten Analysen, der Art der Erkrankungen, an der er leidet, und ganz allgemein von seinem Gesundheitszu stand eingestellt werden.
Die oben beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen können darüber hinaus eine Steroidverbindung in Mengen enthalten, welche die Verabreichung von verträglichen Dosierungen an den Patienten ermöglichen.
Insbesondere kann die Menge des Steroids derart sein, daß die an den Patienten verabreichte Dosis 5 mg/kg/Tag nicht übersteigt.
Bei anderen Zubereitungen kann dieses Dosis größer sein. Diese Dosierungen können insbesondere dann erhöht sein, wenn es sich um Steroidderivate handelt, die ihre hormonelle Wirkung verloren haben.
Die Erfindung betrifft weiterhin biologische Reagenzien, deren Wirkprinzipien durch die Glykosaminoglykan-Zubereitungen der oben definierten Art gebildet werden. Diese biologischen Reagenzien können als Vergleichsstandard bei Untersuchungen eventueller antitumoraler Eigenschaften anderer Substanzen verwendet werden, Insbesondere bei Testverfahren, bei denen Methoden angewandt werden, die bei den obigen Beispielen beschrieben worden sind.
Die erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane können in üblicher Weise an unlösliche Gele und andere übliche inerte unlösliche Matrizes oder Trägermaterialien gebunden werden, um Träger für die Affinitätschromatographie zu ergeben, welche zur Durchführung von Trennungen eingesetzt werden können. Als geeignete Träger kann manjene nennen, die durch ein Polysaccharid gebildet werden, Insbesondere ein Agarosegel, wie das unter der Marke Sepharose vertriebene Material, wobei die hydrophilen unlöslichen Trägermaterialien ganz allgemein Aminoethylpfropfgruppen aufweisen, wie Aminoethyl-Cellulose, Aminoethyl-Polyacrylamid und Aminoethyl-Agarose. Die Glykosaminoglykane werden durch Kondensation, beispielsweise in basischem wäßrigem Medium, in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid gemäß dem folgenden Reaktionsschema an diese Träger gebunden: Matrix Clycosaminoglykane Oligosaccharid
Die in dieser Weise erhaltenen Matrizes werden in Säulenform gebracht.
Wenn man die an die oben definierten Trägermaterialien oder Matrizes gebundenen erfindungsgemäßen Glykosaminoglykane mit anionischen oder kationischen Zellwachstumsfaktoren in Kontakt bringt, verfügt man über Möglichkeiten, die es ermöglichen, selektiv Zellwachstumsfaktoren zurückzuhalten. Diese gebundenen oder fixierten Glykosaminoglykane sind somit als Liganden für die Reinigung von Zellwachstumsfaktoren geeignet oder dazu, die Konzentration dieser Faktoren in einem gegebenen Medium zu verringern.
In vorteilhafter Weise bewirkt man die Abtrennung der Wachstumsfaktoren wie folgt:
- Man bringt den rohen Extrakt oder die Lösung, der bzw. die den zurückzuhaltenden Zellwachstumsfaktor enthält, durch Perkolation auf eine Säule mit neutralem pH-Wert mit einem Puffer mit schwacher Ionenstärke: 0,1 bis 0.6 M NaCl auf. Man spült die Säule dann mit dem gleichen Puffer, bis der Abstrom keine Proteine mehr zeigt. Dann eluiert man den von der Matrix zurückgehaltenen Zellwachstumsfaktor direkt mit einem Puffer mit neutralem pH-Wert mit einer Ionenstärke von 0,8 bis 2 M NaCl oder mit Hilfe eines kontinuierlichen Gradienten der Ionenstärke, der sich von 0,8 M bis 2 M NaCl erstreckt.
Diese Wachstumsfaktoren können entweder direkt aus biologischen Medien stammen oder aus Präparaten, die vorausgehenden Reinigungsmaßnahmen unterworfen worden sind.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen, welche die Herstellung der verschiedenen Glykosaminoglykane und die Ergebnisse von pharmakologischen Untersuchungen umfassen.
Dabei wird weiterhin auf die Figuren 1 bis 14 Bezug genommen, welche folgendes wiedergeben:
- Fig. 1: das ¹³C-NMR-Spektrum eines stark anionischen Hexasaccharids;
- Fig. 2: das Elutionsprofil, das der Gelfiltration einer Mischung der Salpetrigsäure-Depolymerisation entspricht;
- Fig. 3: das Ionenaustauscher-Elutionsprofil der bei der Gelfiltrationsstufe erhaltenen Hexasaccharidfraktion;
- Fig. 4: das Ionenaustauscher-Elutionsprofil des durch Chromatographie über FGF-Sepharose isolierten Hexasaccharids;
- Fig. 5: das Ionenaustauschchromatographie-Elutionsprofil des durch Chromatographie über einer Anionenaustauschersäule gewonnenen Hexasaccharids;
- Fig. 6: das Ionenaustauscher-Elutionsprofil einer Mischung von Octasacchariden;
- Fig. 7: das ¹³C-NMR-Spektrum dieser Octasaccharidmischung;
- Fig. 8: das Ionenaustauscher-Elutionsprofil einer Mischung von Decasacchariden;
- Fig. 9: das ¹³C-NMR-Spektrum dieser Decasaccharidmischung;
- Fig. 10 bis 13: Kurven der Radioaktivität in Zerfällen pro Minute in Abhängigkeit von der Dosis des untersuchten Produkts in ng, die mit dem anionischen FGF allein, einem Hexasaccharid allein oder mit anionischem FGF, einem anderen Hexasaccharid allein oder mit anionischem FGF, einem von Affinität für anionischen FGF freien Vergleichsprodukt, das allein oder in Kombination mit anionischem FGF verwendet wird; und
- Fig. 14 A-D: Kurven der Vermehrung von menschlichen endothelialen Zellen in Kultur unter verschiedenen Bedingungen.

BEISPIEL 1 :

A - DEPOLYMERISATION

Man löst 500 g injizierbares Heparin in Form des Natriumsalzes in 4500 ml entmineralisiertem Wasser bei einer Temperatur von 18ºC (Konzentration etwa 11 % (Gew. /Vol.).
Man rührt die erhaltene Lösung kräftig und senkt ihren pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 ab. Dann gibt man 15 g Natriumnitrit in Lösung in 300 ml Wasser zu (bis zu einer Endkonzentration von 0,043 M). Man stellt den pH-Wert der Reaktion mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 ein und bringt das Gesamtvolumen der Lösung auf 5000 ml, um eine Heparinendkonzentraton von 10% (Gew./Vol.) zu erreichen. Man läßt die Reaktion während 45 Minuten ablaufen. Nach Ablauf dieser Zeitdauer stellt man die Abwesenheit von restlichen Nitritionen in der Reaktionslösung mit Hilfe eines mit Kaliumiodstärke imprägnierten Indikatorpapiers fest (das bei Anwesenheit von NO&sub2;&supmin;-Ionen eine blau-violette Färbung annimmt).
Wenn man Nitritionen feststellt, läßt man die Reaktion noch weiter fortschreiten, bis diese Ionen vollständig verschwunden sind und keine Reaktion mehr mit dem Iodstärkepapier erfolgt, wobei diese Überprüfungen alle 3 oder 4 Minuten erfolgen.
Wenn die Kontrollen negativ sind, betrachtet man die Reaktion als beendet. Der pH-Wert der Lösung wird dann mit konzentrieter Natriumhydroxidlösung auf 10 eingestellt, wonach man 5 g Natriumtetrahydroborat zugibt.
Man setzt das Rühren der Lösung während 15 Stunden fort. Man zerstört das nicht umgesetzte Natriumtetrahydroborat durch Erniedrigen des pH-Werts mit Hilfe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 3,0; rührt die Lösung während 15 Minuten und stellt den pH-Wert dann mit konzentrieter Natriumhydroxidlösung auf 7,0 ein.
Zur Gewinnung der Reaktionsprodukte gibt man 10 ml Ethanol zu, läßt während 48 Stunden stehen, läßt die Mischung sich absetzen und entfernt die überstehende Flüssigkeit.

B - FRAKTIONIERUNG

Man löst den Niederschlag erneut in 9 Liter entmineralisiertem Wasser (Konzentration 5% (Gew./Vol.) auf der Grundlage des Gewichts des als Ausgangsmaterial eingesetzten Heparins). Man gibt 100 g Natriumchlorid zu und stellt den pH-Wert mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 3,8 ein. Man bringt das Volumen mit entmineralisiertem Wasser auf genau 10 Liter und gibt unter heftigem Rühren 10 Liter Ethanol zu. Man läßt während 48 Stunden stehen, hebert die überstehende Flüssigkeit ab und stellt mit 5N Natriumhydroxidlösung auf einen pH- Wert von 7,0 ein. Man gibt 19 Liter Ethanol zu, läßt während 48 Stunden stehen, hebert die überstehende Flüssigkeit ab, gewinnt den Niederschlag, wäscht ihn mit Ethanol, verreibt ihn und trocknet ihn im Vakuum. Man erhält in dieser Weise 120 g einer Mischung von Oligosacchariden.

C - GELFILTRATION

Man löst 60 g der erhaltenen Mischung in 500 ml 0,5 M NaCl und trägt die Lösung auf eine Ultrogel AcA 202 -Säule auf. Man eluiert die Säule mit einem 0,5 M NaCl-Puffer mit einem Durchsatz von 1500 ml/Stunde.
Man zeichnet kontinuierlich die Absorption des Abstroms im UV-Bereich bei 214 nm auf. Man erhält das in der Fig. 2 dargestellte Elutionsprofil. Man trennt 7 Fraktionen ab und fällt mit 2 Volumen Ethanol aus.
Diese Fraktionen besitzen die folgenden Eigenschaften: Nr. der Fraktion Volumen (Liter) Intervalle des Elutionsvolumens (Liter) Trockengewicht des Produkts* Produkt Disaccharid Tetrasaccharid Hexasaccharid Octasaccharid Decasaccharid Dodecasaccharid Tetradecasaccharid * Das durch alkoholische Ausfällung erhaltene Produkt wird zentrifugiert und während etwa 30 Stunden im Vakuum bei 60ºC getrocknet.
Das Ionenaustauscher-Elutionsprofil der Hexasaccharidfraktion ist in der Fig. 3 wiedergegeben, in der auf der Abszisse die Retentionszeit und auf der Ordinate die Menge des Produkts im Eluat aufgetragen sind. Zur Durchführung dieser Messung verwendet man eine von der Firma Pharmacia vertriebene Mono-Q - Säule mit einem NaCl-Gradienten von 0.5 bis 1.5 M bei einem Durchsatz von 1 ml/min. Zum Nachweis benutzt man die Absorption bei 214 nm. Die Untersuchung dieses Elutionsprofils zeigt die Heterogenität der Fraktion.

D - AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE ÜBER FGF-SEPHAROSE

Man bereitet den anionischen FGF ausgehend von Rinderhirnen nach der Methode von Roy R. Lobb und James W. Fett (Biochemistry, Vol. 23. Nr. 26 (1984), S. 6295-6299).
Man fixiert 45 mg anionischen FGF an 30 ml Sepharose 4B nach der Methode von P.M. Cuatrecasas, M. Wilchek und C.B. Anfinsen (Proc. Nat. Acad. Sci., U.S. 61(1968), 636).
Man bringt die in dieser Weise erhaltenen 30 ml FGF-Sepharose in eine Säule (2,5 cm x 6,5 cm) ein und bringt mit einem Tris-HCl-Puffer 0,01M, pH = 7,4, 0,2M NaCl (nachfolgend als Puffer I bezeichnet) ins Gleichgewicht.
Man trägt 300 mg der Hexasaccharidfraktion in Lösung in 60 ml des Puffers I auf die FGF-Sepharose -Säule auf, welche dann mit 600 ml des Puffers I mit einem Durchsatz von 60 ml pro Stunde gewaschen wird. Man eluiert die Säule schließlich mit dem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer I. Man fängt die 18 ml des Eluats, welche die Oligosaccharide enthalten, auf und fällt durch Zugabe von 108 ml reinem Ethanol aus. Man gewinnt in dieser Weise 0,15 mg eines Hexasaccharids, dessen Ionenaustauscher-Elutionsprofil in der Fig. 4 dargestellt ist. Diese Produkt wird im folgenden als IC 1696 bezeichnet.
Im folgenden sind die Eigenschaften des in der Fig. 1 dargestellten ¹³-C-NMR- Spektrums des Hexasaccharids angegeben, wobei zur Wiedergabe der 6 das Molekül bildenden Einheiten die folgenden Symbole verwendet werden: G&sub1; H&sub1; G&sub2; H&sub2; G&sub3; AM&sub3;.
Die Aufzeichnung des Spektrums erfolgte anhand einer Lösung dieses Produkts in deuteriertem Wasser bei 25 MHz, wobei als Referenzstandard für die Verschiebungsmessungen folgendes verwendet wurde:
TST = Natriumsalz der 3-(Trimethylsilyl)-propionsäure. Signal Zuordnung Zuordnung in allgemeinerer Weise* C-2 der Glucosamin-N-sulfatgruppe C-1 der Anhydromannitolgruppe C-6 der Glucosamin-N-sulfat-6-sulfat-gruppe C-6 der Anhydromannitol-6-sulfatgruppe der Anhydromannitolgruppe C-1 der Glucosamin-N-sulfatgruppe C-1 der Iduron-2-sulfatgruppe * Bezogen auf die Erkenntnisse im Bereich des Heparins

BEISPIEL 2:

Man verfährt ähnlich der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise unter Anwendung einer anderen Charge von injizierbarem Heparin.
Man gewinnt schließlich 115 g der Mischung von Oligosacchariden. Man behandelt 60 g dieser Mischung durch Gelfiltration unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.
Die Eigenschaften der gewonnenen Fraktionen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: Nr. der Fraktion Volumen (Liter) Trockengewicht des Produkts Produkt Tetrasaccharid Tetra-hexa-Zwischenprodukt Hexasaccharid Hexa-octa-Zwischenprodukt Octasaccharid Decasaccharid Dodecasaccharid
Man unterwirft 300 mg der Fraktion 2 (Tetra-hexa-Zwischenprodukt) einer Affinitätschromatographie auf FGF-Sepharose . Man erhält schließlich 0,11 mg des Produkts, welches als IC 1697 bezeichnet wird.
Man unterwirft 300 mg der Hexasaccharid-Fraktion einer Affinitätschromatographie über FGF-Sepharose . Man erhält in dieser Weise 0,22 mg eines Produkts, dessen Ionenaustauschergradienten-Elutionsprofil dem der Fig. 4 entspricht.

BEISPIEL 3:

Man trägt 1,5 g der Hexasaccharidfraktion 3 auf eine Anionenaustauschersäule Q-Sepharose (170 ml, 2,5 cm x 35 cm) auf, die mit einem 0,4 M NaCl-Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist.
Man spült die Säule bis zur Abwesenheit von Oligosacchariden im Abstrom mit einem 0,6 M Puffer (Spülvolumen 3,5 Liter). Die nicht absorbierten und beim Spülen gewonnenen Oligosaccharide entsprechen dem Produkt, das frei ist von Affinität für anionischen FGF und das im folgenden als P38EXH13 bezeichnet wird.
Man eluiert die Säule dann mit einem 1 M NaCl-Puffer und fängt die 120 ml des Eluats, welche die Oligosaccharide enthalten, auf und fällt durch Zugabe von 720 ml Ethanol aus.
Man erhält in dieser Weise 80 mg des Produkts, dessen Elutionsprofil bei der Ionenaustauscherchromatographie in der Fig. 5 dargestellt ist.

BEISPIEL 4:

- Verfahren zur Abtrennung eines stark anionischen Hexasaccharids durch Affinitätschromatographie über kationischer FGF-Sepharose :
Die Gewinnung von kationischem FGF aus Rinderhirn und die Bindung des kationischen FGF an Sepharose erfolgen nach den gleichen Methoden, wie sie für anionischen FGF beschrieben worden ist.
Man bringt eine Säule (1,6 cm x 5 cm), die 10 ml kationische FGF-Sepharose (1,5 mg kationischen FGF pro ml Sepharose) enthält, mit dem Puffer I ins Gleichgewicht.
Man trägt 100 mg des (gemäß Beispiel 1 erhaltenen) Hexasaccharids in Lösung in ml des Puffers I auf die Säule auf. Man wäscht die Säule mit Hilfe von 200 ml des Puffers I und eluiert dann mit dem auf 2 M NaCl eingestellten Puffer I.
Man gewinnt die 10 ml des Eluats, welches die Oligosaccharidsubstanzen enthält, und fällt durch Zugabe von 50 ml reinem Ethanol aus.
Man gewinnt in dieser Weise 0,050 mg eines Hexasaccharids, dessen Ionenaustauscher-Elutionsprofil dem in der Fig. 4 dargestellten entspricht.

BEISPIEL 5:

- Varianten der Herstellung einer Depolymerisationsmischung enthaltend die erfindungsgemäßen Oligosaccharide:

Herstellung der Oligosaccharide durch Periodabbau:

Man löst 10 g Heparin in 200 ml entmineralisiertem Wasser.
Dann gibt man Natriummetaperiodat in einer Menge zu, die dazu ausreicht, die Endmolarität auf 0,25 M zu bringen, d. h. 10,7 g, und vermindert dann den pH- Wert der Lösung durch Zugabe von 5N HCl auf 3,0.
Man läßt die Lösung während 48 Stunden im Dunkeln bei 25ºC stehen.
Dann stellt man den pH-Wert mit 5N Natriumhydroxidlösung auf 7 ein und gibt 300 ml reines Ethanol zu. Der gebildete Niederschlag wird gewonnen, zerrieben, mit Ethanol und mit Aceton gewaschen und dann schließlich bei 60ºC im Vakuum getrocknet.
Man löst ihn erneut in 120 ml 0.2N Natriumhydroxidlösung, die 2 mg Natriumborhydrid pro ml enthält. Man rührt die Lösung während 15 Stunden bei Raumtemperatur. Dann stellt man den pH-Wert mit 5N HCl auf 4 ein und dann erneut mit 5N Natriumhydroxidlösung auf 7. Man gibt 200 ml reines Ethanol zu.
Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert, vermahlen, mit Ethanol und Aceton gewaschen und im Vakuum bei 60ºC getrocknet.
Man erhält in dieser Weise 6,4 g einer Mischung von Oligosacchariden. Man unterwirft diese Mischung einer Gelfiltrationsstufe über Ultrogel AcA 202 unter Anwendung der in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen.

Herstellung von Oligosacchariden durch enzymatische Wirkung von Heparinase oder Heparitinase:

Man extrahiert Heparinase oder Heparitinase aus Flavobacterium heparinum und reinigt nach der von P. Hovingh und A. Linker (J. Biol. Chem.,Vol. 245, Nr.22 (1970), S. 6170-6175) beschriebenen Methode.

- Depolymerisation mit Heparinase:

Man löst 10 g Heparin in 500 ml eines 0,1 M Acetatpuffers, pH 7.0, CaCl&sub2; 0,01 M.
Man bringt die Lösung auf ein Wasserbad mit einer Temperatur von 30ºC und gibt 2,5 mg reine Heparinase zu.
Man inkubiert während 24 Stunden bei 30ºC und gibt dann 1200 ml reines Ethanol zu.
Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen, mit Ethanol gewaschen und im Vakuum bei 60ºC getrocknet.
Man erhält 7,1 g einer Mischung von Oligosacchariden, die letztendlich einer Gelfiltraton über Ultrogel AcA 202 unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen unterworfen wird.

- Depolymerisation mit Heparitinase:

Man löst 10 g Heparin in 500 ml eines 0,1 M Acetatpuffers, pH 7,0, CaCl&sub2; 0,01 M.
Man bringt die Lösung auf ein Wasserbad mit einer Temperatur von 40ºC auf und gibt 5 mg reine Heparitinase zu. Man inkubiert während 10 Stunden bei 40ºC und gibt dann 3 mg reine Heparitinase zu. Man inkubiert erneut während 6 Stunden und gibt dann erneut 3 mg Heparitinase zu. 10 Stunden nach der letzten Zugabe fällt man die Reaktionsprodukte durch Zugabe von 1200 ml Ethanol aus.
Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen, mit Ethanol gewaschen und im Vakuum bei 60ºC getrocknet.
Man erhält 6,8 g einer Mischung von Oligosacchariden. die letztlich einer Gelfiltration über Ultrogel AcA 202 unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen unterworfen wird.

BEISPIEL 6:

- Herstellung von Octasacchariden mit hoher Affinität für anionischen FGF durch Affinitätschromatographie über FGF-Sepharose .
Man bereitet die Chromatographiesäule wie es in Beispiel 1 D beschrieben ist.
Man trägt 300 ml der Octasaccharidfraktion, wie sie in Beispiel 1 erhalten worden ist, in Lösung in 60 ml des Puffers I auf die FGF-Sepharose -Säule auf, wobei diese mit 600 ml des Puffers I mit einem Durchsatz von 60 ml pro Stunde gewaschen wird. Die Säule wird schließlich mit dem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer I eluiert.
Man gewinnt die 20 ml des Eluats, welche die Oligosaccharidsubstanzen enthalten, und fällt durch Zugabe von 120 ml reinem Ethanol aus. Man gewinnt in dieser Weise 0,26 mg einer Mischung von Octasacchariden, welche das Ionenaustauscher-Elutionsprofil aufweist, das in der Fig. 6 dargestellt ist.
Das ¹³C-NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser bei 25 MHz für die erhaltene Octasaccharidmischung ist in der Fig. 7 gezeigt.

BEISPIEL 7:

- Herstellung von Decasacchariden mit hoher Affinität für anionischen FGF durch Affinitätschromatographie über FGF-Sepharose

Man bereitet die Chromatographiesäule nach der in Beispiel 1 D beschriebenen Weise.
Man trägt 300 mg der Decasaccharidfraktion, die man gemäß Beispiel 1 erhalten hat, in Lösung in 60 ml des Puffers I auf die FGF-Sepharose -Säule auf und wäscht diese mit 600 ml des Puffers I bei einem Durchsatz von 60 ml pro Stunde. Die Säule wird schließlich mit dem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer I eluiert.
Die 26 ml des Eluats, welche die Oligosaccharidsubstanzen enthalten, werden durch Zugabe von 160 ml reinem Ethanol gewonnen. Man erhält in dieser Weise 0,38 mg einer Mischung von Decasacchariden, welche das Ionenaustauscher- Elutionsprofil zeigt, das in der Fig. 8 wiedergegeben ist.
Das ¹³C-NMR-Spektrum in deuteriertem Wasser bei 25 MHz für die erhaltene Mischung von Decasacchariden ist in der Fig. 9 wiedergegeben.

BEISPIEL 8:

- Gewinnung einer Mischung von Glykosaminoglykan-Fragmenten, die für anionischen FGF affin sind:

Man arbeitet nach der Verfahrensweise des Beispiels 1, jedoch ohne Durchführung der Gelfiltrationsstufe C.
Die Affinitätschromatographie über FGF-Sepharose wird anschließend an einer Mischung durchgeführt, welche die in der Tabelle der Seite 20 angegebene Mischung der Di-, Tetra-, Hexa-, Octa-, Deca-, Dodeca- und Tetradecasaccharide enthält.
Diese Chromatographie ermöglicht die Isolierung jener Ketten der Mischung, die eine Affinität für FGF besitzen.

BEISPIEL 9:

Man bereitet 120 mg des Hexasaccharids nach der oben beschriebenen Methode des Beispiels 3 unter Weglassen der Phase der Reduktion mit Natriumtetrahydroborat bei der anfänglichen Depolymerisation des Heparins gemäß Beispiel 1.
Man löst diese 120 mg des Hexasaccharids in 100 ml 0,5 M NaCl, gibt 50 ml Aminoethyl-Sepharose (die etwa 8 uMol Aminoethylgruppen pro ml dekantierter Matrix enthält) und 50 ml Natriumcyanoborhydrid zu. Man bringt das Ganze mit 5N Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 11 und rührt mäßig während 10 Tagen bei Raumtemperatur.
Anschließend filtriert man die Matrix über einen Büchner-Filter, wäscht mit 1 Liter einer 0,5 M NaCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7, dann mit 1 Liter einer 10&supmin;³N Chlorwasserstoffsäurelösung, anschließend mit 500 ml einer 1 M NaCl- Lösung mit einem pH-Wert von 10,0 und schließlich mit 1 Liter destilliertem Wasser.
Man entnimmt einen aliquoten Anteil von 5 ml der Matrix und hydrolysiert während 3 Stunden bei 100ºC in einer 2 N Chlorwasserstoffsäurelösung. Die Bestimmung der Uronsäuren in dem Hydrolysat zeigt, daß die letztlich erhaltene Matrix 2 mg covalent gebundenes Hexasaccharid pro ml-Sepharose enthält.
Man gibt 40 ml der Hexasaccharid-Sepharose -Matrix: in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Länge von 8 cm ein. Man bringt dann die Säule mit einem 0,02 M Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0, 0,3 M NaCl (Puffer 1) ins Gleichgewicht.
Man führt 2 mg anionischen FGF aus Rinderhirn (hergestellt nach der Methode von R.R. Lobb und J.W. Fett, Biochemistry, Vol. 23, Nr.26 (1984), S. 6295-6299) in Lösung in 10 ml des Puffers I durch die Säule, die anschließend mit 120 ml des gleichen Puffers I gespült wird.
Anschließend eluiert man die Säule mit einem linearen Gradienten, den man durch progressives Vermischen von 200 ml des Puffers I und 200 ml des 0,02 M Tris-HCl-Puffers, pH 7,0, 2 M NaCl, erhält.
Der Peak des anionischen FGF tritt bei einer Ionenstärke von etwa 0,7 M aus der Säule aus und wird mit einer Ausbeute von 95 % gewonnen.

BEISPIEL 10:

Man bereitet 10 mg des Decasaccharids nach der in dem obigen Beispiel 7 beschriebenen Methode unter Weglassen der Phase der Reduktion mit Tetrahydroborat bei der anfänglichen Depolymerisation von Heparin gemäß Beispiel 1.
Man löst diese 10 mg des Decasaccharids in 20 ml destilliertem Wasser. Dann gibt man 5 ml Aminoethyl-Sepharose (die 8 uMol Aminoethylgruppen pro ml enthält) und 5 mg Natriumcyanoborhydrid zu, stellt den pH-Wert der Suspension mit 5 N Natriumhydroxidlösung auf 11 und hält während einer Woche bei mäßigem Rühren bei Raumtemperatur.
Anschließend wird die Sepharose -Matrix über einem Büchner-Filter filtriert, mit 100 ml einer 0,5 M NaCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7, dann mit 100 ml 10&supmin;³N Chlorwasserstoffsäurelösung. dann mit 100 ml 2 M NaCl-Lösung und schließlich mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen.
Man entnimmt 1 ml dieser Matrix und hydrolysiert während 3 Stunden in 5 ml 2N Chlorwasserstoffsäure. Die Bestimmung der Uronsäuren im Hydrolysat zeigt, daß die erhaltene Matrix 1,8 mg covalent gebundenes Decasaccharid pro ml Sepharose enthält.
Man gibt 4 ml Decasaccharid-Sepharose in eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 5 cm ein. Dann bringt man die Säule mit einem 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, 0,6 M NaCl (PufferII) ins Gleichgewicht. Man trägt 0,2 mg kationischen FGF aus Rinderhirn, das man unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt hat, in 2 ml Puffer II auf den Kopf der Säule auf. Man spült die Säule mit 40 ml des Puffers II. Sie wird schließlich mit dem 0,02 M Tris-HCI-Puffer, pH 7,0, 2 M NaCl, eluiert. Der anionische FGF wird in Form eines schmalen Peaks eluiert. Die in dem Eluat gewonnene Menge beträgt 0,18 mg. was einer Ausbeute von 90 % entspricht.

BEISPIEL 11

Gemäß einerAbänderung des Verfahrens 1 bewirkt man die Stufe der Depolymerisation durch Periodoxidation wie folgt:

1/ - Spaltung der Heparinketten mit Periodsäure

Man löst 10 g injizierbares Heparin aus Schweineschleimhaut in Form des Natriumsalzes mit einem Titer von 157 IE/mg bei der Codex-Bestimmung und 155 E/mg bei der Anti-Xa-Faktorbestimmung gemäß Yin et al., bei 4ºC in 250 ml Wasser. Man stellt den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 ein. Dann gibt man unter mäßigem Rühren 10 g Natriummetaperiodat (NaIO&sub4;, MG: 213,89) in Lösung in 250 ml entmineralisiertem Wasser bei 4ºC zu. Man stellt den pH-Wert der Mischung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 ein und läßt die Lösung im Dunkeln und im Kühlschrank bei +4ºC während 24 Stunden stehen.

2/ - Entfernung des restlichen Periodats

Man verteilt die Reaktionslösung anschließend in 3 Dialyseschläuche NOJAX 40 (Porosität 3 bis 4000 Da) und bewirkt eine Dialyse während 15 Stunden gegen strömendes entmineralisiertes Wasser.

3/ - Depolymerisation in basischem Medium

Zu 780 ml der nach der Dialyse erhaltenen Lösung gibt man 16 ml 10N Natriumhydroxidlösung und rührt das Ganze während 3 Stunden bei Raumtemperatur (im Bereich von 18 - 21ºC).
Gegebenenfalls führt man nach diese Stufe eine wie folgt durchgeführte Reduktion durch:
Man gibt 500 mg Natriumborhydrid (NaBH&sub4;, MG: 37,83) zu und rührt die Lösung erneut während 4 Stunden bei Raumtemperatur. Dann bringt man den pH-Wert mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 4. Nach 15-minütigem Rühren stellt man den pH-Wert mit konzentrierter Natriumhydroxidlösung auf 7 ein.
Zu 820 ml der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man 16,4 g NaCl und schließlich 1270 ml Ethanol.
Man läßt das Ganze während 3 Stunden stehen und zentrifugiert dann während 20 Minuten bei 2500 min&supmin;¹.
Der Niederschlag wird gewonnen, erneut in 200 ml reinem Ethanol suspendiert. mit Hilfe eines Ultra-Turrax -Rührers verrieben und schließlich durch Filtration über einer Büchner-Fritte gewonnen.
Das Material wird anschließend während 5 Stunden im Vakuum bei 40ºC getrocknet.
Man gewinnt in dieser Weise 8,9g eines Zwischenprodukts mit den folgenden Eigenschaften:
- Codex-Titer: 8 IE/mg
- APTT-Titer: 7 IE/mg
- Anti-Xa-Titer: 8 E/mg
Man unterwirft die erhaltene Mischung der Ketten einer Gelfiltration nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.

BEISPIEL 12:

- Toxizität:

Man verabreicht die Produkte IC 1696, 1701 und 1702 auf intravenösem und subkutanem Wege an Mäuse während einer Zeitdauer von 15 Stunden, wobei sich keinerlei Todesfall zeigt. Ihr DL&sub5;&sub0;-Wert liegt in beiden Fällen oberhalb 2 g/kg.

BEISPIEL 13:

- Wirkung der erfindungsgemäßen Produkte auf ein Zellkulturmodell

A - BESCHREIBUNG DES MODELLS:

Man züchtet LE II-Zellen (endotheliale Lungenzellen von Mäusen) auf Platten mit Näpfchen in Gegenwart von 10 % Kalbsfötenserum bis zu einem Zusammenfließen von 3/4.
Anschließen stoppt man sie während 48 Stunden in lediglich 0,2 % Serum und hält sie ruhig.
Man gibt anschließend entweder den "Fibroblast Growth Factor" (FGF) oder die zu untersuchenden Oligosaccharidfragmente oder die beiden Produkte gleichzeitig (FGF + das zu untersuchende Produkt) zu.
Anschließend hält man die Kultur während 24 Stunden und gibt dann 4 Stunden vor Ende des Experiments Tritium-thymidin zu.
Anschließend zählt man die aufgenommene Radioaktivität aus, wobei jede Messung dreifach erfolgt.

B - ERGEBNISSE

Die Ergebnisse sind in den folgenden Figuren wiedergegeben:
- Figur 10: Dosis/Wirkungs-Kurve in Gegenwart von lediglich anionischem FGF.
Das Reizplateau liegt bei 126.000 Zerfällen pro Minute bei einer Dosis von 5 ng/ml. Bei den folgenden Figuren wird die maximale Stimulierung in Gegenwart lediglich des anionischen FGF durch die gestrichelte Linie wiedergegeben, während die Kurven Δ_Δ für jene Ergebnisse stehen. die dann erhalten werden. wenn Glykosaminoglykan allein verwendet wird und Kurven._. fürjene Ergebnisse stehen, die dann erhalten werden, wenn Glykosaminoglykan zusammen mit anionischem FGF eingesetzt wird.
- Figur 11: Dosis/Wirkungs-Kurve in Gegenwart des Hexasaccharids IC 1696 allein oder zusammen mit anionischem FGF (5 ng/ml).
Es ist festzuhalten, daß das Produkt IC 1696 eine dosisabhängige Wirkung bei 0,08 bis 50 ug/ml in dem Kulturmedium besitzt.
In Kombination mit anionischem FGF beobachtet man eine Steigerung gegenüber der Aktivität des allein verwendeten FGF beginnend mit 10 ug/ml.
Bei den experimentellen Bedingungen und dem Zellsystem potentialisiert das Produkt IC 1696 die Wirkung von anionischem FGF.
- Figur 12: Dosis/Wirkungs-Kurve in Gegenwart des Hexasaccharids IC 1697 allein oder in Kombination mit anionischem FGF (5 ng/ml).
Das allein verwendete Produkt IC 1697 zeigt eine dosisabhängige Wirkung zwischen 0,04 und 50 ug/ml.
Verwendet man dieses Material bei diesen Bedingungen des experimentellen Modells in Kombination mit anionischem FGF, so ergibt sich eine deutlich potenzierende Wirkung beginnend mit 0,4 ug/ml.
- Figur 13: Dosis/Wirkungs-Kurve in Gegenwart eines von Affinität für anionischen FGF freien Kontrollprodukts, nämlich dem Hexasaccharid P 38 EXH 13 allein oder in Kombination mit anionischem FGF (5 ng/ml).
Das als Vergleich verwendete Fragment zeigt keine signifikante Wirkung, wenn es alleine eingesetzt wird.
Als Schlußfolgerung ist festzuhalten, daß bei diesem experimentellen Modell (ruhende Zellen in Abwesenheit von Serum) die Oligosaccharide mit Affinität für FGF eine stimulierende (mitogene) Wirkung entfalten.

BEISPIEL 14:

- Wirkung der Oligosaccharide auf die Vermehrung von Endothelialzellen der Rinderaorta in Gegenwart von basischem FGF:

Man sät endotheliale Zellen von Rinderaorta in niedriger Dichte (20.000 Zellen pro Behälter von 35 mm) in einem modifizierten Eagle-Medlum aus, das 10 % Kalbsfötenserum enthält.
Man hält die Zellen während 4 Tagen in der Kultur und gibt am Tag J0 und am Tag J+2 10 ul einer Lösung von basischem FGF in einer Konzentration von 8,6 pg/ul zu.
Darüber hinaus werden die Kulturen am Tag J0 gegebenenfalls mit den zu untersuchenden Oligosacchariden in variierenden Konzentrationen zersetzt. Nach Ablauf von 4 Tagen zählt man die Zellen mit Hilfe eines Coulter-Teilchenzählers aus.
Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Inhibierung der Vermehrung der Zellen im Vergleich zu den Kulturen, die nicht mit den zu untersuchenden Produkten behandelt worden sind, angegeben. Zu Vergleichszwecken wurden die Versuche auch mit Heparin durchgeführt.
Die Ergebnisse sind die folgenden:
Die Ergebnisse sind als DE&sub5;&sub0;-Werte angegeben, d. h. die Menge des Produkts, die dazu erforderlich ist, 50 % der Zellvermehrung zu inhibieren, die man mit Zellen. die nur FGF enthalten, erzielt: Untersuchtes Produkt Heparin
Zu Vergleichszwecken wurde auch die Wirkung von regelmäßigen Tetrasacchariden und Disacchariden, die man durch Gelfiltration und Ionenaustauscherchromatographie nach der Depolymerisation mit salpetriger Säure erhalten hat, untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß diese von einer Affinität für FGF freien Produkte keine inhibierende Wirkung auf das angewandte Modell ausüben.
Im Gegensatz dazu zeigen die Produkte IC 1696 und IC 1701 im wesentlichen die gleiche Wirkung wie Heparin. während das Produkt IC 1702 noch sehr starkwirksam ist.

BEISPIEL 15:

- Wirkung der Oligosaccharide auf die Vermehrung von in Kultur gezüchteten menschlichen Endothelialzellen

Man bereitet primäre Kulturen von Endothelialzellen der Nabelvene nach dem VerfahrenvonJaffe (J. Clin. Invest.,52 (1973), 2745). Zum Zeitpunkt des Zusammenfließens (5 - 7 Tage) löst man die Zellen mit einer Trypsin-EDTA-Mischung ab. Sie werden anschließend auf Falcon-Platten mit 24 Näpfchen, die zuvor mit Fibronectin (5 ug/cm²) bedeckt worden sind, in einer Dichte von 5.000 Zellen/cm² in dem mit 20 % Kalbsfötenserum (KFS) versetzten Medium 199 aufgeteilt.
Vierundzwanzig Stunden später ersetzt man das Medium durch das mit 10 % KFS versetzte Medium 199 und gibt die Glykosaminoglykane allein oder in Kombination mit saurem FGF (FGFa) zu. 48 Stunden später gibt man erneut den Wachstumsfaktor zu. Nach Ablauf von 4 Tagen in der Kultur löst man die Zellenmit einer Trypsin-EDTA-Mischung ab und bewirkt eine Zählung mit Hilfe eines Zellzählers (Coulter Counter Coultronics). Jede experimentelle Kurve (Fig. 14 A-D) steht für einen typischen Versuch, der dreifach durchgeführt wird. Jeder Versuch wird 2- bis 3-mal wiederholt.
In den Fig. 14A-D steht die gestrichelte Linie für die Grundvermehrung bei einer Kultur, die 10 % KSF ohne FGFa und ohne Oligosaccharid enthält; die Kurve ._._. steht für die Kontrolluntersuchung in Gegenwart von lediglich FGFa; die Kurven _ _ und _ _ für die Ergebnisse, die in Gegenwart von FGFa in Kombination mit Hepan in Konzentrationen von 1 ug/ml und 5 ug/ml bzw. den Oligosacchariden in Konzentration von 10 ug/ml und 50 ug/ml erhalten worden sind.
Bei den angewandten experimentellen Bedingungen führt das nicht in Kombination mit den Oligosacchariden eingesetzte FGFa zu einer maximalen Erhöhung der Anzahl der Zellen im Vergleich zu dem KFS in einer Konzentration von 10% allein von 230 %, was einem DE&sub5;&sub0;-Wert von 7 ng/ml entspricht. Dabei ist unter dem DE&sub5;&sub0;-Wert die Konzentration an FGFa (ng/ml) zu verstehen, welche im Vergleich zu der maximalen Vermehrung, die man mit 50 - 100 ng/ml FGFa erzielt, 50 % der Vermehrung verursacht.

ERGEBNISSE

Die Wirkungen der Oligosaccharide wurden im Vergleich zu dem als Ausgangsmaterial verwendeten Heparinstandard (Charge 91416) untersucht.
Bei den angewandten experimentellen Bedingungen verstärkt Heparin die Wirkung von FGFa. Diese verstärkende Wirkung beginnt mit einer Heparinkonzentration von 200 ng/ml und erreicht ihre Maximum bei einer Heparinkonzentration von 25 ug/ml. Eine Heparinkonzentration von 1 ug/ml vermindert den DE&sub5;&sub0;- Wert des FGFa um den Faktor 10 (Fig. 14A). Es ist festzuhalten, daß die untersuchten Oligosaccharide in Abhängigkeit von den angewandten experimentellen Bedingungen unterschiedliche Wirkungen aufweisen.
1 / - In Abwesenheit von FGFa inhibieren die Oligosaccharide in einer Konzentration von 1 bis 100 ug/ml das Wachstum der Endothelialzellen (siehe die folgende Tabelle). INHIBIERENDE WIRKUNG VON GLYKOSAMINOGLYKANEN AUF DAS WACHSTUM VON MENSCHLICHEN ENDOTHELIALZELLEN IN GEGENWART VON KFS UND IN ABWESENHEIT VON FGFa Inhibierung (%) Hexasaccharid Octasaccharid Decasaccharid
2/ - Bei Konzentrationen von FGFa oberhalb des DE&sub5;&sub0;-Werts (7 ng/ml) beobachtet man eine stimulierende Wirkung der Oligosaccharide auf das Zellwachstum (Fig. 14 B-D). Diese Wirkung erfordert stärkere Konzentrationen der Oligosaccharide als der von Heparin. Das wirksamste Produkt ist das Decasaccharid IC 1702 (bei 70 ug/ml vermindert sich der DE&sub5;&sub0;-Wert auf 3,2 ug/ml). Das Hexasaccharid IC 1696 besitzt eine sehr schwache stimulierende Wirkung auf das Zellwachstum. Die Wirkung auf die Verstärkung der Wirkung von FGFa steht in guter Korrelation mit der Affinität dieser Oligosaccharide für den Wachstumsfaktor.
Daraus ist zu schließen, daß der angewandte Test zwei Wirkungen der Oligosaccharide verdeutlicht, nämlich eine inhibierende Wirkung in Gegenwart von Serum und in Abwesenheit von FGFa und eine stimulierende Wirkung in Gegenwart des Wachstumsfaktors, für den sie eine Affinität besitzen. Dies weist eine modulierende Wirkung der Glykosaminoglykane auf das Zellwachstum hin. Die inhibierende Wirkung ermöglicht eine antiangiogenetische Wirkung in vivo. Die stimulierende Wirkung in Kombination mit dem Wachstumsfaktor ermöglicht die Verwendung dieser Produkte entweder für die Stabilisierung und die Potenzierung des Wachstumsfaktors oder für die Stimulierung der Gewebewiederherstellung.
Die Wirkung des Hexasaccharids IC 1696 wurde an einem von J. Folkman et al. (Science, 221 (1983), 719) angepaßten Angiogenese-Modell untersucht, bei dem Implantate von imprägnierten Polymeren durch intravenöse Injektionen des zu untersuchenden Produkts ersetzt werden.
Man verabreicht Kaninchen täglich auf intravenösem Wege zwei Injektionen von 10 mg/kg des Hexasaccharids IC 1696 in Lösung in einer isotonischen Chloridlösung und entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Steroiden.
Es ist festzuhalten, daß die mit IC 1696 behandelten Tiere eine deutlich geringere Gefäßbildung zeigen als die Tiere, die lediglich mit der isotonischen Chloridlösung behandelt worden sind. Insbesondere ist bei den erstgenannten Tieren die sekundäre Gefäßbildung deutlich weniger stark entwickelt.
Bei einem vorläufigen Versuch unter Verwendung des gleichen Modells zeigt lediglich das Produkt IC I696 eine inhibierende Wirkung auf die Angiogenese.

Claims

1. Oligosaccharide, dadurch gekennzeichnet, daß sie der folgenden Formel III entsprechen:

R(GH)nR' III

in der

- n eine Zahl mit einem Wert von 2 bis 6,

- G-H eine Disaccharidkette der Struktur (L-Iduronsäure-2-O-sulfat)-(D-Glucosamin-NH-sulfat-6-O-sulfat),

- G eine L-Iduronsäure-2-O-sulfat-gruppe,

- H eine D-Glucosamin-NH-sulfat-6-O-sulfat-gruppe,

- R entweder ein Wasserstoffatom oder eine Disaccharideinheit G'-H, worin die Gruppe G' für den Rest einer α,β-ungesättigten Uronsäure steht,

- R' entweder ein Wasserstoffatom oder eine Disaccharideinheit G-H', worin die Gruppe H' eine 2,5-Anhydromannitol- oder 2,5-Anhydromannonsäure-gruppe bedeuten,

mit der Maßgabe, daß die Bedeutungen von R und R' derart sind, daß die Gesamtzahl der Monosaccharideinheiten der Oligosaccharide einschließlich der modifizierten Einheiten höchstens 14 beträgt,

- die dazu fähig sind, sich in einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer pH 7,4. 0,2 M NaCl an anionischen FGF. der an eine Chromatographiesäule fixiert ist, zu binden, und deren pharmakologisch annehmbare Salze.

2. Oligosaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Ketten gebildet ist, die 6 Monosaccharideinheiten umfassen.

3. Hexasaccharid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es:

- einem Produkt entspricht, das in einer Fraktion enthalten ist, die jener entspricht, die zwischen einem Volumen von 32 bis 36 l von einem Gelfiltrationssystem eluiert wird, auf das man in Lösung in 500 ml 0.5 M NaCl 60g eines Niederschlags, den man durch alkoholische Ausfällung aus einer durch Nitrit-Depolymerisation von Heparin gewonnenen Mischung erhalten hat, auf eine Säule mit den Abmessungen 100 cm x 25 cm, die 45 Liter Agarose-Acrylamid enthält, das mit einem 0,5N NaCl-Puffer, pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufträgt, und die Elution mit einem Durchsatz von 1500 ml/Stunde bewirkt,

- welches Produkt durch Affinitätschromatographie über anionischem FGF, der an einem Agaroseträger fixiert ist, abgetrennt wird unter Verwendung einer Säule mit den Abmessungen 2,5 cm x 6,5 cm, die mit einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 0,2 M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden ist und 30 ml an den Agaroseträger fixierten anionischen FGF enthält, auf welche Säule man 300 mg der oben beschriebenen Fraktion, gelöst in 60 ml des gleichen Puffers, aufträgt und mit diesem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer eluiert und das Oligosaccharid der aufgefangenen Fraktion mit Hilfe von Ethanol ausfällt.

4. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Ketten gebildet sind, die 8 Monosaccharideinheiten umfassen.

5. Octasaccharid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Produkt entspricht:

- einem Produkt entspricht, das in einer Fraktion enthalten ist, die jener entspricht, die zwischen einem Volumen von 28 bis 32 l von einem Gelfiltrationssystem eluiert wird, auf das man in Lösung in 500 ml 0,5 M NaCl 60 g eines Niederschlags, den man durch alkoholische Ausfällung aus einer durch Nitrit-Depolymerisation von Heparin gewonnenen Mischung erhalten hat, auf eine Säule mit den Abmessungen 100 cm x 25 cm, die 45 Liter Agarose-Acrylamid enthält, das mit einem 0.5N NaCl-Puffer, pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufträgt, und die Elution mit einem Durchsatz von 1500 ml/Stunde bewirkt,

6. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Ketten gebildet sind, die 10 Monosaccharideinheiten umfassen.

7. Decasaccharid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Produkt entspricht:

- einem Produkt entspricht, das in einer Fraktion enthalten ist, die jener entspricht, die zwischen einem Volumen von 25 bis 28 l von einem Gelfiltrationssystem eluiert wird, auf das man in Lösung in 500 ml 0,5 M NaCl 60g eines Niederschlags, den man durch alkoholische Ausfällung aus einer durch Nitrit-Depolymerisation von Heparin gewonnenen Mischung erhalten hat, auf eine Säule mit den Abmessungen 100 cm x 25 cm, die 45 Liter Agarose-Acrylamid enthält, das mit einem 0,5N NaCl-Puffer, pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufträgt, und die Elution mit einem Durchsatz von 1500 ml/Stunde bewirkt,

- welches Produkt durch Affinitätschromatographie über anionischen FGF, der an einem Agaroseträger fixiert ist, abgetrennt wird unter Verwendung einer Säule mit den Abmessungen 2,5 cm x 6,5 cm, die mit einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 0,2 M NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden ist und 30 ml an den Agaroseträger fixierten anionischen FGF enthält, auf welche Säule man 300 mg der oben beschriebenen Fraktion, gelöst in 60 ml des gleichen Puffers, aufträgt und mit diesem auf 1 M NaCl eingestellten Puffer eluiert und das Oligosaccharid der aufgefangenen Fraktion mit Hilfe von Ethanol ausfällt.

8. Oligosaccharide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Ketten gebildet sind, die 12 Monosaccharideinheiten umfassen.

9. Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide nach einem der Ansprüche 1, 2, 4, 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Heparin-Glykosaminoglykanpräparat auf den Kopf einer Chromatographiesäule aufträgt, die an einen Agaroseträger fixierten anionischen oder kationischen Wachstumsfaktor umfaßt, welche Säule mit einem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, dessen Ionenstärke einer NaCl-Konzentration 0.2M entspricht, und von der man die auf der Kolonne festgehaltene Oligosaccharidfraktion eluiert, indem man den Puffer auf eine Ionenstärke einstellt, die einer NaCl-Konzentration von 1 M bis 2 M entspricht.

10. Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide nach einem der Ansprüche 1, 2, 4, 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Heparin-Glykosaminoglykanpräparat einer Ionenaustauschchromatographie unterwirft auf einer Austauschersäule für stark basische Anionen, wie quaternäre Ammoniumionen, und die Ionenstärke des Elutionspuffers gemäß einem Gradienten variiert, der einer Variation der Ionenstärke des NaCl-Puffers von 0,5 ± 0,1 M bis 1 - 2 M entspricht, und die am stärksten anionischen Fraktionen gewinnt.

11. Pharmazeutische Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ih-

rem Wirkstoffmindestens ein Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägermaterial umfassen.

12. Mittel zur Modulierung des Zellwachstums in Kulturen, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt.

13. Biologisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgehend von einem Oligosaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt worden ist.